CN116355840A - 家畜骨骼肌卫星细胞培养方法及专用于该方法的辅助装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说，涉及一种家畜骨骼肌卫星细胞培养方法及专用于该方法的辅助装置。该方法对取样自初生活体家畜的肌肉组织进行处理以获取肌肉组织块，后对获取的肌肉组织块进行消化处理以获取用于原代SMSCs培养的肌肉组织块；后将获取的原代培养肌肉组织块在一培养瓶的底壁以贴壁法进行培养，后对原代培养肌肉组织块进行重复利用2‑5次。该辅助装置用于实现原代培养肌肉组织块在重复利用中的转移。本发明能够较佳地实现用于培养原代SMSCs的原代培养肌肉组织块的重复利用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体地说，涉及一种家畜骨骼肌卫星细胞培养方法及专用于该方法的辅助装置。
背景技术
现有的骨骼肌卫星细胞(Skeletal muscle satellite cells，简称SMSCs)在培养过程中，用于培养原代SMSCs细胞的肌肉组织块只会利用一次，在SMSCs首次传代前通常会直接丢弃处理。
实际上，本案发明人发现将已经培养出SMSCs的肌肉组织块在细胞首次增长至约80％时，转移至另一培养瓶并进行相关的处理，能够实现原肌肉组织块的再次培养，且再次培养出的SMSCs游离出组织块的贴壁时间大幅缩短、生长速度大幅提高。故而本案提出了一种家畜SMSCs培养方法及专用于该方法的辅助装置。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
一种家畜骨骼肌卫星细胞培养方法，其包括如下步骤：
步骤S1、预处理，对取样自初生活体家畜的肌肉组织进行处理以获取肌肉组织块；
步骤S2、消化处理，对经步骤S1获取的肌肉组织块进行消化处理以获取原代培养肌肉组织块；
步骤S3、对经步骤S2获取的原代培养肌肉组织块在一培养瓶的底壁以贴壁法进行培养；
步骤S4、在培养出的原代骨骼肌卫星细胞增长至贴壁面积不小于对应培养瓶的底壁面积的80％时，将所述一培养瓶中的原代培养肌肉组织块通过一辅助装置转移至另一培养瓶的底壁以贴壁法进行培养；
重复步骤S4，实现用于培养原代骨骼肌卫星细胞的原代培养肌肉组织块的2-5次重复利用。
通过上述步骤，发现原代培养肌肉组织块经一辅助装置转移至另一培养瓶进行再次培养后，相比于原代SMSCs的首次培养，SMSCs于另一培养瓶内游离出肌肉组织块的时间更短、SMSCs贴壁至长满瓶底壁时间更快、SMSCs生长速度更快。
作为优选，步骤S1包括如下步骤，
步骤S11、在无菌操作台内使用PBS缓冲液对取样自初生活体家畜的肌肉组织进行冲洗，后浸泡于75％医用酒精中；
步骤S12、取经步骤S11处理后的肌肉组织采用PBS缓冲液进行涮洗以去除表面酒精；而后自肌肉组织内部取体积约2-3mm3的肌肉肉块若干，并采用PBS缓冲液进行浸泡；
步骤S13、去除经步骤S12处理后的肌肉肉块中的***，并将肌肉肉块处理成体积约1mm3的肌肉组织块。
通过上述步骤，故而较佳地对肌肉组织的预处理以获取肌肉组织块，以满足于SMSCs的培养条件。
作为优选，步骤S2包括如下步骤，
步骤S21、将肌肉组织块浸入胰蛋白酶溶液中，并置于细胞培养箱内进行消化处理；
步骤S22、消化处理完成后，加入完全培养液终止消化以获取用于培养原代骨骼肌卫星细胞的原代培养肌肉组织块。
通过上述步骤，先通过肌肉组织块和胰蛋白酶充分混合对其进行肌肉组织块充分酶解，再通过完全培养液终止消化以获取原代培养肌肉组织块，故而满足SMSCs游离条件。
作为优选，步骤S3包括如下步骤，
步骤S31、将原代培养肌肉组织块在所述一培养瓶底壁均匀涂拭并粘附于所述一培养瓶底壁处，之后加入完全培养液进行培养；
步骤S32、待原代骨骼肌卫星细胞增长融合至贴壁面积不小于对应培养瓶的底壁面积的80％时，使用差速贴壁法纯化细胞以进行扩大培养。
通过上述步骤，故而较佳地对SMSCs进行后续处理。
此外本发明还提供可一种专用于任一上述方法的辅助装置，其包括装置主体，装置主体包括杆件主体，杆件主体的两端分别设有驱动机构和移运机构；杆件主体内沿轴向方向形成有杆腔，杆腔内设有联动机构，联动机构用于配合驱动机构以驱使移运机构，以及用于提供负压的负压机构；
移运机构包括可拆卸安装于杆件主体对应端部处的移运组件，移运组件包括安装筒，安装筒内沿轴向方向贯穿地形成有筒腔，筒腔内活动地设有推块，推块沿轴向形成有轴孔，轴孔处活动地设有挑针；
负压机构包括设置在推块处且平行于轴孔的第一气道以及设置在杆件主体处且连通于杆腔的第二气道，第一气道与第二气道同轴设置；负压机构还包括设置于第一气道与第二气道处的气管，气管近移运组件的一端形成负压口，气管远移运组件的一端形成用于接入负压源的接口；
推块、挑针与气管间互不干涉，挑针用于在负压口将肌肉组织块吸至筒腔一侧开口时将肌肉组织块挑至筒腔腔体内，推块用于将筒腔腔体内的肌肉组织块推出筒腔。
本发明中，操作人员在将培养瓶内肌肉组织块进行移运至另一培养瓶时，操作人员预先使用装置主体的伸入培养瓶内的端部轻轻刮碰肌肉组织块使其脱离于培养瓶内壁，以避免待移运的肌肉组织块粘附于培养瓶内壁；然后利用负压源提供负压，以使气管的负压口能够较佳地将肌肉组织块吸附至安装筒的筒腔开口处；再利用驱动机构以使联动机构作用于移运机构，故而挑针将筒腔开口处的肌肉组织块进行转移至筒腔腔体内，以配合于气管的负压口，使得肌肉组织块在移运至另一培养瓶之前，肌肉组织块不会脱离于筒腔，故而较佳地保证了肌肉组织块的安全移运；
