CN116350752A - 一种制备凝血酶原复合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种制备凝血酶原复合物的方法，属于生物制药血液制品技术领域。具体步骤包括去冷沉淀血浆制备、阴离子交换剂吸附、洗涤、洗脱步骤，其中洗涤步骤的洗涤液中加入凝血酶抑制剂，洗脱步骤的洗脱液中不加入凝血酶抑制剂。本发明公开的凝血酶原复合物制备方法，肝素的添加量可控且添加量低，同时提供了获得无凝血酶活性、凝血因子活化水平符合《中国药典》标准的凝血酶原复合物产物的可能性。本发明公开的方法肝素损耗进一步降低，生产成本低，尤其适用于凝血酶原复合物制品的工业级放大生产。

Description

一种制备凝血酶原复合物的方法

技术领域

本发明涉及生物制药血液制品技术领域，具体涉及一种从血浆及其衍生物中制备凝血酶原复合物的方法。

背景技术

人凝血酶原复合物(Prothrombin Complex Concentrate，PCC)，亦称PPSB(Prothrombin，Proconvertin，Stuart Factor，Antihemophilic Factor B)，泛称因子IX浓制剂，是血浆来源的凝血因子提取物。这些凝血因子都在肝脏中合成，都属于维生素K依赖蛋白(Vitamin K dependent，VKD)，它们的许多理化、生物学性质很相近，故用一般方法不易分开。最常用的制剂都含有因子II、IX和X，因子VII的含量因则因制备方法不同差别较大。

PCC主要用于治疗凝血因子IX缺乏症(乙型血友病)，抗凝剂过量，维生素K缺乏症，肝病导致的需要纠正凝血功能障碍的出血患者，各种原因所致的凝血酶原时间延长而拟作外科手术患者，治疗已产生因子VIII抑制物的甲型血友病患者的出血症状，逆转香豆素类抗凝剂诱导的出血等。因为PCC还含有凝血因子II、VII和X，因此PCC更加被推荐用于纠正华法林引起的凝血异常，以及先天性和获得性凝血因子II、VII、IX、X缺乏症(单独或联合缺乏)。

PCC的临床应用主要依赖其促凝功能，但其抗凝功能太弱又容易引发血栓风险，用PCC治疗可能导致血栓和弥散性血管内凝血(DIC)。因此，一方面，业内对应发展了一种工艺，包括常规的柱层析法或抗凝血因子IX的单克隆抗体亲和层析法以制备高纯度凝血因子IX，高纯度凝血因子IX的治疗显示不发生上述不良反应。另一方面，可以添加一定量的肝素来减少PCC制备过程中微量凝血酶和致血栓活性生成的可能性。再一方面，也可以在PCC制品中加入肝素和/或抗凝血酶(antithrombin，AT)以降低致栓性。《中国药典》和《欧洲药典》规定PCC中每1IU凝血因子IX的肝素含量应不高于0.5IU，未规定AT的量。

大多数的血液制品厂家倾向于在PCC成品中加入肝素，以防止或减少凝血因子活化的危险，而非在制备工艺中加肝素，主要原因是避免制备工艺中添加的肝素影响其他血液制品产品开发。比如中国专利CN108441490A公开，在PCC分装前配制工艺环节加入肝素及抗凝血酶III(AT3)，可以大大降低PCC在使用时血栓的发生，提高临床使用安全性。也有研发人员开发出了在常规的柱层析环节添加肝素的方案，以最大程度地控制VKD蛋白活化以及降低对其他血浆蛋白回收的影响。比如CN106676089B公开，在吸附血浆后的DEAESephadex A50凝胶洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中分别添加200-500IU/mL肝素，实现了控制VKD蛋白活化、降低对其他血浆蛋白回收的影响。但是，该技术改进方案在实际工艺扩大过程中遇到肝素消耗量过大、肝素添加量随洗涤洗脱液的体积变化而变化，无法准确定量添加肝素等技术问题。同时，PCC制备工艺中引入过量的肝素，制品容易出现肝素超标的情况，而PCC制品肝素量过多，将增加肝素诱导血小板减少症发生的风险(Bershad EM，SuarezJI.Prothrombin Complex concentrates for oral anticoagulant therapy-relatedintracranial hemorrhage：A review of the literature.Neurocrit Care.2010，12(3)：403-413)。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的上述技术问题。为此，本发明提出了一种制备凝血酶原复合物的方法，该方法在肝素添加量可控且量低的同时，提供了获得无凝血酶活性、凝血因子活化水平符合《中国药典》标准的PCC产物的可能性，进而实现了在人凝血酶制备工艺中控制肝素物料损耗，降低生产成本的效果，具有现实的经济价值。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作和/或发现而完成的：

