CN116367854A - 针对hbv的rna复制子疫苗 - Google Patents

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Abstract

本申请描述编码乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原、HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原的核酸分子以及相应组合。本申请还描述表达HBV抗原的载体，如DNA质粒或病毒载体和RNA复制子，以及包含表达载体的药物组合物。本申请还描述使用本发明的药物组合物来诱导针对HBV的免疫应答或者治疗HBV诱导的疾病的方法，特别在患有慢性HBV的个体中。

Description

针对HBV的RNA复制子疫苗
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月8日提交的美国临时专利申请号63/049,400以及2021年2月1日提交的美国临时专利申请号63/144,051的优先权，其公开内容整体援引加入本文。
电子提交的序列表的引用
本申请包含通过EFS-Web电子提交的ASCII序列表格式的序列表，文件名为“TIP1088WOPCT1-Sequence_Listing”，生成日期为2021年6月24日，大小为390KB。通过EFS-Web提交的序列表为说明书的一部分，并且整体援引加入本文。
技术领域
本公开整体上涉及分子生物学和遗传工程领域，包括用于调节基因表达的核酸分子以及核酸分子例如用于在细胞培养中的合适宿主细胞或受试者中产生期望产物和赋予宿主细胞或受试者有益特征的用途。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)是一种小的3.2-kb的嗜肝DNA病毒，编码四个开放阅读框和七种蛋白。约有20亿人感染有HBV，并且约有2.4亿人患有慢性乙型肝炎感染(慢性HBV)，其特点是血液中持续存在病毒和亚病毒颗粒超过6个月(Cohen et al.J.Viral Hepat.(2011)18(6)，377-83)。持续的HBV感染通过病毒肽和循环抗原对HBV特异性T细胞受体的慢性刺激，导致循环和肝内HBV特异性CD4+和CD8+T细胞的T细胞衰竭。因此，T细胞的多功能性下降(即IL-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α、IFN-γ的水平下降，以及缺乏增殖)。
自20世纪80年代以来，一种安全有效的针对HBV感染的预防性疫苗已经问世，并且是乙型肝炎预防的主流(World Health Organization，Hepatitis B：Fact sheet No.204；2015 March)。世界卫生组织建议为所有婴儿接种疫苗，在乙型肝炎低度或中度流行的国家，为所有婴儿和儿童及青少年(<18岁)，以及某些高危人群接种疫苗。由于接种疫苗，全世界的感染率已大幅下降。然而，预防性疫苗并不能治愈已形成的HBV感染。
目前用IFN-α和核苷或核苷酸类似物治疗慢性HBV，但由于感染的肝细胞内持续存在称为共价闭合环状DNA(cccDNA)的细胞内病毒复制中间物，它作为病毒RNA的模板起着基本作用，因此也是新的病毒体，因而无法彻底治愈。据认为，诱导的病毒特异性T细胞和B细胞应答可以有效地消除携带cccDNA的肝细胞。目前靶向HBV聚合酶的疗法抑制病毒血症，但对驻留在细胞核中的cccDNA和相关的循环抗原的产生作用有限。最严格的治愈形式可能是消除机体中的HBV cccDNA，这既不是观察到的自然发生的结果，也不是任何治疗性干预的结果。然而，HBV表面抗原(HBsAg)的丧失在临床上认为相当于治愈，因为只有在严重免疫抑制的情况下才会出现疾病复发，这然后可以通过预防性治疗来预防。因此，至少从临床角度来看，HBsAg的丧失与最严格形式的抗HBV的免疫重建形式有关。
例如，用聚乙二醇干扰素(pegIFN)-α进行免疫调节，据证实，与核苷或核苷酸治疗相比，在有限的治疗过程中获得持续的非治疗应答方面是更好的。除了直接的抗病毒作用，IFN-α据报道在细胞培养和人源化小鼠中对cccDNA施加表观遗传抑制，从而导致病毒生产力和转录物的减少(Belloni et al.J.Clin.Invest.(2012)122(2)，529-537)。然而，这种疗法仍然充满了副作用，而且总体应答相当低，部分地是因为IFN-α对HBV特异性T细胞仅有较差的调节影响。特别是，治愈率低(<10％)并且毒性高。同样，直接作用的HBV抗病毒药物，即HBV聚合酶抑制剂恩替卡韦和替诺福韦，作为单一疗法有效地诱导病毒抑制，对耐药突变体的出现具有高遗传屏障，并且连续预防肝病进展。然而，用这样的HBV聚合酶抑制剂很少实现治愈慢性乙型肝炎，所述治愈以HBsAg丧失或血清转换所定义。因此，这些抗病毒药物理论上需要无限期地给药，以防止肝病的复发，类似于人免疫缺陷病毒(HIV)的抗逆转录病毒疗法。
治疗性疫苗接种有可能消除慢性感染患者的HBV(Michel et al.J.Hepatol.(2011)54(6)，1286-1296)。已经探索了许多策略，但迄今为止，治疗性疫苗接种尚未证明成功。
发明内容
因此，在治疗乙型肝炎病毒(HBV)，特别是慢性HBV方面，存在着未得到满足的医疗需求，需要具有较高治愈率的有限的良好耐受性。本发明通过提供用于诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)感染的免疫应答的免疫原性组合物和方法来满足这一需求。本发明的免疫组合物和方法可用于向受试者，如患有慢性HBV感染的受试者提供治疗性免疫。
在一整体方面，本申请涉及一种核酸分子或组合，其包含非天然存在的多核苷酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多核苷酸序列包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码第一乙型肝炎病毒(HBV)抗原的多核苷酸序列；
(2)第一内部核糖体进入序列(IRES)元件或者编码第一自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；以及
编码第二HBV抗原的多核苷酸序列。
其中第一HBV抗原和第二HBV抗原各自独立地选自HBV核心抗原、HBV聚合酶(pol)抗原和HBV表面抗原，并且第一HBV抗原和第二HBV抗原中的至少一个是HBV表面抗原，优选HBV Pre-S1抗原或HBV PreS2.S抗原。
在一实施方案中，第一HBV抗原或第二HBV抗原中的一个为HBV核心抗原或HBV pol抗原。
在一实施方案中，非天然存在的多核苷酸序列还包含，从5’-端至3’-端排列：
(4)第二IRES元件或者编码第二自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，其可操作地连接至编码第二HBV抗原的多核苷酸序列的3’端；和
(5)编码第三HBV抗原的多核苷酸序列，所述第三HBV抗原独立地选自HBV核心抗原、HBV pol抗原和HBV表面抗原。
在另一实施方案中，非天然存在的多核苷酸序列还包含，从5’-端至3’-端排列：
(6)第三IRES元件或者编码第三自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，其可操作地连接至编码第三HBV抗原的多核苷酸序列的3’端；和
(7)编码第四HBV抗原的多核苷酸序列，所述第四HBV抗原独立地选自HBV核心抗原、HBV pol抗原和HBV表面抗原。
在另一实施方案中，所述核酸分子或组合包含
第一非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码第一乙型肝炎病毒(HBV)抗原的多核苷酸序列；
(2)第一内部核糖体进入序列(IRES)元件或者编码第一自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；和
(3)编码第二HBV抗原的多核苷酸序列；以及
第二非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码第三乙型肝炎病毒(HBV)抗原的多核苷酸序列；
(2)第二内部核糖体进入序列(IRES)元件或者编码第二自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；和
(3)编码第四HBV抗原的多核苷酸序列，
其中第一非天然存在的多核苷酸序列和第二非天然存在的多核苷酸序列通过第三内部核糖体进入序列(IRES)元件或者编码第三自体蛋白酶肽的多核苷酸序列连接，或者存在于不同的核酸分子中，并且
其中第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原独立地选自HBV核心抗原、HBV聚合酶(pol)抗原和HBV表面抗原，第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的至少一个是选自以下的HBV表面抗原：具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列的HBVPre-S1抗原和具有与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列的HBVPreS2.S抗原，优选地，第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原或第四HBV抗原中的一个为HBV核心抗原或HBV pol抗原。
在另一实施方案中，第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个互相不同。
在另一实施方案中，第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(i)第一HBV pre-S1抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(ii)第二HBV Pre-S1抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iii)HBV PreS2.S抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iv)HBV核心抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQID NO：7至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；和
(v)HBV聚合酶抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQID NO：9至少90％相同的氨基酸序列，例如与SED ID NO：9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，
优选地，第一HBV Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBV pol抗原中的每一个独立地可操作地连接至信号肽，并且HBV PreS2.S抗原包含内部信号肽。
在一些实施方案中，HBV核心抗原包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：84、85或86中的至少一个至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：84、85或86至少98％、至少99％或100％相同。在一些实施方案中，HBV核心抗原的最后5个C末端氨基酸包含VVR氨基酸序列，更特别地VVRR(SEQ ID NO：91)氨基酸序列，更特别地VVRRR(SEQ ID NO：92)氨基酸序列。
在一些实施方案中，HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV pol抗原中的每一个包含：
(i)HBV基因型A、B、C和D的共有序列；和/或
(ii)HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*02:01、HLA-A*A2402、HLA-A*A0101或HLA-B*40:01的一个或多个表位。
在一些实施方案中，HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV pol抗原中的每一个包含HLA-A*11:01的一个或多个表位。
在另一实施方案中，第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(i)第一HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成；
(ii)第二HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成；
(iii)HBV PreS2.S抗原，其由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成；
(iv)HBV核心抗原，其由SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成；和
(v)HBV pol抗原，其由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成，
优选地，第一HBV pre-S1抗原和第二HBV pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBV pol抗原中的每一个独立地可操作地连接至信号肽，例如包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的信号肽。
在另一实施方案中，编码第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：
(i)编码第一HBV pre-S1抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：2至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(ii)编码第二HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：4至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iii)编码HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：6至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：6至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iv)编码HBV核心抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：8至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；以及
(v)编码HBV pol抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：10至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，
优选地，编码第一HBV Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBVpol抗原中的每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列，并且HBV PreS2.S抗原包含内部信号肽。
在一些实施方案中，编码第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：
(i)编码第一HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：2的序列组成；
(ii)编码第二HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：4的序列组成；
(iii)编码HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：6的序列组成；
(iv)编码HBV核心抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQID NO：89中任一个的序列组成；以及
(v)编码HBV pol抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：10的序列组成，
优选地，编码第一Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBV pol抗原中的每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸，例如包含SEQ ID NO：90的序列的多核苷酸。
在一实施方案中，第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个独立地包含选自以下的肽序列：猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1 2A(P2A)、***病毒(foot-and-mouth disease virus)(FMDV)2A(F2A)、马鼻炎A病毒(EquineRhinitis A Virus)(ERAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒(Thosea adingna virus)2A(T2A)、质型多角体病毒(cytoplasmic polyhedrosis virus)2A(BmCPV2A)、软化病病毒(FlacherieVirus)2A(BmIFV2A)及其组合。优选地，第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个包含P2A的肽序列，例如SEQ ID NO：11的P2A序列。
在另一实施方案中，第一IRES、第二IRES和第三IRES中的每一个源自脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)(EMCV)或肠道病毒71(Enterovirs71)(EV71)。优选地，第一IRES、第二IRES和第三IRES中的每一个包含SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述核酸分子或组合包含非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(2)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(3)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(4)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(5)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(6)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ IDNO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(7)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBVPre-S1抗原的多核苷酸序列；
(8)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBVPre-S1抗原的多核苷酸序列；
(9)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：11或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(10)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(11)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(12)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBVPre-S1抗原的多核苷酸序列；
(13)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(14)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(15)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(16)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(17)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(18)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(19)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(20)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(21)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；或者
(22)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，
优选地，编码第一HBV Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBVpol抗原中每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列，例如包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的信号肽。
在一实施方案中，所述核酸分子或组合包含SEQ ID NO：15-54中任一个的非天然存在的多核苷酸序列。
在另一整体的方面，本申请涉及一种载体，其包含本申请的核酸分子或组合。
在一实施方案中，载体为DNA质粒。在另一实施方案中，载体为DNA病毒载体或RNA病毒载体。在一实施方案中，载体为修饰的安卡拉痘苗病毒(Modified Vaccinia Ankara)(MVA)载体或腺病毒载体。在一实施方案中，载体为Ad26、Ad35或MVA-BN载体。
在另一整体的方面，本申请涉及一种RNA复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的5’非翻译区(5’-UTR)；
(2)编码RNA病毒的至少一种、优选全部非结构蛋白的多核苷酸序列；
(3)RNA病毒的亚基因组启动子；
(4)本申请的核酸分子或组合；以及
(5)非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的3’非翻译区(3’-UTR)。
在另一整体的方面，本申请涉及一种RNA复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)甲病毒5’非翻译区(5’-UTR)；
(2)甲病毒非结构基因nsp1的5’复制序列；
(3)病毒种的下游环(DLP)基序；
(4)编码第四自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；
(5)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的核苷酸序列；
(6)甲病毒亚基因组启动子；
(7)本申请的核酸分子或组合；
(8)甲病毒3′非翻译区(3′UTR)；以及
(9)任选地，多腺苷酸序列。
在一实施方案中，DLP基序来自选自以下的病毒种：东部马脑炎病毒(Easternequine encephalitis virus)(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus)(VEEV)、沼泽地病毒(Everglades virus)(EVEV)、穆坎布病毒(Mucambo virus)(MUCV)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest viris)(SFV)、那皮舒纳病毒(Pixuna virus)(PIXV)、米德堡病毒(Middleburg virus)(MTDV)、奇昆古尼亚病毒(Chikungunya virus)(CHIKV)、阿尼昂-尼昂病毒(O'Nyong-Nyong virus)(ONNV)、罗斯河病毒(Ross River virus)(RRV)、巴马森林病毒(Barmah Forest virus)(BF)、盖塔病毒(Getah virus)(GET)、鹭山病毒(Sagiyama virus)(SAGV)、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)(BEBV)、马雅罗病毒(Mayaro virus)(MAYV)、乌纳病毒(Unavirus)(UAV)、辛德毕斯病毒(Sindbis virus)(SINV)、奥拉病毒(Aura virus)(AURAV)、沃达罗河病毒(Whataroavirus)(WHAV)、巴班肯病毒(Babanki virus)(BABV)、库孜拉加奇病毒(Kyzylagach virus)(KYZV)、西部马脑炎病毒(Western equine encephalitis virus)(WEEV)、高地J病毒(Highland J virus)(HJV)、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)(FMV)、恩杜穆病毒(Ndumu)(NDUV)和博吉河病毒(Buggy Creek virus)。
在另一实施方案中，第四自体蛋白酶肽选自猪捷申病毒-1 2A(P2A)、***病毒(FMDV)2A(F2A)、马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV2A)、软化病病毒2A(BmIFV2A)及其组合。优选地，第四自体蛋白酶肽包含P2A的肽序列。
在另一整体的方面，本申请涉及一种RNA复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)具有SEQ ID NO：55的多核苷酸序列的5’-UTR；
(2)具有SEQ ID NO：56的多核苷酸序列的5’复制序列；
(3)包含SEQ ID NO：57的多核苷酸序列的DLP基序；
(4)编码SEQ ID NO：11的P2A序列的多核苷酸序列；
(5)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的多核苷酸序列，其分别具有SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61的核酸序列；
(6)具有SEQ ID NO：62的多核苷酸序列的亚基因组启动子；
(7)本申请的核酸分子或组合；以及
(8)具有SEQ ID NO：63的多核苷酸序列的3′UTR。
在一实施方案中，编码P2A序列的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：12，所述核酸分子或组合包含SEQ ID NO：15-54中任一个的多核苷酸序列，并且RNA复制子在复制子的3’-端还包含多腺苷酸序列。优选地，多腺苷酸序列具有SEQ ID NO：64的序列。
在另一整体的方面，本申请涉及一种RNA复制子，其包含SEQ ID NO：65-72中任一个的多核苷酸序列。
在另一整体的方面，本申请涉及一种核酸分子，其包含编码本申请的RNA复制子的多核苷酸序列。
优选地，所述核酸还包含可操作地连接至DNA序列的5’-端的T7启动子。更优选地，T7启动子包含SEQ ID NO：73的核苷酸序列。
在另一整体的方面，本申请涉及一种药物组合物，其包含本申请的核酸分子或组合、载体或者RNA复制子，以及药学可接受的载剂。
在一实施方案中，药学可接受的载剂包含脂质纳米颗粒，优选地，脂质纳米颗粒包含以下的一种或多种：ALC-0315、DOTMA、DOTAP、DDAB、DOGS、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA、DLin-M-C3-DMA、DLin-MP-DMA或DCChol。
在另一实施方案中，药物组合物还包含：(1)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ IDNO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；或者(2)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列。
在另一整体的方面，本申请涉及一种用于针对HBV对受试者进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者给药本申请的药物组合物。在一实施方案中，所述方法还包括向受试者给药第二组合物作为初免-加强方案，所述第二组合物包含编码至少一种相同HBV抗原的核酸分子或组合。在一些实施方案中，初免-加强方案包括初免组合物和加强组合物，所述初免组合物包含本申请的RNA复制子，所述加强组合物包含载体，所述载体不是RNA复制子，并且编码与所述初免组合物相同的至少一种HBV表位，优选与所述初免组合物相同的至少一种HBV抗原。在一实施方案中，加强组合物包含修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、腺病毒载体或质粒载体。在一些实施方案中，加强组合物包含Ad26、Ad35或MVA-BN载体。在一些实施方案中，初免-加强方案包括加强组合物和初免组合物，所述加强组合物包含本申请的RNA复制子，所述初免组合物包含载体，所述载体不是RNA复制子，并且编码与所述加强组合物相同的至少一种HBV表位，例如与所述加强组合物相同的至少一种HLA表位，优选与所述加强组合物相同的至少一种HBV抗原。在一实施方案中，初免组合物包含修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、腺病毒载体或质粒载体。在一些实施方案中，初免组合物包含Ad26、Ad35或MVA-BN载体。
在另一整体的方面，本申请涉及一种用于减少受试者中的HBV感染和/或复制的方法，其包括向所述受试者给药本申请的药物组合物，或者根据本申请的方法疫苗接种所述受试者。
在另一整体的方面，本申请涉及一种分离的宿主细胞，其包含本申请的核酸分子或组合、载体或者RNA复制子。
在另一整体的方面，本申请涉及一种制备RNA复制子的方法，其包括体内或体外转录本申请的核酸。
在另一整体的方面，本申请涉及本申请的药物组合物，用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，任选地联合另一免疫原性剂，优选另一抗HBV剂。
在另一整体的方面，本申请涉及本申请的药物组合物，用于治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(HBV)诱导的疾病，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，并且HBV-诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)，任选地联合另一治疗剂，优选另一抗HBV剂。
可以从以下公开内容明显看出本发明的其他方面、特征和优点，包括对本发明及其优选实施方案的详细描述和所附权利要求。
附图说明
当结合附图阅读时，会更好地理解上述概述以及本发明的以下详细描述。应当理解，本发明不限于附图中所示的具体实施方案。
图1A示出抗原设计的示意图，其包括具有失活的点突变的Pol、具有C末端缺失的截短核心(SEQ ID NO：76)、PreS2.S和显示胱抑素S信号肽(SEQ ID NO：77)的PreS1。
图1B示出双顺反子和四顺反子疫苗设计的示意图。
图2是一系列图，其示出来自前4个双顺反子疫苗设计和前4个四顺反子疫苗设计的HBV抗原的相对表达。通过流式细胞术测量核心、PreS2.S和PreS1在Vero细胞中的表达，并报道为相对于单基因对照的MFI。通过蛋白印迹测量Pol表达，并通过光密度测定法确定相对表达。
图3是一系列图，其示出来自三顺反子疫苗设计的HBV抗原的相对表达。通过流式细胞术测量核心和PreS2.S在Vero细胞中的表达，并报道为相对于单基因对照的MFI。通过蛋白印迹测量Pol表达，并通过光密度测定法确定相对表达。
图4A-图4D是示出用SMARRT复制子编码的HBV抗原进行体内免疫的结果的图。C57BL/6小鼠肌内(i.m.)注射SMARRT复制子编码的单基因HBV抗原或者是混合的(admix)HBV抗原。注射盐水作为对照组。初免后(post-prime)14天收获脾脏，并用核心(图4A)、Pol(图4B)、PreS2.S(图4C)和PreS1(图4D)的重叠肽池重新刺激脾细胞。通过ELISpot测量产生IFNγ的细胞数量。图中示出具有95％ CI的平均值(n＝5只小鼠/组)，用Mann-Whitney检验进行统计学比较，*p<0.05；**p<0.01。
图5A-图5H是示出用SMARRT复制子编码的HBV抗原进行体内免疫和第2周再刺激的结果的图。C57BL/6小鼠i.m.注射SMARRT复制子编码的单基因HBV抗原或是混合的HBV抗原。注射盐水作为对照组。初免后14天，收获脾脏，并用核心(图5A和图5E)、Pol(图5B和图5F)、PreS2.S(图5C和图5G)和PreS1(图5D和图5H)的重叠肽池在布雷菲德菌素A存在下再刺激脾细胞6小时。通过细胞内细胞因子染色测量CD4和CD8 T细胞产生的IFNγ、TNFα和IL-2。根据每个细胞产生的1(IFNγ+)、2(IFNγ+TNFα+)或3(IFNγ+TNFα+IL-2+)细胞因子来对多功能性作图。图显示具有SD的平均值(n＝5只小鼠/组)。
图6A-图6D是示出用SMARRT复制子编码的HBV抗原进行体内免疫的结果的图。C57BL/6小鼠i.m.注射SMARRT复制子编码的单基因HBV抗原或混合的HBV抗原、双基因抗原或四顺反子构建体。注射盐水作为对照组。初免后14天收获脾脏，并用核心(图6A)、Pol(图6B)、PreS2.S(图6C)和PreS1(图6D)的重叠肽池再刺激脾细胞。通过ELISpot测量产生IFNγ的细胞数量。图中示出具有95％CI的平均值(n＝5只小鼠/组)。
图7A-图7D是示出用SMARRT复制子编码的HBV抗原进行体内免疫和第2周再刺激的结果的图。C57BL/6小鼠i.m.注射SMARRT复制子编码的单基因HBV抗原或混合的HBV抗原、双基因抗原或四顺反子构建体。注射盐水作为对照组。初免后14天，收获脾脏，并用核心(图7A)、Pol(图7B)、PreS2.S(图7C)和PreS1(图7D)的重叠肽池在布雷菲德菌素A存在下再刺激脾细胞6小时。过细胞内细胞因子染色测量CD4和CD8T细胞产生的IFNγ、TNFα和IL-2通。根据每个细胞产生的1(IFNγ+)、2(IFNγ+TNFα+)或3(IFNγ+TNFα+IL-2+)细胞因子来对多功能性作图。图显示具有SD的平均值(n＝5只小鼠/组)。
具体实施方式
在背景和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一篇整体援引加入本文。已经包括在本说明书中的文件、法案、材料、装置、文章等的讨论是用于提供本发明的上下文的目的。这样的讨论并非承认任何或所有这些内容形成关于公开或要求保护的任何发明的现有技术的一部分。
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。否则，本文使用的某些术语具有如在说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公开的专利申请和出版物都援引加入本文，如同在本文中充分阐述。
必须指出，如在本文中和在所附权利要求书中所使用的，单数形式“一种”、“一个”和“这个”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指明。
除非另有说明，任何数值，如本文所述的％序列相同性或％序列相同性范围，在所有情况下应理解为由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所列举值的±10％。例如，10mg的剂量包括9mg-11mg。如本文中使用的，数值范围的使用明确包括所有可能的子范围、在该范围内的所有单个数值，包括在这样的范围内的整数和值的分数，除非上下文另外清楚地指出。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”理解为涵盖单独的和组合的选项。例如，当两个要素由“和/或”连接时，第一种选项表示在没有第二个要素的情况下第一个要素的适用性。第二种选项表示在没有第一个要素的情况下第二个要素的适用性。第三种选项表示第一个要素和第二个要素一起的适用性。这些选项中的任何一个都理解为落入其含义内，且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。超过一个选项的同时适用性也被理解为落入该含义内，且因此满足术语“和/或”的要求。
除非另有说明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为表示该系列中的每个要素。本领域技术人员会认识到或仅仅使用常规实验就能够确定许多与本文所述的本发明的具体实施方案等同的方案。这样的等同方案意图为本发明涵盖。
在本说明书和所附的权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包含(comprise)”和变体诸如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组，但是不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”替代，或者有时当在本文中使用时可以用术语“具有”替代。
当在本文中使用时，“由……组成”排除在要求保护的要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由……组成”不排除对权利要求的基本和新颖特征没有实质性影响的材料或步骤。无论何时在本文中使用时在本发明的一个方面或实施方案的上下文中，前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”中的任一个可以用术语“由……组成”或“基本上由……组成”替换以改变本公开内容的范围。
如本文所用，“表位”为一组氨基酸残基，其形成免疫球蛋白、T细胞受体或人白细胞抗原(HLA)所识别的位点。
HLA蛋白由基因簇编码，所述基因簇形成位于6号染色体上称为主要组织相容性复合体(MHC)的区域，以识别MHC基因座所编码的蛋白在移植排斥中的重要作用。因此，HLA蛋白也称为MHC蛋白。HLA或MHC蛋白是细胞表面糖蛋白，其在细胞内位置与肽结合，并将肽递送到细胞表面，在那里结合的配体被T细胞识别。I类MHC蛋白几乎在身体所有的有核细胞上都能找到。I类MHC蛋白与存在于胞质溶胶(cytosol)中的肽结合，并形成肽-MHC蛋白复合物，其呈现在细胞表面，在那里它们被细胞毒性CD8+T细胞识别。II类MHC蛋白通常只在抗原呈递细胞上发现，如B淋巴细胞、巨噬细胞和树突细胞。每个MHC I类受体由可变的α链和相对保守的β2-微球蛋白链组成。已鉴定三个不同的、高度多态的I类α链基因。这些基因被称为HLA-A、HLA-B和HLA-C。α链中的变异占人群中所有不同的I类MHC基因。
在使用参考氨基酸序列时，短语“序列相同性百分比(％)”或“％相同性”或“与……％相同”描述与构成氨基酸序列的总长度的氨基酸残基的数目相比两个或更多个比对的氨基酸序列中相同的氨基酸的匹配(“命中”)数目。换句话说，使用比对，对于两个或更多个序列，当对序列进行对比和比对以获得最大对应时，如使用本领域已知的序列对比算法所测量的，或者当手工比对和目视检查时，可以确定相同的氨基酸残基的百分比(例如在氨基酸序列的全长上，90％、91％、92％、93％、94％、95％、97％、98％、99％或100％相同性)。对核苷酸序列可以进行相同的确定。进行对比以确定序列相同性的序列因此可能因氨基酸的取代、添加或缺失而不同。用于比对蛋白序列的合适程序是技术人员已知的。例如，用诸如CLUSTALW、Clustal Omega、FASTA或BLAST的程序，例如使用NCBI BLAST算法(Altschul SF，et al(1997)，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，可以确定蛋白序列的序列相同性百分比。
如本文所用，在向受试者给药两种或更多种疗法或组分的上下文中，术语和短语“联合”、“与……联合”、“共同递送”和“与……一起给药”表示同时给药两种或更多种疗法或组分，例如两种核酸分子，如RNA复制子，或者免疫原性组合物和佐剂。“同时给药”可以是至少在同一天内给药两种组分。当两种组分“与……一起给药”或“与……联合给药”时，它们可以在短时间段内例如24、20、16、12、8或4小时或在1小时内在分开的组合物中依次施用，或者它们可以同时在单一组合物中施用。术语“与……联合”的使用不限制对受试者给药疗法或组分的顺序。例如，可以在给药第二疗法或组分(例如，第二核酸分子)之前(例如，之前5分钟至1小时)、伴随地或同时地，或之后(例如，之后5分钟至1小时)给药第一疗法或组分(例如，第一核酸分子)。在一些实施方案中，在相同组合物中给药第一疗法或组分(例如，第一核酸分子)和第二疗法或组分(例如，第二核酸分子)。在其他实施方案中，在分开的组合物中给药第一疗法或组分(例如，第一核酸分子)和第二疗法或组分(例如，第二核酸分子)。