在移运过程中，操作人员可将装有肌肉组织块的筒腔的开口朝向上方，进一步保证肌肉组织块的安全移运；待肌肉组织块移运至另一培养瓶内壁时，操作人员利用推块将肌肉组织块推出筒腔开口以使肌肉组织块移运至另一培养瓶内壁对应培养位置，以便于操作人员进行细胞的再次培养。
作为优选，筒腔内壁沿近杆件主体对应端部方向依次形成有推动槽、第一阶梯槽和第二阶梯槽，推动槽、第一阶梯槽、第二阶梯槽的直径逐渐增大；推块包括形成于第一阶梯槽内的推块凸缘以及形成于推动槽内的推动部；推块凸缘与第一阶梯槽底壁之间设有第一回复弹簧，第一阶梯槽用于提供推块朝向近杆件主体对应端部侧运动的回复力；推动部外壁与推动槽内壁之间形成滑动密封；
筒腔内同轴地设有位于第二阶梯槽底壁处的挡片，挡片沿轴对称设有2个推孔以及挡片沿轴向设有用于供挑针对应部穿过的针孔；推块凸缘近挡片的侧壁设有分别伸入所述2个推孔处的2个推动座，推动座伸入对应推孔的端部向内凹陷形成凹槽；
联动机构包括位于杆腔内的第一推动组件以及第二推动组件，第一推动组件包括与杆腔内壁配合的套杆支架，套杆支架用于沿杆腔轴向方向往复运动；套杆支架的近移运组件的一端形成有推板，推板与杆腔同轴设置，且推板的侧壁沿轴对称设有2个推动杆，所述2个推动杆伸出杆件主体的一端且分被用于与推块凸缘处所述2个推动座配合，推动杆伸出杆件主体的端部向外凸起形成用于与凹槽配合的凸块；第二推动组件包括位于杆腔轴向方向上往复运动的活动杆；活动杆的一端伸出杆件主体的一端且伸出杆件主体的端部设置有针座，挑针的对应端过盈安装于针座处；活动杆与套杆支架之间互不干涉。
通过上述构造，操作人员利用驱动机构以使活动杆位于杆腔轴向方向上往复运动，使得挑针位于筒腔处来回运动，进而使得挑针能够将吸附至安装筒的筒腔开口处的肌肉组织块进行带动至筒腔内，以便肌肉组织块的移运；待肌肉组织块移运至另一培养瓶内壁时，操作人员利用驱动机构以使套杆支架沿杆腔轴向方向往复运动，使得推动座位于筒腔处来回运动，进而使得推块将筒腔内的肌肉组织块推出以置于另一培养瓶内壁对应培养位置。
其中，第一回复弹簧用于提供推块的回复力，以使推块将筒腔内的肌肉组织块推出筒腔后，快速回复至初始位置；
推动部外壁与推动槽内壁之间形成滑动密封，较佳地避免了肌肉组织块对移运组件的污染，以保证移运组件较佳的使用寿命；
通过挡片处的推孔、推块凸缘处的推动座与第一回复弹簧及推动杆共同作用下，以及推动座处的凹槽与推动杆处的凸块配合下，故而较佳地实现挡块于筒腔内运动的稳定性，以及较佳地回复初始位置；以及，
挑针于针座处过盈安装，故而较佳地便于挑针的安装与拆除。
作为优选，套杆支架包括多个沿杆腔间隔设置的圆形架以及多个沿圆形架周向均匀布置的连接杆，连接杆用于连接多个圆形架及推板；圆形架的中部设置有通孔，活动杆活动设置于通孔处；推板中部处设有形成有定位槽，活动杆位于定位槽处设有定位块；推板的侧壁与杆腔的底壁之间设有第二回复弹簧，定位块的侧壁与杆腔的底壁之间设有第三回复弹簧。
通过上述构造，第二回复弹簧用于提供套杆支架的回复力，以使套杆支架处推动杆作用于推块后，快速回复至初始位置；第三回复弹簧用于提供活动杆的回复力，以使活动杆处的针座带动挑针作用于肌肉组织块后，快速回复至初始位置；以及，定位槽与定位块的设置，较佳地实现活动杆在转动过程中不会发生自转，避免带动挑针发生自转导致影响挑针作用于肌肉组织块。
作为优选，杆腔内壁沿周向均匀布置有多个沿杆腔轴向延伸的限位槽，套杆支架处的连接杆位于对应的限位槽内；
套杆组件近驱动机构的一端设有压板，压板中部处设有圆孔，活动杆的对应端部位于圆孔处；驱动机构包括可拆卸安装于杆腔对应端部处的安装套，安装套内设有第一驱动组件和第二驱动组件；
第一驱动组件包括设置于安装套内腔且位于轴向方向上的第一压杆，第一压杆的对应部位于安装套内腔内设有限位板，限位板与安装套内腔对应底壁之间设有第四回复弹簧，第一压杆的一端伸入杆腔内且伸入杆腔内的端部用于与活动杆的对应端配合；
第二驱动组件包括设置于安装套近杆件主体的底壁处且沿轴对称设置的2个第二压杆，第二压杆一端设有挡块，挡块与安装套内腔对应底壁之间设有第五回复弹簧，第二压杆的另一端伸入杆腔内且伸入杆腔内的端部用于与压板的侧壁配合；
安装套内壁且对应限位板处设有2个沿安装套轴向呈中心对称的环形槽，环形槽的弧长占安装套一周的四分之一，环形槽的两端分别向杆件主体方向延伸有第一延伸槽和第二延伸槽，第一延伸槽的延伸长度大于第二延伸槽的延伸长度；
限位板对应设有伸入环形槽内的滑块，滑块用于与第一延伸槽、环形槽、第二延伸槽间配合；
限位板沿第一压杆的两侧轴对称的设有2个抵靠杆，所述2个抵靠杆用于与挡块配合；
第一压杆远杆件主体的一端伸出安装套且伸出安装套的一端设有杆状旋钮，安装套的外壁对应第一延伸槽和第二延伸槽的节点处设有标识。
通过上述构造，操作人员欲将筒腔开口处的肌肉组织块进行转移至筒腔腔内时，按压杆状旋钮，使得第一压杆运动，此时限位板的滑块于第一延伸槽内滑动，对应抵靠杆与对应挡块间错位，进一步的，第一压杆伸入杆腔内并作用于活动杆的对应端部，进而驱动挑针作用于肌肉组织块；
第四回复弹簧用于提供限位板的回复力，以使操作人员在进行按压杆状旋钮后快速回复初始位置；
