CN116376737A - 一株副干酪乳杆菌zf616及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及工业微生物技术领域，尤其涉及一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616及其应用，本发明还涉及所述副干酪乳杆菌在酱油生产中的应用。所述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62634，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼。本发明的菌株具有能提高发酵酱油中苹果酸含量高的优点，并且添加后不影响发酵酱油中其他成分，将其应用于酱油发酵过程，得到的酱油既保留了发酵酱油浓郁的酱香风味，又增加了酱油愉悦的酸味，口感更加酸爽，甜酸味更加丰满协调，提升了酱油的浓厚感。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，尤其涉及一株能提高酱油中苹果酸含量的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616及其应用，具体地，本发明还涉及所述副干酪乳杆菌在酱油生产中的应用。
背景技术
酱油是以大豆、小麦、麸皮等蛋白质和淀粉原料，在多种微生物分泌的不同酶系共同作用下，经过一系列复杂的生化反应，最终形成具有明显香味特征的一种液态调味品。在酱油发酵过程中，乳酸菌是促进酱油风味物质形成的重要微生物。
酱油乳酸菌是指在酱醪中生长，并且进行乳酸发酵的耐盐性乳酸菌。这类菌来自制曲、制醪器具或酿造厂空气中。经研究从酱油酱醪中分离出来的乳酸菌(Lactobacillus)主要包括嗜盐片球菌(Pediococcus halophilus)、嗜盐四联球菌(Tetragenocuccushalophilus)、魏斯氏菌(Weisseria)和酱油微球菌(Tetracocu)等。这些乳酸菌再酱油中繁殖产生乳酸，使pH下降至5.0以下，这样的酸度正好是适合于酱油酵母繁殖的酸度，这是酱油乳酸菌的重要作用，也是构成酱油醪风味的重要因素之一。但在酱醪发酵后期，当pH为5.0以下嗜盐片球菌等乳酸菌生长受到抑制，导致酱油发酵体系中有机酸的积累不足，进而影响酱油风味物质的形成。
有机酸的组成种类、含量和比例均是酱油风味组成的重要部分，主要包括乳酸、醋酸、柠檬酸、苹果酸等。本发明中发现酱油中苹果酸含量较高，其具有令人愉悦的酸味，且柔和持久，酱油甜酸味更加自然与协调。而目前我国酿造酱油普遍采用沪酿3.042米曲霉或其诱变菌株，而这些菌株在酱油发酵过程中产生的苹果酸浓度很低，无法到达苹果酸的口味阈值，因此乳酸菌发酵生成有机酸类物质的能力极大影响了酱油风味物质的生成。
因此，寻找新的能够解决上述问题的乳酸菌菌株是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616及其应用。本申请的发明人意外从天然发酵酱醪中筛选和分离鉴定获得了一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616，该菌株具有能提高发酵酱油中苹果酸含量的优点，并且添加后不影响发酵酱油中的其他成分，将其应用于酱油发酵过程，得到的酱油既保留了发酵酱油浓郁的酱香风味，又增加了酱油愉悦的酸味，口感更加酸爽，甜酸味更加丰满协调，提升了酱油的浓厚感。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
本发明提供了一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616，所述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62634，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼。
具体的菌株保藏信息如下：
保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心；
保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；
保藏日期：2022年8月21日；
保藏编号：GDMCC No：62634。
分离筛选得到的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616，具有典型乳酸菌菌落形态，菌落呈乳白色，菌落凸起，呈圆形，表面光滑，边缘整齐。将其置于显微镜下观察，筛选染色后细胞形态呈杆状，短杆或短链状，革兰氏阳性的菌株。
本发明副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的耐酸性较强，pH4.5以下仍具有较好的增殖能力，接种至酱醪中发酵，能有效促进酱醪中有机酸的积累。采用副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616发酵获得的酱油具有苹果酸含量高的优点，同时酱油色泽鲜艳，酯香浓厚，口感更加酸爽，甜酸味更加丰满协调的特点。
本发明还提供了上述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616在制备发酵酱油中的应用。
本发明还提供了所述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的筛选方法，其包括如下步骤：
1)稀释按常规酱油发酵工艺发酵培养的高盐酱醪；
2)将1)中所得稀释液涂布在MRS固体培养基上初筛；
3)接种2)中获得的初筛菌株发酵获得发酵液；
4)对3)中所得发酵液进行常规指标检测复筛，筛选出发酵原油质量正常，全氮、氨基酸态氮和苹果酸含量最高的乳酸菌菌株；
5)对4)中筛选的乳酸菌菌株进行形态学、生理生化、16S rDNA测序分析鉴定。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616在酱油发酵过程中提高苹果酸含量中的应用。