制备PCC最好的起始原料为去冷沉淀上清(CPS)，即去冷沉淀的血浆，其中含有绝大部分的维生素K依赖蛋白(Vitamin K dependent，VKD)成分。PCC的制备方法主要采用吸附法，当前大部分厂家选择离子交换树脂吸附剂，通过DEAE-Sephadex A50层析制备PCC。DEAE-Sephadex A50在洗涤洗脱过程中，因为许多血浆蛋白酶抑制物比如ATIII被去除，使得结合于DEAE-Sephadex A50吸附剂上的凝血因子被激活，尤其是凝血因子II和凝血因子VII被激活，进而影响PCC制品的制备。按《中国药典》规定，PCC制品应无凝血因子激活(检不出FIXa、Th和蛋白酶活性)。

发明人意外发现，与在DEAE Sephadex A50凝胶洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中同时添加肝素以控制凝血因子活化的现有技术方案不同，只需在洗涤步骤中加入特定量的肝素也能达到相同或相近的效果。进一步地，发明人对肝素添加量进行了考察发现，当洗涤液中肝素添加量大于等于0.1IU/g血浆时，所得洗脱液活化的凝血因子活性、凝血酶活性符合《中国药典》PCC制品的成品标准；当肝素添加量大于0.2IU/g血浆，低于0.5IU/g血浆时，所得洗脱液活化的凝血因子活性指标没有显著提高。进一步地，发明人对肝素加入时序进行了考察发现，凝胶洗涤阶段肝素的添加量是影响洗脱液活化的凝血因子活性的关键因素。

为此，本发明提出了一种制备凝血酶原复合物的方法，包括去冷沉淀血浆制备、阴离子交换剂吸附、洗涤、洗脱步骤，其中洗涤步骤使用洗涤液进行洗涤，洗脱步骤使用洗脱液进行洗脱，在洗涤液中加入凝血酶抑制剂，在洗脱液中不加入凝血酶抑制剂。

进一步地，所述阴离子交换剂是DEAE Sephadex A50。

进一步地，所述洗涤液中加入的凝血酶抑制剂优选肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物。

进一步地，所述洗脱液不含凝血酶抑制剂。

在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.1IU/g血浆的肝素。

在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.14IU/g血浆的肝素。

在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.16IU/g血浆的肝素。

在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.18IU/g血浆的肝素。

在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.20IU/g血浆的肝素。

在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.22IU/g血浆的肝素。

在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.24IU/g血浆的肝素。

更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.3IU/g血浆的肝素。

更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.35IU/g血浆的肝素。

更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.4IU/g血浆的肝素。

更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.45IU/g血浆的肝素。

更进一步地，所述洗涤液含有不超过0.5IU/g血浆的肝素。

根据本发明的实施例，当所述洗涤步骤至少反复进行2次时，至少在其中一次洗涤步骤使用含有肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物的洗涤液进行洗涤。

优选地，当所述洗涤步骤至少反复进行2次时，在第一次洗涤步骤使用含有肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物的洗涤液进行洗涤。

在一种具体的实施方式中，所述阴离子交换剂是DEAE Sephadex A50，所述洗涤液的洗涤体积是所述DEAE Sephadex A50平衡后凝胶体积的1-5倍，洗涤2-5次。

根据本发明实施例，所述洗涤液含有10-30mmol/L柠檬酸钠，0.1-0.3mol/L氯化钠，所述洗脱液含有10-30mmol/L柠檬酸钠，0.5-2mol/L氯化钠，pH为6.5-7.5。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、在PCC制品的工业级制备工艺中，本发明公开方法尤其使得肝素的添加量可控且添加量低，同时提供了获得无凝血酶活性、凝血因子活化水平符合《中国药典》标准的PCC产物的可能性。现有已知PCC制备工艺在洗涤洗脱液中添加肝素，不同批次PCC制品A50凝胶洗涤洗脱过程(比如凝胶用量、洗涤洗脱时间、洗涤洗脱流速等)非严格一致，而肝素的添加量与洗涤洗脱液的总体积相关，因此已知PCC制备工艺肝素总添加量在一定范围内浮动、添加量非严格可控。本发明公开的方法，按起始原料的重量添加肝素，与凝胶用量、洗涤洗脱时间、洗涤洗脱流速等可变量不相关，实现了肝素添加量准确控制。