待筒腔开口处的肌肉组织块转移至筒腔腔内后，操作人员欲将筒腔开口内的肌肉组织块进行转移至另一培养瓶内壁的对应培养位置，转动杆状旋钮，以使操作人员再次按压杆状旋钮时，使得第一压杆运动，此时限位板的滑块于第二延伸槽内滑动，限位板处的抵靠杆与挡块相对，进一步的，操作人员按压杆状旋钮过程中，第一压杆的对应端部不与活动杆的对应端部配合，抵靠杆作用于挡块，以使第二压杆作用于套杆支架内的压板，进而驱动推块作用于肌肉组织块；
通过上述操作，即可较佳地实现肌肉组织块移运。
其中，标识的设置，较佳地便于操作人员操作。
作为优选，安装套的端部向外沿周向间隔设有多个安装块，安装块用于与对应限位槽配合，且安装块的端部用于抵靠压板。
通过本发明中安装块与限位槽的设置，故而较佳地实现驱动组件于杆件主体对应端部处的安装与拆除；以及安装块伸入限位槽的端部能够抵靠压板，进而较佳地与第二回复弹簧配合。
附图说明
图1为实施例1中的首次细胞培养在约48h时的显微镜观察图。
图2为实施例1中的首次细胞培养在约60h时的显微镜观察图。
图3为实施例1中的首次细胞培养在约72h时的显微镜观察图。
图4为实施例1中的首次细胞培养在约120h时的显微镜观察图。
图5为实施例1中的第二次细胞培养在约24h时的显微镜观察图。
图6为实施例1中的第二次细胞培养在约48h时的显微镜观察图。
图7为实施例1中的第二次细胞培养在约72h时的显微镜观察图。
图8为实施例1中的第二次细胞培养在约96h时的显微镜观察图。
图9为实施例2中的装置主体的示意图。
图10为实施例2中的装置主体的剖面示意图。
图11为图10中的A部分的放大示意图。
图12为实施例2中的移运机构的***示意图。
图13为实施例2中的安装筒的结构示意图。
图14为实施例2中的推块的结构示意图。
图15为实施例2中的挡片的结构示意图。
图16为实施例2中的杆件主体一端的结构示意图。
图17为实施例2中的套杆支架的结构示意图。
图18为实施例2中的活动杆的结构示意图。
图19为图10中的B部分的放大示意图。
图20为实施例2中的驱动机构的示意图。
图21为实施例2中的驱动机构的内部示意图。
图22为实施例2中的安装套的部分结构示意图。
具体实施方式
为进一步了解本发明的内容，结合附图和实施例对本发明作详细描述。应当理解的是，实施例仅仅是对本发明进行解释而并非限定。
实施例1
如图1-8所示，本实施例提供了一种家畜骨骼肌卫星细胞培养方法，本实施例中的家畜选用牛，其包括如下步骤：
步骤S1、预处理，对取样自初生(出生一周内)活体家畜的肌肉组织进行处理以获取肌肉组织块；
步骤S2、消化处理，对经步骤S1获取的肌肉组织块进行消化处理以获取原代培养肌肉组织块；
其中，原代培养肌肉组织块用于直接进行后续的贴壁培养；
本实施例中，原代培养肌肉组织块，实际是指用于原代SMSCs培养的肌肉组织块；
步骤S3、对经步骤S2获取的原代培养肌肉组织块在一培养瓶的底壁以贴壁法进行培养；
步骤S4、在培养出的原代骨骼肌卫星细胞增长至贴壁面积不小于对应培养瓶的底壁面积的80％时，将所述一培养瓶中的原代培养肌肉组织块通过一辅助装置转移至另一培养瓶的底壁以贴壁法进行培养；
重复步骤S4，实现用于培养原代骨骼肌卫星细胞的原代培养肌肉组织块的重复利用2-5次。
通过上述步骤，发现完成原代SMSCs培养后的原代培养肌肉组织块经一辅助装置转移至另一培养瓶内进行再次培养后，相比于第一次贴壁培养出的原代SMSCs，肌肉组织块于新培养瓶再次贴壁后，SMSCs游离出组织块的时间更短、生长速度更快、贴壁至长满培养瓶底壁的时间更短。
本实施例中，通过步骤S2的消化处理，能够较佳地实现对肌肉组织块的消化处理，故而能够较佳地提升步骤S3中的细胞游离出组织块贴壁和增殖等速度。
通过重复步骤S4，使得用于培养原代SMSCs的原代培养肌肉组织块得以重复利用，且可在2-5次重复利用中，均能够培养出高质量的原代SMSCs。也即通过本实施例的方法，能够通过重复利用同一原代培养肌肉组织块，实现最终所获取的原代SMSCs在数量上2-5倍的提升。
本实施例中，通过步骤S4的处理，能够直接以首次培养出原代SMSCs的原代培养肌肉组织块进行重复利用，扩大SMSCs的培养，故而能够较佳地省去了步骤S1及S2的处理，从而不仅能够节约试验动物及物品的消耗，且能够较佳地提升培养效率。
本实施例中，以贴壁法进行培养所采用的培养瓶均为T75细胞培养瓶。
本实施例的步骤S1能够包括例如如下步骤，
步骤S11、在无菌操作台内使用PBS缓冲液对取样自初生活体家畜的肌肉组织进行冲洗以除去表面杂质，后浸泡于75％医用酒精中；其中，酒精浸泡时间能够为5min，故而能够较佳的消杀肉块上的细菌；冲洗的次数能够为3次，故而能够较佳地进行清洗。
步骤S12、取经步骤S11处理后的肌肉组织采用PBS缓冲液进行涮洗以去除表面酒精；而后自肌肉组织内部取体积约2-3mm3的肌肉肉块若干，并采用PBS缓冲液进行浸泡；其中，涮洗的次数能够为3次，故而能够较佳地进行清洗；
步骤S13、去除经步骤S12处理后的肌肉肉块中的***，并将肌肉肉块处理成体积约1mm3的肌肉组织块。其中，能够采用医用剪刀实现切剪操作。
通过上述步骤S11-S13，能够较佳地实现对原材料的处理以获取肌肉组织块。
本实施例的步骤S2能够包括例如如下步骤，
步骤S21、将肌肉组织块浸入胰蛋白酶溶液中，并置于细胞培养箱内进行消化处理；
步骤S22、消化处理完成后，加入完全培养液(如3ml)终止消化以获取用于培养原代骨骼肌卫星细胞的原代培养肌肉组织块。