如本文所用，“非天然存在的”核酸或多肽表示在自然界中不存在的核酸或多肽。可以在实验室和/或制造环境中合成、处理、制造和/或以其他方式操作“非天然存在的”核酸或多肽。在一些情况下，非天然存在的核酸或多肽可以包含天然存在的核酸或多肽，其经处理、加工或操作以表现出在处理之前在天然存在的核酸或多肽中不存在的特性。如本文所用，“非天然存在的”核酸或多肽可以是从发现它的天然来源分离或分开的核酸或多肽，并且其缺乏与它在天然来源中相关联的序列的共价键。可以重组地制备或通过其他方法(如化学合成)制备“非天然存在的”核酸或多肽。
如本文所用，术语“可操作地连接”表示连接或并置(juxtaposition)，其中如此描述的组件处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。例如，可操作地连接至感兴趣的核酸序列的调节序列能够指导感兴趣的核酸序列的转录，或者可操作地连接至感兴趣的氨基酸序列的信号序列能够跨膜分泌或转移(translocate)感兴趣的氨基酸序列。
如本文所用，“初免组合物”、“初免免疫”或“初次免疫”指使用本发明的第一组合物进行初级抗原刺激。具体地，如本文所用的术语“初免(priming)”或“引发(potentiating)”免疫应答，指使用抗原的第一免疫，其诱导对期望抗原的免疫应答，并在后续用相同抗原再免疫时唤起(recall)对期望抗原更高水平的免疫应答。如本文所用，术语“加强组合物”、“加强免疫”或“增强免疫”指在初级免疫后，向哺乳动物给药的额外免疫或在其中有效的额外免疫。具体地，如本文所用的术语“加强”免疫应答指给药递送与初免免疫中所编码的相同抗原的组合物。
如本文所用，“受试者”表示任何动物，优选哺乳动物，最优选人，其将被或已经被根据本申请的一个实施方案的方法治疗。如本文所用的术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括，但不限于，牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、非人灵长类动物(NHP)如猴或猿、人等，更优选人。人受试者可以包括患者。
为了帮助本申请的读者，说明书已分成多个段落或部分，或涉及本申请的各种实施方案。这些分离不应被视为将段落或部分或实施方案的内容与另一段落或部分或实施方案的内容断开。相反，本领域技术人员会理解，该描述具有广泛的应用并且涵盖了可以考虑的各个部分、段落和句子的所有组合。任何实施方案的讨论意图仅仅是示例性的，并且无意提示本公开内容(包括权利要求)的范围限于这些实施例。例如，虽然本文描述的本申请的甲病毒复制子RNA的实施方案可以包含特定组分，包括、但不限于，以特定顺序排列的某些启动子序列、增强子或调节序列、信号肽、HBV抗原的编码序列、多腺苷酸化信号序列等，本领域普通技术人员会明白，本文公开的概念同样可以适用于以其他顺序排列的可用于本申请的甲病毒复制子RNA中的其他组分。本申请考虑在具有可用于本申请的甲病毒复制子的任何序列的任何组合中使用任何适用组分，无论是否明确描述了特定组合。
乙型肝炎病毒(HBV)
本文所用的“乙型肝炎病毒”或“HBV”是指嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridaefamily)的一种病毒。HBV是一种小型(如3.2kb)的嗜肝DNA病毒，其编码四个开放阅读框和七种蛋白。HBV编码的七种蛋白包括小(S)、中(M)和大(L)表面抗原(HBsAg)或包膜(Env)蛋白、前核心(pre-Core)蛋白、核心(core)蛋白、病毒聚合酶(Pol)和HBx蛋白。HBV表达三种表面抗原或包膜蛋白，L、M和S，其中S是最小的，L是最大的。M和L蛋白中的额外结构域分别称为Pre-S2和Pre-S1。核心蛋白是病毒核衣壳的亚基。Pol是合成病毒DNA(逆转录酶、核糖核酸酶H(RNaseH)和引物)所需的，它发生在定位于受感染肝细胞的细胞质的核衣壳中。PreCore是具有N末端信号肽的核心蛋白，并且在从感染细胞分泌之前，在其N末端和C末端进行蛋白水解加工为所谓的乙型肝炎e-抗原(HBeAg)。HBx蛋白是共价闭合环状DNA(cccDNA)的有效转录所必需的。HBx不是病毒结构蛋白。除共享mRNA的核心和聚合酶外，HBV的所有病毒蛋白都有自身的mRNA。除前核心蛋白外，HBV病毒蛋白都不进行翻译后蛋白水解加工。
HBV病毒体(virion)包含病毒包膜、核衣壳以及部分双链DNA基因组的单拷贝。核衣壳包含120个核心蛋白二聚体，并且由嵌有S、M和L病毒包膜或表面抗原蛋白的衣壳膜覆盖。进入细胞后，病毒成为未包裹的，并且含有松弛环状DNA(rcDNA)的衣壳与共价结合的病毒聚合酶迁移到细胞核。在这个过程中，核心蛋白的磷酸化诱导结构变化，暴露出核定位信号，使衣壳与所谓的输入蛋白相互作用。这些输入蛋白介导核心蛋白与核孔复合物的结合，然后衣壳分解，并且聚合酶/rcDNA复合物被释放到细胞核内。在细胞核内，rcDNA变为去蛋白化(去除聚合酶)，并被宿主DNA修复机制转化为共价闭合环状DNA(cccDNA)基因组，重叠的转录物从中编码HBeAg、HBsAg、核心蛋白、病毒聚合酶和HBx蛋白。核心蛋白、病毒聚合酶和前基因组RNA(pgRNA)在细胞质中缔合，并自组装成含有pgRNA的未成熟衣壳颗粒，其进一步转化为成熟的rcDNA-衣壳，并充当共同的中间物，其被封装并作为感染病毒颗粒分泌，或者运回细胞核以补充和维持稳定的cccDNA池。
迄今为止，HBV基于包膜蛋白上存在的抗原表位被分为四个血清型(adr、adw、ayr、ayw)，并且基于病毒基因组的序列被分为八个基因型(A、B、C、D、E、F、G和H)。HBV基因型分布在不同的地理区域。例如，在亚洲最普遍的基因型是基因型B和C。基因型D在非洲、中东和印度占主导地位，而基因型A则在北欧、撒哈拉以南非洲和西非广泛分布。
HBV抗原
如本文所用，术语“HBV抗原”、“HBV的抗原性多肽”、“HBV抗原性多肽”、“HBV抗原性蛋白”、“HBV免疫原性多肽”和“HBV免疫原”都表示能够在受试者中诱导针对HBV的免疫应答的多肽。诱导的免疫应答可以是体液和/或细胞介导的应答。HBV抗原可以是HBV的多肽、其片段或表位、或多种HBV多肽、其部分或衍生物的组合。HBV抗原能够在宿主中产生保护性免疫应答，例如，诱导针对病毒性疾病或感染的免疫应答，和/或在受试者中产生针对病毒性疾病或感染的免疫(即，接种疫苗)，其保护受试者免受病毒性疾病或感染。例如，HBV抗原可以包含来自任何HBV蛋白的多肽或其免疫原性片段，如HBeAg、前核心蛋白、HBsAg(S、M或L蛋白)、核心蛋白、病毒聚合酶或从任何HBV基因型(例如，基因型A、B、C、D、E、F、G和/或H或其组合)衍生的HBx蛋白。
(1)HBV核心抗原
如本文所用，术语“HBV核心抗原”、“HBcAg”和“核心抗原”中的每一个表示能够在受试者中诱导针对HBV核心蛋白的免疫应答的HBV抗原。诱导的免疫应答可以是体液和/或细胞介导的应答。术语“核心”、“核心多肽”和“核心蛋白”中的每一个指HBV病毒核心蛋白。全长核心抗原通常为183个氨基酸的长度，并且包括组装结构域(氨基酸1-149)和核酸结合结构域(氨基酸150-183)。前基因组RNA衣壳化需要34-残基核酸结合结构域。这个结构域还作为核输入信号起作用。它包含17个精氨酸残基并且是高碱性的，这与其功能一致。HBV核心蛋白在溶液中是二聚体，所述二聚体自组装成二十面体衣壳。核心蛋白的每个二聚体具有四个α-螺旋束，在任一侧侧接α-螺旋结构域。缺乏核酸结合结构域的截短的HBV核心蛋白也能够形成衣壳。
在本申请的一实施方案中，HBV抗原是截短的HBV核心抗原。如本文所用，“截短的HBV核心抗原”表示不含有HBV核心蛋白的整个长度但能够在受试者中诱导针对HBV核心蛋白的免疫应答的HBV抗原。例如，可以修饰HBV核心抗原以缺失核心抗原的高度带正电荷的(富含精氨酸的)C-末端核酸结合结构域的一个或多个氨基酸，所述C-末端核酸结合结构域通常含有17个精氨酸(R)残基。本申请的截短的HBV核心抗原优选地是不包含HBV核心核输入信号的C-末端截短的HBV核心蛋白和/或C-末端HBV核心核输入信号已缺失的截短的HBV核心蛋白。在一实施方案中，截短的HBV核心抗原包含C-末端核酸结合结构域中的缺失，如C-末端核酸结合结构域的1-34个氨基酸残基的缺失，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个氨基酸残基，优选C-末端核酸结合结构域的31-34个C-末端氨基酸残基的缺失。在一优选实施方案中，截短的HBV核心抗原包含C-末端核酸结合结构域中的缺失，优选C-末端核酸结合结构域的31个C-末端氨基酸残基的缺失。
在一些实施方案中，HBV核心抗原氨基酸序列可操作地连接至用于分泌的信号肽。可以使用任何合适的信号肽。在一实施方案中，HBV核心抗原在其N-末端可操作地连接至胱抑素S前体信号肽，以增强分泌。在一特定实施方案中，胱抑素S前体信号肽具有SEQ ID NO：77的氨基酸序列。在另一特定实施方案中，HBV核心抗原的编码序列可操作地连接至具有SEQ ID NO：90的多核苷酸序列的胱抑素S前体信号肽的编码序列。
本申请的HBV核心抗原可以是源自多个HBV基因型(例如，基因型A、B、C、D、E、F、G和H)的共有序列。如本文所用，“共有序列”是指基于同源蛋白的氨基酸序列的比对的人工氨基酸序列，如通过同源蛋白的氨基酸序列的比对所确定的。比对可以使用本领域已知的方法或算法，如使用Clustal Omega来进行。它可以是在序列比对中的每个位置发现的最常见氨基酸残基的计算顺序，基于来自至少100个天然HBV分离株的HBV抗原(例如，核心、pol等)的序列。共有序列可以是非天然存在的并且不同于天然病毒序列。通过使用多序列比对工具比对来自不同来源的多个HBV抗原序列，并在可变比对位置选择最常见的氨基酸，可以设计共有序列。优选地，HBV抗原的共有序列源自HBV基因型A、B、C和D。术语“共有抗原”用于表示具有共有序列的抗原。
本申请的示例性的截短的HBV核心抗原缺乏核酸结合功能，并且能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答。优选地，截短的HBV核心抗原能够在哺乳动物中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的T细胞应答。更优选地，截短的HBV核心抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8T细胞应答。
在一些实施方案中，本申请的HBV核心抗原包含一个或多个I类MHC HLA等位基因的T细胞表位。一些实施方案中，HBV核心抗原包含一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*02:01表位、HLA-A*A0101表位和HLA-B*40:01表位。优选地，HBV核心抗原包含两个或更多个，例如2、3或4个选自以下的T细胞表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*02:01表位、HLA-A*A0101表位和HLA-B*40:01表位。更优选地，HBV核心抗原包含一个或多个HLA-A*11:01表位。
在一些实施方案中，本申请的HBV核心抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型A、B、C和D中的至少两个、优选全部的共有抗原，更优选源自HBV基因型A、B、C和D的截短的共有抗原。本申请的示例性截短的HBV核心共有抗原由与SEQ ID NO：86至少90％相同的氨基酸序列组成，例如与SEQ ID NO：86至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。在一些实施方案中，HBV核心抗原包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO：86为源自HBV基因型A、B、C和D的共有抗原。SEQ ID NO：7含有天然核心抗原的高度带正电荷的(富含精氨酸的)核酸结合结构域的34-氨基酸C-末端缺失。在一些优选的实施方案中，本申请的HBV核心抗原保留一个或多个C-末端精氨酸残基，并且具有SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86的氨基酸序列，从而还原(restore)HBV核心抗原中的HLA-A*11:01表位。在一些实施方案中，HBV核心抗原的最后5个C-末端氨基酸酸包含VVR氨基酸序列，更特别地，VVRR(SEQ ID NO：91)氨基酸序列，更特别地，VVRRR(SEQ IDNO：92)氨基酸序列。
在本申请的一特别实施方案中，HBV核心抗原为截短的HBV抗原，其由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成。在另一特定实施方案中，HBV核心抗原分别由SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：89的多核苷酸序列编码。优选地，HBV核心抗原由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成，并且由SEQ IDNO：89的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，HBV核心抗原由氨基酸序列组成，或者由多核苷酸序列编码，如美国专利申请公开US2019/0185828所述，其内容整体援引加入本文。
(2)HBV聚合酶抗原
如本文所用，术语“HBV聚合酶抗原”、“HBV Pol抗原”或“HBV pol抗原”表示能够在受试者中诱导针对HBV聚合酶的免疫应答的HBV抗原。免疫应答可以是体液和/或细胞介导的应答。术语“聚合酶”、“聚合酶多肽”、“Pol”和“pol”中的每一个表示HBV病毒DNA聚合酶。HBV病毒DNA聚合酶具有四个结构域，从N末端到C末端包括：末端蛋白(TP)结构域，其作为负链DNA合成的引物；对聚合酶功能非必需的间隔区；用于转录的逆转录酶(RT)结构域；和RNase H结构域。
在本申请的一实施方案中，HBV抗原包含HBV Pol抗原，或其任何免疫原性片段或组合。HBV Pol抗原可以含有进一步修饰以提高抗原的免疫原性，如通过将突变引入聚合酶和/或RNase结构域的活性部位以降低或基本上消除某些酶活性。
优选地，本发明的HBV Pol抗原不具有逆转录酶活性和RNase H活性，并且能够在哺乳动物中诱导针对至少两种HBV基因型的免疫应答。优选地，HBV Pol抗原能够在哺乳动物中诱导针对HBV基因型A、B、C和D中至少两种、优选所有的T细胞应答。更优选地，HBV Pol抗原能够在人受试者中诱导针对至少HBV基因型A、B、C和D的CD8T细胞应答。
因此，在一些实施方案中，HBV Pol抗原是灭活的Pol抗原。在一实施方案中，灭活的HBV Pol抗原在聚合酶结构域的活性部位中包含一个或多个氨基酸突变。在另一实施方案中，灭活的HBV Pol抗原在RNaseH结构域的活性部位中包含一个或多个氨基酸突变。在一优选的实施方案中，灭活的HBV pol抗原在聚合酶结构域和RNaseH结构域的活性部位中包含一个或多个氨基酸突变。例如，核苷酸/金属离子结合所需的HBVpol抗原的聚合酶结构域中的“YXDD”基序(SEQ ID NO：74)可以被突变，例如，通过用天冬酰胺残基(N)替换一个或多个天冬氨酸残基(D)，消除或降低金属配位(coordination)功能，从而降低或基本上消除逆转录酶功能。可替换地，或除了“YXDD”基序(SEQ ID NO：74)的突变之外，Mg2+配位所需的HBVPol抗原的RNaseH结构域中的“DEDD”基序(SEQ ID NO：75)可以被突变，例如，通过用天冬酰胺残基(N)替换一个或多个天冬氨酸残基(D)和/或用谷氨酰胺(Q)替换谷氨酸残基(E)，从而降低或基本上消除RNaseH功能。在一特定实施方案中，如下修饰HBV pol抗原：(1)将聚合酶结构域的“YXDD”基序(SEQ ID NO：74)中的天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)；和(2)将RNaseH结构域的“DEDD”基序(SEQ ID NO：75)中的第一个天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)并将第一个谷氨酸残基(E)突变为谷氨酰胺残基(N)，从而降低或基本上消除pol抗原的逆转录酶和RNaseH功能。
在一些实施方案中，HBV pol抗原氨基酸序列可操作地连接至用于分泌的信号肽。可以使用任何合适的信号肽。在一实施方案中，HBV pol抗原在其N-末端可操作地连接至胱抑素S前体信号肽，以增强分泌。在一特定实施方案中，胱抑素S前体信号肽具有SEQ ID NO：77的氨基酸序列。在另一特定实施方案中，HBV pol抗原的编码序列可操作地连接至具有SEQ ID NO：90的多核苷酸序列的胱抑素S前体信号肽的编码序列。
在一些实施方案中，本申请的HBV Pol抗原包含一个或多个I类MHC HLA等位基因的T细胞表位。在一些实施方案中，HBV Pol抗原包含一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位、HLA-A*02:01表位和HLA-A*A0101表位。优选地，HBV pol抗原包含两个或更多个，例如2、3或4个选自以下的T细胞表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位、HLA-A*02:01表位和HLA-A*A0101。更优选地，HBV pol抗原包含HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*02:01和HLA-A*A0101 T细胞表位。更优选地，HBV Pol抗原包含一个或多个HLA-A*11:01表位。
在本申请的一优选实施方案中，HBV Pol抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型A、B、C和D中的至少两个、优选全部的共有抗原，更优选源自HBV基因型A、B、C和D的灭活的共有抗原。本申请的示例性HBV pol共有抗原包含与SEQ ID NO：9至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO：9至少98％相同，例如与SEQ ID NO：9至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO：9为源自HBV基因型A、B、C和D的pol共有抗原，其包含位于聚合酶和RNaseH结构域的活性部位中的4个突变。特别地，4个突变包括聚合酶结构域的“YXDD”基序(SEQ ID NO：74)中天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)；以及RNaseH结构域的“DEDD”(SEQ ID NO：75)基序中第一个天冬氨酸残基(D)突变为天冬酰胺残基(N)和谷氨酸残基(E)突变为谷氨酰胺残基(Q)。
在本申请的一特别实施方案中，HBVpol抗原包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。优选地，HBVpol抗原由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。在另一特定实施方案中，HBVpol抗原由SEQ ID NO：10的多核苷酸序列编码。在一些实施方案中，HBVpol抗原包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成，或者由多核苷酸序列编码，如美国专利申请公开号US2019/0185828所述，其内容整体援引加入本文。
(3)HBV表面抗原
如本文所用，术语“HBV表面抗原”、“表面抗原”、“HBV包膜抗原”、“包膜抗原”和“env抗原”中的每一个表示能够在受试者中诱导或激发针对一种或多种HBV表面抗原或包膜蛋白的免疫应答的HBV抗原。免疫应答可以是体液和/或细胞介导的应答。术语“HBV表面蛋白”、“表面蛋白”、“HBV包膜蛋白”和“包膜蛋白”中的每一个表示HBV病毒表面或包膜蛋白。HBV表达三种表面抗原或包膜蛋白。基因S是HBV基因组中编码表面抗原的基因。表面抗原基因是一个长的开放阅读框，但包含三个框内“起始”(ATG)密码子，其将基因分为三个部分，即pre-S1、pre-S2和S。由于有多个起始密码子，产生三种不同大小的多肽，称为大(L)或L-表面抗原、中(M)或M-表面抗原和小(S)或S-表面抗原，也称为HBV L包膜蛋白、M包膜蛋白和S包膜蛋白。两种不同的启动子(PreS1和PreS2)驱动L-表面抗原编码序列、M-表面抗原编码序列和S-表面抗原编码序列的转录，产生三种不同的翻译蛋白，即L包膜蛋白、M包膜蛋白和S包膜蛋白。PreS2启动子有时称为PreS2/S启动子，因为其分别地驱动M-表面抗原和S-表面抗原转录。L-表面抗原的氨基酸序列与M-表面抗原序列和S-表面抗原序列同框(in-frame)。因此，L-表面抗原含有M-表面抗原结构域和S-表面抗原结构域，并且M-表面抗原包含S-表面抗原结构域。L-表面抗原、M-表面抗原和S-表面抗原是共C末端的，并且共享整个S结构域。相对于S，M在其N末端有额外的结构域，pre-S2，而相对于M，L有pre-S1结构域。
在一些实施方案中，HBV抗原为HBV PreS1抗原，其由pre-S1基因区段编码，并且仅含有L抗原的Pre-S1结构域。PreS1抗原可以具有各种长度，例如具有99-109个氨基酸。本申请的HBV PreS1抗原可以含有任何天然存在的PreS1结构域的序列，及其变体或衍生物。
在其他实施方案中，HBV抗原为HBV PreS2.S抗原，其由pre-S2和S基因区段编码，并且仅含有PreS2结构域和S结构域。PreS2结构域的长度可以为约55个氨基酸，并且S-结构域可以含有约226个氨基酸。本申请的HBV PreS2.S抗原可以含有任何天然存在的PreS2和S结构域的序列，及其变体或衍生物。在一些实施方案中，PreS2.S的内部信号肽保持完好，以促进HBV M和HBV S抗原的PreS2.S蛋白产物。在一实施方案中，HBV PreS2.S抗原为HBV M表面抗原。在另一实施方案中，HBV PreS2.S抗原为HBV S表面抗原。在仍然的另一实施方案中，HBV PreS2.S抗原涵盖HBV M表面抗原和HBV S表面抗原。
在一些实施方案中，HBV表面抗原氨基酸序列可操作地连接至或含有用于分泌的信号肽。可以使用任何合适的信号肽。在一实施方案中，HBV Pre-S1抗原氨基酸序列在其N-末端可操作地连接至胱抑素S前体信号肽以增强分泌。在一特定实施方案中，胱抑素S前体信号肽具有SEQ ID NO：77的氨基酸序列。在另一特定实施方案中，HBV Pre-S1抗原的编码序列可操作地连接至具有SEQ ID NO：90的多核苷酸序列的胱抑素S前体信号肽的编码序列。
在本申请的一实施方案中，HBV抗原包含HBV表面抗原或其任何免疫原性片段或组合。HBV表面抗原能够在受试者中诱导针对L-表面抗原、M-表面抗原和S-表面抗原中的至少一个的免疫应答。优选地，HBV表面抗原如Pre-S1或PreS2.S抗原，为共有抗原，优选源自至少两种HBV基因型A、B、C和D的共有抗原，并且更优选源自HBV基因型A、B、C和D的共有抗原。
在一些实施方案中，本申请的HBV表面抗原包含一个或多个I类MHC HLA等位基因的T细胞表位。在一些实施方案中，HBV表面抗原包含一个或多个选自以下的T细胞表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位和HLA-A*A2402表位。优选地，HBV Pre-S1抗原包含一个或多个选自以下的T细胞表位：HLA-A*11:01表位和HLA-A*24:02表位。更优选地，HBVPre-S1抗原包含HLA-A*11:01和HLA-A*24：02T细胞表位。更优选地，HBV Pre-S1抗原包含一个或多个HLA-A*11:01表位。优选地，HBV PreS2.S抗原包含选自以下的一个或多个T细胞表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位和HLA-A*A2402表位。更优选地，HBV PreS2.S抗原包含HLA-A*11:01、HLA-A*24:02和HLA-A*A2402 T细胞表位。更优选地，HBV PreS2.S抗原包含一个或多个HLA-A*11:01表位。
在本申请的一些实施方案中，HBV表面抗原为Pre-S1抗原。本发明的示例性Pre-S1抗原包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。在本申请的一些实施方案中，HBV表面抗原为Pre-S2.S抗原。本申请的示例性Pre-S2.S抗原包含与SEQ ID NO：5至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQID NO：5至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
在本申请的一特定实施方案中，HBV表面抗原为Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。在另一特定实施方案中，HBV表面抗原由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的多核苷酸序列编码。在另一特定实施方案中，HBV表面抗原为Pre-S2.S抗原，其由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。另一特定实施方案中，HBV表面抗原由SEQ ID NO：6的多核苷酸序列编码。
在本申请的一些实施方案中，HBV表面抗原为S-表面抗原。本申请的示例性S-表面抗原由与SEQ ID NO:79的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列组成，例如与SEQ ID NO:79的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:81为源自HBV基因型A、B、C和D的HBV共有S-表面抗原。在本申请的一特定实施方案中，S-表面抗原由SEQ ID NO:79的氨基酸序列组成。在另一特定实施方案中，HBV表面抗原由SEQ ID NO：78的多核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，HBV表面抗原为M-表面抗原，或其任何免疫原性片段或组合。优选地，M-表面抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型A、B、C和D中的至少两个、优选全部的共有抗原，更优选源自HBV基因型A、B、C和D的共有抗原。优选地，M-表面抗原能够在受试者中诱导或引发针对M-表面抗原的免疫应答。
本申请的示例性M-表面抗原包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:82的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:82的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:82为源自HBV基因型A、B、C和D的HBV共有M-表面抗原。在本申请的一特定实施方案中，M-表面抗原由SEQ ID NO:82的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，HBV表面抗原为L-表面抗原，或其任何免疫原性片段或组合。优选地，L-表面抗原为共有抗原，优选源自HBV基因型A、B、C和D中的至少两个、优选全部的共有抗原，更优选源自HBV基因型A、B、C和D的共有抗原。优选地，L-表面抗原能够在受试者中诱导或引发针对L-表面抗原的免疫应答。
本申请的示例性L-表面抗原包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO:83的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO:83的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:83为源自HBV基因型A、B、C和D的HBV共有L-表面抗原。在本申请的一特定实施方案中，M-表面抗原由SEQ ID NO:83的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，HBV表面抗原包含L-表面抗原、M-表面抗原和S-表面抗原中任一个的一部分，或其任何组合。例如，HBV表面抗原可以包含N-末端L-表面抗原结构域或由N-末端L-表面抗原结构域组成。HBV表面抗原还可以包含M-表面抗原结构域或由M-表面抗原结构域组成。HBV表面抗原还可以包含N-末端L-表面抗原结构域和M-表面抗原结构域或者由N-末端L-表面抗原结构域和M-表面抗原结构域组成。HBV表面抗原还可以包含N-末端L-表面抗原结构域、M-表面抗原结构域和一部分S-表面抗原结构域或者由N-末端L-表面抗原结构域、M-表面抗原结构域和一部分S-表面抗原结构域组成。
本申请这样的表面抗原的示例性实例由与SEQ ID NO:81的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列组成，例如与SEQ ID NO:81至少95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO:81至少98％相同，例如与SEQ ID NO:81至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。SEQ ID NO:81为源自HBV基因型A、B、C和D的共有抗原，其含有N-末端L-表面抗原结构域、完整的M-表面抗原结构域以及S-表面抗原结构域的15-氨基酸C-末端尾。在本申请的一特定实施方案中，HBV表面抗原由SEQ ID NO:81的氨基酸序列组成。在另一特定实施方案中，HBV表面抗原由SEQ ID NO：80的多核苷酸序列编码，其编码HBV表面抗原。在一些实施方案中，HBV表面抗原由氨基酸序列组成，或者由多核苷酸序列编码，如欧洲专利申请号19180926所述，其内容整体援引加入本文。
多核苷酸和载体
在另一整体的方面，本申请提供一种核酸分子或核酸组合，其包含编码本申请的HBV抗原的非天然存在的多核苷酸序列，以及包含一种包含所述非天然存在的核酸的载体。核酸分子可以包含编码本申请的HBV抗原的任何非天然存在的多核苷酸序列，其可以利用本领域已知的方法，参考本公开来制备。优选地，非天然存在的多核苷酸编码本申请的截短的HBV核心抗原、HBV聚合酶抗原、HBV Pre-S1抗原和HBV Pre-S2.S抗原中的至少一种。多核苷酸可以为RNA的形式或DNA形式，其可以通过重组技术(如克隆)或合成制备(化学合成)获得。DNA可以为单链或双链的，或者可以含有双核和单链序列的部分。DNA可以，例如包含基因组DNA、cDNA或其组合。多核苷酸也可以是DNA/RNA杂合体。本申请的多核苷酸和载体可以用于重组蛋白制备、在宿主细胞中表达蛋白或制备病毒颗粒。优选地，多核苷酸为RNA。
在本申请的一实施方案中，核酸分子或组合包含非天然存在的多核苷酸序列，其编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：84、SEQID NO：85或SEQ ID NO：86至少90％相同的氨基酸序列组成，例如与SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：84、SEQ IDNO：85或SEQ ID NO：86 98％、99％或100％相同。在本申请的一特定实施方案中，非天然存在的核酸分子编码截短的HBV核心抗原，所述截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成。优选地，截短的HBV核心抗原由SEQ ID NO：86组成。
本申请的编码由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的截短的HBV核心抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于分别与SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：89至少90％相同的多核苷酸序列，例如与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：89至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SED ID NO：8、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：8998％、99％或100％相同。
编码截短的HBV核心抗原的示例性非天然存在的核酸分子具有SEQ ID NO：8、SEQID NO：87、SED ID NO：88或SED ID NO：89的多核苷酸序列。优选地，编码截短的HBV核心抗原的分子具有SED ID NO：89的多核苷酸序列。
在本申请的一实施方案中，核酸分子或组合包含非天然存在的多核苷酸序列，其编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原包含与SED ID NO：9至少90％相同的氨基酸序列，例如与SED ID NO：9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。在本申请的一特定实施方案中，非天然存在的核酸分子编码HBV聚合酶抗原，所述HBV聚合酶抗原由SED ID NO：9的氨基酸序列组成。
本申请的编码包含SED ID NO：9的氨基酸序列的HBV Pol抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于与SED ID NO：10至少90％相同的多核苷酸序列，例如与SEQ ID NO：10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO：1098％、99％或100％相同。编码HBV Pol抗原的示例性非天然存在的核酸分子具有SEQ ID NO：10的多核苷酸序列。
在本申请的一实施方案中，核酸分子或组合包含非天然存在的多核苷酸序列，其编码HBV Pre-S1抗原，所述HBV Pre-S1抗原由与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至少90％相同的氨基酸序列组成，例如与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO：1或SEQID NO：3 98％、99％或100％相同。在本申请的一特定实施方案中，非天然存在的核酸分子编码HBV Pre-S1抗原，所述HBV Pre-S1抗原由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成。
本申请的编码由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于分别与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4至少90％相同的多核苷酸序列，例如与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO：2或SEQID NO：4 98％、99％或100％相同。编码HBV Pre-S1抗原的示例性非天然存在的核酸分子具有SEQ ID NO：2或4的多核苷酸序列。
在本申请的一实施方案中，核酸分子或组合包含非天然存在的多核苷酸序列，其编码HBV Pre-S2.S抗原，所述HBV Pre-S2.S抗原由与SEQ ID NO：5至少90％相同的氨基酸序列组成，例如与SEQ ID NO：5至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO：5 98％、99％或100％相同。在本申请的一特定实施方案中，非天然存在的核酸分子编码HBV Pre-S2.S抗原，所述HBV Pre-S2.S抗原由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成。
本申请的编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV Pre-S2.S抗原的多核苷酸序列的实例包括但不限于分别与SEQ ID NO：6至少90％相同的多核苷酸序列，例如与SEQID NO：6至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，优选与SEQ ID NO：6 98％、99％或100％相同。编码HBV Pre-S2.S抗原的示例性非天然存在的核酸分子具有SEQ ID NO：6的多核苷酸序列。
在本申请的一实施方案中，核酸分子或组合包含非天然存在的多核苷酸序列，其编码包含，从5’端到3’端：编码第一HBV抗原的多核苷酸序列、第一内部核糖体进入序列(IRES)元件或者编码第一自体蛋白酶肽的多核苷酸序列以及编码第二HBV抗原的多核苷酸序列，其中第一HBV抗原和第二HBV抗原中的至少一个为HBV表面抗原。在一些实施方案中，非天然存在的多核苷酸序列还包含，从5’-端至3’-端排列：可操作地连接至编码第二HBV抗原的多核苷酸序列的3’端的第二IRES元件或者编码第二自体蛋白酶肽的多核苷酸序列、以及编码第三HBV抗原的多核苷酸序列。在一些实施方案中，非天然存在的多核苷酸序列还包含从5’-端至3’-端排列：可操作地连接至编码第三HBV抗原的多核苷酸序列的3’端的第三IRES元件或者编码第三自体蛋白酶肽的多核苷酸序列、以及编码第四HBV抗原的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：(i)第一HBV表面抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；(ii)第二HBV表面抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；(iii)第三HBV表面抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；(iv)HBV核心抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：7至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；以及(v)HBV聚合酶抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：9至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。在一些实施方案中，HBV核心抗原包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
在一些实施方案中，编码第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：(i)编码第一HBV PreS1抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：2至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；(ii)编码第二HBVPreS1抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：4至少90％相同的序列，例如与SEQ IDNO：4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；(iii)编码HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：6至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：6至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；(iv)编码HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：8至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；以及(v)编码HBV核心抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：10至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。在一些实施方案中，编码HBV核心抗原的多核苷酸序列包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：89至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：89至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
在一些实施方案中，第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个独立地包含选自以下的肽序列：猪捷申病毒-12A(P2A)、***病毒(FMDV)2A(F2A)、马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV2A)、软化病病毒2A(BmIFV2A)及其组合。优选地，第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个包含P2A的肽序列，例如SEQ ID NO：11的P2A序列。优选地，编码P2A肽序列的多核苷酸序列为SEQ ID NO：12。
在一些实施方案中，第一IRES、第二IRES和第三IRES中的每一个源自脑心肌炎病毒(EMCV)或肠道病毒71(EV71)，优选地，第一IRES、第二和IRES第三IRES中的每一个包含SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列。