2、同时发明人意外发现，当洗涤液中肝素添加量大于等于0.1IU/g血浆，而洗脱液不添加肝素时，所得洗脱液活化的凝血因子活性、凝血酶活性符合《中国药典》标准。与Josic等公开的3IU/mL血浆的肝素添加量相比，本发明工艺肝素添加量呈数量级降低。CN106676089B公开在洗涤缓冲液洗脱缓冲液中添加200-500IU/mL的肝素，粗略估计，1吨去冷沉淀原料血浆大约需要添加120万IU的肝素，而本发明工艺对应肝素添加量为20万IU肝素，肝素添加量显著降低。进一步地，与CN 106676089 B公开的工艺相比，本发明公开方法省去了在洗脱液中添加肝素的步骤，但是通过本发明方法制得的PCC制品关键质量指标比如凝血因子活性(≥150S)、凝血酶活性(-)、肝素含量(≤0.5IU每IU FIX)等关键质量指标均符合中国药典标准。

3、本发明公开方法使得肝素物料损耗进一步降低，节约了生产成本。血液制品企业在生产PCC的过程中，为了应对分离纯化工艺中缓冲液的损耗或突发情况，通常会超理论需求配置生产用缓冲液。CN 106676089 B公开的技术方案在实际生产活动中，通常会超理论体积10％-20％配置DEAE Sephadex A50凝胶洗涤洗脱用缓冲液，当下批次生产活动结束后，未使用的缓冲液将被废弃，试剂损耗严重，尤其是肝素。

4、本发明公开方法制得的PCC制品批间差异更小。本发明公开的方法，按起始原料的重量添加肝素，与凝胶用量、洗涤洗脱时间、洗涤洗脱流速等可变量不相关，实现肝素添加量准确控制的同时，工艺重复性更好、制得的产品批间差异更小。现有工艺因为不同批次产品生产工艺洗涤洗脱过程(比如凝胶用量、洗涤洗脱时间、洗涤洗脱流速等)非严格一致，进而造成洗脱样品中肝素含量的浮动，一定程度上影响产品批间一致性。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

抗凝血酶III是血浆中结构相近的精氨酸蛋白酶抑制物的一种，占血浆中总抗凝血酶活性的50％-60％，是体内最重要的抗凝血酶物质。抗凝血酶III对凝血酶活性的抑制作用可因肝素的存在而大大加速，因为肝素能与抗凝血酶III及凝血酶双向结合，使它们的分子构象改变，有利于复合物的形成，故可使抗凝血酶III的抗凝作用增强约千倍。

在PCC阴离子交换剂吸附分离步骤中，DEAE Sephadex A50凝胶吸附去冷沉淀血浆后，PCC活性物质被保留在凝胶中，而抗凝血酶III流穿至吸附后血浆中。随着以抗凝血酶III为代表的精氨酸蛋白酶抑制物(其它还有抗纤溶酶、α抗胰蛋白酶、C1酯酶抑制剂以及肝素辅因子)部分或完全被去除，PCC的活性成分凝血因子II、VII、IX、X极易被激活。

大多数的血液制品厂家倾向于在PCC成品中加入肝素，以防止或减少凝血因子活化的危险，而非在制备工艺中加肝素，主要原因是避免制备工艺中添加的肝素影响其他血液制品产品开发。但是长期生产实践证实，在PCC制备工艺中不加肝素，仅仅通过控制工艺参数条件的优化，非常难实现对凝血因子活化水平的控制。这也是PCC制品合格率低、市场供应量低的一个原因。

发明人在长期的生产实践中观察并意外发现，与在DEAE Sephadex A50凝胶洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中同时添加肝素以控制凝血因子活化的现有技术方案不同，只需在洗涤步骤中加入特定量的肝素也能达到相同或相近的效果。进一步地，发明人在实验室通过小试试验对肝素添加量进行考察发现，当洗涤液中肝素添加量大于等于0.1IU/g血浆时，所得洗脱液活化的凝血因子活性、凝血酶活性符合《中国药典》PCC制品的成品标准；但是当肝素添加量大于0.2IU/g血浆，小于等于0.5IU/g血浆时，所得洗脱液活化的凝血因子活性指标没有显著提高。进一步地，发明人对肝素加入时序进行考察发现，凝胶洗涤阶段肝素的添加量是影响洗脱液活化的凝血因子活性的关键因素。最后，根据以上发现，发明人在现有PCC制备工艺的基础上，对洗涤步骤进行了调整，并成功制得了符合《中国药典》标准的PCC制品。