通过上述步骤S21-S22，能够较佳地实现在以贴壁法培养前对肌肉组织块的消化处理，故而能够较佳地缩短培养周期。
步骤S21中，能够在培养瓶处加入胰蛋白酶溶液，并将肌肉组织块完全浸入；在实际培养时，能够在培养箱内以恒温、恒湿且通入CO2环境的培养箱内进行培养；培养时间能够为1h，且为了使肌肉组织块能够与胰蛋白酶溶液更加充分地混合，还能够在培养过程中每间隔约10分钟对该培养瓶摇晃约15次；其中，恒温温度能够控制为37℃，保持箱底部水盘内无菌水>1L，湿度能够控制为相对湿度为95％，CO2的浓度能够控制为5％。
其中，胰蛋白酶溶液能够选取Gibco品牌的“EDTA(0.25％)含酚红”型号为25200-056的产品。
本实施例的步骤S3能够包括例如如下步骤，
步骤S31、将原代培养肌肉组织块在所述一培养瓶底壁均匀涂拭并粘附于所述一培养瓶底壁处，之后加入完全培养液进行培养；
步骤S32、待原代骨骼肌卫星细胞增长融合至贴壁面积不小于对应培养瓶的底壁面积的80％时，使用差速贴壁法纯化细胞以进行扩大培养。
通过上述步骤S31-S32，能够较佳地实现“组织块消化+贴壁”法培养出原代SMSCs。
步骤S31中，能够首先通过本实施例中的辅助装置在对应培养瓶底壁处均匀涂拭，以增大肉块表面活细胞粘附于瓶底壁的概率，使得多块原代培养肌肉组织块能够较佳地均匀分布于对应培养瓶底壁处；而后，能够将对应培养瓶倒置与培养箱中约1h，从而能够较佳地实现原代培养肌肉组织块能够被适度干燥并粘附于对应培养瓶底壁处；之后能够加入完全培养液，并放置于培养箱内进行培养。
在执行步骤S32时，能够首先倒出所述一培养瓶内的完全培养液，此时所述一培养瓶内仅剩余粘附于对应培养瓶底壁处的多块原代培养肌肉组织块及贴合于对应培养瓶底壁处的SMSCs；而后，在所述一培养瓶内倒入PBS缓冲液，以完成清洗；之后，即可执行步骤S4，以实现培养后的原代培养肌肉组织块的转移；而后即可对对应培养瓶底壁内的SMSCs进行纯化，纯化后的SMSCs即可较佳地进行扩大培养。
本实施例的步骤S4的流程与步骤S31的流程一致，区别仅在于培养对象的区别，可以理解的是，步骤S31的培养对象为原代培养肌肉组织块，步骤S4的培养对象为经上一次培养完成后的原代培养肌肉组织块。
本实施例中，PBS缓冲液能够采用含1％Penicillin-Streptomycin(青链霉素)的PBS缓冲液，具体能够选取美国Gibco品牌的“P/S”型号的产品。
本实施例中，培养箱能够采用“Thermo Fisher Scientific(赛默飞世尔科技)”公司的相关产品。
本实施例中，完全培养液的配方能够包括：20％胎牛血清(品牌Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国)，1％青霉素-链霉素混合液(品牌Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国)，以及78％DME/F-12完全培养基(Hyclone，美国)。
本实施例中，通过步骤S2的消化处理，能够较佳地缩短SMSCs的培养周期，且能够较佳地提升培养效果。
以牛为例，在对牛的细胞进行培养时，相关数据如下表。
| 组织块于新培养瓶重复贴壁次数 | 首次 | 第二次 | 第三次 | 第四次 | 第五次 |
| 细胞游离出组织块并贴壁时间(h) | 48-72 | 24-48 | 12-24 | 12-24 | 12-24 |
| 长满培养瓶底部时间(h) | 96-144 | 72-96 | 48-72 | 48-72 | 48-72 |
通过上表可以看出，由于步骤S2的处理，相较于传统贴壁法培养，本实施例的方法，在首次培养时，即可实现细胞游离出组织块时间、细胞贴壁时间以及长满培养瓶底部时间的较大提升。而在第二至五次的培养中，细胞游离出组织块时间、细胞贴壁时间以及长满培养瓶底部时间，能较首次培养再次有大幅提升。
本实施例中，通过步骤S4，能够较佳地实现培养后的原代培养肌肉组织块的重复利用，故而不仅能够较佳地降低培养成本，且能够较佳地缩短培养周期，且能够较佳地降低贴壁时间。
见于图1-8，在显微镜下进行观察可以发现：
在首次进行培养时，培养至约48小时，SMSCs从组织游离出来，见于图1；
在首次进行培养时，培养至约60小时，SMSCs成倍增加，见于图2；
在首次进行培养时，培养至约72小时，SMSCs快速增殖，见于图3；
在首次进行培养时，培养至约120小时，SMSCs基本铺满瓶底，见于图4；
在第二次进行培养时，培养至约24小时，SMSCs从组织游离出来，见于图5；
在第二次进行培养时，培养至约48小时，SMSCs成倍增加，见于图6；
在第二次进行培养时，培养至约72小时，SMSCs快速增殖，见于图7；
在第二次进行培养时，培养至约96小时，SMSCs基本铺满瓶底，见于图8。
实施例2
如图9-22所示，本实施例提供了一种专用的辅助装置，用于实现实施例1中的方法，其包括装置主体100，装置主体100包括杆件主体110，杆件主体110的两端分别设有驱动机构120和移运机构130；杆件主体110内沿轴向方向形成有杆腔210，杆腔210内设有联动机构220，联动机构220用于配合驱动机构120以驱使移运机构130，以及用于提供负压的负压机构；