将所述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616接种至MRS固体培养基上发酵，连续传代10代，其发酵液中苹果酸的含量在各代之间误差在10％范围以内，则表明菌株遗传稳定性良好。
本发明还提供了一种酱油的制备方法，包括以下步骤：
ⅰ)往发酵酱醪中接种上述含有副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的菌液；
ⅱ)对ⅰ)中所得酱醪继续发酵7～14天；
ⅲ)对ⅱ)中所得发酵酱醪压榨、过滤、灭菌获得酱油原油(根据GB18186-2000高盐稀态酱油原油制作)。
作为本发明所述酱油的制备方法的优选实施方式，步骤ⅰ)中，所述菌液中副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的浓度为1.0×107cfu/mL～1.0×108cfu/mL。
作为本发明所述酱油的制备方法的优选实施方式，步骤ⅰ)中，所述含有副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的菌液的接种量为1～3％，优选地，所述含有副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的菌液的接种量为1～2％。
随着副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616添加量的增加，酱油中苹果酸的含量逐渐增加，但是当副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616添加量增大到一定程度时，由于苹果酸含量偏高，酱油滋味受到影响。因此，在使用本发明提供的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616进行酱醪发酵时，应注意副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的添加量。
当含有副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的菌液中菌体浓度为1.0×107cfu/mL～1.0×108cfu/mL、接种量为2％时，发酵酱醪效果最佳，既提高了苹果酸的含量，口感更加酸爽，甜酸味更加丰满协调，提升了酱油的浓厚感，又不会因酸味过重改变酱油风味的协调性。
作为本发明所述酱油的制备方法的优选实施方式，步骤ⅰ)发酵酱醪发酵天数为41～49d(例如41d、43d、45d、47d、49d)；步骤ⅱ)发酵的温度为30～37℃。
本发明还提供了一种酱油，采用上述制备方法获得。
本发明还提供了一种提高发酵酱油中有机酸含量的方法，包括添加上述的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616进行发酵。
在某些实施例中，所述有机酸包括苹果酸、琥珀酸和乳酸中的至少一种。
乳酸、琥珀酸、苹果酸等有机酸在一定意义上会生成脂类、醇类物质，可以增加食物的特殊风味，赋予绵长细腻口感。
经过实验测试，本发明的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616在产苹果酸的同时，还可以产生较高含量的琥珀酸和乳酸。而且经过培养发酵后的酱油中其草酸、甲酸、酒石酸含量很低，可以增加酱油的口感，而又不影响酱油的质量，感官评价较佳。
副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616可以显著提升酱油中的苹果酸的含量，同时不影响酱油中其他成分。
本发明还提供了一种发酵菌剂，包括上述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616。
本发明还提供了副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616在酱油生产过程中通过产生苯乳酸抑制污染菌的应用。所述污染菌包括枯草芽孢杆菌、小球菌、粪链球菌、毕赤氏酵母、醭酵母中的至少一种。
本发明的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616能够产生苯乳酸抑制杂菌污染，还可以增强酱油的甜酸味以及浓厚感。当副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616产生的苯乳酸含量在1.5g/L时对枯草芽孢杆菌、小球菌、醭酵母有抑菌效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616具有耐酸性较强，在pH 4.5以下仍具有较好的增殖能力等特点，将其应用于酱油生产的过程中有明显优于其他副干酪乳酸菌的苹果酸生产特性，可显著提高苹果酸含量，并且添加后不影响发酵酱油中其他成分，将其应用于酱油发酵过程，得到的酱油既保留了发酵酱油浓郁的酱香风味，又增加了酱油愉悦的酸味，口感更加酸爽，甜酸味更加丰满协调，提升了酱油的浓厚感。此外，副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616还可以产生较高含量的苯乳酸，使得生产酱油过程中可以较好地抑制杂菌污染，不影响酱油的风味。
附图说明
图1为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616在MRS平板上的菌落形态图；
图2为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616在显微镜下的形态图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规食品级试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明实施例所用试验条件为本领域常规试验条件。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。
实施例1、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的分离筛选
1、菌株的初筛