发明人推测，本发明方法之所以可以省去洗脱液中肝素的添加，可能的原因在于：先前的洗涤步骤，洗涤液中的肝素与被A50凝胶吸附后的人凝血因子IX结合，肝素从而部分被保留在凝胶中，在洗脱步骤中持续发挥作用。本发明利用了肝素与人凝血因子FIX结合原理，巧妙地与PCC阴离子凝胶洗涤洗脱步骤相配合，设计并验证了上述推断。本发明实施例1、实施例5试验结果从侧面验证了上述推测。

更进一步地，如果在A50凝胶吸附洗涤液中同时加入肝素和抗凝血酶III，含有抗凝血酶III和肝素混合物的洗涤液对于凝血酶活性、凝血因子活化的抑制作用将更优。

根据本发明实施例，在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.10IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.14IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.16IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.18IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.20IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.22IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，在一种实施方式中，所述洗涤液含有不低于0.24IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，较优地，所述洗涤液含有不超过0.30IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，较优地，所述洗涤液含有不超过0.35IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，较优地，所述洗涤液含有不超过0.40IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，较优地，所述洗涤液含有不超过0.45IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，较优地，所述洗涤液含有不超过0.50IU/g血浆的肝素。

根据本发明实施例，洗涤步骤可以反复多次进行。当所述洗涤步骤至少反复进行2次时，至少在其中一次洗涤步骤使用含有肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物的洗涤液进行洗涤。

优选地，在第一次洗涤步骤使用含有肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物的洗涤液进行洗涤。

在本发明实施例中，A50凝胶吸附洗涤缓冲液配方可选：10-30mmol/L柠檬酸钠，0.1-0.3mol/L氯化钠。

在本发明实施例中，A50凝胶吸附洗涤缓冲液配方优选：20mmol/L柠檬酸钠，0.2mol/L氯化钠。

在本发明实施例中，A50凝胶吸附洗脱缓冲液配方可选：10-30mmol/L柠檬酸钠，0.5-2mol/L氯化钠，pH为6.5-7.5。

在本发明实施例中，A50凝胶吸附洗脱缓冲液配方优选：20mmol/L柠檬酸钠，0.5-2mol/L氯化钠，pH为7.0。

根据本发明实施例，在本领域已知的现有PCC工艺条件下，可制备得到符合《中国药典》要求的合格PCC制品。

凝血因子活性测定是对人体内的各种凝血因子进行活性测定，凝血因子在血液凝固过程中，起着非常重要的作用，在临床实践中，测定各个凝血因子的活性，有助于判断血友病的类型，血友病的轻重程度以及某些病理情况下的凝血状况。本发明依据活化的凝血因子在脑磷脂存在下，使缺血小板血浆发生凝固的原理，将供试品(PCC分离纯化原料血浆、中间品以及PCC制品)与缺血小板血浆及脑磷脂混合，测定凝固时间，根据凝固时间判定供试品是否有活化凝血因子。为方便对本发明方案解释说明，凝固时间判定标准根据《中国药典》2020年版三部“人凝血酶原复合物”制定，人凝血酶原复合物成品稀释至人凝血因子IX20IU/ml时，其凝固时间大于150s则符合要求。在PCC分离纯化工艺开发中，应结合实际工况选择凝固时间判定标准，在A50凝胶吸附后的洗脱阶段，现实的凝固时间判定标准可选250s或更长。

本发明人凝血酶活性检测根据凝血酶能使人纤维蛋白原凝固的原理是：将供试品(PCC分离纯化原料血浆、中间品以及PCC制品)和人纤维蛋白原混合，观察是否产生凝块，以此判定供试品是否具有凝血酶活性。根据《中国药典》2020年版三部“人凝血酶原复合物”规定，人凝血酶原复合物成品人凝血酶活性检测结果应为阴性。在PCC制备工艺开发中，相关的中间品及成品该项检索结果均应为阴性。