移运机构130包括可拆卸安装于杆件主体110对应端部处的移运组件，移运组件包括安装筒310，安装筒310内沿轴向方向贯穿地形成有筒腔320，筒腔320内活动地设有推块340，推块340沿轴向形成有轴孔640，轴孔640处活动地设有挑针330；
负压机构包括设置在推块340处且平行于轴孔640的第一气道650以及设置在杆件主体110处且连通于杆腔210的第二气道810，第一气道650与第二气道810同轴设置；负压机构还包括设置于第一气道650与第二气道810处的气管140，气管140近移运组件的一端形成负压口820，气管140远移运组件的一端形成用于接入负压源的接口230；
推块340、挑针330与气管140间互不干涉，挑针330用于在负压口820将肌肉组织块吸至筒腔320一侧开口时将肌肉组织块挑至筒腔320腔体内，推块340用于将筒腔320腔体内的肌肉组织块推出筒腔320。
本实施例中，操作人员在将培养瓶内肌肉组织块进行移运至另一培养瓶时，操作人员预先使用装置主体100的伸入培养瓶内的端部轻轻刮碰肌肉组织块使其脱离于培养瓶内壁，以避免待移运的肌肉组织块粘附于培养瓶内壁；然后利用负压源提供负压，以使气管140的负压口820能够较佳地将肌肉组织块吸附至安装筒310的筒腔320开口处；再利用驱动机构120以使联动机构220作用于移运机构130，故而挑针330将筒腔320开口处的肌肉组织块进行转移至筒腔320腔体内，以配合于气管140的负压口820，使得肌肉组织块在移运至另一培养瓶之前，肌肉组织块不会脱离于筒腔320，故而较佳地保证了肌肉组织块的安全移运；
在移运过程中，操作人员可将装有肌肉组织块的筒腔320的开口朝向上方，进一步保证肌肉组织块的安全移运；待肌肉组织块移运至另一培养瓶内壁时，操作人员利用推块340将肌肉组织块推出筒腔320开口以使肌肉组织块移运至另一培养瓶内壁对应培养位置，以便于操作人员进行细胞的再次培养。
其中，安装筒310远杆件主体110的端部处设有圆滑部311，圆滑部311用于刮碰培养瓶内壁处的肌肉组织块以及对肌肉组织块进行涂拭于培养瓶内壁处，较佳地方便。
通过本实施例中的装置，能够较佳地实现实施例1中的如步骤S3中的贴壁操作、涂抹操作，以及步骤S4中的如组织块的移动操作等。
结合图12-18所示，本实施例中，筒腔320内壁沿近杆件主体110对应端部方向依次形成有推动槽321、第一阶梯槽322和第二阶梯槽323，推动槽321、第一阶梯槽322、第二阶梯槽323的直径逐渐增大；推块340包括形成于第一阶梯槽322内的推块凸缘610以及形成于推动槽321内的推动部620；推块凸缘610与第一阶梯槽322底壁之间设有第一回复弹簧410，第一阶梯槽322用于提供推块340朝向近杆件主体110对应端部侧运动的回复力；推动部620外壁与推动槽321内壁之间形成滑动密封；
筒腔320内同轴地设有位于第二阶梯槽323底壁处的挡片350，挡片350沿轴对称设有2个推孔710以及挡片350沿轴向设有用于供挑针330对应部穿过的针孔720；推块凸缘610近挡片350的侧壁设有分别伸入所述2个推孔710处的2个推动座630，推动座630伸入对应推孔710的端部向内凹陷形成凹槽631；
联动机构220包括位于杆腔210内的第一推动组件以及第二推动组件，第一推动组件包括与杆腔210内壁配合的套杆支架360，套杆支架360用于沿杆腔210轴向方向往复运动；套杆支架360的近移运组件的一端形成有推板910，推板910与杆腔210同轴设置，且推板910的侧壁沿轴对称设有2个推动杆361，所述2个推动杆361伸出杆件主体110的一端且分被用于与推块凸缘610处所述2个推动座630配合，推动杆361伸出杆件主体110的端部向外凸起形成用于与凹槽631配合的凸块950；第二推动组件包括位于杆腔210轴向方向上往复运动的活动杆370；活动杆370的一端伸出杆件主体110的一端且伸出杆件主体110的端部设置有针座830，挑针330的对应端过盈安装于针座830处；活动杆370与套杆支架360之间互不干涉。
通过上述构造，操作人员利用驱动机构120以使活动杆370位于杆腔210轴向方向上往复运动，使得挑针330位于筒腔320处来回运动，进而使得挑针330能够将吸附至安装筒310的筒腔320开口处的肌肉组织块进行带动至筒腔320内，以便肌肉组织块的移运；待肌肉组织块移运至另一培养瓶内壁时，操作人员利用驱动机构120以使套杆支架360沿杆腔210轴向方向往复运动，使得推动座630位于筒腔320处来回运动，进而使得推块340将筒腔320内的肌肉组织块推出以置于另一培养瓶内壁对应培养位置。
其中，第一回复弹簧410用于提供推块340的回复力，以使推块340将筒腔320内的肌肉组织块推出筒腔320后，快速回复至初始位置；
推动部620外壁与推动槽321内壁之间形成滑动密封，较佳地避免了肌肉组织块对移运组件的污染，以保证移运组件较佳的使用寿命；
通过挡片350处的推孔710、推块凸缘610处的推动座630与第一回复弹簧410及推动杆361共同作用下，以及推动座630处的凹槽631与推动杆361处的凸块950配合下，故而较佳地实现推块340于筒腔320内运动的稳定性，以及较佳地回复初始位置；以及，
挑针330于针座830处过盈安装，故而较佳地便于挑针330的安装与拆除。