从发酵酱醪中分离筛选乳酸菌，将高盐稀态酱油加入生理盐水并梯度稀释101～106倍，并分别取100μL不同倍数稀释液涂布在MRS(含16％NaCl)固体培养基上，置于37℃培养箱中倒置培养48h。培养完成后，挑选具有典型乳酸菌菌落形态的菌株，菌落呈乳白色，菌落凸起，呈圆形，表面光滑，边缘整齐。从平板上共挑选出74株单菌落进行镜检复筛。
在显微镜下观察，筛选染色后细胞形态呈杆状、短杆或短链状，革兰氏阳性的菌株。而后将相关菌株进行多从划线纯化，共获得23株具有典型的乳酸菌形态的菌株，分别记做ZF601、ZF602、ZF603、ZF604、ZF605、ZF606、ZF607、ZF608、ZF609、ZF610、ZF611、ZF612、ZF613、ZF614、ZF615、ZF616、ZF617、ZF618、ZF619、ZF620、ZF621、ZF622和ZF623。
2、菌株的复筛
将上述初筛得到的23株菌株活化后接入液体MRS(含16％NaCl)液体培养基中，37℃培养24h，制成含有菌体的菌液。在酱醪发酵中期，即第45d接入含有菌体的菌液，菌液中菌体的浓度为1.0×108cfu/mL，菌液的接种量为2％，按照传统高盐稀态发酵工艺放入30℃～37℃静置发酵14天后，发酵结束后，获得发酵原油(根据GB18186-2000高盐稀态酱油原油制作，需经过压榨、过滤、灭菌等过程)，测定发酵原油常规指标，包括全氮、氨基酸态氮和苹果酸含量检测。
其中，全氮的含量测定参照《国家标准酿造酱油GB 18186-2000》。
氨基酸态氮的含量测定参照《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定GB5009.25-2016》。
苹果酸的含量测定参照《食品安全国家标注食品中有机酸的测定GB5009.157-2016》。
结果如表1所示。
表1发酵原油质量分析
如表1所示，选取发酵原油质量正常，全氮、氨基酸态氮和苹果酸含量高的菌株ZF603、ZF616、ZF608、ZF612、ZF617、ZF622进行感官鉴评，感官鉴评的标准如表2所示。
表2感官鉴评评分标准
感官评价结果如表3所示。
表3发酵原油感官结果
| 菌种名称 | 色泽 | 香气 | 滋味 | 综合得分 |
| ZF603 | 92 | 91 | 93 | 92 |
| ZF616 | 94 | 95 | 96 | 95 |
| ZF608 | 86 | 89 | 87 | 87 |
| ZF612 | 88 | 90 | 86 | 88 |
| ZF617 | 90 | 90 | 89 | 90 |
| ZF622 | 91 | 91 | 90 | 91 |
备注：各项指标满分为100分，得分越高表示结果越好，以上各指标的分数为10位感官鉴评师评分的平均值。
从表3的感官结果评分可得，选择感官评价结果最好的3株菌株：ZF603、ZF616、ZF622，进行遗传稳定性检测。
遗传稳定性检测：
将上述筛选的3株菌株(ZF603、ZF616和ZF622)接种至MRS固体培养基上，连续传代10代，将第1代、第5代、第10代菌株在MRS液体培养基中进行发酵，检测发酵液中苹果酸的含量，判断其遗传稳定性，若苹果酸含量在各代之间误差在10％范围以内，则表明菌株遗传稳定性良好，上述3株菌株遗传稳定性检测结果如表4所示。
表4 3株菌的遗传稳定性检测结果
从表4的结果可知，3株菌株ZF603、ZF616、ZF622不同代数发酵产生的苹果酸含量间误差在10％范围内，表明3株菌株的遗传稳定性良好。本发明综合考虑鉴评结果及遗传稳定性结果，最终选择了ZF616作为最终菌株。菌株ZF616的16S rDNA测序结果如SEQ ID NO:1所示：
CAGGATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCTTTTAGGGAGCGAGCCGTC(SEQ ID NO:1)。
经过鉴定，菌株ZF616为副干酪乳杆菌，并命名为副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616。
该菌株已于2022年8月21日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼，保藏编号为GDMCC No：62634。
实施例2、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的性能测试
1、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的耐酸性能测试：
将实施例1最终筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616在MRS固体培养基上传代2次，然后将其接种至MRS液体培养基中，液体MRS培养基用质量浓度为1.0g/L的盐酸调节pH值分别达到3.5、4.0、4.5和5.0。培养基置于37℃恒温静置培养12h，采用平板稀释法计数，参照《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验GB4789.35-2016》。涂布平板于37℃恒温静置培养48h后进行乳酸菌活菌计数。
副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616耐酸性测试结果如表5所示。
表5耐酸性测试结果
| 活菌数 | pH 3.5 | pH 4.0 | pH 4.5 | pH 5.0 |
| 0h | 2.1×105 | 2.1×105 | 2.1×105 | 2.1×105 |
| 24h | 8.4×105 | 3.7×106 | 6.8×106 | 1.6×107 |
从表5的数据可知，副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616耐酸性较强，在pH 4.5以下仍具有较好的增殖能力。
2、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的产苹果酸性能测试和感官鉴评测试：