本发明肝素活性检测依据的原理是：肝素与足量的人抗凝血酶III结合形成复合物，复合物将一定量的活化人凝血酶X因子(Xa)消耗掉，剩余的Xa因子在显色底物的作用下显色，在405nm处波长检测对硝基苯胺释放量，其测定值与肝素含量成反比。

根据《中国药典》2020年版三部“人凝血酶原复合物”的规定，人凝血酶原复合物成品每1IU人凝血因子IX肝素含量应不高于0.5IU，而正常新鲜人血浆，人凝血因子IX活性约1IU/mL。因此发在PCC制备过程中，肝素的加入量按每毫升血浆计，整个工艺流程中肝素总加入量最好不超过0.5IU。进一步地，在A50凝胶吸附后的洗涤洗脱步骤中，肝素最高考察量选择0.5IU。特别说明地是，为了简便起见，每毫升血浆按1克重量计。

本发明所述“肝素”，又称肝素钠或肝磷脂，指由葡萄糖胺，L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组成的黏多糖硫酸脂，平均分子量为15KDa，呈强酸性，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。

在本发明实施例中，“DEAE Sephadex A50凝胶”等同于“A50凝胶”，是人凝血酶原复合物制备过程中常用的阴离子交换剂。为方便实验，本发明实施例将吸附后的A50凝胶连同400目滤布平铺在烧杯底部，然后将洗涤缓冲液和洗脱液分别加入烧杯中洗涤洗脱，来模拟流化床或层析柱等分离纯化设备洗涤洗脱过程并评估实验效果。

制备PCC最好的起始原料为冷沉淀上清(CPS)，即去冷沉淀的血浆，其中含有绝大部分的维生素K依赖蛋白(Vitamin K dependent，VKD)成分；也可以从Cohn低温乙醇法的组分I、III以及IV-1中回收。为了提高血浆的综合利用率，同时尽量避免凝血因子的活化，国内外血液制品企业通常采用去冷沉淀血浆作为原料。为了便于说明本发明，除非特别说明，本发明实施例选用去冷沉淀的血浆作为制备PCC的起始原料。

由于原料血浆通常都是以枸橼酸盐为抗凝剂，而枸橼酸盐有中和无机吸附剂的作用，因而最好选用离子交换树脂作为吸附剂。又因为这些VKD蛋白都具低PI，故都选用各种阴离子交换剂。常用的阴离子交换剂为DEAE-A50，DEAE-琼脂糖以及DEAE-纤维素(如DE52，Whatman UK)。其中，A50是最强的交换剂，DE52最弱。较强的交换剂能结合较多的蛋白，能在较高的离子强度下进行吸附，但也需要用较强离子强度的洗脱缓冲液洗脱。目前，国内外各大血制品企业生产PCC制品多采用DEAE Sephadex A50离子交换法制备(参考文献：HeystekJ，Brummelhuis HGJ，Krijnen HW.Contributions to the opitimal use of humanblood.Ⅱ.The large scale preparation of prothrombin complex a comparisonbetween two methods using the anion exchangers DEAE-Cellulose DE52 and DEAE-Sephadex A-50.Vox Sang，1973，25(2):113-123)(参考文献：余蓉，刘文芳，赵青蓉，等.改良凝胶吸附法制备的凝血酶原复合物.中国输血杂志，1997，10(2):63-66)，进一步地，整个过程分为吸附、洗涤、洗脱3个步骤。为了便于说明本发明，除非特别说明，本发明实施例选择DEAE Sephadex A50凝胶作为阴离子交换剂。

离子交换树脂的洗涤处理一般以柱层析法进行。先用离子强度和CPS相当的缓冲液洗涤吸附了蛋白的凝胶，可使残留在凝胶上的CPS洗下(供其他蛋白回收)。稍微提高洗涤剂的离子强度，亦可洗除吸附力较弱的杂质蛋白，但也可能同时洗去许多血浆蛋白酶抑制物，比如ATIII，使结合的VKD蛋白易于活化。为争取速度，减少活化的潜在危险，在大规模制备中，多采用批量洗涤，随后装柱洗脱。为减少活化的潜在危险，US4465623A公开了在原料血浆中添加肝素或者在铝胶吸附过程中添加肝素以抑制VKD蛋白活化。但是，此方法弊端在于血浆中加入肝素，影响其他血浆蛋白质的回收。因此，研发人员开发出了在洗涤洗脱过程中添加肝素的方案，以最大程度地控制VKD蛋白活化以及降低对其他血浆蛋白回收的影响。比如CN106676089B公开了，在吸附血浆后的DEAE Sephadex A50凝胶洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中添加200-500IU/mL肝素，解决了控制VKD蛋白活化以及降低对其他血浆蛋白回收的影响。但是，这类技术改进在实际工艺扩大过程中遇到肝素消耗量过大、肝素添加量随洗涤洗脱液的体积变化而变化进而无法准确定量的技术问题。