结合图17-18所示，本实施例中，套杆支架360包括多个沿杆腔210间隔设置的圆形架920以及多个沿圆形架920周向均匀布置的连接杆930，连接杆930用于连接多个圆形架920及推板910；圆形架920的中部设置有通孔921，活动杆370活动设置于通孔921处；推板910中部处设有形成有定位槽911，活动杆370位于定位槽911处设有定位块1010；推板910的侧壁与杆腔210的底壁之间设有第二回复弹簧380，定位块1010的侧壁与杆腔210的底壁之间设有第三回复弹簧390。
通过上述构造，第二回复弹簧380用于提供套杆支架360的回复力，以使套杆支架360处推动杆361作用于推块340后，快速回复至初始位置；第三回复弹簧390用于提供活动杆370的回复力，以使活动杆370处的针座830带动挑针330作用于肌肉组织块后，快速回复至初始位置；以及，定位槽911与定位块1010的设置，较佳地实现活动杆370在转动过程中不会发生自转，避免带动挑针330发生自转导致影响挑针330作用于肌肉组织块。
本实施例中，杆腔210内壁沿周向均匀布置有多个沿杆腔210轴向延伸的限位槽，套杆支架360处的连接杆930位于对应的限位槽内。
通过本实施例中限位槽与连接杆930的设置，故而较佳地实现套杆支架360于杆腔210内滑动的稳定性，以及较佳地保证推动杆361与推动座630配合。
本实施例中，杆件主体110与移运组件配合的端部向外沿周向间隔设有多个插接块840，安装筒310内壁且位于第二阶梯槽323处设有多个用于供插接块840配合的插接槽510，插接块840与插接槽510间过盈配合。
通过本实施例中插接块840、插接槽510的设置，故而较佳地实现移运组件于杆件主体110对应端部处的安装与拆除。
结合图19-22所示，本实施例中，套杆组件近驱动机构120的一端设有压板940，压板940中部处设有圆孔，活动杆370的对应端部位于圆孔处；驱动机构120包括可拆卸安装于杆腔210对应端部处的安装套1110，安装套1110内设有第一驱动组件和第二驱动组件；
第一驱动组件包括设置于安装套1110内腔且位于轴向方向上的第一压杆1120，第一压杆1120的对应部位于安装套1110内腔内设有转向板1130，转向板1130与安装套1110内腔对应底壁之间设有第四回复弹簧1140，第一压杆1120的一端伸入杆腔210内且伸入杆腔210内的端部用于与活动杆370的对应端配合；
第二驱动组件包括设置于安装套1110近杆件主体110的底壁处且沿轴对称设置的2个第二压杆1150，第二压杆1150一端设有挡块1160，挡块1160与安装套1110内腔对应底壁之间设有第五回复弹簧1170，第二压杆1150的另一端伸入杆腔210内且伸入杆腔210内的端部用于与压板940的侧壁配合；
安装套1110内壁且对应转向板1130处设有2个沿安装套1110轴向呈中心对称的环形槽1410，环形槽1410的弧长占安装套1110一周的四分之一，环形槽1410的两端分别向杆件主体110方向延伸有第一延伸槽1420和第二延伸槽1430，第一延伸槽1420的延伸长度大于第二延伸槽1430的延伸长度；
转向板1130对应设有伸入环形槽1410内的滑块1310，滑块1310用于与第一延伸槽1420、环形槽1410、第二延伸槽1430间配合；
转向板1130沿第一压杆1120的两侧轴对称的设有2个抵靠杆1180，所述2个抵靠杆1180用于与挡块1160配合；
第一压杆1120远杆件主体110的一端伸出安装套1110且伸出安装套1110的一端设有杆状旋钮1190，安装套1110的外壁对应第一延伸槽1420和第二延伸槽1430的节点处设有标识1320。
通过上述构造，操作人员欲将筒腔320开口处的肌肉组织块进行转移至筒腔320腔内时，按压杆状旋钮1190，使得第一压杆1120运动，此时转向板1130的滑块1310于第一延伸槽1420内滑动，对应抵靠杆1180与对应挡块1160间错位，进一步的，第一压杆1120伸入杆腔210内并作用于活动杆370的对应端部，进而驱动挑针330作用于肌肉组织块；
第四回复弹簧1140用于提供转向板1130的回复力，以使操作人员在进行按压杆状旋钮1190后快速回复初始位置；
待筒腔320开口处的肌肉组织块转移至筒腔320腔内后，操作人员欲将筒腔320开口内的肌肉组织块进行转移至另一培养瓶内壁的对应培养位置，转动杆状旋钮1190，以使操作人员再次按压杆状旋钮1190时，使得第一压杆1120运动，此时转向板1130的滑块1310于第二延伸槽1430内滑动，转向板1130处的抵靠杆1180与挡块1160相对，进一步的，操作人员按压杆状旋钮1190过程中，第一压杆1120的对应端部不与活动杆370的对应端部配合，抵靠杆1180作用于挡块1160，以使第二压杆1150作用于套杆支架360内的压板940，进而驱动推块340作用于肌肉组织块；
通过上述操作，即可较佳地实现肌肉组织块移运。
其中，标识1320的设置，较佳地便于操作人员操作。
本实施例中，安装套1110的端部向外沿周向间隔设有多个安装块1210，安装块1210用于与对应限位槽配合，且安装块1210的端部用于抵靠压板940。
通过本实施例中安装块1210与限位槽的设置，故而较佳地实现驱动组件于杆件主体110对应端部处的安装与拆除；以及安装块1210伸入限位槽的端部能够抵靠压板940，进而较佳地与第二回复弹簧380配合。
本实施例中，挑针330的对应端处形成弯曲部331以及防滑部332。