本实施例选择实施例1筛选得到的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616及7株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)，上述7株来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)的菌株名称分别为：副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC 1.12731、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)CGMCC 1.9089、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC1.9088、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC1.574、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC 1.3107、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)CGMCC 1.2744、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC1.2468。
将上述七株副干酪乳杆菌和实施例1筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616分别在MRS固体培养基上进行活化，然后将活化后的菌株接种至MRS(含16％NaCl)液体培养基中，37℃培养24h，制成含有菌体的菌液，菌液中菌体的浓度为1.0×108cfu/ml。在酱醪发酵中期，第45d接入各菌液，菌液浓度为1.0×108cfu/mL。按照传统高盐稀态发酵工艺放入30℃～37℃静置发酵14d后，发酵结束后，获得发酵原油，并按照实施例1所述方法测定发酵原油的全氮、氨基酸态氮和苹果酸的含量，参考表2感官鉴评评分标准，测定发酵原油的感官鉴评，上述副干酪乳酸菌(Lacticaseibacillus paracasei)产苹果酸测试结果如表6所示，感官鉴评结果如表7所示。
表6副干酪乳酸菌(Lacticaseibacillus paracasei)产苹果酸测试结果
| 菌株名称 | 全氮(g/100mL) | 氨基酸态氮(g/100mL) | 苹果酸(g/L) |
| CGMCC 1.12731 | 1.08 | 0.68 | 0.09 |
| CGMCC 1.9089 | 1.09 | 0.79 | 0.35 |
| CGMCC 1.9088 | 1.26 | 0.86 | 0.43 |
| CGMCC 1.574 | 0.82 | 0.52 | 0.15 |
| CGMCC 1.3107 | 1.18 | 0.78 | 0.21 |
| CGMCC 1.2744 | 1.16 | 0.60 | 0.25 |
| CGMCC 1.2468 | 1.23 | 0.83 | 0.40 |
| ZF616 | 1.88 | 1.13 | 1.65 |
表7副干酪乳酸菌(Lacticaseibacillus paracasei)感官鉴评结果
备注：各项指标满分为100分，得分越高表示结果越好，以上各指标的分数为10位感官鉴评师评分的平均值。
从表6-7的数据可知，本发明筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616在酱油生产的过程中，有明显优于其他副干酪乳酸菌的苹果酸生产特性，可显著提高苹果酸含量。本发明筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616与其他几株副干酪乳杆菌产苹果酸性能相比，生产含量有显著优势，而且通过感官鉴评可以发现，苹果酸可以使酱油味道更加酸鲜适口，醇厚感更好，浓厚感也强，更加受到好评。
3、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616产苯乳酸的性能测试：
将实施例1中的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616活化后接入MRS(含16％NaCl)液体培养基中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成含有菌体的菌液，该菌液中菌体的浓度为1.0×108cfu/mL。
将上述菌液添加至发酵酱醪中，此时发酵酱醪已发酵45天，菌液接种量为2％。酱醪继续发酵14天，发酵结束检测样品中苯乳酸含量。
苯乳酸检测方法为高效液相色谱法(HPLC)，C18色谱柱，采用0.05％三氟乙酸(TFA)和乙腈以1ml/min洗脱，检测波长为210nm，回收率在99.88％-100.08％。
苯乳酸是一种新型小分子抗菌物质，对很多食源性致病菌，或者某些丝状真菌具有很强的抑菌作用，是一种广谱抗菌物质，且对人体无毒无害，能够很好的延长食品的保质期。为了验证苯乳酸是否对酱油中的污染杂菌具有抑制效果，本发明有针对性的选择几株酱油的常见污染菌枯草芽孢杆菌、小球菌、粪链球菌、毕赤氏酵母、醭酵母，检测苯乳酸的抑菌浓度，结果如表8所示，各污染菌株初始检测浓度为1×104cfu/ml。
表8苯乳酸对酱油中污染菌的抑制检测结果
备注：“-”表示无抑菌作用，“+”表示有抑菌效果。
从表8的数据可知，副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616产苯乳酸的效果，当苯乳酸的含量在1.5g/L时对枯草芽孢杆菌、小球菌、醭酵母有抑菌效果，说明苯乳酸对酱油污染菌是有一定的防腐作用，从而说明副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616可以抑制酱油中的污染菌。