为了便于说明本发明，除非特别说明，本发明实施例去冷沉淀血浆制备、DEAESephadex A50凝胶(以下简称A50凝胶)吸附、洗涤洗脱步骤操作以及活性检测项如下：

去冷沉淀血浆制备：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，合血浆，连续离心工序去除血浆中的冷沉淀，得到去冷沉淀的血浆离心上清液。

A50凝胶吸附：血浆温度控制在10-18℃，按照0.5-1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的，搅拌吸附45min后停止搅拌，收集吸附后的A50凝胶。

洗涤：取吸附后凝胶9.375g连同400目滤布平铺在烧杯底部，将洗涤缓冲液加入烧杯中搅拌后提起滤布，废弃洗涤液。

洗脱：将洗脱缓冲液加入烧杯中搅拌后，收集并合并洗脱液。

活性检测：取洗脱液，参考《中国药典》推荐方法，检活化的凝血因子活性、凝血酶活性、肝素含量。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1肝素加入量考察

洗涤缓冲液配方：20mmol/L柠檬酸钠，0.2mol/L氯化钠。

洗涤方法：用2倍凝胶量的洗涤缓冲液洗涤血浆吸附后A50凝胶中的杂蛋白，洗涤2次，每次5min，每1min至少搅拌10s。第1次洗涤前，按每g血浆0IU、0.1IU、0.2IU、0.3IU、0.5IU肝素的量，在洗涤缓冲液中添加肝素，再进行洗涤。第2次洗涤前，洗涤缓冲液中不再额外添加肝素。

洗脱缓冲液配方：20mmol/L的柠檬酸钠，0.5-2mol/L的氯化钠，pH为7.0。

洗脱方法：用5倍凝胶量的洗脱缓冲液洗脱A50凝胶目标蛋白，洗脱2次，每次15min，每1min至少搅拌10s，合并洗脱液。

取洗脱液，参考《中国药典》推荐方法，检活化的凝血因子活性、凝血酶活性、肝素含量。检测结果如下：

备注：凝血酶活性(﹢/﹣)，“﹢”表示有凝固或有纤原析出，“﹣”表示无凝固，无纤原析出。“吸附后血浆”指经A50凝胶吸附后的血浆。NA表示未检测该数据或无该数据。

以上试验结果表明：当第1次洗涤液肝素添加量大于等于0.1IU/g血浆时，所得洗脱液活化的凝血因子、凝血酶活性符合《中国药典》标准；当肝素添加量大于0.2IU/g血浆，低于0.5IU/g时，考虑待检测样品中肝素对检测结果的影响，所得洗脱液活化的凝血因子活性指标没有显著提高。

当肝素添加量大于等于0.5IU/g血浆时，虽然活化的凝血因子(秒)表现优秀，但是洗脱液中肝素含量过高，整体工艺肝素添加量大，从PCC制剂制备工艺开发角度看，不是较优的选择，有可能肝素含量超标造成PCC制品不合格。

对比例1

Josic等在文献《Manufacturing of a prothrombin complex concentrateaiming at low thrombogenicity》(Thromb Res，100(5)：433-441)中公开，在制备PCC的过程中通过向血浆中加入3IU/mL血浆的肝素来抑制凝血酶原的激活，最终获得的制品在体内和体外血栓性模型检测，均无致血栓性。

对比例2

蒋桂香等在中国专利CN 106676089 B中公开，在制备PCC的过程中，通过在吸附血浆后的DEAE Sephadex A50凝胶洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中添加200-500IU/mL的肝素，可以获得高纯度人凝血酶原复合物(合格)产品。

对比例3

曹海军等在科技文献《凝血酶原复合物制备过程吸附条件的研究》(中国输血杂志，2017年7月(25):655-659)中公开，在去冷沉淀的血浆混浆前，按0.2IU/mL添加肝素；1mol/L HCl调混浆pH至7.0，可进一步通过DEAE Sephadex A50凝胶吸附分离PCC活性成分。