在本申请的一实施方案中，核酸分子或组合包含非天然存在的多核苷酸序列，其编码包含，从5’端至3’端：(1)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；(2)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；(3)编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBVPre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；(4)编码具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列，优选由具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；(5)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；(6)编码具有SEQ IDNO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ IDNO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；(7)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；(8)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；99)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；(10)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；(11)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ IDNO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；(12)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ IDNO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ IDNO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；(13)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ IDNO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；(14)编码具有SEQID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；(15)编码具有SEQID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ IDNO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；(16)编码具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；(17)编码具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ IDNO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：86的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；(18)编码具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；(19)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；(20)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ IDNO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；(21)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ IDNO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；(22)编码具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；(23)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ IDNO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；以及(24)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：84、85或86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列。在一些实施方案中，HBV抗原中的每一个独立地可操作地连接至或含有用于分泌的信号肽。可以使用任何合适的信号肽。优选地，对于HBV PreS1抗原、HBV核心抗原和HBV Pol抗原中的每一个，信号肽可操作地连接至抗原序列的N-末端。在一些实施方案中，信号肽含有SEQ ID NO：77的氨基酸序列，优选地，信号肽由SEQ ID NO：90的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，核酸分子或核酸组合包含SEQ ID NO：15-54中任一个的非天然存在的多核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸分子或核酸组合包含至少两个SEQ IDNO：15-54的非天然存在的多核苷酸序列。
本申请还涉及一种载体，其包含编码HBV抗原的非天然存在的多核苷酸。如本文所用，“载体”是用于将遗传物质携带到另一细胞中的核酸分子，在那里它可以复制和/或表达。可以鉴于本公开，使用领域技术人员已知的任何载体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体(细菌噬菌体、动物病毒和植物病毒)、粘粒和人工染色体(例如，YAC)。优选地，载体为DNA质粒。载体可以是DNA载体或RNA载体。鉴于本公开，本领域普通技术人员可以通过标准重组技术构建本申请的载体。
本申请的载体可以是表达载体。如本文所用，术语“表达载体”表示包含核酸的任何类型的遗传构建体，所述核酸编码能够被转录的RNA。表达载体包括但不限于用于重组蛋白表达的载体，如DNA质粒或病毒载体，以及用于将核酸递送到受试者中以在受试者的组织中表达的载体，如DNA质粒或病毒载体。本领域技术人员会理解，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白表达水平等因素。
本申请的载体可以含有多种调节序列。如本文所用，术语“调节序列”表示允许、有助于或调节核酸分子的功能调节(包括核酸或其衍生物之一(即mRNA)的复制、重复、转录、剪接、翻译、稳定性和/或运输进宿主细胞或生物体中)的任何序列。在本公开内容的上下文中，这个术语涵盖启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号和影响mRNA稳定性的元件)。
在本申请的一些实施方案中，载体为非病毒载体。非病毒载体的实例包括、但不限于DNA质粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、细菌噬菌体等。优选地，非病毒载体为DNA质粒。与“DNA质粒载体”、“质粒DNA”或“质粒DNA载体”互换使用的“DNA质粒”表示能够在合适的宿主细胞中自复制的双链且通常为环状的DNA序列。用于表达编码的多核苷酸的DNA质粒通常包含复制起点、多克隆位点和选择标志物，例如可以是抗生素抗性基因。可以使用的合适的DNA质粒的实例包括但不限于用于众所周知的表达***(包括原核和真核***)的可商购表达载体，如pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可以用于在大肠杆菌(Escherichia coli）中生产和/或表达蛋白；pYES2(Invitrogen，Thermo FisherScientific)，其可以用于在酵母的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae strainsof yeast)中生产和/或表达；
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完整杆状病毒表达***(Thermo FisherScientific)，其可以用于在昆虫细胞中生产和/或表达；pcDNATM或pcDNA3TM(LifeTechnologies，Thermo Fisher Scientific)，其可以用于在哺乳动物细胞中的高水平组成型蛋白表达；以及pVAX或pVAX-1(Life Technologies，Thermo Fisher Scientific)，其可以用于在大多数哺乳动物细胞中高水平瞬时表达感兴趣的蛋白。通过使用常规技术和容易得到的起始原料，可以修饰任何可商购的DNA质粒的骨架以优化在宿主细胞中的蛋白表达，如反转某些元件(例如，复制起点和/或抗生素抗性盒)的方向，替换质粒的内源启动子(例如，抗生素抗性盒中的启动子)，和/或替换编码所转录的蛋白的多核苷酸序列(例如，抗生素抗性基因的编码序列)(参见例如，Sambrook et al.，Molecular Cloning a LaboratoryManual，Second Ed.Cold Spring Harbor Press(1989))。
优选地，DNA质粒是适合于在哺乳动物宿主细胞中表达蛋白的表达载体。适用于在哺乳动物宿主细胞中表达蛋白的表达载体包括但不限于pcDNATM、pcDNA3TM、pVAX、pVAX-1、ADVAX、NTC8454等。优选地，表达载体基于pVAX-1，其可进一步修饰以优化在哺乳动物细胞中的蛋白表达。pVAX-1是DNA疫苗中的常用质粒，并且含有强大的人巨细胞病毒立即早期(CMV-IE)启动子，然后是牛生长激素(bGH)衍生的多腺苷酸化序列(pA)。pVAX-1进一步含有pUC复制起点和由允许细菌质粒繁殖的小原核启动子驱动的卡那霉素抗性基因。
本申请的载体还可以是病毒载体。一般而言，病毒载体是遗传工程改造的病毒，其携带已赋予非传染性的经修饰的病毒DNA或RNA，但仍含有病毒启动子和转基因，从而允许通过病毒启动子翻译转基因。因为病毒载体通常缺乏传染性序列，因此它们需要辅助病毒或包装线以进行大规模转染。在某些实施方案中，本文所述的载体为例如重组腺病毒；重组逆转录病毒；重组痘病毒，如牛痘病毒(如修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA))；重组甲病毒，如塞姆利基森林病毒；重组副粘病毒，如重组麻疹病毒；或另一重组病毒。可以使用的病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、肠道病毒载体、委内瑞拉马脑炎病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、烟草花叶病毒载体、慢病毒载体等。在某些实施方案中，本文所述的载体为MVA载体。载体还可以为非病毒载体。
在一些实施方案中，病毒载体为腺病毒载体，例如重组腺病毒载体。重组腺病毒载体可以例如衍生自人腺病毒(HAdV或AdHu)或猿猴腺病毒如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV)或恒河猴腺病毒(rhAd)。优选地，腺病毒载体为重组人腺病毒载体，例如重组人腺病毒血清型26，或重组人腺病毒血清型5、4、35、7、48等中的任一种。在其他实施方案中，腺病毒载体为rhAd载体，如rhAd51、rhAd52或rhAd53。鉴于本公开，使用本领域已知的方法可以制备用于本申请的重组病毒载体。例如，鉴于遗传密码的简并性，可以设计几种编码相同多肽的核酸序列。编码本申请的HBV抗原的多核苷酸可以任选地进行密码子优化以确保在宿主细胞(例如，细菌或哺乳动物细胞)中的适当表达。密码子优化是本领域广泛应用的技术，并且鉴于本公开，获得经过密码子优化的多核苷酸的方法是本领域技术人员众所周知的。
本申请的载体，如DNA质粒或病毒载体(特别是腺病毒载体)可以包含任何调节元件以建立载体的常规功能，包括但不限于由载体的多核苷酸序列编码的HBV抗原的复制和表达。调节元件包括但不限于启动子、增强子、多腺苷酸化信号、翻译终止密码子、核糖体结合元件、转录终止子、选择标志物、复制起点等。载体可以包含一个或多个表达盒。“表达盒”是指导细胞机器(cellular machinery)制造RNA和蛋白的载体的一部分。表达盒通常包含三个组件：启动子序列、开放阅读框和任选地包含多腺苷酸化信号的3’-非翻译区(UTR)。开放阅读框(ORF)是阅读框，其含有从起始密码子到终止密码子的感兴趣的蛋白(例如，HBV抗原)的编码序列。表达盒的调节元件可以可操作地连接至编码感兴趣的HBV抗原的多核苷酸序列。本文中使用的术语“可操作地连接”应放在最广泛的合理上下文中，并表示具有功能关系的多核苷酸元件的连接。当多核苷酸置于与另一多核苷酸的功能关系中时，多核苷酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子影响编码序列的转录，则启动子可操作地连接至编码序列。适用于本文所述的表达盒的任何组件可以以任何组合和以任何顺序使用来制备本申请的载体。
载体可以包含启动子序列，优选在表达盒内，以控制感兴趣的HBV抗原的表达。术语“启动子”以其常规含义使用，并且表示启动可操作地连接的核苷酸序列的转录的核苷酸序列。启动子位于同一条链上，靠近它所转录的核苷酸序列。启动子可以是组成型、诱导型或抑制型。启动子可以是天然存在的或合成的。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以是同源启动子(即，源自与载体相同的遗传来源)或异源启动子(即，源自不同的载体或遗传来源)。例如，如果要使用的载体是DNA质粒，则启动子可以是质粒内源性的(同源的)或源自其他来源(异源的)。优选地，启动子在表达盒内位于编码HBV抗原的多核苷酸的上游。
可以使用的启动子的实例包括但不限于来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒(avian leukosis virus)(ALV)启动子、诸如CMV立即早期启动子(CMV-IE)的巨细胞病毒(CMV)启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。适合用于本申请的其他启动子包括但不限于RSV启动子、逆转录病毒LTR、腺病毒主要晚期启动子和各种痘病毒启动子，包括但不限于以下牛痘病毒或MVA衍生和FPV衍生的启动子：30K启动子、I3启动子、PrS启动子、PrHyb、PrS5E启动子、Pr7.5K、Pr13.5长启动子、40K启动子、MVA-40K启动子、FPV 40K启动子、30k启动子、PrSynIIm启动子、PrLE1启动子和PR1238启动子。启动子也可以是来自人基因的启动子，如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子也可以是组织特异性启动子，如天然的或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。优选地，启动子为26S亚基因组启动子或T7启动子。示例性26S亚基因组启动子的核苷酸序列示于SEQ ID NO：62。示例性T7启动子的核苷酸序列示于SEQ ID NO：73。
载体可以包含额外的多核苷酸序列，其稳定化表达的转录物、增强RNA转录物的核输出和/或改善转录-翻译偶联。这样的序列的实例包括多腺苷酸化信号和增强子序列。多腺苷酸化信号在载体表达盒内通常位于感兴趣的蛋白(例如，HBV抗原)的编码序列的下游。增强子序列是调节性DNA序列，当被转录因子结合时，其增强相关基因的转录。增强子序列优选地在载体表达盒内位于编码HBV抗原的多核苷酸序列的上游，但位于启动子序列的下游。
可以鉴于本公开，使用本领域技术人员已知的任何多腺苷酸化信号。例如，多腺苷酸化信号可以是SV40多腺苷酸化信号(例如，SEQ ID NO：64)、LTR多腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多腺苷酸化信号或人β-球蛋白多腺苷酸化信号。优选地，多腺苷酸化信号为SV40多腺苷酸化信号。示例性SV40多腺苷酸化信号的核苷酸序列示于SEQ ID NO：64中。
可以鉴于本公开，使用本领域技术人员已知的任何增强子序列。例如，增强子序列可以是人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、HA、RSV或EBV的增强子。具体增强子的实例包括但不限于土拨鼠HBV转录后调节元件(WPRE)、源自人载脂蛋白A1前体(ApoAI)的内含子/外显子序列、人T-细胞白血病病毒1型(HTLV-1)长末端重复序列(LTR)的非翻译R-U5结构域、剪接增强子、合成的兔β-球蛋白内含子，或其任意组合。
载体可以包含编码信号肽序列的多核苷酸序列。优选地，编码信号肽序列的多核苷酸序列位于编码HBV抗原的多核苷酸序列的上游。信号肽通常指导蛋白的定位，促进蛋白从产生蛋白的细胞中的分泌，和/或改善抗原表达和向抗原呈递细胞的交叉呈递。当从载体表达时，信号肽可以存在于HBV抗原的N末端，但被信号肽酶切割，例如在从细胞分泌后。其中信号肽已被切割的表达的蛋白经常称为“成熟蛋白”。可以鉴于本公开，使用本领域已知的任何信号肽。例如，信号肽可以是胱抑素S信号肽；免疫球蛋白(Ig)分泌信号，如胱抑素S信号肽、Ig重链γ信号肽SPIgG或Ig重链ε信号肽SPIgE。
载体，如DNA质粒，还可以包括细菌复制起点和抗生素抗性表达盒，用于在细菌细胞(例如大肠杆菌)中选择和维持质粒。细菌复制起点和抗生素抗性盒可以以与编码HBV抗原的表达盒相同的方向或以相反(反向)方向位于载体中。复制起点(ORI)是启动复制处的序列，从而使质粒能够在细胞内繁殖和存活。适用于本申请的ORI的实例包括但不限于ColE1、pMB1、pUC、pSC101、R6K和15A，优选pUC。
用于在细菌细胞中选择和维持的表达盒通常包括可操作地连接至抗生素抗性基因的启动子序列。优选地，可操作地连接至抗生素抗性基因的启动子序列不同于可操作地连接至编码感兴趣的蛋白(例如HBV抗原)的多核苷酸序列的启动子序列。抗生素抗性基因可以是密码子优化的，并且抗生素抗性基因的序列组成通常根据细菌(例如，大肠杆菌)密码子使用进行调整。可以鉴于本公开，使用本领域技术人员已知的任何抗生素抗性基因，包括但不限于卡那霉素抗性基因(Kanr)、氨苄西林抗性基因(Ampr)和四环素抗性基因(Tetr)、以及赋予对氯霉素、博来霉素、大观霉素、羧苄西林等的抗性的基因。
鉴于本公开，通过本领域已知的任意方法可以制备本申请的编码HBV抗原的多核苷酸和表达载体。例如，使用本领域技术人员众所周知的标准分子生物学技术，例如聚合酶链式反应(PCR)等，可以将编码HBV抗原的多核苷酸引入或“克隆”到表达载体中。
腺病毒
在一方面，本申请提供一种重组腺病毒，其包含编码抗原性HBV抗原的核苷酸序列。在一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含编码抗原性HBV核心抗原的核苷酸序列。在另一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含编码抗原性HBV pol抗原的核苷酸序列。在另一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含编码抗原性HBV表面抗原的核苷酸序列。在一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含编码抗原性HBV抗原的一种、两种、三种或四种核苷酸序列，所述抗原性HBV抗原各自独立地选自HBV核心抗原、HBV聚合酶(pol)抗原和HBV表面抗原。
本发明的腺病毒属于腺病毒(Adenoviridae)科，并且优选地是属于哺乳动物腺病毒(Mastadenovirus)属的腺病毒。它可以是人腺病毒，但还可以是感染其他物种的腺病毒，包括但不限于牛腺病毒(例如牛腺病毒3，BAdV3)、犬腺病毒(例如CAdV2)、猪腺病毒(例如PAdV3或PAdV5)或猿猴腺病毒(其包括猴腺病毒和猿腺病毒，例如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。优选地，腺病毒为人腺病毒(HAdV或AdHu；在申请中，如果提及Ad但是没有指示物种的情况下，即指人腺病毒，例如简短符号“Ad5”表示与HAdV5(人腺病毒血清型5)相同)或猿猴腺病毒(例如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh或SAdV))。
已使用人腺病毒进行大多数高级研究，并且根据本申请的某些方面，人腺病毒是优选的。在某些优选的实施方案中，本申请的重组腺病毒基于人腺病毒。在优选的实施方案中，重组腺病毒基于人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49或50。根据本申请的特别优选的实施方案，腺病毒是人腺病毒血清型26和35中的一种。
这些血清型的优点是在人群中的低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价。rAd26载体的制备描述于以下文献中：例如WO 20007/104792以及ABBink et al.，(2007)Virol 81(9)：4654-63，这些文献整体援引加入本文。Ad26的示例性基因组序列发现于GenBank登录号EF 153474中和WO2007/104792中(参见，例如SEQ ID NO：1。rAd35载体的制备描述于以下文献中：例如美国专利号7,270,811、WO00/70071以及Vogels et al.，(2003)J Virol 77(15)：8263-71，这些文献整体援引加入本文。Ad35的示例性基因组序列发现于GenBank登录号AC_000019中和WO00/70071中(参见，例如图6)。
猿猴腺病毒在人群中通常也具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体效价，并且已经报道了使用黑猩猩腺病毒载体的大量工作(例如US6083716；WO2005/071093；WO 2010/086189；WO 2010085984；Farina et al，2001，J Virol 75：11603-13；Cohen etal，2002，J Gen Virol 83：151-55；Kobinger et al，2006，Virology 346：394-401；Tatsiset al.，2007，MOlecular Therapy 15：608-17；还参见Bangari and Mittal的综述，2006，Vaccine 24：849-62；以及Lasaro and Ertl的综述，2009，Mol Ther 17：1333-39)。因此，在其他优选的实施方案中，本申请的重组腺病毒基于猿猴腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在本申请的一实施方案中，重组腺病毒基于猿猴腺病毒类型1、3、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或SA7P。
腺病毒载体rAd26和rAd35
在本申请的一优选实施方案中，腺病毒载体包含来自两种稀有血清型的衣壳蛋白：Ad26和Ad35。在典型的实施方案中，载体为rAd26或rAd35病毒。
因此，可以用于本申请的载体包含Ad26或Ad35衣壳蛋白(例如，纤维、五邻体或六邻体蛋白)。本领域技术人员会理解，无需在本申请的载体中使用整个Ad26或Ad35衣壳蛋白。因此，在本申请的载体中可以使用包含至少一部分Ad26或Ad35衣壳蛋白的嵌合衣壳蛋白。本申请的载体还可以包含衣壳蛋白，其中纤维、五邻体和六邻体蛋白各自源自不同的血清型，只要至少一种衣壳蛋白源自Ad26或Ad35。在优选的实施方案中，纤维、五邻体和六邻体蛋白各自源自Ad26或者各自源自Ad35。
本领域技术人员会了解，源自多个血清型的元件可以组合在单一的重组腺病毒载体中。因此，可以产生组合来自不同血清型的期望性质的嵌合腺病毒。因此，在一些实施方案中，本申请的嵌合腺病毒可以将Ad26和Ad35血清型的预先存在的免疫性的缺失与以下特征相结合：如温度稳定性、组装、锚定、产量、重定向或改善的感染、靶细胞中DNA的稳定性等。
在本申请的一实施方案中，用于本申请的重组腺病毒载体主要或完全源自Ad35或Ad26(即，载体是rAd35或rAd26)。在一些实施方案中，腺病毒是复制缺陷的，例如，因为其含有基因组的E1区域中的缺失。对于源自Ad26或Ad35的本申请的腺病毒，典型地是将腺病毒的E4-orf6编码序列与人亚群C(如Ad5)的腺病毒的E4-orf6交换。这允许在表达Ad5的E1基因的熟知的补充细胞系中此类腺病毒的繁殖，例如293细胞、PER.C6细胞等(参见，例如Havenga et al，2006，J Gen Virol 87：2135-43；WO 03/104467)。在本申请的一实施方案中，腺病毒为血清型35的人腺病毒，具有克隆了编码抗原的核酸的E1区域中的缺失，并且具有Ad5的E4 orf6区域。在本申请的一实施方案中，腺病毒为血清型26的人腺病毒，具有克隆了编码抗原的核酸的E1区域中的缺失，并且具有Ad5的E4 orf6区域。对于Ad35腺病毒，通常在腺病毒中保留E1B 55K开放阅读框的3’端，例如pIX开放阅读框正上游的166 bp或包括其的片段，如pIX起始密码子正上游的243 bp片段，在5’端用Bsu36I限制性位点标记，因为这增加腺病毒的稳定性，因为pIX基因的启动子部分地驻留在这个区域(参见，例如Havengaet al，2006，见上文；WO 2004/001032)。
重组腺病毒载体的制备在本领域中是熟知的。rAd26载体的制备描述于例如WO2007/104792和Abbink et al.，(2007)Virol 81(9)：4654-63中。Ad26的示例性基因组序列发现于GenBank登录号EF 153474和WO 2007/104792的SEQ ID NO：1中。rAd35载体的制备描述于例如美国专利号7,270,811和Vogels et al.，(2003)J Virol 77(15)：8263-71。Ad35的示例性基因组序列发现于GenBank登录号AC_000019中。
在本申请的一实施方案中，用于本申请的载体包括WO2012/082918中描述的那些，其公开整体援引加入本文。
典型地，使用核酸来产生用于本申请的载体，所述核酸包括整个重组腺病毒基因组(例如，质粒、粘粒、或杆状病毒载体)。因此，本申请还提供分离的核酸分子，其编码本申请的腺病毒载体。本申请的核酸分子可以为RNA形式或通过克隆获得或合成产生的DNA形式。DNA可以是双链或单链的。
用于本申请的腺病毒载体典型地是复制缺陷的。在这些实施方案中，病毒通过使对病毒复制关键的区域(例如E1区域)缺失或失活而变得复制缺陷。可以通过在区域内例如***感兴趣的基因(通常连接至启动子)来使区域基本上缺失或失活。在一些实施方案中，本申请的载体可以含有其他区域如E2、E3或E4区域中的缺失，或者连接至启动子的异源基因的***。对于E2-突变和/或E4-突变的腺病毒，通常使用E2-补充细胞系和/或E4-补充细胞系来产生重组腺病毒。腺病毒的E3区域中的突变不需要被细胞系补充，因为复制并不需要E3。
通常使用包装细胞系来产生足量的本申请的腺病毒载体。包装细胞是包含在复制缺陷型载体中缺失或失活的那些基因的细胞，因此允许病毒在细胞中复制。合适的细胞系包括，例如PER.C6、911、293和E1 A549。
如上所述，各种各样的乙型肝炎病毒(HBV)抗原(如HBV核心、HBV聚合酶、HBV Pre-S1、HBV PreS2.S抗原)可以在载体中表达。如果需要，可以对编码HBV抗原的异源基因进行密码子优化，以确保在处理的宿主(如人)中正确表达。密码子优化是在本领域广泛使用的技术。通常，将异源基因克隆到腺病毒基因组的E1区域和/或E3区域。
异源乙型肝炎病毒基因可以在腺病毒衍生的启动子(如主要晚期启动子)的控制下(即可操作地连接至)，或者也可以在异源启动子的控制下。合适的异源启动子的实例包括CMV启动子和RSV启动子。优选地，启动子位于表达盒中感兴趣的异源基因的上游。
MVA载体
用于本申请的MVA载体使用源自修饰的安卡拉痘苗病毒的减毒病毒。MVA载体表达各种各样的HBV抗原(如，HBV核心、HBV聚合酶、HBV Pre-S1、HBV PreS2.S抗原)。在一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含编码抗原性HBV核心抗原的核苷酸序列。在另一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含编码抗原性HBV pol抗原的核苷酸序列。在另一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含编码抗原性HBV表面抗原的核苷酸序列。在一方面，本申请提供一种重组MVA载体，其包含编码抗原性HBV抗原的一种、两种、三种或四种核苷酸序列，所述抗原性HBV抗原各自独立地选自HBV核心抗原、HBV聚合酶(pol)抗原和HBV表面抗原。
人工减毒修饰的牛痘病毒安卡拉(“MVA”)通过牛痘病毒的安卡拉(Ankara)毒株(CVA)在鸡胚成纤维细胞上连续传代516次而产生(对于综述，参见Mayr，A.，etal.Infection 3，6-14(1975))。作为这些长期传代的结果，所得MVA病毒缺失其基因组序列的约31千碱基，因此描述为高度局限于禽类细胞的宿主细胞(Meyer，H.et al.，J.Gen.Virol.72，1031-1038(1991))。在各种动物模型中显示，与完全复制能力的起始材料相比，所产生的MVA是明显无毒的(Mayr，A.&Danner，K.Dev.Biol.Stand.41：225-34(1978))。
用于实施本申请的MVA病毒可以包括但不限于MVA-572(作为ECACC V94012707于1994年1月27日保藏)、MVA-575(作为ECACC V00120707于2000年12月7日保藏)、MVA-I721(参考Suter et al.，Vaccine 2009)和ACAM3000(作为
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PTA-5095于2003年3月27日保藏)。
更优选地，根据本申请使用的MVA包括MVA-BN和MVA-BN的衍生物。MVA-BN描述于国际PCT公开WO 02/42480。如本文所述，MVA-BN的“衍生物”是指表现出与MVA-BN基本相同的复制特性的病毒，但在其基因组的一个或多个部分表现出差异。
MVA-BN及其衍生物是不能复制的，这表示无法在体内和体外进行生殖复制。更具体地，在体外，MVA-BN或其衍生物描述为能够在鸡胚胎成纤维细胞(CEF)中进行生殖复制，但不能在以下细胞系中进行生殖复制：人角质细胞系HaCat(Boukamp et al (1988)，J.Cell Biol.106：761-771)、人骨肉瘤细胞系143B(ECACC保藏号91112502)、人胚胎肾细胞系293(ECACC保藏号85120602)以及人***细胞系HeLa(ATCC保藏号CCL-2)。此外，MVA-BN或其衍生物在Hela细胞和HaCaT细胞系中的病毒扩增率比MVA-575低至少2倍，更低优选3倍。MVA-BN及其衍生物的测试和测定描述于WO 02/42480(美国专利申请号2003/0206926)和WO 03/048184(美国专利申请号2006/0159699)。
前段所描述的术语在人细胞系中体外“不能生殖复制”或“不具备生殖复制能力”例如描述于WO 02/42480，其还教导了如何获得具有上述期望特性的MVA。该术语适用于使用WO 02/42480或美国专利号6,761,893中所描述的测定，感染后4天的体外病毒扩增率小于1的病毒。
前段中所描述的术语“无法生殖复制”指在人细胞系中，在感染后4天的体外病毒扩增率小于1的病毒。描述于WO 20/42480或美国专利号6,761,893中的测定可以用于确定病毒扩增率。
前段中所描述的人细胞系中病毒的扩增或复制通常表示为感染的细胞产生的病毒(输出)与最初的原始用于感染细胞的量(输入)的比率，称为“扩增率”。扩增率“1”定义这样的扩增状态，即从感染的细胞中产生的病毒量与最初用于感染细胞的量相同，这意味着感染的细胞对病毒感染和繁殖是允许的。相反地，扩增率小于1，即与输入水平相比，输出减少，表示缺乏生殖复制，因此病毒减弱。
基于MVA的疫苗的优点包括其安全性谱以及可用于大规模的疫苗生产。临床前测试表明，与其他MVA毒株相比，MVA-BN表现出更优异的减毒和有效性(WO 02/42480)。MVA-BN毒株的另一个特性是，与DNA-初免/牛痘病毒加强方案相比，在牛痘病毒初免/牛痘病毒增强方案中能够诱导基本相同的免疫水平。
重组MVA-BN病毒，本文最优选的实施方案，认为是安全的，因为它们在哺乳动物细胞中明显缺乏复制能力，而且它们公认是无毒的。而且，除了其效力外，工业规模制造的可行性可以是有利的。此外，基于MVA的疫苗可以递送多种异源抗原，并允许同时诱导体液和细胞免疫。
用于本申请的MVA载体可以用本领域已知的方法制备，如WO/2002/042480和WO/2002/24224中描述的那些，其相关公开援引加入本文。
在本申请的一优选实施方案中，MVA载体包含编码选自以下的一种或多种抗原性的核酸：HBV核心抗原、HBV pol抗原和HBV表面抗原。
HBV抗原蛋白可以***MVA的一个或多个基因间区域(IGR)。在本申请的一实施方案中，IGR选自IGR07/08、IGR 44/45、IGR 64/65、IGR 88/89、IGR 136/137和IGR 148/149。在本申请的一实施方案中，重组MVA的5、4、3或2个以下的IGR包含异源核苷酸序列，其编码HBV核心抗原和/或HBV pol抗原的抗原决定簇。额外地或可选地，异源核苷酸序列可以***MVA基因组的一个或多个天然存在的缺失位点，特别是***主缺失位点I、II、III、IV、V或VI。在本申请的一实施方案中，重组MVA的5、4、3或2个以下的天然存在的缺失位点包含编码HBV核心抗原和/或HBV pol抗原的抗原决定簇的异源核苷酸序列。
包含编码HBV蛋白的抗原决定簇的异源核苷酸序列的MVA的***位点数目可以为1、2、3、4、5、6、7或更多。在本申请的一实施方案中，异源核苷酸序列***4、3、2或更少个***位点。优选地，使用2个***位点。在本申请的一实施方案中，使用3个***位点。优选地，重组MVA包含***2或3个***位点的至少2、3、4、5、6或7个基因。
本文提供的重组MVA病毒可以通过本领域已知的常规方法产生。获得重组痘病毒或将外源编码序列***痘病毒基因组的方法是本领域技术人员熟知的。例如，标准分子生物学技术的方法，如DNA克隆、DNA和RNA的分离、蛋白印迹分析、RT-PCR和PCR扩增技术在Molecular Cloning，A laboratory Manual (2nd Ed.)(J.Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))中有描述，处理和操作病毒的技术描述于VirologyMethods Manual(B.W.J.Mahy et al.(eds.)，Academic Press(1996))。类似地，MVA的处理、操做和遗传工程的技术和知识(know-how)描述于Molecular Virology：A PracticalApproach(A.J.Davison&R.M.Elliott(Eds.)，The Practical Approach Series，IRLPress at Oxford University Press，Oxford，UK(1993)(参见，例如Chapter9：Expressionof genes by Vaccinia virus vectors))和Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Son，Inc.(1998)(参见，例如Chapter 16，Section IV：Expression ofproteins in mammalian cells using vaccinia viral vector))。
对于本文所公开的各种重组MVA的产生，可以采用不同的方法。要***病毒的DNA序列可以置于大肠杆菌质粒构建体中，其中已经***与MVA的一段DNA同源的DNA。另外，要***的DNA序列可以连接至启动子。启动子基因连接可以置于质粒构建体中，通过DNA与含有非必须基因座的MVA DNA区域侧接的DNA序列同源，使启动子基因侧接在两端，。所得的质粒构建体可以通过在大肠杆菌内的繁殖而扩增并分离。分离的含有要***的DNA基因序列的质粒可以转染到细胞培养物中，例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)，同时用MVA感染培养物。质粒和病毒基因组中同源MVA DNA之间分别的重组，可以产生因外来DNA序列的存在而修饰的MVA。
根据一优选实施方案，合适的细胞培养物的细胞，如CEF细胞，可以用痘病毒感染。随后，感染的细胞可以用第一质粒载体转染，其包含外来或异源基因或多个基因，优选在痘病毒表达控制元件的转录控制下。如上文所解释的，质粒载体还包含能够指导外源序列***痘病毒基因组选定部分的序列。任选地，质粒载体还含有盒，其包含可操作地连接至痘病毒启动子的标记和/或选择基因。
合适的标记或选择基因有，例如，编码绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶、新霉素-磷酸核糖转移酶或其他标记的基因。选择或标记盒的使用简化生成的重组痘病毒的鉴定和分离。然而，重组痘病毒也可以通过PCR技术来鉴定。随后，可以用如上所述获得的重组痘病毒感染其他细胞，并用包含第二外来或异源基因或多个基因的第二载体转染。如果该基因被引入痘病毒基因组的不同***位点，第二载体也有不同的痘病毒同源序列，其引导第二外来基因或多个基因整合到痘病毒的基因组中。在发生同源重组后，可以分离包含两个或更多个外来或异源基因的重组病毒。为了在重组病毒中引入额外的外来基因，可以重复感染和转染的步骤，使用在先前步骤中分离的重组病毒进行感染，并使用包含其他外来基因或多个基因的其他载体进行转染。
或者，上述感染和转染的步骤是可以互换的，即，可以先用包含外来基因的质粒载体转染合适的细胞，然后用痘病毒感染。作为进一步的替代选择，也可以将每个外来基因引入不同的病毒中，用所有获得的重组病毒共同感染细胞，并筛选包含所有外来基因的重组。第三种替代选择是在体外将DNA基因组和外来序列连接，并使用辅助病毒重组牛痘病毒DNA基因组。第四种替代选择是在大肠杆菌或其他细菌物种中，在克隆为细菌人工染色体(BAC)的牛痘病毒基因组(如MVA)与线性外来序列之间的同源重组，所述线性外来序列侧接与牛痘病毒基因组中期望整合的位点侧接的序列同源的DNA序列。
异源HBV基因(如HBV核心抗原、HBV pol抗原和/或HBV表面抗原)可以在一个或多个痘病毒启动子的控制下(即可操作地连接至)。在本申请的一实施方案中，痘病毒启动子为Pr7.5启动子、早期/晚期混合启动子或PrS启动子、PrS5E启动子、合成或天然的早期或晚期启动子、或牛痘病毒ATI启动子。
RNA复制子
优选地，载体为自复制RNA复制子。如本文中使用的，“自复制RNA分子”与“自扩增RNA分子”或“RNA复制子”或“复制子RNA”或“saRNA”互换使用，是指含有指导其在可允许的细胞(其可以是人、哺乳动物或动物细胞)内进行自我扩增或自复制所需的所有遗传信息的RNA。自复制RNA分子与mRNA相似。它是单链的、5′加帽、3′多腺苷酸化的，并且是正向的。为了指导其自我复制，RNA分子1)编码聚合酶、复制酶或其他蛋白，其可以与病毒或宿主细胞衍生的蛋白、核酸或核糖核蛋白相互作用以催化RNA扩增过程；并且2)含有复制和转录亚基因组复制子编码的RNA所需的顺式作用RNA序列。因此，递送的RNA导致多个子代RNA的产生。这些子代RNA以及共线的(collinear)亚基因组转录物可以自身翻译以提供感兴趣的基因的原位表达，或者可以转录以提供具有与递送的RNA相同义的进一步转录物，所述递送的RNA被翻译以提供感兴趣的基因的原位表达。这一系列转录的总体结果是引入的复制子RNA的量大幅扩增，因此感兴趣的编码基因成为细胞的主要多肽产物。
RNA复制子1)编码RNA依赖性RNA聚合酶，其可以与病毒或宿主细胞衍生的蛋白、核酸或核糖核蛋白来相互作用以催化RNA扩增过程，以及非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3、nsP4；以及2)含有复制和转录基因组和亚基因组RNA所需的顺式作用RNA序列，如3’和5’非翻译区(UTR；用于非结构蛋白介导的扩增的甲病毒核苷酸序列)，和/或亚基因组启动子。在复制过程中，这些序列可以结合自编码的蛋白，或者非自编码的细胞来源的蛋白、核酸或核糖核蛋白，或者任何这些组分之间的复合物。在一些实施方案中，修饰的RNA复制子分子通常含有以下顺序的元件：复制所需的顺式5′病毒RNA序列(如5’UTR和5’CSE)；编码生物活性非结构蛋白的序列(如nsP1234)；转录亚基因组RNA的启动子；复制所需的顺式3′病毒序列(如3’UTR)；和聚腺苷酸簇，以及任选存在的，在亚基因组启动子之后或其控制下的编码异源蛋白或肽的序列(或者两种或更多种序列)。此外，术语RNA复制子可以指正义(或信息义(message sense)分子，并且RNA复制子的长度可以与任何已知的天然存在的RNA病毒的长度不同。在本公开的任何实施方案中，RNA复制子可以缺少(或不含)至少一种(或全部)结构病毒蛋白(如，核衣壳蛋白C，以及包膜蛋白P62、6K和E1)的序列。在这些实施方案中，编码一个或多个结构基因的序列可以用一个或多个异源序列取代，例如，至少一种异源蛋白或肽(或其他感兴趣的基因(GOI))的编码序列。