分析实施例1筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616及副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC 1.12731、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC 1.9089、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)CGMCC 1.9088、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC1.574、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC 1.3107、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC 1.2744、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)CGMCC 1.2468产苯乳酸测试，其结果如表9所示。
表9
| 菌株名称 | 苯乳酸含量(g/L) |
| CGMCC 1.12731 | 0.72 |
| CGMCC 1.9089 | 0.03 |
| CGMCC 1.9088 | 1.84 |
| CGMCC 1.574 | 2.66 |
| CGMCC 1.3107 | 1.25 |
| CGMCC 1.2744 | 0.04 |
| CGMCC 1.2468 | 0.66 |
| ZF616 | 1.68 |
从表9的数据可知，实施例1筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616在酱油生产中也可以产生苯乳酸，相较副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)CGMCC 1.9088和副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)CGMCC 1.574来说苯乳酸含量较低，但在这7株副干酪乳杆菌中，本发明的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的苯乳酸含量还是处于较高的水平，且已经达到抑制部分酱油污染菌的浓度范围，因此本发明的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616不仅可以增强酱油的甜酸味以及浓厚感，还能够产生苯乳酸抑制杂菌污染，又不影响口味。
4、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616产其他有机酸性能测试：
酱油在发酵过程中经过复杂的生物化学变化，会产生多种有机酸，比如草酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸等，他们可以调节酱油酸味，关系到酱油的口感，影响酱油质量。
将实施例1中的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616活化后接入MRS(含16％NaCl)液体培养基中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成含有菌体的菌液，该菌液中菌体的浓度为1.0×108cfu/mL。
将上述菌液添加至发酵酱醪中，此时发酵酱醪已发酵45d，菌液的接种量为2％。酱醪继续发酵14天，发酵结束检测样品中草酸、琥珀酸、酒石酸、甲酸含量，检测结果如表10所示。
有机酸检测采用Aminex HPX-87H(300mm×7.8mm)有机酸柱，流动相为0.5mmol/L硫酸溶液，流速0.6ml/min，进样量10μL，紫外检测波长210nm，柱温30℃。
表10副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616产其他有机酸检测结果
备注：“ND”表示没有检出含有这种物质。
在酱油发酵中，乳酸，琥珀酸，苹果酸等有机酸在一定意义上会生成脂类、醇类物质，可以增加食物的特殊风味，赋予绵长细腻口感，如表10所示，实施例1筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616在产苹果酸的同时，还可以产生较高含量的琥珀酸和乳酸。而且本发明培养发酵后的酱油中其草酸，甲酸，酒石酸含量很低，所以副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616既能增加酸爽厚重的口感，又不会降低酱油质量。
实施例3
将实施例1最终筛选的的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616活化后接入MRS(含16％NaCl)液体培养基中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成含有菌体的菌液，该菌液中菌体的浓度为1.0×108cfu/mL。
将上述菌液添加至发酵酱醪中，此时发酵酱醪已发酵45天，菌液的接种量为1％。酱醪继续发酵14天，发酵结束后获得酱油原油。
实施例4
将实施例1最终筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616活化后接入MRS(含16％NaCl)液体培养基中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成含有菌体的菌液，该菌液中菌体的浓度为1.0×108cfu/mL。
将上述菌液添加至发酵酱醪中，此时发酵酱醪已发酵45d，菌液的接种量为2％。酱醪继续发酵12天，发酵结束后获得酱油原油。
实施例5
将实施例1最终筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616活化后接入MRS(含16％NaCl)液体培养基中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成含有菌体的菌液，该菌液中菌体的浓度为1.0×108cfu/mL。
将上述菌液添加至发酵酱醪中，此时发酵酱醪已发酵45d，菌液的接种量为2％。酱醪继续发酵14天，发酵结束后获得酱油原油。
实施例6
将实施例1最终筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616活化后接入MRS(含16％NaCl)液体培养基中，放入培养箱中37℃培养48h后，制成含有菌体的菌液，该菌液中菌体的浓度为1.0×108cfu/mL。