与对比例1-2公开的肝素添加量相比，发明人出乎预料地发现，在制备PCC的过程中，仅需要在吸附血浆后的A50凝胶的洗涤液中加入大于等于0.1IU/g血浆的肝素，就可以有效抑制A50凝胶洗涤洗脱过程中凝血酶原以及凝血因子的激活，大幅度降低PCC制备工艺中肝素纳的添加量。具体地，与Josic等公开的3IU/mL血浆的肝素添加量相比，本实施例工艺肝素添加量呈数量级降低。CN 106676089 B公开在洗涤缓冲液洗脱缓冲液中添加200-500IU/mL的肝素，粗略估计，采用该专利工艺1吨去冷沉淀原料血浆大约需要添加120万IU的肝素，而本实施例工艺对应肝素添加量为20万IU肝素，肝素添加量显著降低。

与对比例3公开的工艺相比，发明人意外地发现，在保证凝血酶原以及凝血因子不被激活的前提下，肝素纳的添加时机可以后移至A50凝胶洗涤环节，进而避免了因为在制备工艺前端添加肝素而影响其他血液制品产品开发的技术问题。因此本发明的方法可避免在去冷沉淀血浆原料中添加肝素进而影响人免疫球蛋白、人血白蛋白或人纤维蛋白原等血制品的开发。

与对比例2公开的工艺相比，本发明的方法在低肝素添加量的前提下，进一步省去了在洗脱液中添加肝素的步骤。因此，发明人进一步考察了本发明的方法对PCC制品的关键质量指标的影响。

实施例2PCC合格制品的制备

(1)去冷沉淀血浆制备：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，合并血浆，连续离心工序去除血浆中的冷沉淀，得到去冷沉淀的血浆离心上清液。

(2)A50凝胶第一次吸附：血浆温度控制在10-18℃，按照0.5-1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的A50凝胶，搅拌吸附45min后停止搅拌，收集吸附后的A50凝胶。

(3)洗涤：取吸附后凝胶9.375g连同400目滤布平铺在烧杯底部，将洗涤缓冲液加入烧杯中搅拌后提起滤布，废弃洗涤液。

洗涤缓冲液配方：10-30mmol/L柠檬酸钠，0.1-0.3mol/L氯化钠。

洗涤方法：用2倍凝胶量的洗涤缓冲液洗涤血浆吸附后A50凝胶中的杂蛋白，洗涤2次，每次5min，每1min至少搅拌10s。第1次洗涤前，按每g血浆0.18IU肝素的量，在洗涤缓冲液中添加肝素，再进行洗涤。第2次洗涤前，洗涤缓冲液中不再额外添加肝素。

(4)洗脱：将洗脱缓冲液加入烧杯中搅拌后，收集并合并洗脱液。

洗脱缓冲液配方：洗脱液由10-30mmol/L的柠檬酸钠，0.5-2mol/L的氯化钠，pH为6.5-7.5。

洗脱方法：用5倍凝胶量的洗脱缓冲液洗脱A50凝胶目标蛋白，洗脱2次，每次15min，每1min至少搅拌10s，合并洗脱液。

(5)将洗脱液进行超滤、透析。

(6)S/D灭活并稀释：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入超滤浓缩液中，添加完毕后搅拌30min；调整液温为24-26℃，灭活6h。

(7)第二次凝胶吸附：将SD灭活后蛋白溶液，按照0.2-0.6g干凝胶/L血浆，将SD灭活后蛋白液中加入平衡后的A50凝胶，搅拌吸附45min后，收集吸附后的A-50凝胶，上清废弃。

(8)将吸附后的A50凝胶用洗涤液冲洗10次，再用洗脱液洗脱3次，收集滤液并使用0.45μm滤芯过滤。

(9)第二次超滤浓缩，除菌分装。

(10)冻干。

(11)干热灭活。

参考《中国药典》推荐方法，检测所得PCC制品活化的凝血因子活性(≥200S)、凝血酶活性(-)、肝素含量(0.15IU每IU FIX)等关键质量指标，均符合药典标准。

实施例3PCC合格制品的制备

(1)去冷沉淀血浆制备：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，合并血浆，连续离心工序去除血浆中的冷沉淀，得到去冷沉淀的血浆离心上清液。