在某些实施方案中，本申请的RNA复制子包含，从5’-端至3’-端排列：(1)非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的5’非翻译区(5’-UTR)；(2)编码RNA病毒的至少一种、优选全部非结构蛋白的多核苷酸序列；(3)RNA病毒的亚基因组启动子；(4)编码HBV抗原的多核苷酸序列；以及(5)非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的3’非翻译区(3’-UTR)。
在某些实施方案中，自复制RNA分子编码用于自扩增的酶复合物(复制酶多蛋白)，其包含RNA依赖性RNA-聚合酶功能、解旋酶、加帽和多聚腺苷酸化活性。复制酶下游的病毒结构基因在亚基因组启动子的控制下，可以被HBV抗原代替。转染时，复制酶被立即翻译，与基因组RNA的5′末端和3′末端相互作用，并合成互补的基因组RNA拷贝。这些作为模板，用于合成新的正义链、加帽和多腺苷酸化的基因组拷贝以及亚基因组转录物。扩增最终导致非常高的RNA拷贝数，高达2×105拷贝/细胞。因此，与常规mRNA相比，低得多的量的saRNA足以实现有效的基因转移和保护性疫苗接种(Beissert et al.，Hum Gene Ther.2017，28(12)：1138–1146)。
亚基因组RNA是长度或大小小于其衍生的基因组RNA的RNA分子。病毒亚基因组RNA可以从内部启动子转录，其序列位于基因组RNA或其互补物中。亚基因组RNA的转录可以由与宿主细胞编码的蛋白、核糖核蛋白或其组合相关的病毒编码聚合酶介导。许多RNA病毒产生用于表达其3′近端基因的亚基因组mRNA(sgRNA)。
在本公开的一些实施方案中，HBV抗原在亚基因组启动子的控制下表达。在某些实施方案中，代替原始的亚基因组启动子，亚基因组RNA可以位于源自以下的内部核糖体进入位点(IRES)的控制下：脑心肌炎病毒(EMCV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、脊髓灰质炎病毒、***病毒(FMD)、肠道病毒71(EV71)或丙型肝炎病毒。亚基因组启动子的范围从24个核苷酸(辛德毕斯病毒)到超过100个核苷酸(甜菜坏死黄脉病毒)，并且通常在转录起点的上游发现。
在一些实施方案中，RNA复制子包含至少1个、至少2个、至少3个或至少4个非结构病毒蛋白(如nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的编码序列。甲病毒基因组编码非结构蛋白nsp1、nsP2、nsP3和nsP4，其作为单一的多蛋白前体产生，有时命名为P1234(或nsP1-4或nsP1234)，并通过蛋白水解加工切割为成熟蛋白。nsP1的大小可以为约60kDa，并且可以具有甲基转移酶活性，并参与病毒的加帽反应。nsP2的大小为约90kDa，并且可以具有解旋酶和蛋白酶活性，而nsP3的大小为约60kDa，并且包含3个结构域：宏结构域(macrodomain)、中心(或甲病毒独特)结构域和超变结构域(HVD)。nsP4的大小为约70kDa，并且含有核心RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)催化结构域。感染后，甲病毒基因组RNA翻译以产生P1234多蛋白，其被切割成单个的蛋白。在本文公开核酸或多肽序列时，例如nsP1、nsP2、nsP3、nsP4的序列，还公开了认为是基于或源于原始序列的序列。
在一些实施方案中，RNA复制子包含至少一种非结构病毒蛋白的一部分的编码序列。例如，RNA复制子可以包含至少一种非结构病毒蛋白的编码序列的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％，或这些数值中的任何两个之间的范围。在一些实施方案中，RNA复制子可以包含至少一种非结构病毒蛋白的主要(substantial)部分的编码序列。如本文所用，编码非结构病毒蛋白的核酸序列的“主要部分”包括足够的编码非结构病毒蛋白的核酸序列，以提供该蛋白的推定鉴定，通过本领域技术人员对序列的人工评估，或提供使用诸如BLAST的算法的计算机自动序列比较和鉴定(参见，例如“BasicLocal Alignment Search Tool”；Altschul S F et al.，Mol.Biol.215:403-410，1993)。在一些实施方案中，RNA复制子可以包含至少一种非结构蛋白的整个编码序列。在一些实施方案中，RNA复制子基本上包含原始病毒非结构蛋白的所有编码序列。在某些实施方案中，一种或多种非结构病毒蛋白源自相同的病毒。在其他实施方案中，一种或多种非结构病毒蛋白源自不同的病毒。
RNA复制子可以源自任何合适的正链RNA病毒，如甲病毒或黄病毒。优选地，RNA复制子源自甲病毒。术语“甲病毒”描述披膜病毒科(Togaviridae)的包膜单链正义RNA病毒。甲病毒属包括约30个成员，其可以感染人和其他动物。甲病毒颗粒的直径通常为70nm，倾向于球形或略微的多形性，并具有40nm的等距核衣壳。甲病毒的基因组总长度为11,000-12,000核苷酸，并且具有5′帽和3′poly-A尾。基因组中有两个开放阅读框(ORF)，非结构(ns)和结构的。ns ORF编码的蛋白(nsP1-nsP4)对病毒RNA的转录和复制是必需的。结构ORF编码三个结构蛋白：核心核衣壳蛋白C，以及作为异二聚体相关的包膜蛋白P62和El。病毒膜锚定的表面糖蛋白负责受体识别和通过膜融合进入靶细胞。四种ns蛋白基因由基因组5′三分之二处的基因编码，而三个结构蛋白则由与基因组3′三分之一处共线的亚基因组mRNA翻译。
在一些实施方案中，用于本发明的自复制RNA为源自甲病毒病毒种的RNA复制子。在一些实施方案中，甲病毒RNA复制子具有属于VEEV/EEEV组、或SF组、或SIN组的甲病毒。SF组甲病毒的非限制性实例包括塞姆利基森林病毒、阿尼昂-尼昂病毒、罗斯河病毒、米德堡病毒(Middelburg virus)、奇昆古尼亚病毒、巴马森林病毒、盖塔病毒、马雅罗病毒、鹭山病毒、贝巴鲁病毒和乌纳病毒。SIN组甲病毒的非限制性实例包括辛德毕斯病毒、GirdwoodS.A.病毒、86号南非虫媒病毒(South African Arbovirus No.86)、Ockelbo病毒、奥拉病毒、巴班肯病毒、沃达罗河病毒和库孜拉加奇病毒。VEEV/EEEV组甲病毒的非限制性实例包括东部马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、沼泽地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、那皮舒纳病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、奇昆古尼亚病毒(CHIKV)、阿尼昂-尼昂病毒(ONNV)、罗斯河病毒(RRV)、巴马森林病毒(BF)、盖塔病毒(GET)、鹭山病毒(SAGV)、贝巴鲁病毒(BEBV)、马雅罗病毒(MAYV)和乌纳病毒(UNAV)。
甲病毒物种的非限制性实例包括东部马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、沼泽地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、那皮舒纳病毒(PIXV)、米德堡病毒(MIDV)、奇昆古尼亚病毒(CHIKV)、阿尼昂-尼昂病毒(ONNV)、罗斯河病毒(RRV)、巴马森林病毒(BF)、盖塔病毒(GET)、鹭山病毒(SAGV)、贝巴鲁病毒(BEBV)、马雅罗病毒(MAYV)、乌纳病毒(UNAV)、辛德毕斯病毒(SINV)、奥拉病毒(AURAV)、沃达罗河病毒(WHAV)、巴班肯病毒(BABV)、库孜拉加奇病毒(KYZV)、西部马脑炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜穆病毒(NDUV)和博吉河病毒。毒性和无毒性甲病毒毒株都是合适的。在一些实施方案中，甲病毒RNA复制子属于辛德毕斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、罗斯河病毒(RRV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)或东部马脑炎病毒(EEEV)。在一些实施方案中，甲病毒RNA复制子属于委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)。
在某些实施方案中，自复制RNA分子包含编码一个或多个非结构蛋白nsp1-4的多核苷酸、亚基因组启动子如26S亚基因组启动子以及编码本文所述的HBV抗原或其片段的感兴趣的基因。
自复制RNA分子可以具有5'帽(如，7-甲基鸟苷)。这个帽可以增强RNA的体内翻译。
用于本发明的自复制RNA分子5'核苷酸可以具有5'三磷酸基团。在加帽的RNA中，这可以通过5'-至-5'桥连接至7-甲基鸟苷。5'三磷酸可以增强RIG-I结合。
自复制RNA分子可以具有3′poly-A尾。它还可以在靠近其3'端处包含poly-A聚合酶识别序列(如AAUAAA)。
在本公开的任何实施方案中，RNA复制子可以缺少(或不含有)至少一种(或全部)结构病毒蛋白(如，核衣壳蛋白C以及包膜蛋白P62、6K和E1)的编码序列。在这些实施方案中，编码一个或多个结构基因的序列可以用一个或多个异源序列取代，例如本文所述的HBV抗原或其片段的编码序列。
在某些实施方案中，本申请的自复制RNA载体包含一个或多个特征以赋予对先天免疫***的翻译抑制的抗性或者以其他方式增加GOI(如HBV抗原)的表达。
在某些实施方案中，RNA序列可以进行密码子优化以提高翻译效率。RNA分子可以鉴于本公开，通过本领域已知的任何方法进行修饰，以提高稳定性和/或翻译，例如添加polyA尾(如至少30个腺苷残基)；和/或用修饰的核糖核苷酸在5-端加帽(如7-甲基鸟苷帽)，这可以在RNA合成过程中并入或在RNA转录后酶促改造。
在某些实施方案中，本申请的RNA复制子包含，从5’-端至3’-端排列：(1)甲病毒5’非翻译区(5’-UTR)；(2)甲病毒非结构基因nsp1的5’复制序列；(3)病毒种的下游环(DLP)基序；(4)编码第四自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；(5)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的核苷酸序列；(6)甲病毒亚基因组启动子；(7)本申请的编码一个或多个HBV抗原的非天然存在的多核苷酸序列；(8)甲病毒3′非翻译区(3′UTR)；以及(9)任选地，多腺苷酸序列。
在某些实施方案中，本申请的自复制RNA载体包含病毒种的下游环(DLP)基序。如本文所用，“下游环”或“DLP基序”指包含至少一个RNA茎环的多核苷酸序列，当置于开放阅读框(ORF)的起始密码子下游时，其提供与相比没有DLP基序的除此之外相同的构建体增加的ORF翻译。作为实例，甲病毒属的成员可以通过病毒26S转录本中存在的突出(prominent)RNA结构来抵抗抗病毒RNA激活蛋白激酶(PKR)的激活，这使得这些mRNA的翻译起始不依赖于eIF2。这个结构称为下游环(DLP)，位于SINV 26S mRNA中AUG的下游。塞姆利基森林病毒(SFV)中也检测到DLP。类似的DLP结构据报道存在于甲病毒属的至少14个其他成员中，包括新世界(例如，MAYV、UNAV、EEEV(NA)、EEEV(SA)、AURAV)和旧世界(SV、SFV、BEBV、RRV、SAG、GETV、MIDV、CHIKV和ONNV)成员。这些甲病毒26S mRNA的预测结构基于SHAPE(选择性2′-羟基酰化和引物延伸)数据构建(Toribio et al.，Nucleic Acids Res.May 19；44(9)：7368-80，2016)，其内容援引加入本文)。除CHIKV和ONNV，在所有情况下都检测到稳定的茎环结构，而MAYV和EEEV显示的DLP稳定性较低(Toribio et al.，2016，见上文)。在辛德毕斯病毒的情况下，DLP基序在辛德毕斯亚基因组RNA的前150nt发现。发夹位于辛德毕斯衣壳AUG起始密码子的下游(AUG位于(collate)辛德毕斯亚基因组RNA的nt 50处)。以前的序列比较和结构RNA分析研究揭示了DLP在SINV中的进化保守性，并预测在甲病毒属的许多成员中存在相当的DLP结构(参见，例如Ventoso，J.Virol.9484-9494，Vol.86，Seotenver 2012)。包含DLP基序的自复制RNA载体的实例描述于美国专利申请公开US2018/0171340和国际专利申请公开WO2018106615，其内容整体援引加入本文。在一些实施方案中，本申请的复制子RNA包含DLP基序，其表现出与SEW ID NO：57所示的序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性。
在一实施方案中，自复制RNA分子还含有可操作地连接至DLP基序下游和非结构蛋白(如nsp1-4中的一个或多个)或感兴趣的基因(如本文所述的HBV抗原)的编码序列上游的自体蛋白酶肽的编码序列。自体蛋白酶肽的实例包括但不限于，选自以下肽序列：猪捷申病毒-12A(P2A)、***病毒(FMDV)2A(F2A)、马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV2A)、软化病病毒2A(BmIFV2A)及其组合。在一些实施方案中，本申请的复制子RNA包含具有SEW ID NO：11的氨基酸序列的P2A的编码序列。优选地，编码序列表现出与SEQ ID NO:12所示的序列的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性。
本发明的任何复制子也可以包含5’和3’非翻译区(UTR)。UTR可以是野生型新世界或旧世界甲病毒UTR序列，或从它们中的任何衍生的序列。在各种的实施方案中，5’UTR可以具有任何合适的长度，例如约60nt或50-70nt或40-80nt。在一些实施方案中，5’UTR也可以具有保守的一级或二级结构(如一个或多个茎环)，并可以参与甲病毒或复制子RNA的复制。在一些实施方案中，3’UTR可以高达数百核苷酸，例如可以是50-900、或100-900、或50-800、或100-700、或200nt-700nt。3’UTR也可以具有二级结构，例如茎环(step loop)，并可以在其后有聚腺苷酸束或poly-A尾。在本发明的任何实施方案中，5’非翻译区和3’非翻译区可以与复制子编码的任何其他序列可操作地连接。UTR可以通过提供用于识别和转录其他编码序列所需的序列和间隔，与启动子和/或编码异源蛋白或肽的序列可操作地连接。鉴于本公开，可以使用本领域技术人员已知的任何多腺苷酸化信号。例如，多腺苷酸化信号可以是SV40多腺苷酸化信号、LTR多腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多腺苷酸化信号或人β-球蛋白多腺苷酸化信号。
在另一实施方案中，本申请的自复制RNA复制子包含修饰的5’非翻译区(5′-UTR)，优选地，RNA复制子缺少至少一部分编码病毒结构蛋白的核酸序列。例如，修饰的5′-UTR可以包含在1、2、4位或其组合的一个或多个核苷酸取代。优选地，修饰的5′-UTR包含2位处的核苷酸取代，更优选地，修饰的5′-UTR具有2位处的U->G或U->A取代。这样的自复制RNA分子的实例描述于美国专利申请公开US2018/0104359和国际专利申请公开WO2018075235，其内容整体援引加入本文。在一些实施方案中，本申请的复制子RNA包含5′-UTR，其表现出与SSEQ ID NO：55所示的序列至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列相同性。
在一些实施方案中，本申请的RNA复制子包含，从5’-端至3’-端排列：(1)具有SEQID NO：55的多核苷酸序列的5’-UTR，(2)具有SEQ ID NO：56的多核苷酸序列的5’复制序列，(3)包含SEQ ID NO：57的多核苷酸序列的DLP基序，(4)编码SEQ ID NO：11的P2A序列的多核苷酸序列，(5)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的多核苷酸序列，其分别具有SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61的核酸序列，(6)具有SEQ IDNO：62的多核苷酸序列的亚基因组启动子，(7)本文所述的非天然存在的多核苷酸序列，以及(8)具有SEQ ID NO：63的多核苷酸序列的3′UTR。在一些实施方案中，编码P2A序列的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：12，非天然存在的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：15-54中任一个的多核苷酸序列，并且RNA复制子还包含多腺苷酸序列。优选地，多腺苷酸序列具有SEQ IDNO：64的序列，在复制子的3’端。
在一些优选的实施方案中，本申请的RNA复制子包含SEQ ID NO：65-72中任一个的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，本申请的RNA复制子包含编码信号肽序列的多核苷酸序列。优选地，编码信号肽序列的多核苷酸序列位于多核苷酸序列的5’端的上游或位于5’端，所述多核苷酸序列编码HBV抗原，例如HBV PreS1抗原、HBV核心抗原和HBV pol抗原。信号肽通常指导蛋白的定位，促进蛋白从产生其的细胞分泌，和/或改进抗原表达和对抗原呈递细胞的交叉呈递。当从复制子中表达时，信号肽可以存在于HBV抗原的N末端，但被信号肽酶切割，例如在从细胞中分泌时。信号肽已被切割的表达蛋白通常称为“成熟蛋白”。鉴于本公开，可以使用本领域内已知的任何信号肽。例如，信号肽可以是胱抑素S信号肽；免疫球蛋白(Ig)分泌信号，如胱抑素S信号肽、Ig重链γ信号肽SPIgG、Ig重链ε信号肽SPIgE，或短前导肽序列。示例性信号肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO：77。
在各种实施方案中，本文公开的RNA复制子可以是工程化的、合成的或重组的RNA复制子。如本文所用，术语重组表示任何分子(如DNA、RNA等)，其是或间接地产生于对多核苷酸的人为操纵。作为非限制性实例，cDNA是重组DNA分子，如通过体外聚合酶反应产生的任何核酸分子，或与其连接了接头，或已整合到载体中，如克隆载体或表达载体。作为非限制性实例，重组RNA复制子可以是以下的一种或多种：1)体外合成或修饰，例如，使用化学或酶促技术(例如，使用化学核酸合成，或使用用于复制、聚合、核酸外切消化、核酸内切消化、连接、逆转录、转录、碱基修饰(包括，例如甲基化)或核酸分子的重组(包括同源和定点重组)的酶；2)自然界中并非共连接的共连接的核苷酸序列；3)使用分子克隆技术进行改造，从而其与天然存在的核苷酸序列相比，缺少一个或多个核苷酸；和4)使用分子克隆技术进行操作，从而其与天然存在的核苷酸序列相比，具有一个或多个序列变化或重排。
RNA复制子的任何组分或序列可以可操作地连接至任何其他组分或序列。RNA复制子的组分或序列可以可操作地连接，用于在宿主细胞或处理的生物体中表达至少一种异源蛋白或肽(或生物治疗剂)和/或用于复制子自复制的能力。术语“可操作地连接”指两个或更多个序列之间的功能连接，所述序列配置为执行其通常功能。因此，当适当的酶存在时，可操作地连接至编码序列的启动子或UTR能够实现编码序列的转录和表达。启动子无需与编码序列相邻，只要它能行使功能以指导其表达。因此，编码异源蛋白或肽的RNA序列与调节序列(如启动子或UTR)之间的可操作地连接是功能连接，其允许表达感兴趣的多核苷酸。可操作地连接也可以指序列的连接，例如编码nsP1-4的序列、UTR、启动子和RNA复制子中编码的其他序列，从而他们允许生物治疗分子的转录和翻译和/或复制子的复制。UTR可以通过提供其他编码序列的核糖体识别和翻译所需的序列和间隔被可操作地连接。
本发明的RNA复制子可以源自甲病毒基因组，这意味着它们具有甲病毒基因组的一些结构特征，或与它们相似。本发明的RNA复制子可以是修饰的甲病毒基因组。在一些实施方案中，本文公开的复制子中，一个或多个复制子的序列可以“反式(in trans)”提供，即复制子的序列提供在一个以上的RNA分子上。在其他实施方案中，复制子的所有序列存在于单一的RNA分子上，其也可以向本文所述待治疗的哺乳动物给药。
如本文使用的，术语“百分比相同性”或“同源性”或“共享序列相同性”或“百分比(％)序列相同性”，对于核酸或多肽序列，定义为在对序列进行最大百分比相同性比对，并且在必要时引入空位，以实现最大百分比同源性之后，候选序列中与已知多核苷酸或多肽相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。N-末端或C-末端***或缺失不应解释为影响同源性，并且内部缺失和/或***核苷酸或多肽序列中的约30以下、约20以下或约10以下或5以下的氨基酸残基不应理解为影响同源性。核苷酸或氨基酸序列水平的同源性或相同性可以通过BLAST(基本局部比对检索工具)分析来确定，使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx(Altschul(1997)，Nucleic Acids Res.25，3389-3402和kARLIN(1990)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，2264-2268)，其是为序列相似性检索定制的。BLAST程序使用的方法首先考虑查询序列和数据库序列之间的相似片段，有空位和无空位，然后评估所有鉴定匹配的统计学显著性，最后仅总结那些满足预先选择的显著性阈值的匹配。关于序列数据库相似性检索的基本问题的讨论，参见Altschul(1994)，Nature Gentics 6，119-129。直方图、描述、比对、预期(即报告与数据库序列匹配的统计学显著性的阈值)、截断值、矩阵和过滤器(低复杂性)的检索参数可以为默认设置。Blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默认评分矩阵为BLOSUM62矩阵(Henikoff(1992)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10915-10919)，推荐用于长度超过85的查询序列(核苷酸碱基或氨基酸)。
对于为比较核苷酸序列设计的blastn，评分矩阵由M(即一对匹配残基的奖励得分)与N(即不匹配残基的惩罚得分)的比率设定，其中M和N的默认值可以分别为+5和-4。四个blastn参数可以调整如下。Q＝10(空位创建罚分)；R＝10(空位扩展罚分)；wink＝1(在沿查询的每个winkth位置生成词命中)；gapw＝16(设定产生空位比对的窗口宽度)。用于比较氨基酸序列的等效Blastp的参数设置可以是Q＝9；R＝2；wink＝1；以及gapw＝32。GCG软件包10.0版中可用的序列之间的
Figure BDA0004111907790000441
比较可以使用DNA参数GAP＝50(空位创建罚分)和LEN＝3(空位扩展罚分)，蛋白比较中的等效设置可以是GAP＝8和LEN＝2。
在本文公开核酸或多肽序列时，例如病毒衣壳增强子、自体蛋白酶肽、亚基因组启动子、非结构蛋白、HBV抗原，还公开了认为基于或源自原始序列的序列。因此，公开的序列包括多核苷酸或多肽序列，其分别与本文描述的任何多核苷酸或多肽序列的全长多核苷酸或多肽序列具有至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％，例如至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列相同性，或者85-99％或85-95％或90-99％或95-99％或97-99％或98-99％序列相同性，例如SEQ ID NO：1-90及其片段。还公开了任何本文公开序列的片段或部分。序列的片段或部分可以包含这样的序列，其具有本文公开的SEQ ID NO：1-90中任一个的完整序列或任何片段的至少5、或至少7、或至少10、或至少20、或者至少30、至少50、至少75、至少100、至少125、150或更多个，或者5-10、或10-12、或10-15、或15-20、或20-40、或20-50、或30-50、或30-75、或30-100个氨基酸或核酸残基，或者至少100、或至少200、或至少300、或至少400、或至少500、或至少600、或至少700、或至少800、或至少900、或至少1000、或者100-200、或100-500、或100-1000、或500-1000个氨基酸或核酸残基，或者任何这些量，但少于500、或少于700、或少于1000、或少于2000个组成型氨基酸或核酸。还公开了这些序列的变体，例如其中至少1或2或3或4或5个氨基酸残基已经***含有***和取代的公开序列的N-末端和/或C-末端和/或含有***和取代的公开序列中，以及编码这样的变体的核酸序列。所考虑的变体可以额外地或者可选地包括那些通过例如同源重组或定点或PCR诱变而含有预定的突变的变体，以及其他物种的相应多肽或核酸，包括但不限于本文描述的那些，多肽或核酸家族中含有***和取代的等位基因或其他天然存在变体；和/或其中多肽已通过取代、化学、酶促或其他适当的方法用含有***和取代的天然存在的氨基酸以外的部分(例如，可检测的部分，如酶)共价修饰的衍生物。本文所述的核酸序列可以是RNA序列。
异源蛋白和肽
本发明的RNA复制子可以包含编码至少一种蛋白或肽的RNA序列，所述RNA序列与甲病毒异源，也可以(但并非必须)与在体内表达这RNA序列的人、哺乳动物或动物异源。在任何实施方案中，复制子可以具有编码两种或三种或四种或更多种异源蛋白或肽的RNA序列。在一些实施方案中，异源蛋白或肽是本文所述的HBV抗原。在任何实施方案中，编码异源蛋白或肽的序列可以与复制子的一个或多个其他序列(如，启动子或者5’或3’UTR序列)可操作地连接，并且可以在亚基因组启动子的控制下，使异源蛋白或肽在人、哺乳动物或动物中表达。
在一实施方案中，本发明的RNA复制子可以具有编码异源蛋白或肽(如，单克隆抗体或生物治疗性蛋白或肽)的RNA序列，编码源自野生型甲病毒nsP1、nsP2、nsP3和nsP4蛋白序列的氨基酸序列的RNA序列，以及5’和3’UTR序列(用于非结构蛋白介导的扩增)。RNA复制子还可以具有5’帽和聚腺苷酸(或poly-A)尾。
异源蛋白或肽的免疫原性可以通过一些普通技术人员已知的测定来确定，例如通过表位特异性T细胞群体对细胞内细胞因子或分泌的细胞因子进行免疫染色，或者通过定量表位特异性T细胞的频率和总数，并表征它们的分化和激活状态，例如短命效应CD8+T细胞和记忆前体效应CD8+T细胞。免疫原性也可以通过测量抗体介导的免疫应答来确定，例如，通过测量血清IgA或IgG滴度的抗体的产生。
除了本申请的HBV抗原，本申请的RNA复制子还可以任选地进一步编码一种或多种异源蛋白或肽，其可以是任何蛋白或肽，包括但不限于细胞因子、生长因子、免疫球蛋白、单克隆抗体(包括Fab抗原结合片段、Fc融合蛋白)、激素、干扰素、白细胞介素、调节肽和蛋白。
在一些实施方案中，异源蛋白或多肽可以由高达5kb、或高达6kb、或高达7kb、或高达8kb、或高达9kb、或高达10kb、或高达11kb、或高达12kb的RNA序列编码。异源蛋白也可以是单链抗体分子。
本发明的甲病毒复制子也可以具有用于表达异源蛋白或肽的亚基因组启动子。如本文所用，术语“亚基因组启动子”是指病毒核酸的亚基因组mRNA的启动子。如本文所用，“甲病毒亚基因组启动子”是最初在甲病毒基因组中定义的启动子，其指导作为甲病毒复制过程的一部分的亚基因组信使RNA的转录。
当提及多核苷酸、基因、核酸、多肽、蛋白或酶时，术语“异源”表示多核苷酸、基因、核酸、多肽、蛋白或酶不是源自宿主物种。例如，本文所用的“异源基因”或“异源核酸序列”是指来自与引入基因或核酸序列的宿主生物体物种不同的物种。异源序列也可以是合成的，而不是源自生物体，也不是在自然界中发现的。当提及基因调节序列或用于操作基因序列表达的辅助核酸序列(例如5'非翻译区、3'非翻译区、poly A添加序列、内含子序列、剪接位点、核糖体结合位点、内部核糖体进入序列、基因组同源区、重组位点等)，或者编码蛋白结构域或蛋白定位序列的核酸序列时，“异源”表示调节或辅助序列或者编码蛋白结构域或定位序列的序列与基因组、染色体或附加体(episome)中与调节或辅助核酸序列或者编码蛋白结构域或定位序列的核酸序列并列的基因来源不同。因此，与基因可操作地连接的启动子，其在天然状态下(例如，在非遗传改造生物体的基因组中)与所述基因不是可操作地连接，在本文中称为“异源启动子”，虽然所述启动子可能源自与其连接的基因相同的物种(或在某些情况下，相同的生物体)。类似地，当提及改造蛋白的蛋白定位序列或蛋白结构域时，“异源”表示所述定位序列或蛋白结构域源自不同于通过基因工程引入的蛋白。
如本文所用，术语“非天然存在”、“重组”或“改造”的核酸分子或多核苷酸序列是指通过人干预而改变的核酸分子或非天然存在的多核苷酸序列。作为非限制性实例，重组核酸分子：1)已经体外合成或修饰，例如，使用化学或酶促技术(例如，使用化学核酸合成，或使用用于复制、聚合、核酸外切消化、核酸内切消化、连接、逆转录、转录、碱基修饰(包括，例如甲基化)或核酸分子的重组(包括同源和定点重组)的酶；2)包含自然界中并非共连接的共连接的核苷酸序列；3)已经使用分子克隆技术进行改造，从而其与天然存在的核苷酸序列相比，缺少一个或多个核苷酸；和/或4)已经使用分子克隆技术进行操作，从而其与天然存在的核苷酸序列相比，具有一个或多个序列变化或重排。作为非限制性实例，cDNA为重组DNA分子，其为通过体外聚合酶反应产生的任何核酸分子或与其连接的接头，或者整合入载体的任何核酸分子，如克隆载体或表达载体，或者整合入RNA复制子的任何核酸分子。
在一些实施方案中，本发明的RNA复制子包含，从5’-端至3’-端排列：非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的5’非翻译区(5’-UTR)；编码RNA病毒的至少一种、优选全部非结构蛋白的多核苷酸序列；RNA病毒的亚基因组启动子；本文所述的非天然存在的多核苷酸序列；以及非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的3’非翻译区(3’-UTR)。
在一些实施方案中，本发明的RNA复制子包含，从5’-端至3’-端排列：甲病毒5’非翻译区(5’-UTR)；甲病毒非结构基因nsp1的5’复制序列；病毒种的下游环(DLP)基序；编码第四自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的核苷酸序列；甲病毒亚基因组启动子；本文所述的非天然存在的多核苷酸序列；甲病毒3′非翻译区(3′UTR)；以及任选地，多腺苷酸序列。
在一些实施方案中，DLP基序来自选自以下的病毒种：东部马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、沼泽地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、那皮舒纳病毒(PIXV)、米德堡病毒(MTDV)、奇昆古尼亚病毒(CHIKV)、阿尼昂-尼昂病毒(ONNV)、罗斯河病毒(RRV)、巴马森林病毒(BF)、盖塔病毒(GET)、鹭山病毒(SAGV)、贝巴鲁病毒(BEBV)、马雅罗病毒(MAYV)、乌纳病毒(U AV)、辛德毕斯病毒(SINV)、奥拉病毒(AURAV)、沃达罗河病毒(WHAV)、巴班肯病毒(BABV)、库孜拉加奇病毒(KYZV)、西部马脑炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜穆病毒(NDUV)和博吉河病毒。
在一些实施方案中，第四自体蛋白酶肽选自猪捷申病毒-12A(P2A)、***病毒(FMDV)2A(F2A)、马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV2A)、软化病病毒2A(BmIFV2A)、及其组合。优选地，第四自体蛋白酶肽包含P2A的肽序列。在一些实施方案中，第四自体蛋白酶肽包含SEQ ID NO：11。在一些实施方案中，编码第四自体蛋白酶肽的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：12。在一些实施方案中，编码第四自体蛋白酶肽的多核苷酸序列由SEQ ID NO：12组成。
在一些实施方案中，本发明的RNA复制子包含，从5’-端至3’-端排列：具有SEQ IDNO：55的多核苷酸序列的5’-UTR；具有SEQ ID NO：56的多核苷酸序列的5’复制序列；包含SEQ ID NO：57的多核苷酸序列的DLP基序；编码SEQ ID NO：11的P2A序列的多核苷酸序列；编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的多核苷酸序列，如分别由SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61的核酸序列编码的那些；具有SEQ ID NO：62的多核苷酸序列的亚基因组启动子；本文公开的非天然存在的多核苷酸序列；以及具有SEQID NO：63的多核苷酸序列的3′UTR。在一些实施方案中，编码P2A序列的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：12，非天然存在的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：15-54中任一个的多核苷酸序列，并且RNA复制子还包含多腺苷酸序列。优选地，多腺苷酸序列具有SEQ ID NO：64的序列，在复制子的3’端。
在一些实施方案中，本发明的RNA复制子包含SEQ ID NO：65-72中任一个的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，包含编码本文公开的RNA复制子的多核苷酸序列的核酸分子还包含可操作地连接至DNA序列的5’端的T7启动子。更优选地，T7启动子包含SEQ ID NO：73的核苷酸序列。
本文还提供制备本申请的RNA复制子的方法，其包括转录核酸分子，所述核酸分子包含编码本文公开的RNA复制子的DNA序列。在一些实施方案中，体内转录核酸分子。在一些实施方案中，体外转录核酸分子。
细胞和多肽
本申请还提供细胞，优选分离的细胞，其包含本文所述的任何多核苷酸和载体。细胞可以例如用于重组蛋白产生或用于产生病毒颗粒。在一些实施方案中，细胞可以用于产生RNA复制子。
包含本申请的RNA复制子或编码RNA复制子的核酸的宿主细胞也构成本发明的一部分。HBV抗原可以通过重组DNA技术生产，其涉及分子在宿主细胞中的表达，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、肿瘤细胞系、BHK细胞、人细胞系如HEK293细胞、PER.C6细胞，或者酵母、真菌、昆虫细胞等，或者转基因动物或植物。在某些实施方案中，细胞来自多细胞生物，在某些实施方案中，它们来自脊椎动物或无脊椎动物。在某些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞，如人细胞或昆虫细胞。一般来说，在宿主细胞中生产重组蛋白，如本发明的HBV抗原，包括将编码蛋白的异源核酸分子以可表达的形式引入宿主细胞，在有利于核酸分子表达的条件下培养细胞，并使蛋白在所述细胞中表达。编码可表达形式的蛋白的核酸分子可以是表达盒的形式，并且通常需要能够实现核酸表达的序列，如增强子、启动子、多腺苷酸化信号等。本领域技术人员了解，各种启动子可用于获得基因在宿主细胞中的表达。启动子可以是组成型的，也可以是调节型的，并且可以从各种来源获得，包括病毒、原核生物或真核生物来源，或者可以是人工设计。可以进一步添加调节序列。许多启动子可用于表达转基因，并且是技术人员已知的，例如，这些启动子可包括病毒、哺乳动物、合成启动子等。用于在真核细胞中获得表达的合适启动子的非限制性实例为CMV-启动子(US 5，385，839)，例如CMV立即早期启动子，例如包含CMV立即早期基因增强子/启动子的nt.-735至+95。多腺苷酸化信号，例如牛生长激素polyA信号(US 5，122，458)，可以存在于转基因之后。或者，一些广泛使用的表达载体是本领域中和商业来源可得的，例如Invitrogen的pcDNA和pEF载体系列，BDSciences的pMSCV和pTK-Hyg，Stratagene的pCMV-Script等，其可以用于重组表达感兴趣的蛋白，或者获得合适的启动子和/或转录终止子序列、polyA序列等。
细胞培养可以是任何类型的细胞培养，包括贴壁细胞培养，例如附着在培养容器表面或微载体上的细胞，以及悬浮培养。大多数大规模悬浮培养以分批或进料分批处理的方式进行，因为它们是最直接的操作和扩大规模。如今，基于输注原理的连续处理变得越来越普遍，并且也是合适的。合适的培养基对于技术人员来说也是熟知的，并且一般可以从商业来源大量获得，或者根据标准方案定制。培养可以在盘、摇瓶或生物反应器中进行，使用分批、进料分批、连续***等。培养细胞的合适条件是已知的(参见，例如Tissue Culture，Academic Press，Kruse adn Paterson，editors(1973)和R.I.Freshney，Culture ofanimal cells：A manual of basic technique，fourth edition(Wiley-Liss Inc.，2000，-Liss Inc.，2000，ISBN 0-471-34889-9))。细胞培养基可以从各种供应商获得，并且可以为宿主细胞常规地选择合适的培养基来表达感兴趣的蛋白，这里是HBV抗原。合适的培养基可以含有血清或者不含有血清。
因此，本申请的实施方案还涉及一种制备本申请的HBV抗原的方法。所述方法包括用表达载体转染宿主细胞，所述表达载体包含可操作地连接至启动子的编码本申请的HBV抗原的多核苷酸，使转染的细胞在适合表达HBV抗原的条件下生长，以及任选地纯化或分离细胞中表达的HBV抗原。可以通过本领域已知的任何方法从细胞中分离或收集HBV抗原，包括亲和色谱、尺寸排除色谱等。鉴于本公开，本领域普通技术人员熟知用于重组蛋白表达的技术。表达的HBV抗原也可以在不纯化或不分离表达的蛋白的情况下研究，例如，通过分析用编码HBV抗原的表达载体转染的细胞的上清并在适合表达HBV抗原的条件下生长。
因此，本文还提供非天然存在的多肽或重组的多肽，其包含与SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、84、85或86或者SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列。如上和如下所述，本申请还考虑编码这些序列的分离核酸分子、包含可操作地连接至启动子的这些序列的载体，以及包含所述多肽、多核苷酸或载体的组合物。
在本申请的一实施方案中，重组多肽包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7、84、85或86或者SEQ ID NO：9的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、84、85或86或SEQ IDNO：9 90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。优选地，非天然存在的多肽或重组的多肽由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：、SEQ ID NO：84、85或86或者SEQ ID NO：9组成。
组合物
本申请还涉及组合物、药物组合物、免疫原性组合，并且更特别是疫苗，其包含一种或多种HBV抗原、编码本申请的一种或多种HBV抗原的多核苷酸和/或载体。本申请所述的任何HBV抗原、多核苷酸(包括RNA和DNA)和/或载体可以用于本申请的组合物、药物组合物、免疫原性组合和疫苗。
本申请提供例如一种药物组合物，其包含本文所述的任何核酸分子、载体或RNA复制子，以及药学可接受的载剂。药学可接受的载剂是无毒的，并且不应干扰活性成分的效力。药学可接受的载剂可以包括一种或多种赋形剂，如粘合剂、崩解剂、溶胀剂、悬浮剂、乳化剂、润湿剂、润滑剂、调味剂、甜味剂、防腐剂、染料、增溶剂和包衣。载剂或其他材料的确切性质可以取决于给药途径，例如，肌内、皮内、皮下、口服、静脉内、皮肤、粘膜内(例如，肠道)、鼻内或腹腔内途径。对于液体注射制剂，例如悬浮液和溶液，合适的载剂和添加剂包括水、乙二醇、油、醇、防腐剂、着色剂等。对于固体口服制剂，例如粉剂、胶囊剂(capsule)、囊片(caplet)、胶囊(gelcap)和片剂，合适的载剂和添加剂包括淀粉、糖、稀释剂、造粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。对于鼻喷剂/吸入剂混合物，水溶液/悬浮液可以包括水、乙二醇、油、润肤剂、稳定剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂、香料等作为合适的载剂和添加剂。
本申请的药物组合物可以配制成任何适合向受试者给药的物质，以促进给药和提高效力，包括但不限于口服(肠道)给药和肠胃外注射。肠胃外注射包括静脉内注射或输注、皮下注射、皮内注射和肌内注射。本申请的药物组合物也可以配制为其他给药途径，包括经粘膜、眼、直肠、长效植入、舌下给药、舌下、从口腔粘膜绕门静脉循环、吸入或鼻内。
在本申请的一优选实施方案中，本申请的药物组合物配制为肠胃外注射，优选皮下注射、皮内注射或肌内注射，更优选肌内注射。
根据本申请的实施方案，用于给药的药物组合物通常包括药学可接受的载剂中的缓冲溶液，例如，含水载剂，如缓冲盐水等，如磷酸缓冲盐水(PBS)。组合物和免疫原性组合还可以根据需要含有药学可接受的物质，以接近生理条件，如pH调节剂和缓冲剂。例如，包含质粒DNA的本申请的药物组合物可以包含磷酸缓冲盐水(PBS)作为药学可接受的载剂。质粒DNA存在的浓度可以为例如0.5mg/mL-5mg/mL，例如0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL或5mg/mL，优选1mg/mL。
在一些实施方案中，包含RNA复制子的本申请的药物组合物的给药浓度可以为约20μg/mL-约200μg/mL，例如20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、110μg/mL、120μg/mL、130μg/mL、140μg/mL、150μg/mL、160μg/mL、170μg/mL、180μg/mL、190μg/mL或200μg/mL。在一些实施方案中，包含RNA复制子的本申请的药物组合物的给药浓度可以为20μg/mL以下。在一些实施方案中，包含RNA复制子的本申请的药物组合物的给药浓度可以为200μg/mL以上。