将上述菌液添加至发酵酱醪中，此时发酵酱醪已发酵45d，菌液的接种量为3％。酱醪继续发酵14天，发酵结束后获得酱油原油。
对比例1
按照传统高盐稀态发酵工艺发酵酱醪，不接种副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616作为对照例，其他发酵条件与实施例3相同。发酵结束后获得酱油原油。
上述实施例3-6及对比例1最终获得的酱油原油经过全氮、氨基酸态氮和苹果酸含量检测，具体参考实施例1，感官鉴评评分标准参考表2。
全氮、氨基酸态氮和苹果酸含量检测结果如表11所示；感官鉴评结果如表12所示。
表11酱油原油质量分析结果
| 组别 | 全氮(g/100mL) | 氨基酸态氮(g/100mL) | 苹果酸(g/L) |
| 实施例3 | 1.86 | 1.13 | 0.53 |
| 实施例4 | 1.87 | 1.15 | 0.68 |
| 实施例5 | 1.87 | 1.16 | 0.82 |
| 实施例6 | 1.88 | 1.16 | 0.93 |
| 对比例1 | 1.78 | 1.09 | 0.11 |
表12感官鉴评结果
| 组别 | 色泽 | 香气 | 滋味 | 综合得分 |
| 实施例3 | 94 | 95 | 94 | 94 |
| 实施例4 | 95 | 96 | 96 | 96 |
| 实施例5 | 97 | 98 | 98 | 98 |
| 实施例6 | 97 | 95 | 93 | 95 |
| 对比例1 | 86 | 87 | 86 | 86 |
备注：各项指标满分为100分，得分越高表示结果越好，以上各指标的分数为10位感官鉴评师评分的平均值。
从表11的数据可知，实施例3、实施例4、实施例5、实施例6的酱油原油的全氮、氨基酸态氮含量与对比例1的酱油原油相比无明显差异，而苹果酸含量由于接种副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616，相对于对比例1有显著提升。
从表12的数据可知，实施例3、实施例4、实施例5、实施例6，酱油原油的色泽、香气、滋味均优于对照例。
将实施例1筛选的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616应用于酱油生产的过程中，可显著提升酱油中苹果酸的含量，同时不影响酱油中其他成分。在实施例3至实施例6中，随着副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616添加量的增加，酱油中苹果酸的含量逐渐增加，但是当副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616添加量增大到一定程度时，由于苹果酸含量偏高，酱油滋味受到影响。因此，在使用本发明提供的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616进行酱醪发酵时，应注意副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的添加量。
综上研究表明：当菌液中菌体(副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei))的浓度为1.0×108cfu/mL、菌液的接种量为2％时，发酵酱醪效果最佳，既提高了苹果酸的含量，口感更加酸爽，甜酸味更加丰满协调，提升了酱油的浓厚感，又不会因酸味过重改变酱油风味的协调性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一株副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616，其特征在于，所述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62634，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼。
2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616在制备发酵酱油中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616在酱油发酵过程中提高苹果酸含量中的应用。
4.一种酱油的制备方法，包括以下步骤：
ⅰ)往发酵酱醪中接种含有如权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)ZF616的菌液；
ⅱ)对ⅰ)中所得酱醪继续发酵7～14天；
ⅲ)对ⅱ)中所得发酵酱醪压榨、过滤、灭菌获得酱油原油。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤ⅰ)中，所述菌液中副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616的浓度为1.0×107cfu/mL～1.0×108cfu/mL；所述菌液的接种量为1～3％。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤ⅰ)发酵酱醪发酵天数为41d～49d；步骤ⅱ)发酵的温度为30～37℃。
7.一种酱油，其特征在于，所述酱油采用如权利要求4至6中任一项所述的制备方法制得。
8.一种提高发酵酱油中有机酸含量的方法，其特征在于，包括添加权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616进行发酵；所述有机酸包括苹果酸、琥珀酸和乳酸中的至少一种。
9.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)ZF616在酱油生产过程中抑制污染菌的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述污染菌包括枯草芽孢杆菌、小球菌、粪链球菌、毕赤氏酵母、醭酵母中的至少一种。
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