通过本实施例中挑针330的构造，弯曲部331能够较佳地带动筒腔320开口处的肌肉组织块转移至筒腔320内，防滑部332为单向防滑纹路，即，挑针330朝向筒腔320开口进行作用肌肉组织块时，单向防滑纹路不影响肌肉组织块位于挑针330针杆处的滑动，挑针330将筒腔320开口处的肌肉组织块转移至筒腔320内时，单向防滑纹路提供阻力，以迫使筒腔320开口处的肌肉组织块转移至筒腔320内，较佳地方便。
本实施例中，推板910中部处向外形成有刮除部660，以及推板910内部形成供挑针330容置的容置缝隙。
通过本实施例中刮除部660的设置，使得推块340将肌肉组织块推出筒腔320时，刮除部660能够较佳地刮除挑针330处的肌肉组织块；以及容置缝隙能够较佳地在推块340过程中容置挑针330。
值得说明的是，考虑到装置主体100在移运肌肉组织块过程中，可能存在双向污染，如使用多次的移运组件可能被肌肉组织块所污染，以及多次使用的移运组件可能污染另一培养瓶，故而本实施例所提供的装置主体100中的移运组件可为一次性制品，而杆件主体110及驱动机构120可为重复使用制品，因此对于移运组件而言，使用到一定次数后，需要对其进行更换，对于杆件主体110及驱动机构120而言，使用多次后只需对其拆解进行高温消毒即可。
容易理解的是，本领域技术人员在本申请提供的一个或多个实施例的基础上，可以对本申请的实施例进行结合、拆分、重组等得到其他实施例，这些实施例均没有超出本申请的保护范围。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (10)
1.一种家畜骨骼肌卫星细胞培养方法，其包括如下步骤：
步骤S1、预处理，对取样自初生活体家畜的肌肉组织进行处理以获取肌肉组织块；
步骤S2、消化处理，对经步骤S1获取的肌肉组织块进行消化处理以获取原代培养肌肉组织块；
步骤S3、对经步骤S2获取的原代培养肌肉组织块在一培养瓶的底壁以贴壁法进行培养；
步骤S4、在培养出的原代骨骼肌卫星细胞增长至贴壁面积不小于对应培养瓶的底壁面积的80％时，将所述一培养瓶中的原代培养肌肉组织块通过一辅助装置转移至另一培养瓶的底壁以贴壁法进行培养；
重复步骤S4，实现用于培养原代骨骼肌卫星细胞的原代培养肌肉组织块2-5次的重复利用。
2.根据权利要求1所述的一种家畜骨骼肌卫星细胞培养方法，其特征在于：步骤S1包括如下步骤，
步骤S11、在无菌操作台内使用PBS缓冲液对取样自初生活体家畜的肌肉组织进行冲洗，后浸泡于75％医用酒精中；
步骤S12、取经步骤S11处理后的肌肉组织采用PBS缓冲液进行涮洗以去除表面酒精；而后自肌肉组织内部取体积约2-3mm3的肌肉肉块若干，并采用PBS缓冲液进行浸泡；
步骤S13、去除经步骤S12处理后的肌肉肉块中的***，并将肌肉肉块处理成体积约1mm3的肌肉组织块。
3.根据权利要求1所述的一种家畜骨骼肌卫星细胞培养方法，其特征在于：步骤S2包括如下步骤，
步骤S21、将肌肉组织块浸入胰蛋白酶溶液中，并置于细胞培养箱内进行消化处理；
步骤S22、消化处理完成后，加入完全培养液终止消化以获取用于培养原代骨骼肌卫星细胞的原代培养肌肉组织块。
4.根据权利要求1所述的一种家畜骨骼肌卫星细胞培养方法，其特征在于：步骤S3包括如下步骤，
步骤S31、将原代培养肌肉组织块在所述一培养瓶底壁均匀涂拭并粘附于所述一培养瓶底壁处，之后加入完全培养液进行培养；
步骤S32、待原代骨骼肌卫星细胞增长融合至贴壁面积不小于对应培养瓶的底壁面积的80％时，使用差速贴壁法纯化细胞以进行扩大培养。
5.一种家畜骨骼肌卫星细胞培养的辅助装置，用于实现权利要求1-4任一所述的一种家畜骨骼肌卫星细胞培养方法，其特征在于：包括装置主体(100)，装置主体(100)包括杆件主体(110)，杆件主体(110)的两端分别设有驱动机构(120)和移运机构(130)；杆件主体(110)内沿轴向方向形成有杆腔(210)，杆腔(210)内设有联动机构(220)，联动机构(220)用于配合驱动机构(120)以驱使移运机构(130)，以及用于提供负压的负压机构；
移运机构(130)包括可拆卸安装于杆件主体(110)对应端部处的移运组件，移运组件包括安装筒(310)，安装筒(310)内沿轴向方向贯穿地形成有筒腔(320)，筒腔(320)内活动地设有推块(340)，推块(340)沿轴向形成有轴孔(640)，轴孔(640)处活动地设有挑针(330)；
负压机构包括设置在推块(340)处且平行于轴孔(640)的第一气道(650)以及设置在杆件主体(110)处且连通于杆腔(210)的第二气道(810)，第一气道(650)与第二气道(810)同轴设置；负压机构还包括设置于第一气道(650)与第二气道(810)处的气管(140)，气管(140)近移运组件的一端形成负压口(820)，气管(140)远移运组件的一端形成用于接入负压源的接口(230)；
推块(340)、挑针(330)与气管(140)间互不干涉，挑针(330)用于在负压口(820)将肌肉组织吸至筒腔(320)一侧开口时将肌肉组织挑至筒腔(320)腔体内，推块(340)用于将筒腔(320)腔体内的肌肉组织推出筒腔(320)。
6.根据权利要求5所述的专用于该方法的辅助装置，其特征在于：筒腔(320)内壁沿近杆件主体(110)对应端部方向依次形成有推动槽(321)、第一阶梯槽(322)和第二阶梯槽(323)，推动槽(321)、第一阶梯槽(322)、第二阶梯槽(323)的直径逐渐增大；推块(340)包括形成于第一阶梯槽(322)内的推块凸缘(610)以及形成于推动槽(321)内的推动部(620)；推块凸缘(610)与第一阶梯槽(322)底壁之间设有第一回复弹簧(410)，第一阶梯槽(322)用于提供推块(340)朝向近杆件主体(110)对应端部侧运动的回复力；推动部(620)外壁与推动槽(321)内壁之间形成滑动密封；