本申请的药物组合物可以按照本领域公知的方法配制成疫苗(也称为“免疫原性组合物”)。这样的组合物可以包含佐剂以增强免疫应答。制剂中每种组分的最佳比例可以鉴于本公开，通过本领域技术人员熟知的技术来确定。
在本申请的一特定实施方案中，药物组合物、组合物或免疫原性组合为DNA疫苗。DNA疫苗通常包含细菌质粒，其含有编码强真核启动子控制下的编码感兴趣的抗原的多核苷酸。一旦质粒递送到宿主的细胞质中，编码的抗原就内源性地产生和加工。所得的抗原通常诱导体液介导的免疫应答和细胞介导的免疫应答。DNA疫苗的优势至少在于它们提供改进的安全性，温度稳定，可以容易地适于表达抗原性变体，并且生产简单。本申请的任何DNA质粒可以用来制备这样的DNA疫苗。
在本申请的其他特定实施方案中，药物组合物、组合物或免疫原性组合为RNA疫苗。RNA疫苗通常包含至少一种编码感兴趣的抗原的单链RNA分子，例如HBV抗原。一旦RNA递送到宿主的细胞质中，编码的抗原就内源性地产生和加工，诱导体液介导的免疫应答和细胞介导的免疫应答，类似于DNA疫苗。RNA序列可以进行密码子优化以改进翻译效率。鉴于本公开，RNA分子可以通过本领域已知的任何方法进行修饰，以增强稳定性和/或翻译，例如添加polyA尾，如至少30个腺苷残基；和/或用修饰的核糖核苷酸，如7-甲基鸟苷帽盖进行5端加帽，这可以在RNA合成期间并入或在RNA转录后酶促加工。RNA疫苗也可以是由甲病毒表达载体开发的自复制RNA疫苗。自复制RNA疫苗包括源自属于甲病毒家族的病毒的复制酶RNA分子，其具有控制HBV抗原RNA复制的亚基因组启动子，然后是位于复制酶下游的poly A尾。
在某些实施方案中，佐剂包含在本申请的药物组合物中，或与本申请的药物组合物共同给药。佐剂的使用是任选的，并且当组合物用于疫苗接种目的时，可以进一步增强免疫应答。适用于共同给药或包含在本申请的组合物中的佐剂优选为在人中可能是安全的、良好耐受和有效的佐剂。佐剂可以是小分子或抗体，其包括但不限于免疫检查点抑制剂(如抗PD1、抗TIM-3等)、toll样受体激动剂(如TLR7激动剂和/或TLR8激动剂)、RIG-1激动剂、IL-15超激动剂(Altor Bioscience)、突变体IRF3和IRF7基因佐剂、STING激动剂(Aduro)、FLT3L基因佐剂、IL-12基因佐剂和IL-7-hyFc。
本申请还提供制备本申请的药物组合物和免疫原性组合的方法。制备药物组合物或免疫原性组合的方法包括混合本申请的编码HBV抗原的分离的多核苷酸、载体和/或多肽与一种或多种药学可接受的载剂。本领域普通技术人员熟知用于制备这样的组合物的常规技术。
诱导免疫应答的方法
本申请还提供在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药免疫原性有效量的本申请的药物组合物。本文描述的本申请任何药物组合物可以用在本申请的方法中。
如本文所用，术语“感染”表示病原体((disease causing agent)侵入宿主。当病原体能够侵入宿主并在宿主内复制或繁殖时，它被认为是“感染性的”。感染性物质的实例包括病毒，例如HBV和某些种的腺病毒、朊病毒、细菌、真菌、原生动物等。“HBV感染”特别表示HBV侵入宿主生物体，如宿主生物体的细胞和组织。
在参考本文所述的方法使用时，短语“诱导免疫应答”涵盖在有需要的受试者中引起针对感染(例如，HBV感染)的期望的免疫应答或效果。“诱导免疫应答”也涵盖提供治疗性免疫以针对致病体进行治疗，例如，HBV。如本文所用，术语“治疗性免疫”或“治疗性免疫应答”是指，疫苗接种的受试者能够控制疫苗接种所针对的致病体(pathohenic agent)的感染，例如通过疫苗接种HBV疫苗赋予的针对HBV感染的免疫。在一实施方案中，“诱导免疫应答”是指在有需要的受试者中产生免疫，例如，以提供针对疾病如HBV感染的治疗效果。在某些实施方案中，“诱导免疫应答”表示引起或改善针对HBV感染的细胞免疫，例如，T细胞应答。在某些实施方案中，“诱导免疫应答”表示引起或改善针对HBV感染的体液免疫应答。在某些实施方案中，“诱导免疫应答”表示引起或改善针对HBV感染的细胞和体液免疫应答。
本申请还提供针对HBV疫苗接种受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药本申请的药物组合物。在一些实施方案中，受试者的疫苗接种为预防性疫苗接种或治疗性疫苗接种，更特别地，疫苗接种为治疗性疫苗接种。本申请还提供减少受试者中HBV感染和/或复制的方法，所述方法包括向所述受试者给药本申请的药物组合物或本申请的疫苗。本文描述的本申请的任何药物组合物或疫苗可以用在本申请的方法中。
如本文所用，术语“保护性免疫”或“保护性免疫应答”是指，疫苗接种的受试者能够控制疫苗接种所针对的致病体的感染。通常，已经产生“保护性免疫应答”的受试者仅出现轻度至中度临床症状或根本不出现症状。通常，具有针对某种病原体(agent)的“保护性免疫应答”或“保护性免疫”的受试者不会因所述病原体的感染而死亡。
通常，本申请的药物组合物和免疫原性组合的给药会具有治疗目的，以在HBV感染后或出现HBV感染的症状特征后产生针对HBV的免疫应答，例如用于治疗性疫苗接种。
如本文所用，“免疫原性有效量”或“免疫学有效量”是指，足以在有需要的受试者中诱导期望的免疫效果或免疫应答的组合物、多核苷酸、载体或抗原的量。免疫原性有效量可以是足以在有需要的受试者中诱导免疫应答的量。免疫原性有效量可以是足以在有需要的受试者中产生免疫的量，例如提供针对诸如HBV感染的疾病的治疗效果。免疫原性有效量可以根据多种因素而变化，如受试者的身体状况、年龄、重量、健康等；特定应用，例如提供保护性免疫或治疗性免疫；以及免疫所期望针对的特定疾病，例如病毒感染。鉴于本公开，免疫原性有效量可以由本领域普通技术人员容易地确定。
在本申请的特定实施方案中，免疫原性有效量表示足以实现以下效果中的一种、两种、三种、四种或更多种的组合物或免疫原性组合的量：(i)降低或改善HBV感染或与之相关的症状的严重程度；(ii)减少HBV感染或与之相关的症状的持续时间；(iii)防止HBV感染或与之相关的症状的进展；(iv)造成HBV感染或与之相关的症状的消退；(v)预防HBV感染或与之相关的症状的发展或发作；(vi)防止HBV感染或与之相关的症状的复发；(vii)减少具有HBV感染的受试者的住院治疗；(viii)减少具有HBV感染的受试者的住院治疗长度；(ix)提高具有HBV感染的受试者的存活率；(x)消除受试者中的HBV感染；(xi)抑制或减少受试者中的HBV复制；和/或(xii)增强或改善另一疗法的预防或治疗效果。
免疫原性有效量也可以是这样的量，其足以降低与临床血清转换进化一致的HBsAg水平；实现受试者的免疫***对与被感染的肝细胞的减少相关的持续HBsAg清除；诱导HBV-抗原特异性的活化的T-细胞群体；和/或在12个月内实现HBsAg持续消失。目标指数的实例包括低于500个拷贝HBsAg国际单位(IU)的阈值的较低HBsAg和/或较高CD8计数。
作为一般指导，当参考核酸分子、载体或RNA复制子使用时，免疫原性有效量可以在约1μg核酸分子、载体或RNA复制子至约1mg核酸分子、载体或RNA复制子的范围内，例如1μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1mg。优选地，核酸分子、载体或RNA复制子的免疫原性有效量为约10μg至约100μg。当参考药物组合物中的核酸分子、载体或RNA复制子使用时，免疫原性有效量可以在约0.01mg/mL至约2mg/mL的核酸分子、载体或RNA复制子总量的范围内，例如0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.03mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL、0.1mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL或2mg/mL。优选地，核酸分子、载体或RNA复制子的免疫原性有效量为1mg/mL以下，更优选0.05mg/mL以下。免疫原性有效量可以来自一种核酸分子、载体或RNA复制子，或者来自多种核酸分子、载体或RNA复制子。免疫原性有效量可以在单一组合物中或在多个组合物中给药，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个组合物(例如，片剂、胶囊剂或注射剂，或适用于皮内递送的任何组合物，例如，适用于使用皮内递送贴剂的皮内递送)，其中多个胶囊剂或注射剂的给药共同为受试者提供免疫原性有效量。例如，当使用两种DNA质粒时，免疫原性有效量可以是3-4mg/mL，其中每种质粒为1.5-2mg/mL。在所谓的初免-加强方案中，也可以向受试者给药免疫原性有效量，并随后向相同受试者给药免疫原性有效量的另一剂量。初免-加强方案的这种一般概念是疫苗领域的技术人员众所周知的。如果需要，可以任选地将进一步加强给药添加到该方案中。
通过混合两种载体并将混合物递送至单个解剖学部位，可以向受试者给药包含两种载体(例如，编码第一HBV抗原的第一载体和编码第二HBV抗原的第二种载体)的免疫原性组合。或者，可以进行两次分开的免疫接种，每次递送单一表达载体。在这样的实施方案中，无论两种载体在单次免疫接种中给药还是作为两次分开免疫接种的混合物给药，第一载体和第二载体可以以10:1至1:10的重量比给药，如10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10重量比。优选地，第一和第二载体以1:1的重量比给药。
优选地，将根据本申请的方法治疗的受试者是HBV感染的受试者，特别是患有慢性HBV感染的受试者。急性HBV感染通过先天免疫***的有效激活，并辅以随后的广泛适应性应答表征(例如，HBV-特异性T-细胞、中和抗体)，这通常导致复制的成功抑制或受感染的肝细胞的去除。相反地，由于高病毒载量和抗原载量，这样的应答会受损或减弱，例如，大量产生HBV包膜蛋白，并且可以相对感染性病毒以1,000倍过量的亚病毒颗粒形式释放。
以病毒载量、肝酶水平(坏死性炎症活性)、HBeAg或HBsAg载量或针对这些抗原的抗体的存在所表征的阶段来描述慢性HBV感染。cccDNA水平保持相对稳定在每个细胞大约10到50个拷贝，即使病毒血症可以有很大差异。cccDNA物质的持续存在导致慢性化。更具体地，慢性HBV感染的阶段包括：(i)以高病毒载量和正常或轻微升高的肝酶表征的免疫耐受阶段；(ii)免疫激活HBeAg阳性阶段，其中观察到病毒复制水平降低或下降和肝酶显著升高；(iii)非活动性(inactive)HBsAg携带期，这是一种低复制状态，具有低病毒载量和血清中正常的肝酶水平，可能在HBeAg血清转换之后；和(iv)HBeAg阴性阶段，其中病毒复制周期性地发生(重新激活)，伴随肝酶水平的波动，前核心和/或基础核心启动子中的突变是常见的，因此受感染的细胞不会产生HBeAg。
如本文所用，“慢性HBV感染”表示受试者具有可检测的HBV存在超过6个月。具有慢性HBV感染的受试者可以处于慢性HBV感染的任何阶段。慢性HBV感染按照其在本领域中的普通含义来理解。慢性HBV感染可以例如以在急性HBV感染后HBsAg持续存在6个月或更长表征。例如，本文所提及的慢性HBV感染遵循疾病控制和预防中心(CDC)公布的定义，根据该定义，慢性HBV感染可以通过实验室标准表征，例如：(i)针对乙型肝炎核心抗原的IgM抗体(IgM抗-HBc)为阴性，且乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、或关于乙型肝炎病毒DNA的核酸测试为阳性，或(ii)HBsAg或关于HBV DNA的核酸测试为阳性，或HbeAg为阳性2次间隔至少6个月。优选地，免疫原性有效量表示足以治疗慢性HBV感染的本申请的组合物或免疫原性组合的量。
在一些实施方案中，患有慢性HBV感染的受试者正在接受核苷类似物(NUC)治疗，并且是NUC抑制的。如本文所用，“NUC抑制的”表示受试者具有不可检测的HBV病毒水平和稳定的丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平至少六个月。核苷/核苷酸类似物治疗的实例包括HBV聚合酶抑制剂，如恩替卡韦(entacavir)和替诺福韦(tenofovir)。优选地，患有慢性HBV感染的受试者不具有晚期肝纤维化或肝硬化。这样的受试者通常具有小于3的关于纤维化的METAVIR评分和小于9kPa的肝脏的瞬时弹性硬度检测(fibroscan)结果。METAVIR评分是一种评分***，其常用于在乙型肝炎患者的肝活检中通过组织病理学评价来评估炎症和纤维化的程度。评分***分配两个标准化数字：一个反映炎症程度，一个反映纤维化程度。
据信，慢性HBV的消除或减少可能允许严重肝病的早期疾病拦截，包括病毒诱导的肝硬化和肝细胞癌。因此，本申请的方法也可以用作治疗HBV诱导的疾病的疗法。HBV诱导的疾病的实例包括但不限于肝硬化、癌症(例如，肝细胞癌)和纤维化，特别是以关于纤维化的METAVIR评分为3或更高表征的晚期纤维化。在这样的实施方案中，免疫原性有效量是足以在12个月内实现HBsAg的持续消失并显著减少临床疾病(例如，肝硬化、肝细胞癌等)的量。
根据本申请的实施方案的方法进一步包括与本申请的药物组合物联合向有此需要的受试者给药另一免疫原性剂(如另一HBV抗原或其它抗原)或另一抗HBV剂(如核苷类似物或其它抗HBV剂)。例如，另一抗HBV剂或免疫原性剂可以是小分子或抗体，包括但不限于免疫检查点抑制剂(如抗-PD1、抗-TIM-3等)、toll样受体激动剂(如TLR7激动剂和/或TLR8激动剂)、RIG-1激动剂、IL-15超激动剂(Altor Bioscience)、突变体IRF3和IRF7基因佐剂、STING激动剂(Aduro)、FLT3L基因佐剂、IL12基因佐剂、IL-7-hyFc；结合HBV包膜的CAR-TS-CAR细胞)；衣壳组装调节剂；cccDNA抑制剂、HBV聚合酶抑制剂(例如，恩替卡韦和替诺福韦)。一种或其他抗HBV活性剂可以是，例如，小分子、抗体或其抗原结合片段、多肽、蛋白或核酸。
递送方法
鉴于本公开，通过本领域已知的任何方法，包括、但不限于，肠胃外给药(例如，肌内、皮下、静脉内或皮内注射)、口服给药、透皮给药和鼻给药，可以向受试者给药本申请的药物组合物和免疫原性组合。优选地，肠胃外给药(例如，通过肌内注射或皮内注射)或透皮给药药物组合物和免疫原性组合。
在本申请的一些实施方案中中药物组合物和免疫原性组合包含一种或多种DNA质粒，给药可以是通过皮肤注射，例如肌内注射或皮内注射，优选肌内注射。肌内注射可以与电穿孔组合，即施加电场以促进DNA质粒向细胞递送。如本文所用，术语“电穿孔”表示使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观通路(孔)。在体内电穿孔过程中，对细胞施加适当大小和持续时间的电场，诱导增强的细胞膜渗透性的瞬时状态，从而实现不能自行穿过细胞膜的分子的细胞吸收。通过电穿孔产生这样的孔有利于生物分子(如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物等)从细胞膜的一侧向另一侧的通过。用于递送DNA疫苗的体内电穿孔已经表明显著增加宿主细胞的质粒吸收，同时还会导致在注射部位处的轻度至中度炎症。因此，与常规注射相比，皮内或肌内电穿孔显著改善转染效率和免疫应答(例如，分别高达1,000倍和100倍)。
在典型的实施方案中，将电穿孔与肌内注射组合。但是，也可能将电穿孔与其他形式的肠胃外给药(例如，皮内注射、皮下注射等)组合。
可以使用电穿孔装置完成通过电穿孔对本申请的药物组合物、免疫原性组合或疫苗的给药，所述电穿孔装置可以配置为向哺乳动物的期望组织递送有效造成可逆孔在细胞膜中形成的能量脉冲。电穿孔装置可以包括电穿孔部件和电极组件或手柄组件。电穿孔组件可以包括电穿孔装置的以下部件中的一种或多种：控制器、电流波形发生器、阻抗测试仪、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、存储器部件、电源和电源开关。可以使用体内电穿孔装置完成电穿孔。电穿孔装置和可以促进本申请的组合物和免疫原性组合(特别是包含DNA质粒的那些)的递送的电穿孔方法的实例包括
Figure BDA0004111907790000531
(InovioPharmaceuticals，Blue Bell，PA)、Elgen电穿孔仪(Inovio Pharmaceuticals，Inc.)Tri-GridTM递送***(Ichor Medical Systems，Inc.，San Diego，CA 92121)以及在以下中描述的那些：美国专利号7,664,545、美国专利号8,209,006、美国专利号9,452,285、美国专利号5,273,525、美国专利号6,110,161、美国专利号6,261,281、美国专利号6,958,060和美国专利号6,939,862、美国专利号7,328,064、美国专利号6,041,252、美国专利号5,873,849、美国专利号6,278,895、美国专利号6,319,901、美国专利号6,912,417、美国专利号8,187,249、美国专利号9,364,664、美国专利号9,802,035、美国专利号6,117,660以及国际专利申请公开WO2017172838，它们都整体援引加入本文。体内电穿孔装置的其他实例描述在标题为“Method and Apparatus for the Delivery of Hepatitis B Virus(HBV)Vaccines”的国际专利申请中，其以代理人案卷号688097-405WO与本申请在同一天提交，其内容整体援引加入本文。用于递送本申请的组合物和免疫原性组合的应用还考虑使用脉冲电场，例如在例如美国专利号.6,697,669中所描述，其整体援引加入本文。
在本申请的其他实施方案中，药物组合物或免疫原性组合包含一种或多种DNA质粒的，给药方法是透皮给药。透皮给药可以与表皮皮肤磨损(abrasion)相合以促进DNA质粒向细胞递送。例如，皮肤病学贴剂可用于表皮皮肤磨损。在除去皮肤病学贴剂后，组合物或免疫原性组合可以沉积在磨损的皮肤上。
递送方法不限于上述实施方案，并且可以使用用于细胞内递送的任何方式。本申请的方法考虑的其他细胞内递送方法包括但不限于脂质体包封、脂质体复合物(lipoplex)、纳米颗粒等。例如，本申请的RNA复制子可以配制在免疫原性组合物中，所述免疫原性组合物包含一种或多种脂质分子，优选带正电的脂质分子。在一些实施方案中，本公开的RNA复制子可以使用一种或多种脂质体、脂质体复合物和/或脂质纳米颗粒来配制。在一些实施方案中，本文所述的脂质体或脂质纳米颗粒制剂可以包含聚阳离子组合物。在一些实施方案中，包含聚阳离子组合物的制剂可以用于在体内和/或离体递送本文所述的RNA复制子。
根据本发明，术语“脂质”是指任何脂肪酸衍生物或其他两性化合物，其能够形成易溶(lyotropic)脂质相，或者更优选地，层状易溶相。特别地，术语“脂质”是指任何能够形成双层的任何脂肪酸衍生物，从而脂质分子的疏水部分朝向双层，而亲水部分朝向水相。术语“脂质”包括中性、阴离子或阳离子脂质。脂质优选地包括疏水结构域，其具有至少一个、优选两个烷基链或胆固醇部分以及极性头基。脂质疏水结构域中的脂肪酸的烷基链不限于特定的长度或双键数目。然而，优选地，脂肪酸的长度为10-30、优选14-25个碳原子。脂质也可以包括两种不同的脂肪酸。
在本公开的上下文中，基于脂质的递送媒介物通常用于将期望的RNA复制子递送至靶细胞或组织。在一些实施方案中，基于脂质的递送媒介物包括纳米颗粒或脂质分子的双层以及本公开的RNA复制子。在一些实施方案中，脂质双层优选地进一步包括中性脂质或聚合物。术语“中性脂质”表示在选定的pH下以不带电荷或中性两性离子的形式存在的脂质物质。在生理pH下，这样的脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰甘油。在一些实施方案中，脂质制剂优选包含液体介质。在一些实施方案中，制剂优选地进一步包封核酸。在一些实施方案中，脂质制剂优选地进一步包含核酸和中性脂质或聚合物。在一些实施方案中，脂质制剂优选地包封核酸。
本说明书提供脂质制剂，其包含一种或多种包封在脂质制剂中的RNA复制子。在一些实施方案中，脂质制剂包含脂质体。在一些实施方案中，脂质制剂包含阳离子脂质体。在一些实施方案中，脂质制剂包含脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，RNA复制子或核酸分子的组合完全包封在脂质制剂的脂质部分中，从而脂质制剂中的RNA复制子或核酸分子的组合物在水溶液中抵抗核酸酶降解。术语“完全封装”表示核酸脂质颗粒中的核酸((如，RNA复制子))在暴露于血清或者会显著降解游离RNA的核酸酶测定后不会显著降解。当完全包封时，在通常会降解100％游离核酸的处理中，优选颗粒中25％以下的核酸被降解，更优选颗粒中10％以下，并且最优选5％以下的核酸被降解。本文所用的“完全包封”也表示核酸脂质颗粒在体内给药时不会迅速分解成其组成部分。在其他实施方案中，本文所述的脂质制剂对哺乳动物(如人)是基本无毒的。在一些实施方案中，核酸的组合包封在相同的脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，核酸分子的组合中的每个核酸分子独立地包封在单独的脂质纳米颗粒中。
本公开的脂质制剂通常还具有以下总脂质:RNA比(质量/质量比)：约1∶1-约100∶1、约1∶1-约50∶1、约2∶1-约45∶1、约3∶1-约40∶1、约5∶1-约38∶1、或约6∶1-约40∶1、或约7∶1-约35∶1、或约8∶1-约30∶1、或约10∶1-约25∶1、或约8∶1-约12∶1、或约13∶1-约17∶1、或约18∶1-约24∶1、或约20∶1-约30∶1。在一些优选的实施方案中，总脂质:RNA比(质量/质量比)为约10∶1-约25∶1。比率可以是所指范围中的任何值或子值，包括端点。
本公开的脂质制剂的平均直径通常为约30nm-约150nm、约40nm-约150nm、约50nm-约150nm、约60nm-约130nm、约70nm-约110nm、约70nm-约100nm、约80nm-约100nm、约90nm-约100nm、约70-约90nm、约80nm-约90nm、约70nm-约80nm或者约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约105nm、约110nm、约115nm、约120nm、约125nm、约130nm、约135nm、约140nm、约145nm或约150nm，并且是基本上无毒的。直径可以是所指范围中的任何值或子值，包括端点。此外，核酸，当存在于本公开的脂质纳米颗粒中时，在水溶液中抵抗核酸酶的降解。
在优选的实施方案中，脂质制剂包含RNA复制子或核酸分子的组合、阳离子脂质(如本文所述的一种或多种阳离子脂质或其盐)、磷脂以及抑制颗粒聚集的缀合脂质(如一种或多种PEG-脂质缀合物)。脂质制剂也可以包含胆固醇。术语“脂质缀合物”表示抑制脂质颗粒聚集的缀合脂质。这样的脂质缀合物包括但不限于PEG-脂质缀合物，如偶联至二烷基氧基丙基的PEG(如PEG-DAA缀合物)，偶联至二酰基甘油的PEG(如PEG-DAG缀合物)，偶联至胆固醇的PEG，偶联至磷脂酰乙醇胺的PEG和偶联至神经酰胺的PEG，阳离子PEG脂质，聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物，聚酰胺寡聚物，及其混合物。PEG或POZ可以直接与脂质缀合，或者可以通过接头部分(linker moiety)与脂质连接。可以使用任何适合将PEG或POZ与脂质偶联的接头部分，包括例如非含酯接头部分和含酯接头部分。在某些优选实施方案中，使用非含酯接头部分，如酰胺或氨基甲酸酯。在某些优选实施方案中，PEG-脂质缀合物为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(2-[polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide)(即，ALC-0159)。
如本文所用，术语“阳离子脂质”是指两性脂质及其盐，其具有带正电的亲水头基；一个、两个、三个或更多个疏水(即具有非极性基团)脂肪酸或脂肪烷基链；以及这两个结构域之间的连接物。可离子化或质子化的阳离子脂质在pH值低于其pKa时通常是质子化的(即带正电)，并且在pH值高于pKa时基本上是中性的。优选的可离子化阳离子脂质是那些pKa小于生理pH值的阳离子脂质，通常为约7.4。本公开的阳离子脂质也可称为可滴定(titratable)阳离子脂质。阳离子脂质可以为“氨基脂质”，其具有可质子化的叔胺(例如，pH-可滴定)头基。一些示例性氨基脂质可以包含C18烷基链，其中每个烷基链独立地具有0-3(例如0、1、2或3)个双键；以及头基和烷基链之间的醚、酯或缩酮连接。这样的阳离子脂质包括但不限于(4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)(又称为ALC-0315)、LipofectinTM，又称为DOTMA(N-D-(2,3-二油基氧基)丙基N,N,N-三甲基氯化铵)(N-D-(2,3-dioleyloxy)propyls N，N，N-trimethylammonium chloride)、DOTAP(1，2-双(油基氧基)-3(三甲基丙基铵)(1,2-bis(oleyloxy)-3(trimethylammonio)propane)、DDAB(二甲基双十八烷基-溴化铵)(dimethyldioctadecyl-ammonium bromide)、DOGS(双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺)(dioctadecylamidologly cyl spermine)，、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA(又称为DLin-C2K-DMA、XTC2和C2K)、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA(又称为MC2)、DLin-M-C3-DMA(又称为MC3)、(DLin-MP-DMA)(又称为1-Bl 1)以及胆固醇衍生物，如DCChol(3β-(N—(N′,N′-二甲基氨基甲烷)-氨基甲酰基)胆固醇)(3 beta-(N-(N’,N'-dimethyl aminomethane)-carbamoyl)cholesterol)。在某些优选实施方案中，阳离子脂质为((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)，即ALC-0315。
本文使用的术语“阴离子脂质”表示在生理pH下带负电荷的脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-月桂酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(palmitoyloleyolphosphatidylglycerol)(POPG)以及连接至中性脂质的其他阴离子改性基团。
在核酸-脂质制剂中，RNA复制子或核酸分子的组合可以完全包封在制剂的脂质部分中，从而保护核酸免于核酸酶降解。在优选实施方案中，脂质制剂包含的RNA复制子或核酸分子的组合完全包封在脂质制剂的脂质部分中，从而保护核酸免于核酸酶降解。在某些情况下，脂质制剂中的RNA复制子或核酸分子的组合在颗粒于37℃下暴露于核酸酶至少20、30、45或60分钟后，不会明显降解。在某些其他情况下，脂质制剂中的RNA复制子或核酸分子的组合在制剂于37℃下在血清中孵育至少30、45或60分钟或至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小时后，不会明显降解。在其他实施方案中，RNA复制子或核酸分子的组合与制剂中的脂质部分复合。
在核酸的上下文中，可以通过进行膜不可渗透荧光染料排除测定来确定完全包封，其使用的染料在与核酸缔合时具有增强的荧光。通过在脂质制剂中添加染料，测量所产生的荧光，并将其与添加少量非离子洗涤剂后观察到的荧光进行比较来确定包封。洗涤剂介导的脂质层的破坏释放包封的核酸，使其与膜不可渗透染料相互作用。核酸包封可以计算为E＝(I0-I)/I0，其中I和I0是指添加洗涤剂之前和之后的荧光强度。
在其他实施方案中，本公开提供一种核酸-脂质组合物，其包含多种核酸-脂质体、核酸-阳离子脂质体或核酸-脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，核酸-脂质组合物包含多种RNA复制子-脂质体。在一些实施方案中，核酸-脂质组合物包含多种RNA复制子-阳离子脂质体。在一些实施方案中，核酸-脂质组合物包含多种RNA复制子-脂质纳米颗粒。
在一些实施方案中，脂质制剂包含RNA复制子或核酸分子的组合，其完全包封在制剂的脂质部分中，从而约30％-约100％、约40％-约100％、约50％-约100％、约60％-约100％、约70％-约100％、约80％-约100％、约90％-约100％、约30％-约95％、约40％-约95％、约50％-约95％、约60％-约95％、约70％-约95％、约80％-约95％、约85％-约95％、约90％-约95％、约30％-约90％、约40％-约90％、约50％-约90％、约60％-约90％、约70％-约90％、约80％-约90％或者至少约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％(或其任何分数或其中的范围)的颗粒具有包封于其中的RNA复制子或核酸分子的组合。这个量可以是所指范围中的任何值或子值，包括端点。
取决于脂质制剂的预期用途，可以改变组分的比例，并使用本领域已知的测定来测量特定制剂的递送效率。
根据一些实施方案，本文所述的可表达的多核苷酸和RNA复制子是脂质配制的。脂质制剂优选地选自但不限于脂质体、阳离子脂质体和脂质纳米颗粒。在一优选实施方案中，脂质制剂为阳离子脂质体或脂质纳米颗粒(LNP)，其包含：
(a)本公开的RNA复制子或核酸分子组合，
(b)阳离子脂质，
(c)聚集降低剂(reducing agent)(如聚乙二醇(PEG)脂质或PEG修饰的脂质)，
(d)任选地，非阳离子脂质(如中性脂质)，和
(e)任选地，甾醇。
优选地，包封RNA复制子或核酸分子的组合的脂质纳米颗粒包含阳离子脂质以及至少一种选自以下的其他脂质：阴离子脂质、两性离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合脂质、磷脂、糖脂及其组合。
在一些实施方案中，阳离子脂质为可离子化阳离子脂质。在一实施方案中，脂质纳米颗粒制剂由以下组成：(i)至少一种阳离子脂质；(ii)辅助脂质；(iii)甾醇(如胆固醇；以及(iv)PEG-脂质，摩尔比为约30％-约60％可离子化阳离子脂质：约5％-约20％辅助脂质：约35％-约50％甾醇：约0.5-5％ PEG-脂质。下文描述示例性阳离子脂质(包括可离子化阳离子脂质)、辅助脂质(如中性脂质)、甾醇、和包含配体的脂质(如PEG-脂质)。
具体脂质的选择和它们的相对百分比组成取决于几个因素，其包括期望的治疗效果、预期的体内递送靶标以及计划的剂量给药方案和频率。一般来说，最优选的脂质具有高效力(即治疗效果，如敲除活性或翻译效率)和生物可降解性，导致快速组织清除。然而，对于只意图在受试者中一次或两次给药的制剂来说，生物可降解性可能不那么重要。此外，脂质组成可能需要精心设计，从而脂质制剂在体内给药和到达预期靶标的过程中保持其形态，但在吸收入靶细胞后能够释放活性剂。因此，通常需要对几个配方进行评估，以便找到最佳的可能脂质摩尔比以及总脂质与活性成分比率中的最佳可能脂质组合。
合适的脂质组分和制备脂质纳米颗粒的方法是本领域公知的，并且描述于例如PCT/US2020/023442、U.S.8，058，069、U.A.8，882，668、U.S.9，738，593、U.A.9，139，554、PCT/US2014/066242、PCT/US2015/030218、PCT/2017/015886和PCT/US2017/067756，其内容援引加入本文。
阳离子脂质
脂质制剂优选包含适合于形成阳离子脂质体或脂质纳米颗粒的阳离子脂质。阳离子脂质广泛研究用于核酸递送，因为它们可以与带负电荷的膜结合并诱导吸收。一般来说，阳离子脂质是两性分子，其含有带正电的亲水头基、两个(或更多个)亲脂尾巴或类固醇部分以及这两个结构域之间的连接物。优选地，阳离子脂质体在约生理pH下带有净正电荷。阳离子脂质体是传统上最常用的寡核苷酸的非病毒递送***，包括质粒DNA、反义寡核苷酸和siRNA/小发夹RNA-shRNA。阳离子脂质，如DOTAP，(1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷)(1,2-dioleoy1-3-trimethylammonium-propane)和DOTMA(N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基-甲基硫酸铵)(N-[I-(2,3-dioleoyloxy)propyl|-N,N,N-trimethyl-ammoniummethyl sulfate)可以通过静电相互作用与带负电的核酸形成复合物或脂质体复合物，提供高体外转染效率。
在本公开的脂质制剂中，阳离子脂质可以为，例如((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(又称为ALC-0315)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride)(DODAC)、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide)(DDAB)、1,2-二油酰三甲基丙烷氯化铵(1,2-dioleoyltrimethylammoniumpropane chloride)(DOTAP)(又称为N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(N-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride)和l,2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(1,2-Dioleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride salt))、N-(l-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl-N,N,N-trimethylammoniumchloride)(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基)丙基胺(N,N-dimethy1-2,3-dioleyloxy)propylamine)(DODMA)、l,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-DiLinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane)(DLinDMA)、l,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-Dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane)(DLenDMA)、l,2-二-y-亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-di-ylinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane)(γ-DLenDMA)、1,2-二亚油基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-Dilinoleylcarbamoyloxy-3-dimethylaminopropane)(DLin-C-DAP)、l,2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(1,2-Dilinoleyoxy-3-(dimethylamino)acetoxypropane)(DLin-DAC)、l,2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(1,2-Dilinoleyoxy-3-morpholinopropane)(DLin-MA)、l,2-二亚油酰-3-二甲基氨基丙烷(1,2-Dilinoleoy1-3-dimethylaminopropane)(DLinDAP)、l,2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(1,2-Dilinoleylthio-3-dimethylaminopropane)(DLin-S-DMA)、l-亚油酰-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(|-Linoleoy1-2-linoleyloxy-3-dimethylaminopropane)(DLin-2-DMAP)、l,2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(1,2-Dilinoleyloxy-3-trimethylaminopropane chloride salt)(DLin-TMA.Cl)、l,2-二亚油酰-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(1,2-Dilinoleoyl-3-trimethylaminopropane chloride salt)(DLin-TAP.Cl)、l,2-二亚油基氧基-3-(N-甲基哌嗪)丙烷(1,2-Dilinoleyloxy-3-(Nmethylpiperazino)propane)(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油基氨基)-l,2-丙烷二醇(3-(N,N-Dilinoleylamino)-l,2-propanediol)(DLinAP)、3-(N,N-二油基氨基)-l,2-丙烷二醇(3-(N,N-Dioleylamino)-1,2-propanediol)(DOAP)、l,2-二亚油基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(1,2-Dilinoleyloxo-3-(2-N,Ndimethylamino)ethoxypropane)(DLin-EG-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊环(2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminomethy]-[1,3]-dioxolane)(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][l,3]二氧-5-胺、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯((3aR,5s,6aS)-N,N-dimethy1-2,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9，|2-dieny])tetrahy dro-3aH-cyclopenta]d][1,3]dioxol-5-amine,(6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-y14-(dimethylamino)butanoate)(MC3)、l,l'-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-l-基)乙基氮烷二基)十二烷-2-醇(LI'-(2-(4-(2-((2-(bis(2-hy droxy dodecyl)amino)ethyl)(2-hy droxydodecyl)amino)ethy1)piperazin-l-yl)ethylazanediyl)didodecan-2-ol)(C12-200)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[l,3]-二氧戊环(2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethy1)-[1,3]-dioxolane)(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧戊环(2,2-dilinoley]-4-dimethylaminomethy1-[1,3]-dioxolane)(DLin-K-DMA)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6，9，28 31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6，9，28 31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate)(DLin-M-C3-DMA)、3-((6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6，9，28，3 1-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丙烷-l-胺(3-((6Z，9Z，28Z，31Z)-heptatriaconta-6，9，28，3 1-tetraen-19-yloxy)-N,N-dimethylpropan-l-amine)(MC3醚)、4-((6Z，9Z，28Z，31 Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基氧基)-N,N-二甲基丁-l-胺(4-((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6，9，28，3 1-tetraen-19-yloxy)-N,Ndimethylbutan-l-amine)(MC4醚)，或其任何组合。其他阳离子脂质包括但不限于N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide)(DDAB)、3P-(N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(3P-(N-(N',N'-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol)(DC-Choi)、N-(l-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N-2-(sperminecarboxamido)ethyl)-N,N-dimethylammoniumtrifluoracetate)(DOSPA)、双十八烷基酰胺基甘氨酰羧基精胺(dioctadecylamidoglycylcarboxyspermine)(DOGS)、l,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(1,2-dileoyl-sn-3-phosphoethanolamine)(DOPE)、l,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium propane)(DODAP)、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(N-(1,2-dimyrusty loxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hy droxyethylammonium bromide)(DMRIE)和2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧戊环(2,2-Dilinoleyl-4-dimethylaminoethy]-[1,3]-dioxolane)(XTC)。此外，可以使用阳离子脂质的商业制品，例如LIPOFECTIN包含DOTMA和DOPE，可获得自GIBCO/BRL)和Lipofectamine包含DOSPA和DOPE，可获得自GIBCO/BRL)。
其他合适的阳离子脂质公开于国际公开WO 09/086558、WO 09/127060、WO 10/048536、WO 10/054406、WO 10/088537、WO 10/129709，和WO 2011/153493；美国专利公开号2011/0256175、2012/0128760和2012/0027803；美国专利号8,158,601；以及Love et al.，PNAS，107(5)，1864-69，2010，其内容援引加入本文。
其他合适的阳离子脂质包括那些具有替代脂肪酸基团和其他二烷基氨基的阳离子脂质，包括那些烷基取代基不同的阳离子脂质(例如，N-乙基-N-甲基氨基-和N-丙基-N-乙基氨基-)。这些脂质为称为氨基脂质的阳离子脂质亚类的一部分。在一些实施方案中，本文描述的脂质制剂的阳离子脂质为氨基脂质。一般来说，具有较少饱和酰基链的氨基脂质更容易确定大小(size)，特别是当复合物的大小必须为约0.3微米以下，以达到过滤消毒的目的。可以使用含有碳链长度为C14-C22的不饱和脂肪酸的氨基脂质。其他支架也可用于分离氨基脂质的氨基和脂肪酸或脂肪烷基部分。
在一些实施方案中，脂质制剂包含具有专利申请PCT/EP2017/064066的式I的阳离子脂质。在这样的上下文中，PCT/EP2017/064066的公开援引加入本文。
在一些实施方案中，本公开的氨基或阳离子脂质是可离子化的，并且具有至少有一个可质子化或去质子化基团，从而脂质在生理pH或低于生理pH(如pH 7.4)时带正电，而在第二pH，优选在生理pH或高于生理pH时为中性。当然，应当理解，作为pH的函数(function)，质子的添加或去除是一个平衡过程，并且提及带电或中性脂质是指主要物质的性质，并不要求所有脂质都以带电或中性形式存在。具有一个以上可质子化或去质子化基团的脂质或者是两性离子的脂质，也不排除在本公开中使用。在某些实施方案中，可质子化脂质的可质子化基团的pKa为约4-约11。在一些实施方案中，可离子化阳离子脂质的pKa为约5-约7。在一些实施方案中，可离子化阳离子脂质的pKa为约6-约7。
在一些实施方案中，脂质制剂包含式I的可离子化阳离子脂质或者其药学可接受的盐或溶剂化物：
Figure BDA0004111907790000601
其中R5和R6各自独立地选自直链或支链C1-C31烷基、C2-C31烯基或C2-C31炔基和胆甾醇基；L5和L6各自独立地选自直链C1-C20烷基和C2-C20烯基；X5为-C(O)O-，从而形成-C(O)O-R6，或者-OC(O)-，从而形成-OC(O)-R6；X6为-C(O)O-，从而形成-C(O)O-R5，或者-OC(O)-，从而形成-OC(O)-R5；X7为S或O；L7不存在或者为低级烷基；R4为直链或支链C1-C6烷基；并且R7和R8各自独立地选自氢和直链或支链C1-C6烷基。
在一些实施方案中，X7为S。
在一些实施方案中，X5为-C(O)O-，从而形成-C(O)O-R6，并且X6为-C(O)O-，从而形成-C(O)O-R5。
在一些实施方案中，R7和R8各自独立地选自甲基、乙基和异丙基.
在一些实施方案中，L5和L6各自独立地为C1-C10烷基。在一些实施方案中，L5为C1-C3烷基，并且L6为C1-C5烷基。在一些实施方案中，L6为C1-C2烷基。在一些实施方案中，L5和L6各自为直链C7烷基。在一些实施方案中，L5和L6各自为直链C9烷基。
在一些实施方案中，R5和R6各自独立地为烯基。在一些实施方案中，R6为烯基。在一些实施方案中，R6为C2-C9烯基。在一些实施方案中，烯基包含单个的双键。在一些实施方案中，R5和R6各自为烷基。在一些实施方案中，R5为支链烷基。在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自C9烷基、C9烯基和和C9炔基。在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自C11烷基、C11烯基和C11炔基。在一些实施方案中，R5和R6各自独立地选自C7烷基、C7烯基和C7炔基。在一些实施方案中，R5为–CH((CH2)pCH3)2或–CH((CH2)pCH3)((CH2)p-1CH3)，其中p为4-8。在一些实施方案中，p为5，并且L5为C1-C3烷基。在一些实施方案中，p为6，并且L5为C3烷基。在一些实施方案中，p为7。在一些实施方案中，p为8，并且L5为C1-C3烷基。在一些实施方案中，R5由–CH((CH2)pCH3)((CH2)p-1CH3)组成，其中p为7或8。
在一些实施方案中，R4为亚乙基或亚丙基。在一些实施方案中，R4为正亚丙基或异亚丁基。
在一些实施方案中，L7不存在，R4为亚乙基，X7为S，并且R7和R8各自为甲基。在一些实施方案中，L7不存在，R4为正亚丙基，X7为S，并且R7和R8各自为甲基。在一些实施方案中，L7不存在，R4为亚乙基，X7为S，并且R7和R8各自为乙基。
在一些实施方案中，X7为S，X5为-C(O)O-，从而形成-C(O)O-R6，X6为-C(O)O-，从而形成-C(O)O-R5，L5和L6各自独立地为直链C3-C7烷基，L7不存在，R5为–CH((CH2)pCH3)2，并且R6为C7-C12烯基。在一些其他实施方案中，p为6，并且R6为C9烯基。
在一些实施方案中，脂质制剂包含选自以下的可离子化阳离子脂质：
Figure BDA0004111907790000611
/>
Figure BDA0004111907790000621
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Figure BDA0004111907790000631
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Figure BDA0004111907790000641
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Figure BDA0004111907790000651
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Figure BDA0004111907790000661
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Figure BDA0004111907790000671
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Figure BDA0004111907790000681
在一些实施方案中，可以明确排除本文所述的一种或多种脂质。
辅助脂质和甾醇
本公开的RNA复制子-脂质可以包含辅助脂质(helper脂质)，其可以称为中性脂质、中性辅助脂质、非阳离子脂质、非阳离子辅助脂质、阴离子脂质、阴离子辅助脂质或两性离子脂质。据发现，如果制剂中存在辅助脂质，脂质制剂，特别是阳离子脂质体和脂质纳米颗粒增加细胞摄入(Curr.Drug Metab.2014；15(9)：882-92)。例如，一些研究证实，中性和两性离子脂质，如1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine)(DOPC)、二-油酰-磷脂酰-乙醇胺(DiOleoyl-Phosphatidyl-Ethanoalamine)(DOPE)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-DiStearoyl-sn-glycero-3-PhosphoCholine)(DSPC)，比阳离子脂质是更加促融合(fusogenic)的(即，促进融合)，可以影响脂质-核酸复合物的多态性质，促进从片状转换成六边形相，因此诱导细胞膜和融合和破裂(Nanomedicine(Lond).2014Jan；9(1)：105-20)。此外，使用辅助脂质可以有助于减少由于使用许多普遍的阳离子脂质而导致的任何潜在有害影响，如毒性和免疫原性。
适合于本公开的脂质制剂的非阳离子脂质的非限制性实例包括磷脂，如卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸酯(dicetylphosphate)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰甘油(POPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二反油酰基-磷脂酰乙醇胺(dielaidoy1-phosphatidylethanolamine)(DEPE)、硬脂酰油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱及其混合物。也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选源自具有C10-C24碳链的脂肪酸，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰或油酰基。
非阳离子脂质的其他实例包括甾醇，如胆固醇及其衍生物。一项研究结论表明，作为辅助脂质，胆固醇增加与核酸相接(interface)的脂质层的电荷的间隔，使得电荷分布更紧密地匹配核酸(J.R.Soc.Interface.2012Mar7；9(68)：548–561)。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，如5α-胆甾烷醇、5α-粪甾醇、胆甾醇基-(2'-羟基)-乙基酯、胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5α-胆甾烷酮和胆甾醇基癸酸酯；及其混合物。在优选的实施方案中，胆固醇衍生物为极性类似物，如胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚。
在一些实施方案中，脂质制剂中存在的辅助脂质包括一种或多种磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物或者由一种或多种磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物组成。在其他实施方案中，脂质制剂中存在的辅助脂质包含一种或多种磷脂或由一种或多种磷脂组成，例如无胆固醇脂质制剂。在另外其他的实施方案中，脂质制剂中存在的辅助脂质包含胆固醇或其衍生物或者由胆固醇或其衍生物组成，例如无磷脂脂质制剂。
辅助脂质的其他实例包括不含磷的脂质，如十八胺、十二胺、十六胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻酸酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂酸硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚氧乙基脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺和鞘磷脂。
在一些实施方案中，辅助脂质包含脂质制剂中存在的总脂质的约30摩尔％-约60摩尔％、约32摩尔％-约58摩尔％、约34摩尔％-约56摩尔％、约35摩尔％-约54摩尔％、约36摩尔％-约52摩尔％、约37摩尔％-约51摩尔％、约38摩尔％-约50摩尔％或者约39摩尔％、约50摩尔％、约41摩尔％、约42摩尔％、约43摩尔％、约44摩尔％、约45摩尔％、约46摩尔％、约47摩尔％、约48摩尔％或约49摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。
在一些实施方案中，制剂中的总辅助脂质包含两种或更多种辅助脂质，并且辅助脂质的总量包含脂质制剂中存在的总脂质的约30摩尔％-约60摩尔％、约32摩尔％-约58摩尔％、约34摩尔％-约56摩尔％、约35摩尔％-约54摩尔％、约36摩尔％-约52摩尔％、约37摩尔％-约51摩尔％、约38摩尔％-约50摩尔％或者约39摩尔％、约50摩尔％、约41摩尔％、约42摩尔％、约43摩尔％、约44摩尔％、约45摩尔％、约46摩尔％、约47摩尔％、约48摩尔％或约49摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。在一些实施方案中，辅助脂质为DSPC和DOTAP的组合。在一些实施方案中，辅助脂质为DSPC和DOTMA的组合。
脂质制剂中的胆固醇或胆固醇衍生物包含脂质制剂中存在的总脂质的高达约50摩尔％、约35摩尔％、约40摩尔％、约45摩尔％或约50摩尔％。在一些实施方案中，胆固醇或胆固醇衍生物包含脂质制剂中存在的总脂质的约15摩尔％-约45摩尔％、约20摩尔％-约45摩尔％、约30摩尔％-约45摩尔％、或约35摩尔％、约36摩尔％、约37摩尔％、约38摩尔％、约39摩尔％、约40摩尔％、约41摩尔％、约42摩尔％、约43摩尔％、约44摩尔％或约45摩尔％。
脂质制剂中存在的辅助脂质的百分比为目标量，并且制剂中存在的辅助脂质的实际量可以变化，例如5摩尔％。
含有阳离子脂质化合物或可电离阳离子脂质化合物的脂质制剂可以为，按摩尔计，约30-60％的阳离子脂质化合物、约35-50％的胆固醇、约5-20％的辅助脂质和约0.5-5％的聚乙二醇(PEG)脂质，其中百分比为制剂中存在的总脂质的百分比。在一些实施方案中，组合物为约40-50％的阳离子脂质化合物、约35-45％的胆固醇、约5-15％的辅助脂质和约0.5-3％的PEG-脂质，其中百分比为制剂中存在的总脂质的百分比。
脂质缀合物
本文所述的脂质制剂还可以包含脂质缀合物。缀合脂质用于防止颗粒的聚集。合适的缀合脂质包括但不限于PEG-脂质缀合物、阳离子-聚合物-脂质缀合物，及其混合物。此外，脂质递送媒介物可以通过将配体(如，抗体、肽和碳水化合物)与其表面或连接的PEG链的末端连接而用于特异性靶向(Front.Pharmacol.2015Dec1；6：286)。
在一优选实施方案中，脂质缀合物为PEG-脂质。脂质制剂中包含聚乙二醇(PEG)作为包覆或表面配体，这是一种称为PEG化的技术，有助于保护纳米颗粒免于免疫***的作用，并且有助于其从RES吸收逃逸(Nanomedicine(Lond).2011Jum；6(4)：715-28)。PEG化广泛地用于通过物理、化学和生物学机制来稳定脂质制剂及其负载物(payload)。洗涤剂样PEG脂质(如PEG-DSPE)可以进入脂质制剂以在表面上形成水化层和空间屏障。根据PEG化的程度，表面层一般可分为两种类型，刷状层和蘑菇状层。对于PEG-DSPE稳定的制剂，PEG在低程度的PEG化下(通常低于5摩尔％下)会呈现蘑菇构型，并且当PEG-DSPE的含量增加到超过一定水平时，会转为刷状构型(J.Nanomaterials.2011；2011:12)。已经表明，增加的PEG化会导致脂质制剂的循环半衰期显著增加(Annu.Rev.Biomed.Eng.2011 Aug 15；13：507-30；J.Control Release.2010 Aug 3；145(3)：178-81)。
PEG-脂质的合适实例包括但不限于与二烷氧基丙基偶联的PEG(PEG-DAA)、与二酰基甘油偶联的PEG(PEG-DAG)、与磷脂偶联的PEG，如磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、与神经酰胺偶联的PEG、与胆固醇或其衍生物偶联的PEG，及其混合物。
PEG是具有两个末端羟基的乙烯PEG重复单元的直链水溶性聚合物，PEG按其分子量分类，包括以下：单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟甲基磺酸酯(monomethoxy polyethlene glycol-tresylate)(MePEG-TRES)、单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)，以及含有末端羟基代替末端甲氧基的这类化合物(如HO-PEG-S、HO-PEG-S-NHS、HO-PEG-NH2)。
本文所述的PEG-脂质缀合物的PEG部分可以包含约550道尔顿-约10,000道尔顿的平均分子量。在某些情况下，PEG部分的平均分子量为约750道尔顿-约5,000道尔顿(如约1,000道尔顿-约5,000道尔顿、约1,500道尔顿-约3,000道尔顿、约750道尔顿-约3,000道尔顿、约750道尔顿-约2,000道尔顿)。在优选的实施方案中，PEG部分的平均分子量为约2,000道尔顿或约750道尔顿。平均分子量可以为所指范围的任何值或子值，包括端点。
在某些情况下，PEG单体可以任选地被烷基、烷氧基、酰基或芳基取代。PEG可以直接与脂质缀合，或者可以通过接头部分与脂质连接。可以使用任何适合将PEG与脂质偶联的接头部分，包括例如不含酯的接头部分和含酯的接头部分。在一优选实施方案中，接头部分为不含酯的接头部分。合适的不含酯的接头部分包括但不限于，酰氨基(-C(O)NH-)、氨基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、氨基甲酸酯(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫键(-S-S-)、醚(-O-)、琥珀酰基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、琥珀酰胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚，及其组合(例如包含氨基甲酸酯接头部分和酰氨基接头部分的接头)。在一优选实施方案中，用氨基甲酸酯接头将PEG与脂质偶联。
在其他实施方案中，含酯的接头部分用于将PEG与脂质偶联。合适的含酯的接头部分包括，例如碳酸酯(-OC(O)O-)、琥珀酰基(succinoyl)、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及其组合。
具有不同链长和饱和度的各种酰基链基团的磷脂酰乙醇胺可以与PEG缀合以形成脂质缀合物。这样的磷脂酰乙醇胺是可商购的，或者可以使用本领域技术人员已知的常规技术来分离或合成。含有碳链长度为C10-C20的饱和或不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺是优选的。也可以使用具有单不饱和或双不饱和脂肪酸的磷脂酰乙醇胺以及饱和和不饱和脂肪酸的混合物。合适的磷脂酰乙醇胺包括但不限于二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)。
在一些实施方案中，PEG-DAA缀合物为PEG-二癸酰氧基丙基(C10)缀合物、PEG-二月桂酰氧基丙基(C12)缀合物、PEG-二肉豆蔻酰氧基丙基(C14)缀合物、PEG-二棕榈酰氧基丙基(C16)缀合物或PEG-二硬脂酰氧基丙基(C18)缀合物。在这些实施方案中，PEG优选的平均分子量为约750-约2,000道尔顿。在特别的实施方案中，PEG的末端羟基被甲基取代。
除上述以外，还可以使用其他亲水聚合物来代替PEG。可用于替代PEG的合适聚合物的实例包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基丙基、甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺和聚二甲基丙烯酰胺、聚乳酸、聚乙醇酸以及衍生化的纤维素，如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
在一些实施方案中，脂质缀合物(如PEG-脂质)包含脂质制剂中存在的总脂质的约0.1摩尔％-约2摩尔％、约0.5摩尔％-约2摩尔％、约1摩尔％-约2摩尔％、约0.6摩尔％-约1.9摩尔％、约0.7摩尔％-约1.8摩尔％、约0.8摩尔％-约1.7摩尔％、约0.9摩尔％-约1.6摩尔％、约0.9摩尔％-约1.8摩尔％、约1摩尔％-约1.8摩尔％、约1摩尔％-约1.7摩尔％、约1.2摩尔％-约1.8摩尔％、约1.2摩尔％-约1.7摩尔％、约1.3摩尔％-约1.6摩尔％或约1.4摩尔％-约1.6摩尔％(或其任何分数或其中的范围)。在其他实施方案中，脂质缀合物(如PEG-脂质)包含脂质制剂中存在的总脂质的约0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％或5％(或其任何分数或其中的范围)。量可以为所指范围的任何值或子值，包括端点。
在一些实施方案中，PEG-脂质为PEG550-PE。在一些实施方案中，PEG-脂质为PEG750-PE。在一些实施方案中，PEG-脂质为PEG2000-DMG。在一些实施方案中，PEG-脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(2-[(polyrthylene glycol)-2000]-N,Nditetradecylacetamide)(又称为ALC-0159)。
本公开的脂质制剂中存在的脂质缀合物(如PEG-脂质)的百分比为目标量，并且制剂中存在的脂质缀合物的实际量可以变化，例如±5摩尔％。本领域普通技术人员会了解，脂质缀合物的浓度可以根据所用的脂质缀合物和脂质制剂变为促融合的速率而变化。
脂质制剂细胞吸收的作用机制
用于核酸细胞内递送的脂质制剂，特别是脂质体、阳离子脂质体和脂质纳米颗粒设计为通过使用靶细胞的内吞机制，其中将脂质递送媒介物的内容物递送到靶细胞的胞质溶胶，从而穿透靶细胞进行细胞吸收(Nucleic Acid Therapeutics，28(3)：146-157，2018)。具体来说，在本文所述的靶向肝细胞的RNA复制子-脂质制剂的情况下，mRNA-脂质制剂通过受体介导的内吞作用进入肝细胞。在内吞之前，脂质递送媒介物表面的官能化(functionalized)配体如PEG-脂质从表面脱落，这引发内化进入靶细胞。在内吞过程中，细胞质膜的一些部分围绕载体，并将其卷入囊泡中，然后从细胞膜上夹断(pinch off)，进入胞质溶胶，并最终进行内溶酶体途径。对于含可电离的阳离子脂质的递送媒介物，随着内体老化，酸度增加，导致媒介物表面带强正电荷。然后递送媒介物和内体膜之间的相互作用导致膜融合事件，从而导致负载物的细胞溶质递送。对于RNA负载物，然后，细胞自身的内部翻译过程将RNA复制子或核酸分子的组合翻译成编码的蛋白(如HBV抗原)。编码的蛋白可以进一步进行翻译后加工，包括运送到细胞内的靶细胞器或位置。
通过控制脂质缀合物的组成和浓度，可以控制脂质缀合物交换出脂质制剂的速率，并又可以控制脂质制剂变为促融合的速率。此外，其他变量包括，例如，pH、温度或离子强度，可以用来改变和/或控制脂质制剂变为促融合的速率。其他可用于控制脂质制剂变为促融合的速率的方法，对于本领域的技术人员来说，在阅读本公开后会变得很明显。此外，通过控制脂质缀合物的组成和浓度，可以控制脂质体或脂质颗粒的大小。
脂质制剂制备
有许多不同的用于制备包含核酸如RNA复制子或核酸分子的组合的脂质制剂的方法(Curr.Drug Metabol.2014，15，882–892；Chem.Phys.Lipids 2014，177，8–18；Int.J.Pharm.Stud.Res.2012，3，14–20)。本文简要描述薄膜水化、双乳化、反相蒸发、微流体制备、双不对称离心、乙醇注射、洗涤剂透析、通过乙醇稀释自发形成囊泡以及预制脂质体包封的技术。
薄膜水化
在薄膜水化(TFH)或Bangham方法中，将脂质溶于有机溶剂中，然后通过使用旋转蒸发器蒸发，从而形成薄脂质层。在被含有待装载化合物的水性缓冲溶液层水化后，形成多层囊泡(MLV)，通过膜的挤压或对起始MLV的超声处理，可以减小其大小，产生小或大单层囊泡(LUV和SUV)。
双乳化
脂质制剂也可以通过双乳化技术制备，这涉及脂质在水/有机溶剂混合物中的溶解。含有水滴的有机溶液与过量的水性介质混合，导致水包油包水(water-in-oil-in-water，W/O/W)双乳液的形成。经过剧烈机械震荡，部分水滴崩解(collapse)，产生大单层囊泡(LUV)。
反相蒸发
反相蒸发(REV)方法也可以获得装载核酸的LUV。在这种技术中，磷脂溶解在有机溶剂和水性缓冲液中，形成两相***。然后将所得的悬浮液进行简单的超声处理，直到混合物成为透明的单相分散液。减压蒸发有机溶剂后获得脂质制剂。这种技术已用于包封不同的大亲水分子和小亲水分子，包括核酸。
微流体制备
与其他大体积(bulk)技术不同，微流体方法提供控制脂质水化过程的可能性。根据操纵流动的方式，这个方法可分为连续流动的微流体和基于液滴的微流体。在以连续流动模式运行的微流体流体动力学聚焦(MHF)方法中，脂质溶解在异丙醇中，其以流体动力学方式集中在两个水性缓冲流之间的微通道交叉口。囊泡的大小可以通过调节流速来控制，从而控制脂质溶液/缓冲液稀释过程。通过使用由三个入口和一个出口组成的微流体装置，这个方法可用于制备寡核苷酸(ON)脂质制剂。
双不对称离心
双不对称离心(DAC)与更常见的离心不同，因为其使用围绕其自身垂直轴的额外旋转。由于产生了两个重叠的运动，因此实现了有效的均质化：将样品向外推，就像在正常的离心中一样，然后其由于额外的旋转而被推到小瓶的中心。通过混合脂质和NaCl溶液，可以获得粘稠的囊泡磷脂凝胶(VPC)，然后将其稀释以获得脂质制剂分散液。脂质制剂的大小可以通过优化DAC速度、脂质浓度和均质化时间来调节。
乙醇注射
乙醇注射(EI)方法可用于核酸包封。这种方法通过使用针头将溶解有脂质的乙醇溶液快速注入含有核酸的水性介质中进行包封。当磷脂分散在整个介质中时，会自发形成囊泡。
洗涤剂透析
洗涤剂透析方法可用于包封核酸。简而言之，将脂质和质粒溶于适当离子强度的洗涤剂溶液中，通过透析去除洗涤剂后，形成稳定的脂质制剂。然后通过离子交换色谱去除未包封的核酸，通过蔗糖密度梯度离心去除空囊泡。这个技术对阳离子脂质含量和透析缓冲液的盐浓度高度敏感，而且这个方法也难以放大。
通过乙醇稀释自发形成囊泡
稳定的脂质制剂也可以通过乙醇稀释自发形成囊泡的方法来生产，其中，通过向含有核酸的快速混合的水性缓冲液中控制添加溶解在乙醇中的脂质，逐步或滴加乙醇稀释，瞬间形成装载有核酸的囊泡。
预制脂质体封装
核酸的包封(entrapment)也可以通过两种不同的方法从预制的脂质体开始获得：(1)将阳离子脂质体与核酸的简单混合，得到称为“脂质体复合物(lipoplex)”的静电复合物，它们可以成功地用于转染细胞培养物，但其特点是包封效率低，并且在体内的表现不佳；(2)脂质体去稳定化，向阳离子囊泡的悬浮液中缓慢添加无水乙醇，浓度达到40％v/v，然后滴加核酸，实现负载的囊泡；但是，两个主要步骤的特点是包封过程太敏感，并且必须缩小颗粒。
在某些实施方案中，脂质和脂质纳米颗粒、包含脂质的药物组合物、制备脂质或者配制包含脂质和核酸分子的药物组合物的方法以及使用药物组合物治疗或预防疾病的方法描述于美国或国际专利申请公开，例如US2017/0190661、US2006/0008910、US2015/0064242、US2005/0064595、WO2019/036030、US2019/0022247、WO2019/036028、WO2019/036008、WO2019/036000、US2016/0376224、US2017/0119904、WO2018/200943、WO2018/191657、WO2018/118102、US2018/0169268、WO2018/118102、WO2018/119163、US2014/0255472和US2013/0195968，其每一个的相关内容整体援引加入本文。
初免/加强免疫的方法
本申请的实施方案还考虑，在所谓的初免-加强方案中，向受试者给药免疫学有效量的药物组合物或免疫原性组合，并且随后向相同受试者给药另一剂量的免疫学有效量的药物组合物或免疫原性组合。因此，在一实施方案中，本申请的药物组合物或免疫原性组合为用于引发免疫应答的初免疫苗。在另一实施方案中，本申请的药物组合物或免疫原性组合为用于加强免疫应答的加强疫苗。本申请的初免疫苗和加强疫苗可以用于本文所述的本申请的方法。初免-加强方案的这个一般概念是疫苗领域的技术人员所熟知的。本文所述的本申请的任何药物组合物和免疫原性组合可以用作引发和/或加强针对HBV的免疫应答的初免和/或加强疫苗。优选地，向受试者免疫接种的方法包括向受试者给药包含本申请的核酸分子、核酸组合、载体或RNA复制子的药物组合物，并且向受试者给药包含编码至少一种相同HBV抗原的核酸分子的第二组合物，作为初免-加强方案。
在本申请的一些实施方案中，可以给药本申请的药物组合物或免疫原性组合用于初免免疫。可以再给药本申请的药物组合物或免疫原性组合用于加强免疫。若需要，可以向方案中任选地增加药物组合物或疫苗组合的进一步加强给药。佐剂可以存在于本申请的药物组合物中用于加强免疫，存在于不同的组合物中以连同本申请的药物组合物或免疫原性组合一起给药用于加强免疫，或者以自身给药作为加强免疫。在方案中包含佐剂的那些实施方案中，佐剂优选用于加强免疫。
初免-加强方案的示例性且非限制性实例包括向受试者给药单一剂量的免疫学有效量的本申请的药物组合物或免疫原性组合以引发免疫应答；并且随后给药另一剂量的免疫学有效量的本申请的药物组合物或免疫原性组合以加强免疫，其中在初始给药初免免疫后约2-6周、优选4周，首次给药加强免疫。任选地，初次给药初免免疫后约10-14周，优选12周，给药药物组合物或免疫原性组合的进一步加强免疫或其他佐剂。
初免和加强组合物中的抗原无需相同，但是应当是互相共享抗原或者是基本上类似的。在某些实施方案中，加强组合物的载体与初免组合物的载体不同，例如腺病毒载体、修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、DNA或蛋白。本发明的初免组合物和加强组合物可以各自包含1、2、3或多个剂量。
实施方案
实施方案1包括一种核酸分子或组合，其包含非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码第一乙型肝炎病毒(HBV)抗原的多核苷酸序列；
(2)第一内部核糖体进入序列(IRES)元件或者编码第一自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；以及
编码第二HBV抗原的多核苷酸序列，
其中第一HBV抗原和第二HBV抗原中的至少一个为HBV表面抗原。
实施方案1a包括实施方案1的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原和第二HBV抗原各自独立地选自HBV核心抗原、HBV聚合酶(pol)抗原和HBV表面抗原。
实施方案1b包括实施方案1或1a的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原和第二HBV抗原中的至少一个是HBV Pre-S1抗原或HBV PreS2.S抗原。
实施方案2包括实施方案1-1b中任一项的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原或第二HBV抗原中的一个为HBV核心抗原或HBV pol抗原。
实施方案3包括实施方案1-2中任一项的核酸分子或组合，其中所述非天然存在的多核苷酸序列还包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)第二IRES元件或者编码第二自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，其可操作地连接至编码第二HBV抗原的多核苷酸序列的3’端；和
(2)编码第三HBV抗原的多核苷酸序列。
实施方案3a包括实施方案3的核酸分子或组合，其中所述第三HBV抗原独立地选自HBV核心抗原、HBV聚合酶(pol)抗原和HBV表面抗原。
实施方案4包括实施方案3或3a的核酸分子或组合，其中所述非天然存在的多核苷酸序列还包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)第三IRES元件或者编码第三自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，其可操作地连接至编码第三HBV抗原的多核苷酸序列的3’端；和
(2)编码第四HBV抗原的多核苷酸序列。
实施方案4a包括实施方案4的核酸分子或组合，其中所述第三HBV抗原独立地选自HBV核心抗原、HBV聚合酶(pol)抗原和HBV表面抗原。
实施方案4b包括实施方案1-2的核酸分子或组合，其包含
第一非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码第一乙型肝炎病毒(HBV)抗原的多核苷酸序列，
(2)第一内部核糖体进入序列(IRES)元件或编码第一自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，和
(3)编码第二HBV抗原的多核苷酸序列；以及
第二非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码第三乙型肝炎病毒(HBV)抗原的多核苷酸序列，
(2)第二内部核糖体进入序列(IRES)元件或者编码第二自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，和
(3)编码第四HBV抗原的多核苷酸序列，
其中第一非天然存在的多核苷酸序列和第二非天然存在的多核苷酸序列通过第三内部核糖体进入序列(IRES)元件或编码第三自体蛋白酶肽的多核苷酸序列连接，或者存在于不同的核酸分子中，并且
其中第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原各自独立地选自HBV核心抗原、HBV聚合酶(pol)抗原和HBV表面抗原，并且
第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的至少一个是选自以下的HBV表面抗原：HBV Pre-S1抗原，其具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，和HBV PreS2.S抗原，其具有与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，
优选地，第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原或第四HBV抗原中的一个是HBV核心抗原或HBV pol抗原。
实施方案5包括实施方案1-4b中任一项的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个互相不同。
实施方案6包括实施方案1-5中任一项的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(i)第一HBV PreS1抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(ii)第二HBV PreS1抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iii)HBV PreS2抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iv)HBV核心抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQID NO：7至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；和
(v)HBV聚合酶抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQID NO：9至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
实施方案6a包括实施方案6的核酸分子或组合，其中所述HBV核心抗原包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：86至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：86至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
实施方案6b包括实施方案6的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(1)第一HBV Pre-S1抗原，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
(2)第二HBV Pre-S1抗原，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；
(3)HBV PreS2.S抗原，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；
(4)HBV核心抗原，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；和
(5)HBV聚合酶抗原，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
实施方案6b1包括实施方案6b的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(1)第一HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成；
(2)第二HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成；
(3)HBV PreS2.S抗原，其由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成；
(4)HBV核心抗原，其由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成；和
(5)HBV聚合酶抗原，其由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。
实施方案6b2包括实施方案6b的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(1)第一HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成；
(2)第二HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成；
(3)HBV PreS2.S抗原，其由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成；
(4)HBV核心抗原，其由SEQ ID NO：84的氨基酸序列组成；和
(5)HBV聚合酶抗原，其由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。
实施方案6b3包括实施方案6b的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(1)第一HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成；
(2)第二HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成；
(3)HBV PreS2.S抗原，其由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成；
(4)HBV核心抗原，其由SEQ ID NO：85的氨基酸序列组成；和
(5)HBV聚合酶抗原，其由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。
实施方案6b4包括实施方案6b的核酸分子或组合，其中第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(1)第一HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成；
(2)第二HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成；
(3)HBV PreS2.S抗原，其由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成；
(4)HBV核心抗原，其由SEQ ID NO：7的氨基酸序列组成；和