筒腔(320)内同轴地设有位于第二阶梯槽(323)底壁处的挡片(350)，挡片(350)沿轴对称设有2个推孔(710)以及挡片(350)沿轴向设有用于供挑针(330)对应部穿过的针孔(720)；推块凸缘(610)近挡片(350)的侧壁设有分别伸入所述2个推孔(710)处的2个推动座(630)，推动座(630)伸入对应推孔(710)的端部向内凹陷形成凹槽(631)；
联动机构(220)包括位于杆腔(210)内的第一推动组件以及第二推动组件，第一推动组件包括与杆腔(210)内壁配合的套杆支架(360)，套杆支架(360)用于沿杆腔(210)轴向方向往复运动；套杆支架(360)的近移运组件的一端形成有推板(910)，推板(910)与杆腔(210)同轴设置，且推板(910)的侧壁沿轴对称设有2个推动杆(361)，所述2个推动杆(361)伸出杆件主体(110)的一端且分被用于与推块凸缘(610)处所述2个推动座(630)配合，推动杆(361)伸出杆件主体(110)的端部向外凸起形成用于与凹槽(631)配合的凸块(950)；第二推动组件包括位于杆腔(210)轴向方向上往复运动的活动杆(370)；活动杆(370)的一端伸出杆件主体(110)的一端且伸出杆件主体(110)的端部设置有针座(830)，挑针(330)的对应端过盈安装于针座(830)处；活动杆(370)与套杆支架(360)之间互不干涉。
7.根据权利要求6所述的专用于该方法的辅助装置，其特征在于：套杆支架(360)包括多个沿杆腔(210)间隔设置的圆形架(920)以及多个沿圆形架(920)周向均匀布置的连接杆(930)，连接杆(930)用于连接多个圆形架(920)及推板(910)；圆形架(920)的中部设置有通孔(921)，活动杆(370)活动设置于通孔(921)处；推板(910)中部处设有形成有定位槽(911)，活动杆(370)位于定位槽(911)处设有定位块(1010)；推板(910)的侧壁与杆腔(210)的底壁之间设有第二回复弹簧(380)，定位块(1010)的侧壁与杆腔(210)的底壁之间设有第三回复弹簧(390)。
8.根据权利要求6所述的专用于该方法的辅助装置，其特征在于：杆腔(210)内壁沿周向均匀布置有多个沿杆腔(210)轴向延伸的限位槽，套杆支架(360)处的连接杆(930)位于对应的限位槽内；
套杆组件近驱动机构(120)的一端设有压板(940)，压板(940)中部处设有圆孔，活动杆(370)的对应端部位于圆孔处；驱动机构(120)包括可拆卸安装于杆腔(210)对应端部处的安装套(1110)，安装套(1110)内设有第一驱动组件和第二驱动组件；
第一驱动组件包括设置于安装套(1110)内腔且位于轴向方向上的第一压杆(1120)，第一压杆(1120)的对应部位于安装套(1110)内腔内设有转向板(1130)，转向板(1130)与安装套(1110)内腔对应底壁之间设有第四回复弹簧(1140)，第一压杆(1120)的一端伸入杆腔(210)内且伸入杆腔(210)内的端部用于与活动杆(370)的对应端配合；
第二驱动组件包括设置于安装套(1110)近杆件主体(110)的底壁处且沿轴对称设置的2个第二压杆(1150)，第二压杆(1150)一端设有挡块(1160)，挡块(1160)与安装套(1110)内腔对应底壁之间设有第五回复弹簧(1170)，第二压杆(1150)的另一端伸入杆腔(210)内且伸入杆腔(210)内的端部用于与压板(940)的侧壁配合；
安装套(1110)内壁且对应转向板(1130)处设有2个沿安装套(1110)轴向呈中心对称的环形槽(1410)，环形槽(1410)的弧长占安装套(1110)一周的四分之一，环形槽(1410)的两端分别向杆件主体(110)方向延伸有第一延伸槽(1420)和第二延伸槽(1430)，第一延伸槽(1420)的延伸长度大于第二延伸槽(1430)的延伸长度；
转向板(1130)对应设有伸入环形槽(1410)内的滑块(1310)，滑块(1310)用于与第一延伸槽(1420)、环形槽(1410)、第二延伸槽(1430)间配合；
转向板(1130)沿第一压杆(1120)的两侧轴对称的设有2个抵靠杆(1180)，所述2个抵靠杆(1180)用于与挡块(1160)配合；
第一压杆(1120)远杆件主体(110)的一端伸出安装套(1110)且伸出安装套(1110)的一端设有杆状旋钮(1190)，安装套(1110)的外壁对应第一延伸槽(1420)和第二延伸槽(1430)的节点处设有标识(1320)。
9.根据权利要求8所述的专用于该方法的辅助装置，其特征在于：安装套(1110)的端部向外沿周向间隔设有多个安装块(1210)，安装块(1210)用于与对应限位槽配合，且安装块(1210)的端部用于抵靠压板(940)。
10.根据权利要求9所述的专用于该方法的辅助装置，其特征在于：推板(910)中部处向外形成有刮除部(660)，以及推板(910)内部形成供挑针(330)容置的容置缝隙。
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