(5)HBV聚合酶抗原，其由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成。
实施方案6c包括实施方案1-6b4中任一项的核酸分子或组合，其中所述核酸分子包含编码第一HBV Pre-S1抗原、第二HBV Pre-S1抗原和HBV PreS2.S抗原中的至少一个的多核苷酸序列，以及编码HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的至少一个的多核苷酸序列。
实施方案6c1包括实施方案1-6c中任一项的核酸分子或组合，其中第一HBV Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBV pol抗原中的每一个独立地可操作地连接至信号肽，并且所述HBV PreS2.S抗原包含内部信号肽。
实施方案6c2包含实施方案6c1的核酸分子或组合，其中所述信号肽为胱抑素S信号肽、Ig重链γ信号肽SPIgG、Ig重链ε信号肽SPIgE或冠状病毒的短前导肽序列。
实施方案6c3包括实施方案6c2的核酸分子或组合，其中所述信号肽包含SEQ IDNO：77的氨基酸序列，并且可操作地连接至HBV Pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBVpol抗原的N-末端。
实施方案6d包括实施方案1-6c3中任一项的核酸分子或组合，其中所述核酸分子包含至少一个IRES元件。
实施方案6d1包括实施方案6d的核酸分子或组合，其中所述IRES元件包含SEQ IDNO：13的多核苷酸序列。
实施方案6d2包括实施方案6d1的核酸分子或组合，其中所述IRES元件由SEQ IDNO：13的多核苷酸序列组成。
实施方案6d3包括实施方案6d的核酸分子或组合，其中所述IRES元件包括SEQ IDNO：14的多核苷酸序列。
实施方案6d4包括实施方案6d3的核酸分子或组合，其中所述IRES元件由SEQ IDNO：14的多核苷酸序列组成。
实施方案6e包括实施方案1-6d4中任一项的核酸分子或组合，其中所述核酸分子包含至少一种编码自体蛋白酶肽的多核苷酸序列。
实施方案6e1包括实施方案6e的核酸分子或组合，其中所述自体蛋白酶肽包含SEQID NO：11的氨基酸序列。
实施方案6e2包括实施方案6e1的核酸分子或组合，其中所述自体蛋白酶肽由SEQID NO：11的氨基酸序列组成。
实施方案6e3包括实施方案6e的核酸分子或组合，其中所述自体蛋白酶肽由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO：12的序列。
实施方案6e4包括实施方案6e的核酸分子或组合，其中所述自体蛋白酶肽由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列由SEQ ID NO：12的序列组成。
实施方案7包括实施方案6c-6e4中任一项的核酸分子或组合，其中所述HBV核心抗原包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：84、85或86中的至少一个至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：84、85或86至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
实施方案7a包括实施方案7的核酸分子或组合，其中所述HBV核心抗原包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：选自SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86的氨基酸序列。
实施方案7b包括实施方案7a的核酸分子或组合，其中所述HBV核心抗原由SEQ IDNO：86的氨基酸序列组成。
实施方案8包括实施方案1-7b中任一项的核酸分子或组合，其中所述HBV核心抗原的最后5个C-末端氨基酸包含VVR氨基酸序列，更特别地VVRR(SEQ ID NO：91)氨基酸序列，更特别地VVRRR(SEQ ID NO：92)氨基酸序列。
实施方案9包括实施方案1-8中任一项的核酸分子或组合，其中HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的至少一个包含：
(i)HBV基因型A、B、C和D中的两个或更多个、优选全部的共有序列；和/或
(ii)HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*02:01、HLA-A*A2402、HLA-A*A0101或HLA-B*40:01的一个或多个表位。
实施方案9a包括实施方案9的核酸分子或组合，其中HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的至少一个包含一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位、HLA-A*02:01表位和HLA-A*A2402表位。
实施方案9a1包括实施方案9或9a的核酸分子或组合，其中HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的至少一个包含一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位和HLA-A*02:01表位。
实施方案9a2包括实施方案9-9a1中任一项的核酸分子或组合，其中HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的至少一个包含HLA-A*11:01的一个或多个表位。
实施方案9a3包括实施方案9-9a2中任一个的核酸分子或组合，其中HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的每一个包含HLA-A*11:01的一个或多个表位。
实施方案9a4包括实施方案9-9a3中任一项的核酸分子或组合，其中HBV preS1、HBV preS2.S、HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的每一个包含HLA-A*11:01的一个或多个表位。
实施方案9b包括实施方案9-9a4中任一项的核酸分子或组合，其中HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的每一个包含HBV基因型A、B、C和D的共有序列。
实施方案9c包括实施方案9的核酸分子或组合，其中HBV聚合酶抗原、HBV pre-S1抗原和HBV preS2.S抗原中的至少一个包含一个或多个HLA-A*24:02表位。
实施方案9c1包括实施方案9或9c的核酸分子或组合，其中HBV聚合酶抗原、HBVpre-S1抗原和HBV preS2.S抗原中的每一个包含一个或多个HLA-A*24:02表位。
实施方案9c2包括实施方案9-9c1中任一项的核酸分子或组合，其中所述HBVpreS2.S抗原包含一个或多个HLA-A*24:02表位。
实施方案9d包括实施方案9的核酸分子或组合，其中HBV聚合酶抗原和HBV核心抗原中的至少一个包含一个或多个HLA-A*02:01表位。
实施方案9d1包括实施方案9d的核酸分子或组合，其中HBV聚合酶抗原和HBV核心抗原中的每一个包含一个或多个HLA-A*02:01表位。
实施方案9e包括实施方案9的核酸分子或组合，其中所述HBV preS2.S抗原包含一个或多个HLA-A*A2402表位。
实施方案9f包括实施方案9的核酸分子或组合，其中HBV聚合酶抗原和HBV核心抗原中的至少一个包含一个或多个HLA-A*A0101表位。
实施方案9f1包括实施方案9f的核酸分子或组合，其中HBV聚合酶抗原和HBV核心抗原中的每一个包含一个或多个HLA-A*A0101表位。
实施方案9g包括实施方案9的核酸分子或组合，其中所述HBV核心抗原包含一个或多个HLA-B*40:01表位。
实施方案9h包括实施方案9的核酸分子或组合，其中所述HBV核心抗原包含一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*02:01表位、HLA-A*A0101表位和HLA-B*40:01表位。
实施方案9i包括实施方案9的核酸分子或组合，其中所述HBV聚合酶抗原包含一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位、HLA-A*02:01表位和HLA-A*A0101表位。
实施方案9j包括实施方案9的核酸分子或组合，其中所述HBV Pre-S1抗原包含一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位和HLA-A*24:02表位。
实施方案9k包括实施方案9的核酸分子或组合，其中所述HBV PreS2.S抗原包含一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位和HLA-A*A2402表位。
实施方案9l包括实施方案9的核酸分子或组合，其中HBV表面抗原、HBV核心抗原和HBV聚合酶抗原中的每一个包含：
(i)HBV基因型A、B、C和D的共有序列；和
(ii)HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*02:01、HLA-A*A0201、HLA-A*A2402和HLA-A*A0101的一个或多个表位。
实施方案10包括实施方案1-9l中任一项的核酸分子或组合，其中编码第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：
(i)编码第一HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：2至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(ii)编码第二HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：4至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iii)编码HBV preS2.S抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：6至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：6至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iv)编码HBV核心抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：8至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；以及
(v)编码HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：10至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，
优选地，编码第一HBV Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBVpol抗原中的每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列，并且HBV PreS2.S抗原包含内部信号肽。
实施方案10a包括实施方案10的核酸分子或组合，其中编码第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：
(i)编码第一HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列；
(ii)编码第二HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列；
(iii)编码HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，其具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列；
(iv)编码HBV核心抗原的多核苷酸序列，其具有SEQ ID NO：89的核苷酸序列；以及
(v)编码HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列，其具有SEQ ID NO：10的核苷酸序列。
实施方案10b包括实施方案10的核酸分子或组合，其中编码第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：
(i)编码第一HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：4的核苷酸序列组成；
(ii)编码第二HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：4的核苷酸序列组成；
(iii)编码HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：6的核苷酸序列组成；
(iv)编码HBV核心抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：87的核苷酸序列组成；以及
(v)编码HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：10的核苷酸序列组成。
实施方案10c包括实施方案10的核酸分子或组合，其中编码第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：
(i)编码第一HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成；
(ii)编码第二HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：4的核苷酸序列组成；
(iii)编码HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：6的核苷酸序列组成；
(iv)编码HBV核心抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：88的核苷酸序列组成；以及
(v)编码HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：10的核苷酸序列组成。
实施方案10d包括实施方案10的核酸分子或组合，其中编码第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：
(i)编码第一HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：2的核苷酸序列组成；
(ii)编码第二HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：4的核苷酸序列组成；
(iii)编码HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：6的核苷酸序列组成；
(iv)编码HBV核心抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：89的核苷酸序列组成；以及
(v)编码HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：10的核苷酸序列组成。
实施方案11包括实施方案10的核酸分子或组合，其中编码HBV核心抗原的多核苷酸序列包含以下核苷酸序列、优选由以下核苷酸序列组成：与SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：89至少90％相同的多核苷酸序列，例如与SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQID NO：89至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同。
实施方案11a包括实施方案11的核酸分子或组合，其中编码HBV核心抗原的多核苷酸序列包含以下核苷酸序列、优选由以下核苷酸序列组成：SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：89中的任一个。
实施方案11b包括实施方案11或11a的核酸分子或组合，其中编码HBV核心抗原的多核苷酸序列由SEQ ID NO：89组成。
实施方案11c包括实施方案10-11b中任一项的核酸分子或组合，其中编码第一HBVPre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBVpol抗原中的每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸，例如胱抑素S信号肽、Ig重链γ信号肽SPIgG、Ig重链ε信号肽SPIgE或冠状病毒的短前导肽序列。
实施方案11d包括实施方案11c的核酸分子或组合，其中编码信号肽的多核苷酸包含SEQ ID NO：90的核苷酸序列。
实施方案12包括实施方案1-11d中任一项的核酸分子或组合，其中第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个独立地包含选自以下的肽序列：猪捷申病毒-12A(P2A)、***病毒(FMDV)2A(F2A)、马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV2A)、软化病病毒2A(BmIFV2A)及其组合。
实施方案12a包括实施方案12的核酸分子或组合，其中第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个包含P2A的肽序列，例如SEQ ID NO：11的P2A序列。
实施方案13包括实施方案1-12a中任一项的核酸分子或组合，其中第一IRES、第二IRES和第三IRES中的每一个源自脑心肌炎病毒(EMCV)或肠道病毒71(EV71)。
实施方案13a包括实施方案13的核酸分子或组合，其中第一IRES、第二IRES和第三IRES中的每一个包含SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列。
实施方案14包括实施方案1-3a中任一项的核酸分子或组合，其包含非天然存在的多核苷酸序列，其具有，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(2)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(3)编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBNPre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(4)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(5)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(6)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(7)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(8)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ IDNO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(9)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(10)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(11)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(12)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(13)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(14)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ IDNO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(15）编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(16)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(17)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(18)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(19)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(20)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(21)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(22)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(23)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；以及
(24)编码具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列。
实施方案14a1包括实施方案14的核酸分子或组合，其包含非天然存在的多核苷酸序列，其具有，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(2)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(5)编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(6)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(7)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(8)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(9）编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(10)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(11)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(12)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(13)编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(14)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(15)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(16)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(17)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(18)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(19)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(20)编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(21)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(22)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(23)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；以及
(24)编码由SEQ ID NO：7、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列。
实施方案14a2包括实施方案14的核酸分子或组合，其包含非天然存在的多核苷酸序列，其具有，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(2)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(3)编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(4)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(5)编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBVPre-S1抗原的多核苷酸序列；
(6)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ IDNO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(7)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(8)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(9)编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ IDNO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(10)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(11)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(12)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(13)编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(14)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(15)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(16)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列组成的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(17)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(18)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(19)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(20)编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(21)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(22)编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(23)编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；以及
(24)编码由SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列。
实施方案14a3包括实施方案14、14a1或14a2的核酸分子或组合，其中编码第一HBVPre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、HBV核心抗原和HBV Pol抗原中的每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列。
实施方案14a4包括实施方案14a3的核酸分子或组合，其中所述信号肽包括胱抑素S信号肽、Ig重链γ信号肽SPIgG、Ig重链ε信号肽SPIgE或冠状病毒的短前导肽序列。
实施方案14a5包括实施方案14a4的核酸分子或组合，其中所述信号肽包含SEQ IDNO：77的氨基酸序列。
实施方案14a6包括实施方案14a5的核酸分子或组合，其中编码信号肽的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：90的多核苷酸序列。
实施方案14b包括实施方案14-14a6中任一项的核酸分子或组合，其包含实施方案14(3)-14(24)、14a1(5)-14a1(24)或14a2(3)-14a2(24)中任一项的非天然存在的多核苷酸序列。
实施方案14c包括实施方案14b的核酸分子或组合，其包含SEQ ID NO：21-54中任一项的非天然存在的多核苷酸序列。
实施方案14d包括实施方案14b或14c的核酸分子或组合，与选自实施方案14(1)、14(2)、14a1(1)、14a1(2)、14a2(1)和14a2(2)的非天然存在的多核苷酸序列中的任一个组合。
实施方案14e包含实施方案14b或14c的核酸分子或组合，与选自SEQ ID NO：15-20的非天然存在的多核苷酸序列中的任一个组合。
实施方案15包括实施方案14的核酸分子或组合，其包含SEQ ID NO：15-54中任一项的非天然存在的多核苷酸序列。
实施方案16包括一种载体，其包含实施方案1-15中任一项的核酸分子或组合。
实施方案17包括实施方案16的载体，其为DNA质粒。
实施方案18包括实施方案16的载体，其为DNA病毒载体。
实施方案18a包括实施方案16的载体，其为RNA病毒载体。
实施方案18b包括实施方案18a的载体，其为RNA复制子。
实施方案18c包括实施方案16的载体，其为修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)载体或腺病毒载体。
实施方案18c1包括实施方案18c的载体，其为MVA-BN载体。
实施方案18c2包括实施方案18c的载体，其为Ad26或Ad35载体。
实施方案19包括一种RNA复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的5’非翻译区(5’-UTR)；
(2)编码RNA病毒的至少一种、优选全部非结构蛋白的多核苷酸序列；
(3)RNA病毒的亚基因组启动子；
(4)实施方案1-15中任一项的核酸分子或组合；以及
(5)非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的3’非翻译区(3’-UTR)。
实施方案20包括一种RNA复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)甲病毒5’非翻译区(5’-UTR)；
(2)甲病毒非结构基因nsp1的5’复制序列；
(3)病毒种的下游环(DLP)基序；
(4)编码第四自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；
(5)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的核苷酸序列；
(6)甲病毒亚基因组启动子；
(7)实施方案1-15中任一项的核酸分子或组合；
(8)甲病毒3′非翻译区(3′UTR)；以及
(9)任选地，多腺苷酸序列。
实施方案21包括实施方案20的RNA复制子，其中所述DLP基序来自选自以下的病毒种：东部马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、沼泽地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、那皮舒纳病毒(PIXV)、米德堡病毒(MTDV)、奇昆古尼亚病毒(CHIKV)、阿尼昂-尼昂病毒(ONNV)、罗斯河病毒(RRV)、巴马森林病毒(BF)、盖塔病毒(GET)、鹭山病毒(SAGV)、贝巴鲁病毒(BEBV)、马雅罗病毒(MAYV)、乌纳病毒(UAV)、辛德毕斯病毒(SINV)、奥拉病毒(AURAV)、沃达罗河病毒(WHAV)、巴班肯病毒(BABV)、库孜拉加奇病毒(KYZV)、西部马脑炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜穆病毒(NDUV)和博吉河病毒。
实施方案22包括实施方案21的RNA复制子，其中所述第四自体蛋白酶肽选自猪捷申病毒-12A(P2A)、***病毒(FMDV)2A(F2A)、马鼻炎A病毒(HRAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV2A)、软化病病毒2A(BmIFV2A)及其组合。
实施方案22a包括实施方案22的RNA复制子，其中所述第四自体蛋白酶肽包含P2A的肽序列。
实施方案22b包括实施方案22或22a的RNA复制子，其中所述第四自体蛋白酶肽包含SEQ ID NO：11的肽序列。
实施方案23包含一种RNA复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)具有SEQ ID NO：55的多核苷酸序列的5’-UTR；
(2)具有SEQ ID NO：56的多核苷酸序列的5’复制序列；
(3)包含SEQ ID NO：57的多核苷酸序列的DLP基序；
(4)编码SEQ ID NO：11的P2A序列的多核苷酸序列；
(5)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的多核苷酸序列，所述甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4分别由SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61的核酸序列编码；
(6)具有SEQ ID NO：62的多核苷酸序列的亚基因组启动子；
(7)实施方案1-15中任一项的核酸分子或组合；以及
(8)具有SEQ ID NO：63的多核苷酸序列的3′UTR。
实施方案24包括实施方案23的RNA复制子，其中
(i)编码P2A序列的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：12；
(ii)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的多核苷酸序列分别具有SEQID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61的核酸序列；
(iii)所述核酸分子或组合包含SEQ ID NO：15-54中任一个的多核苷酸序列；并且
(iv)所述RNA复制子在复制子的3’-端还包含多腺苷酸序列，优选地，所述多腺苷酸序列具有SEQ ID NO：64的序列。
实施方案25包括一种RNA复制子，其包含SEQ ID NO：65-72中任一个的多核苷酸序列。
实施方案26包括一种核酸分子，其包含编码实施方案19-25中任一项的RNA复制子的多核苷酸序列，优选地，所述核酸还包含可操作地连接至DNA序列的5’-端的T7启动子，更优选地，所述T7启动子包含SEQ ID NO：173的核苷酸序列。
实施方案27包括一种药物组合物，其包含实施方案1-15和26中任一项的核酸分子或组合、实施方案16-18c2中任一项的载体或者实施方案19-25中任一项的RNA复制子，以及药学可接受的载剂。
实施方案28包括实施方案27的药物组合物，其中所述药学可接受的载剂的包括一种或多种脂质。
实施方案28a包括实施方案28的药物组合物，其中所述一种或多种脂质包括阳离子脂质。
实施方案28a1包括实施方案28a的药物组合物，其中所述阳离子脂质包括可电离的阳离子脂质。
实施方案28a2包括实施方案28a的药物组合物，其中所述阳离子脂质选自ALC-0315(((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))、DOTMA(N-D-(2,3-二油基氧基)丙基N,N,N-三甲基氯化铵)、DOTAP(1，2-双(油基氧基)-3(三甲基丙基铵)、DDAB(二甲基双十八烷基-溴化铵)、DOGS(双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺)、DOPE(l,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺)、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA、DLin-M-C3-DMA、DLin-MP-DMA和DCChol(3β-(N—(N′,N′-二甲基氨基甲烷)-氨基甲酰基)胆固醇)、及其组合。
实施方案28a3包括实施方案28a-28a2中任一项的药物组合物，其中所述阳离子脂质为ALC-0315。
实施方案28b包括实施方案28a-28a3中任一项的药物组合物，其还包含以下的一种或多种：(a)聚乙二醇(PEG)脂质或PEG-修饰的脂质，(b)辅助脂质，和(c)甾醇。
实施方案28b1包括实施方案28b的药物组合物，其中所述PEG脂质PEG-修饰的脂质选自2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、PEG550-PE、PEG750-PE、PEG2000-DMG、PEG-DSPE、PEG-DAA、PEG-DAG、PEG-PE、单甲氧基聚乙二醇(MePEG-OH)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酸酯(MePEG-S)、单甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(MePEG-S-NHS)、单甲氧基聚乙二醇-胺(MePEG-NH2)、单甲氧基聚乙二醇-三氟甲基磺酸酯(MePEG-TRES)、单甲氧基聚乙二醇-咪唑基-羰基(MePEG-IM)及其组合。
实施方案28b2包括实施方案28b或28b1的药物组合物，其中所述PEG脂质为ALC-0159。
实施方案28c包括实施方案28b-28b2中任一项的药物组合物，其中所述辅助脂质选自中性脂质、中性辅助脂质、非阳离子脂质、非阳离子辅助脂质、阴离子脂质、阴离子辅助脂质或两性离子脂质，或其组合。
实施方案28c1包括实施方案28c的药物组合物，其中所述辅助脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸酯、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰-磷脂酰甘油(POPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二反油酰基-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、硬脂酰油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰磷脂酰胆碱，及其组合。
实施方案28c2包括实施方案28c或28c1的药物组合物，其中所述辅助脂质为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
实施方案28d包括实施方案28b-28c2中任一项的药物组合物，其中所述甾醇选自胆固醇、5α-胆甾烷醇、5α-粪甾醇、胆甾醇基-(2'-羟基)-乙基酯、胆甾醇基-(4'-羟基)-丁基醚、6-酮胆甾烷醇、5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5α-胆甾烷酮、胆甾醇基癸酸酯，及其组合。
实施方案28d1包括实施方案28d的药物组合物，其中所述甾醇为胆固醇。
实施方案28e包括实施方案28-28d1中任一项的药物组合物，其中一种或多种脂质包括ALC-0315、ALC-0159、DSPC和胆固醇。
实施方案28f包括实施方案28-28e中任一项的药物组合物，其中所述药学可接受的载剂包括脂质纳米颗粒。
实施方案29包括实施方案27-28f中任一项的药物组合物，其还包含
(1)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；或
(2)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列。
实施方案30包括一种针对HBV对受试者疫苗接种的方法，所述方法包括向所述受试者给药实施方案27-28f中任一项的药物组合物，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染。
实施方案30a包括实施方案27-28f中任一项的药物组合物，用于针对HBV对受试者疫苗接种，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染。
实施方案30b包括实施方案30a用于疫苗接种的药物组合物，其还包含第二组合物，所述第二组合物包含编码至少一种相同HBV表位的核酸分子，例如至少一种相同HLA表位，优选至少一种相同抗原，用于初免-加强方案。
实施方案30c包括实施方案27-28f中任一项的药物组合物，用于治疗HBV感染。
实施方案31包括实施方案30的方法，还包括在初免-加强方案中，向所述受试者给药第二组合物，所述第二组合物包含编码至少一种相同HBV表位的核酸分子，例如至少一种相同HLA表位，优选至少一种相同抗原。
实施方案32包括实施方案31的方法，其中所述初免-加强方案包括包含实施方案19-25中任一项的RNA复制子的第一组合物以及包含载体的第二组合物，所述载体不是RNA复制子，并且编码与初免组合物相同的至少一种HBV表位，例如与初免组合物相同的至少一种HLA表位，优选与初免组合物相同的至少一种抗原。
实施方案32a包括实施方案32的方法，其中在初免-加强方案中，所述第一组合物用于初免免疫，并且所述第二组合物用于加强免疫。
实施方案32b包括实施方案32的方法，其中在初免-加强方案中，所述第二组合物用于初免免疫，并且所述第一组合物用于加强免疫。
实施方案33包括实施方案32-32b中任一项的方法，其中所述第二组合物包含修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、腺病毒载体或质粒。
实施方案33a包括实施方案33的方法，其中所述第二组合物包含MVA-BN载体。
实施方案33b包括实施方案33的方法，其中所述第二组合物包含Ad26或Ad35载体。
实施方案34包括一种用于减少受试者中的HBV感染和/或复制的方法，其包括向所述受试者给药实施方案27-28f中任一项的药物组合物，或者根据实施方案30或31-33b中任一项疫苗接种所述受试者。
实施方案34a包括实施方案30或31-34中任一项的方法，其中所述受试者选自HLA-A*11:01受试者、HLA-A*24:02受试者、HLA-A*02:01受试者、HLA-A*A2402受试者、HLA-A*A0101受试者和HLA-B*40:01受试者。
实施方案34a1包括实施方案34a的方法，其中所述受试者选自HLA-A*11:01受试者、HLA-A*24:02受试者、HLA-A*02:01受试者和HLA-A*A2402受试者。
实施方案34a2包括实施方案34a或34a1的方法，其中所述受试者选自HLA-A*11:01受试者、HLA-A*24:02受试者和HLA-A*02:01受试者。
实施方案34a3包括实施方案34a-34a2中任一项的方法，其中所述受试者为HLA-A*11:01受试者。
实施方案34a4包括实施方案34a-34a3中任一项的方法，其中所述受试者为人患者。
实施方案34b包括实施方案30或31-34中任一项的方法，其中所述受试者包含至少一种HBV抗原，所述HBV抗原含有一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位、HLA-A*02:01表位、HLA-A*A2402表位、HLA-A*A0101表位和HLA-B*40:01表位。
实施方案34b1包括实施方案34b的方法，其中所述受试者包含至少一种HBV抗原，所述HBV抗原含有一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位、HLA-A*02:01表位和HLA-A*A2402表位。
实施方案34b2包括实施方案34b或34b1的方法，其中所述受试者包含至少一种HBV抗原，所述HBV抗原含有一个或多个选自以下的表位：HLA-A*11:01表位、HLA-A*24:02表位和HLA-A*02:01表位。
实施方案34b3包括实施方案34b-34b2中任一项的方法，其中所述受试者包含至少一种HBV抗原，所述HBV抗原含有一个或多个HLA-A*11:01表位。
实施方案34b4包括实施方案34b-34b3中任一项的方法，其中所述受试者为人患者。
实施方案35包括一种分离的宿主细胞，其包含实施方案1-15和26中任一项的核酸分子或组合、实施方案16-18c2中任一项的载体或者实施方案19-25中任一项的RNA复制子。
实施方案36包括一种制备RNA复制子的方法，其包括体内或体外转录实施方案26的核酸。
实施方案36a包括实施方案36的方法，其中在非人动物中体内转录所述核酸。
实施方案36b包括实施方案36的方法，其中在人中体内转录所述核酸。
实施方案37包括实施方案27-28f中任一项的药物组合物，其用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，任选地联合另一免疫原性剂或其他抗HBV剂。
实施方案37a包括实施方案37的用于诱导免疫应答的药物组合物，其中所述其他抗HBV剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、多肽、蛋白或核酸。
实施方案37b包括一种用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)免疫应答的方法，其包括向所述受试者给药实施方案27-28f中任一项的药物组合物，任选地，所述方法还包括向所述受试者给药另一免疫原性剂和/或另一抗HBV剂，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染。
实施方案38包括实施方案27-28f中任一项的药物组合物，其用于治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(HBV)诱导的疾病，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，并且所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)，任选地联合另一治疗剂，优选另一抗HBV剂。
实施方案38a包括一种治疗有需要的受试者的乙型肝炎病毒(HBV)诱导的疾病的方法，其包括向所述受试者给药实施方案27-28f中任一项的药物组合物，任选地，所述方法还包括向所述受试者给药另一治疗剂，优选另一抗HBV剂，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，并且所述HBV诱导的疾病选自晚期纤维化、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。
实施方案39包括一种分离的HBV抗原，其包含SEQ ID NO：1、3、5、9、84、85或86中任一个的氨基酸序列。
实施方案39a包括实施方案39的分离的HBV抗原，其中所述HBV抗原包含HBV基因型A、B、C和D的共有序列。
实施方案39b包括实施方案39或39a的分离的HBV抗原，其中所述HBV抗原包含以下的至少2个、3个、4个、5个或所有表位：HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*02:01、HLA-A*A2402、HLA-A*A0101和HLA-B*40:01。
实施方案39c包括实施方案39-39b中任一项的分离的HBV抗原，其由SEQ ID NO：1、3、5、9、84、85或86中任一个的氨基酸序列组成。
实施方案40包括一种分离的多核苷酸序列，其编码实施方案39-39c中任一项的HBV抗原。
实施方案40a包括实施方案40的分离的多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2、4、6、10、87、88或89中任一个的核苷酸序列。
实施方案40b包括实施方案40a的分离的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：2、4、6、10、87、88或89中任一个的核苷酸序列组成。
实施方案41为一种载体，其包含实施方案40-40b中任一项的多核苷酸序列。
实施方案41a为实施方案41的载体，其为质粒。
实施方案41b为实施方案41的载体，其为病毒载体。
实施方案41b1为实施方案41b的载体，其为MVA载体，优选MVA-BN。
实施方案41b2为实施方案41b的载体，其为腺病毒载体，优选Ad26或Ad35。
实施方案41c为实施方案41的载体，其为RNA复制子。
实施方案42为一种药物组合物，其包含实施方案39-39c中任一项的分离的HBV抗原、实施方案40-40b中任一项的分离的多核苷酸序列或者实施方案41-41c中任一项的载体。
实施方案43为一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述受试者给药实施方案42的药物组合物。
实施方案43a包括实施方案42的药物组合物，其用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，任选地联合另一免疫原性剂，优选另一抗HBV剂。
实施方案44包括一种分离的宿主细胞，其包含实施方案40-40b中任一项的核酸分子、实施方案41-41c中任一项的载体。
实施例
实施例1：复制子疫苗候选物的抗原选择、设计和体外评价
分别选择L表面抗原的高免疫原性HBV蛋白核心、Pol、PreS2.S和PreS1结构域以纳入复制子HBV治疗性疫苗中。为了集中免疫原性，基于基因型A，B，C和D的每个抗原的独特序列的比对产生共有序列。通过包含这4种占世界上＞78％的慢性乙型肝炎(CHB)感染的基因型，最大化可治疗的目标人群的规模。将在中国、美国和欧洲已知最常见的三种MHC I类HLA等位基因的人T细胞表位(包括HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*02:01、HLA-A*A0201、HLA-A*A2402、HLA-A*A0101和HLA-B*40:01)映射(map)到每个共有序列。如果发现已知的表位发生改变，则调整共有序列以恢复表位。例如，将C末端的Arg149、150和151包含在HBV治疗性疫苗中编码的HBV核心中。进一步优化Pol以失活其逆转录酶和RNase活性。将胱抑素S前体信号肽添加至核心、Pol和PreS1结构域来促进分泌，同时使PreS2.S的内部信号肽保持完整以促进分泌PreS2.S蛋白产物M和S。最后，将每个抗原的氨基酸序列反向翻译并且优化密码子以最大化人细胞中的表达(图1A)。
将这些抗原以单独复制子或者多顺反子构型编码，每个抗原在复制子里的位置不同，各自通过P2A核糖体跳跃元件或者EMCV或EV71的内部核糖体进入位点(IRES)连接(图1B)。使用质粒模板，在体外转录反应中产生每个复制子设计的RNA并且电穿孔进入Vero细胞。电穿孔后24-48小时，通过流式细胞术、蛋白印迹分析和ELISA测量每个抗原的表达和分泌。还测定双链RNA(dsRNA)和抗原阳性细胞的频率，作为复制子扩增效率的指示。对于每个构建体，基于相应的水平给每个抗原打分：1)表达、2)分泌和3)抗原/dsRNA阳性细胞相对于表达单一抗原的复制子的频率。将抗原分数加权和合并以给出总复制子构建体分数(下方表1)。基于这些分数将每种构建体排序，并且选择前4个双顺反子和前4个四顺反子构建体进行进一步的体内评估(图2)。如果构建体分数相同(tie)，基因分数按以下用于对这些构建体进行排序的顺序进行优先排序：核心>Pol>PreS2.S>PreS1。此外，对每个抗原具有更多类似相对表达水平的构建体优于具有单一抗原的高水平表达和其他抗原的低水平表达的构建体。
Figure BDA0004111907790000991
图2示出前8个复制子的每种抗原相对于单基因对照的表达量。所有的构建体都能够保持每种抗原的相对高水平表达。然而，当核心和pol从同一双顺反子复制子RNA表达时，观察到核心的表达减少。相反，从同一复制子中表达核心、Pol、PreS2.S和PreS1的四顺反子复制子，一致地证实核心表达相对于单基因对照的2-3倍增加。从四顺反子复制子RNA表达核心、Pol和PreS2.S同样导致核心表达水平增高(图3)，虽然增加不如从同一复制子RNA表达PreS1显著。
实施例2:SMARRT复制子RNA平台在小鼠中诱导针对HBV靶标的细胞应答
这些研究目的是确定编码HBV抗原的合成的修饰的αRNA复制子技术(SMARRT)是否能引发C57BL/6小鼠的免疫应答。SMARRT单基因HBV构建体以15μg剂量给药，并且混合组接受4种SMARRT单基因复制子，每种复制子15μg(每只小鼠RNA总共60μg)。在第0周，用所述的SMARRT构建体通过IM注射免疫小鼠，并且对照组注射盐水。在第2周处死所有实验动物，并且用15mer重叠肽池刺激脾细胞，所述重叠肽池覆盖***物中的抗原序列(对于SMARRT.Pol，重叠文库分成2个池)。用IFN-γELISpot测量产生IFN-γ细胞的诱导。通过流式细胞术检测IFN-γ、TNFa和IL-2的产生来确定CD8和CD4多能T细胞应答。下表2示出不同的实验组。
表2
组别 动物# 组别描述
5 盐水
2 5 SMARRT.核心
5 SMARRT.Pol
5 SMARRT.PreS2.S
5 5 SMARRT.PreS1
6 5 SMARRT.混合的单基因(monotope)
在用覆盖适当抗原序列的多肽刺激下，所有用SMARRT复制子编码的HBV抗原免疫的动物都出现产生IFN-γ的细胞(图4)。此外，混合4种SMARRT复制子对所有4种抗原都诱导产生IFNγ的细胞。在相同但独立的实验中，通过细胞内流式细胞术测量多能T细胞细胞因子的产生(图5)。这个实验表明，使用SMARRT.核心或SMARRT.PreS1免疫小鼠在C57BL/6小鼠中诱导多能CD4 T细胞。SMARRT.Pol和SMARRT.PreS2.S免疫导致小鼠中多能CD4和CD8 T细胞应答。
实施例3：小鼠中SMARRT HBV治疗性疫苗候选物的淘汰筛选(down selection)
体外筛查之后，选择8个构建体用在小鼠体内进行免疫原性分析，这包括4个四顺反子构建体和4个双基因构建体，其混合在4个组合中以递送所有的4个HBV抗原。在第0周免疫C57BL/6小鼠，然后根据下表3的实验概述对在第2周收获的脾脏进行免疫原性分析。离体实验包括IFNγ ELISpot和细胞内细胞因子染色。
表3
组别 动物# 组别描述(2-15所有SMARRT)
1 5 盐水
2 5 SMARRT.核心
3 5 SMARRT.Pol
4 5 SMARRT.PreS2.S
5 5 SMARRT.PreS1
6 5 SMARRT.混合的单基因
7 5 PreS2.S-IRES-PreS1(EV71 IRES)+Pol-IRES-核心(EMCV IRES)混合的
8 5 PreS2.S-IRES-PreS1(EV71 IRES)+核心-2A-Pol混合的
9 5 PreS1-2A-PreS.S+Pol-IRES-核心(EMCV IRES)混合的
10 5 PreS1-2A-PreS.S+核心-2A-Pol混合的
11 5 PreS1-2A-PreS.S-2A-核心-Pol
12 5 PreS1-2A-PreS.S-2A-Pol-2A-核心
13 5 Pol-2A-核心-IRES-PreS2.S-2A-PreS1(EMCV IRES)
14 5 Pol2A-核心-IRES-PreS2.S-2A-PrS1(EV71 IRES)
15 5 SMARRT.核心+Pol混合的
如通过IFNγELISpot所测量，所有双基因构建体和四顺反子构建体都诱导针对HBV核心(图6A)、Pol(图6B)和PreS2.S(图6C)的强T细胞应答。所有双基因和四顺反子构建体都诱导针对PreS1的T细胞应答(图6D)，具有取决于构建体的一些变化。双基因2和3(组9)、双基因2和4(组10)的混合物以及四顺反子构建体组(组11-14)诱导最强的PreS1应答。
所有双基因和四顺反子构建体诱导针对核心(图7A)、Pol(图7B)、PreS2.S(图7C)和PreS1(图7D)的多能CD4+和CD8+T细胞应答，如通过产生多种细胞因子的能力来评估的。取决于构建体，针对PreS1的应答更多变，双基因2和3(组9)、双基因2和4(组10)的混合物以及四顺反子构建体(组11-14)诱导的应答最强。
实施例4:非人灵长类中SMARRTHBV治疗性疫苗候选物的淘汰筛选
为了确认小鼠中所选择的构建体在大型动物中具有免疫原性，在恒河猴(M.fascicularis)中进行免疫原性研究。在第0周，用两种不同的SMARRT疫苗候选物免疫NHP，然后每四周加强额外的三次。按照下表4所示，评估三种不同剂量水平的SMARRT。离体测定包括IFNγ ELISpot和使用PBMC的细胞内细胞因子染色，以确定注射后第10天的功能性T细胞应答。在注射日取血清，以通过ELISA测量抗-HBsAg抗体水平。在注射日当天以及注射后6小时和24小时收集血清，来测量细胞因子和C-反应性蛋白水平。
表4
组别 动物# 组别描述
1 5(3m，2f) 盐水
2 5(3m，2f) SMARRT候选物1100μg
3 5(3m，2f) SMARRT候选物130μg
4 5(3m，2f) SMARRT候选物110μg
5 5(3m，2f) SMARRT候选物2100μg
6 5(3m，2f) SMARRT候选物230μg
7 5(3m，2f) SMARRT候选物210μg
8 5(3m，2f) SMARRT.混合的单基因
对于本领域技术人员来说明显的是，可以对本发明的公开做不同的替换和修改而不偏离本发明的范围和精神。
本说明书引用的所有专利和出版物表明本发明所属领域的技术人员的水平。
在本文中说明性描述的发明，可以在本文未具体公开的任何元素或多个元素、限制或多个限制的情况下适当地实施。因此，例如，在本文中每个情况中，任何术语"包含”，"基本上由……组成"和"由…组成"可以被其他两个中的任一个代替。本文所用术语和表述用作描述术语并不意图限制，并且不意图在使用这样的术语和描述时，排除所示和所述特征或其部分的任何等同物，但是应当理解，各种修改可以在本发明要求保护的范围内。另外，当本发明的特征或方面以马库什组描述时，本领域技术人员会意识到，本发明还描述了马库什组中的任何个体成员或成员的亚组。例如，如果X描述为选自溴、氯和碘，则完整描述了X为溴的权利要求和X为溴和氯的权利要求。其他的实施方案在所附权利要求中。
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Claims (42)

1.一种核酸组合，其包含
第一非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码第一乙型肝炎病毒(HBV)抗原的多核苷酸序列，
(2)第一内部核糖体进入序列(IRES)元件或编码第一自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，和
(3)编码第二HBV抗原的多核苷酸序列；以及
第二非天然存在的多核苷酸序列，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码第三乙型肝炎病毒(HBV)抗原的多核苷酸序列，
(2)第二内部核糖体进入序列(IRES)元件或编码第二自体蛋白酶肽的多核苷酸序列，和
(3)编码第四HBV抗原的多核苷酸序列，
其中所述第一非天然存在的多核苷酸序列和所述第二非天然存在的多核苷酸序列通过第三内部核糖体进入序列(IRES)元件或编码第三自体蛋白酶肽的多核苷酸序列连接，或者存在于不同的核酸分子中，并且
其中所述第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原各自独立地选自HBV核心抗原、HBV聚合酶(pol)抗原和HBV表面抗原，并且
所述第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的至少一个是选自以下的HBV表面抗原：HBV Pre-S1抗原，其具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，和HBV PreS2.S抗原，其具有与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，
优选地，所述第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原或第四HBV抗原中的一个是HBV核心抗原或HBVpol抗原。
2.权利要求1的核酸组合，其中所述第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原或第四HBV抗原中的一个是HBV核心抗原，并且一个是HBVpol抗原。
3.权利1或2的核酸组合，其中所述第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个互相不同。
4.权利要求1-3中任一项的核酸组合，其中所述第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(i)第一HBV Pre-S1抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQID NO：1的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(ii)第二HBV Pre-S1抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iii)HBV PreS2.S抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQID NO：5的氨基酸序列至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：5的氨基酸序列至少98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iv)HBV核心抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ IDNO：7至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：7至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；和
(v)HBVpoi抗原，其包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：9至少90％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：9至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，
优选地，所述第一HBV Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、所述HBV核心抗原和所述HBV pol抗原中的每一个独立地可操作地连接至信号肽，并且所述HBV PreS2.S抗原包含内部信号肽。
5.权利要求1-4中任一项的核酸组合，其中所述HBV核心抗原包含以下氨基酸序列，优选由以下氨基酸序列组成：与SEQ ID NO：84、85或86中的至少一个至少98％相同的氨基酸序列，例如与SEQ ID NO：84、85或86至少98％、至少99％或100％相同。
6.权利要求1-5中任一项的核酸组合，其中所述HBV核心抗原的最后5个C末端氨基酸包含VVR氨基酸序列，更特别VVRR(SEQ ID NO：91)氨基酸序列，更特别VVRRR(SEQ ID NO：92)氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项的核酸组合，其中所述HBV表面抗原、所述HBV核心抗原和所述HBV pol抗原中的每一个包含：
(i)HBV基因型A、B、C和D的共有序列；和/或
(ii)HLA-A*11：01、HLA-A*24：02、HLA-A*02：01、HLA-A*A2402、HLA-A*A0101或HLA-B*40：01的一个或多个表位。
8.权利要求7的核酸组合，其中所述HBV表面抗原、所述HBV核心抗原和所述HBV pol抗原中的每一个包含HLA-A*11∶01的一个或多个表位。
9.权利要求4的核酸组合，其中所述第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原中的每一个独立地选自：
(i)第一HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：1的氨基酸序列组成；
(ii)第二HBV Pre-S1抗原，其由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成；
(iii)HBV PreS2.S抗原，其由SEQ ID NO：5的氨基酸序列组成；
(iv)HBV核心抗原，其由SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86的氨基酸序列组成；和
(vi)HBV pol抗原，其由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成，
优选地，所述第一HBV Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、所述HBV核心抗原和所述HBV pol抗原中的每一个独立地可操作地连接至信号肽，例如包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的信号肽。
10.权利要求1-9中任一项的核酸组合，其中编码所述第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：
(i)编码所述第一HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：2至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：2至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(ii)编码所述第二HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：4至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：4至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iii)编码所述HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：6至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：6至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；
(iv)编码所述HBV核心抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：8至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：8至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同；以及
(v)编码所述HBV pol抗原的多核苷酸序列，其具有与SEQ ID NO：10至少90％相同的序列，例如与SEQ ID NO：10至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％相同，
优选地，编码所述第一HBV Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、所述HBV核心抗原和所述HBV pol抗原中的每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列，并且HBV PreS2.S抗原包含内部信号肽。
11.权利要求10的核酸组合，其中编码所述第一HBV抗原、第二HBV抗原、第三HBV抗原和第四HBV抗原的多核苷酸序列中的每一个独立地选自：
(i)编码所述第一HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：2的序列组成；
(ii)编码所述第二HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：4的序列组成；
(iii)编码所述HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：6的序列组成；
(iv)编码所述HBV核心抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88或SEQID NO：89中任一个的序列组成；以及
(v)编码所述HBVpol抗原的多核苷酸序列，其由SEQ ID NO：10的序列组成，
优选地，编码所述第一HBV Pre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、所述HBV核心抗原和所述HBV pol抗原中的每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸，例如包含SEQ ID NO：90的序列的多核苷酸。
12.权利要求1-11中任一项的核酸组合，其中所述第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个独立地包含选自以下的肽序列：猪捷申病毒-12A(P2A)、***病毒(FMDV)2A(F2A)、马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV2A)、软化病病毒2A(BmIFV2A)及其组合，
优选地，所述第一自体蛋白酶肽、第二自体蛋白酶肽和第三自体蛋白酶肽中的每一个包含P2A的肽序列，例如SEQ ID NO：11的P2A序列。
13.权利要求1-12中任一项的核酸组合，其中所述第一IRES、第二IRES和第三IRES中的每一个源自脑心肌炎病毒(EMCV)或肠道病毒71(EV71)，
优选地，所述第一IRES、第二IRES和第三IRES中的每一个包含SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列。
14.权利要求1的核酸组合，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(2)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(3)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(4)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(5)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBVPre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(6)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBVPre-S1抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(7)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(8)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBVPreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(9)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBVPre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(10)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(11)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBVPre-S1抗原的多核苷酸序列；
(12)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列；
(13)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ IDNO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(14)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：1或3的氨基酸序列的HBV Pre-S1抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(15)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBVPreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(16)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：14的多核苷酸序列的IRES、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(17)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(18)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；
(19)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列；
(20)编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；
(21)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列；或者
(22)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列、以及编码具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列的HBV PreS2.S抗原的多核苷酸序列，
优选地，编码所述第一HBVPre-S1抗原和第二HBV Pre-S1抗原、所述HBV核心抗原和所述HBV pol抗原中每一个的多核苷酸序列独立地可操作地连接至编码信号肽的多核苷酸序列，例如包含SEQ ID NO：77的氨基酸序列的信号肽。
15.权利要求14的核酸组合，其包含SEQ ID NO：15-54中任一个的非天然存在的多核苷酸序列。
16.一种载体，其包含权利要求1-15中任一项的核酸组合。
17.权利要求16的载体，其为DNA质粒。
18.权利要求16的载体，其为DNA病毒载体或RNA病毒载体。
19.权利要求18的载体，其为修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)载体或腺病毒载体。
20.权利要求19的载体，其为Ad26、Ad35或MVA-BN载体。
21.一种RNA复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的5’非翻译区(5’-UTR)；
(2)编码RNA病毒的至少一种、优选全部非结构蛋白的多核苷酸序列；
(3)RNA病毒的亚基因组启动子；
(4)权利要求1-15中任一项的核酸组合；以及
(5)非结构蛋白介导的RNA病毒扩增所需的3’非翻译区(3’-UTR)。
22.权利要求21的RNA复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)甲病毒5’非翻译区(5’-UTR)；
(2)甲病毒非结构基因nsp1的5’复制序列；
(3)病毒种的下游环(DLP)基序；
(4)编码第四自体蛋白酶肽的多核苷酸序列；
(5)编码甲病毒非结构蛋白nspl、nsp2、nsp3和nsp4的核苷酸序列；
(6)甲病毒亚基因组启动子；
(7)权利要求1-15中任一项的核酸组合；
(8)甲病毒3′非翻译区(3′UTR)；以及
(9)任选地，多腺苷酸序列。
23.权利要求22的RNA复制子，其中所述DLP基序来自选自以下的病毒种：东部马脑炎病毒(EEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)、沼泽地病毒(EVEV)、穆坎布病毒(MUCV)、塞姆利基森林病毒(SFV)、那皮舒纳病毒(PIXV)、米德堡病毒(MTDV)、奇昆古尼亚病毒(CHIKV)、阿尼昂-尼昂病毒(ONNV)、罗斯河病毒(RRV)、巴马森林病毒(BF)、盖塔病毒(GET)、鹭山病毒(SAGV)、贝巴鲁病毒(BEBV)、马雅罗病毒(MAYV)、乌纳病毒(U AV)、辛德毕斯病毒(SINV)、奥拉病毒(AURAV)、沃达罗河病毒(WHAV)、巴班肯病毒(BABV)、库孜拉加奇病毒(KYZV)、西部马脑炎病毒(WEEV)、高地J病毒(HJV)、摩根堡病毒(FMV)、恩杜穆病毒(NDUV)和博吉河病毒。
24.权利要求23的RNA复制子，其中所述第四自体蛋白酶肽选自猪捷申病毒-12A(P2A)、***病毒(FMDV)2A(F2A)、马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)、明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV2A)、软化病病毒2A(BmIFV2A)及其组合，优选地，所述第四自体蛋白酶肽包含P2A的肽序列。
25.权利要求21的RNA复制子，其包含，从5’-端至3’-端排列：
(1)具有SEQ ID NO：55的多核苷酸序列的5’-UTR；
(2)具有SEQ ID NO：56的多核苷酸序列的5’复制序列；
(3)包含SEQ ID NO：57的多核苷酸序列的DLP基序；
(4)编码SEQ ID NO：11的P2A序列的多核苷酸序列；
(5)编码甲病毒非结构蛋白nsp1、nsp2、nsp3和nsp4的多核苷酸序列，其分别具有SEQID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61的核酸序列；
(6)具有SEQ ID NO：62的多核苷酸序列的亚基因组启动子；
(7)权利要求1-15中任一项的核酸组合；以及
(8)具有SEQ ID NO：63的多核苷酸序列的3′UTR。
26.权利要求25的RNA复制子，其中，
(i)所述编码P2A序列的多核苷酸序列包含SEQ ID NO：12；
(ii)所述核酸组合包含SEQ ID NO：15-54中任一个的多核苷酸序列；并且
(iii)所述RNA复制子在复制子的3’-端还包含多腺苷酸序列，优选地，所述多腺苷酸序列具有SEQ ID NO：64的序列。
27.一种RNA复制子，其包含SEQ ID NO：65-72中任一个的多核苷酸序列。
28.一种核酸分子，其包含编码权利要求21-27中任一项的RNA复制子的多核苷酸序列，优选地，所述核酸还包含可操作地连接至DNA序列的5’-端的T7启动子，所述T7启动子包含SEQ ID NO：73的核苷酸序列。
29.一种药物组合物，其包含权利要求1-15中任一项的核酸组合，权利要求16-20中任一项的载体、权利要求21-27中任一项的RNA复制子或者权利要求28的核酸分子，以及药学可接受的载剂。
30.权利要求29的药物组合物，其中所述药学可接受的载剂包括脂质纳米颗粒，优选地，所述脂质纳米颗粒包含以下的一种或多种：ALC-0315、DOTMA、DOTAP、DDAB、DOGS、DSDMA、DODMA、DLinDMA、DLenDMA、γ-DLenDMA、DLin-K-DMA、DLin-K-C2-DMA、DLin-K-C3-DMA、DLin-K-C4-DMA、DLen-C2K-DMA、y-DLen-C2K-DMA、DLin-M-C2-DMA、DLin-M-C3-DMA、DLin-MP-DMA或DCChol。
31.权利要求29或30的药物组合物，其还包含：
(1)编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列；或者
(2)编码具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列，优选由SEQ ID NO：9的氨基酸序列组成的HBV聚合酶抗原的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO：11的P2A氨基酸序列的多核苷酸序列或者具有SEQ ID NO：13或14的多核苷酸序列的IRES、以及编码具有SEQ ID NO：84、85或86中任一个的氨基酸序列的HBV核心抗原的多核苷酸序列。
32.权利要求29-31中任一项的药物组合物，其用于治疗HBV感染。
33.权利要求32的用于治疗HBV感染的药物组合物，其中所述药物组合物为针对HBV的治疗性疫苗。
34.权利要求32或33的用于治疗HBV感染的药物组合物，其还包含第二组合物用作初免-加强方案，所述第二组合物包含编码至少一种相同HBV抗原的核酸分子。
35.权利要求34的用于治疗HBV感染的药物组合物，其中所述初免-加强方案包括包含权利要求21-27中任一项的RNA复制子的第一组合物以及包含载体的第二组合物，所述载体不是RNA复制子，并且编码与所述第一组合物相同的至少一种HBV表位，优选与所述第一组合物相同的至少一种HBV抗原，并且所述第一组合物和第二组合物中的一种用于初免免疫，并且另一种用于加强免疫。
36.权利要求35的用于治疗HBV感染的药物组合物，其中所述第二组合物包含修饰的安卡拉痘苗病毒(MVA)载体、腺病毒载体或质粒载体。
37.权利要求36的用于治疗HBV感染的药物组合物，其中所述第二组合物包含Ad26、Ad35或MVA-BN载体。
38.权利要求28-31中任一项的用于治疗HBV感染的药物组合物，其用于在有需要的受试者中诱导针对乙型肝炎病毒(HBV)的免疫应答，优选地，所述受试者患有慢性HBV感染，任选地联合另一免疫原性剂或其他抗HBV剂。
39.权利要求38的用于治疗HBV感染的药物组合物，其中所述其他抗HBV剂为小分子、抗体或其抗原结合片段、多肽、蛋白或核酸。
40.权利要求29-31中任一项的用于治疗HBV感染的药物组合物，其用于减少有需要的受试者中的HBV感染和/或复制。
41.一种分离的宿主细胞，其包含权利要求1-15中任一项的核酸组合、权利要求16-20中任一项的载体、权利要求21-27中任一项的RNA复制子或者权利要求28的核酸分子。
42.一种制备RNA复制子的方法，其包括体内或体外转录权利要求28的核酸。
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