(2)A50凝胶第一次吸附：血浆温度控制在10-18℃，按照0.5-1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的A50凝胶，搅拌吸附45min后停止搅拌，收集吸附后的A50凝胶。

(3)洗涤：取吸附后凝胶9.375g连同400目滤布平铺在烧杯底部，将洗涤缓冲液加入烧杯中搅拌后提起滤布，废弃洗涤液。

洗涤缓冲液配方：10-30mmol/L柠檬酸钠，0.1-0.3mol/L氯化钠。

洗涤方法：用5倍凝胶量的洗涤缓冲液洗涤血浆吸附后A50凝胶中的杂蛋白，洗涤2次，每次5min，每1min至少搅拌10s。第1次洗涤前，按每g血浆0.14IU肝素的量，在洗涤缓冲液中添加肝素，再进行洗涤。第2次洗涤前，洗涤缓冲液中不再额外添加肝素。

(4)洗脱：将洗脱缓冲液加入烧杯中搅拌后，收集并合并洗脱液。

洗脱缓冲液配方：洗脱液由10-30mmol/L的柠檬酸钠，0.5-2mol/L的氯化钠，pH为6.5-7.5。

洗脱方法：用5倍凝胶量的洗脱缓冲液洗脱A50凝胶目标蛋白，洗脱2次，每次15min，每1min至少搅拌10s，合并洗脱液。

(5)将洗脱液进行超滤、透析。

(6)S/D灭活并稀释：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入超滤浓缩液中，添加完毕后搅拌30min；调整液温为24-26℃，灭活6h。

(7)第二次凝胶吸附：将SD灭活后蛋白溶液，按照0.2-0.6g干凝胶/L血浆，将SD灭活后蛋白液中加入平衡后的A50凝胶，搅拌吸附45min后，收集吸附后的A-50凝胶，上清废弃。

(8)将吸附后的A50凝胶用洗涤液冲洗10次，再用洗脱液洗脱3次，收集滤液并使用0.45μm滤芯过滤。

(9)第二次超滤浓缩，除菌分装。

(10)冻干。

(11)干热灭活。

参考《中国药典》推荐方法，检测所得PCC制品活化的凝血因子活性(>180S)、凝血酶活性(-)、肝素含量(0.1IU每IU FIX)等关键质量指标，均符合药典标准。

实施例4PCC合格制品的制备

(1)去冷沉淀血浆制备：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，合并血浆，连续离心工序去除血浆中的冷沉淀，得到去冷沉淀的血浆离心上清液。

(2)A50凝胶第一次吸附：血浆温度控制在10-18℃，按照0.5-1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的A50凝胶，搅拌吸附45min后停止搅拌，收集吸附后的A50凝胶。

(3)洗涤：取吸附后凝胶9.375g连同400目滤布平铺在烧杯底部，将洗涤缓冲液加入烧杯中搅拌后提起滤布，废弃洗涤液。

洗涤缓冲液配方：10-30mmol/L柠檬酸钠，0.1-0.3mol/L氯化钠。

洗涤方法：用1倍凝胶量的洗涤缓冲液洗涤血浆吸附后A50凝胶中的杂蛋白，洗涤5次，每次5min，每1min至少搅拌10s。第1次洗涤前，按每g血浆0.24IU肝素的量，在洗涤缓冲液中添加肝素，再进行洗涤。第2次洗涤前，洗涤缓冲液中不再额外添加肝素。

(4)洗脱：将洗脱缓冲液加入烧杯中搅拌后，收集并合并洗脱液。

洗脱缓冲液配方：10-30mmol/L柠檬酸钠，0.5-2mol/L氯化钠，pH为6.5-7.5。

洗脱方法：用5倍凝胶量的洗脱缓冲液洗脱A50凝胶目标蛋白，洗脱2次，每次15min，每1min至少搅拌10s，合并洗脱液。

(5)将洗脱液进行超滤、透析。

(6)S/D灭活并稀释：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入超滤浓缩液中，添加完毕后搅拌30min；调整液温为24-26℃，灭活6h。

(7)第二次凝胶吸附：将SD灭活后蛋白溶液，按照0.2-0.6g干凝胶/L血浆，将SD灭活后蛋白液中加入平衡后的A50凝胶，搅拌吸附45min后，收集吸附后的A-50凝胶，上清废弃。

(8)将吸附后的A50凝胶用洗涤液冲洗10次，再用洗脱液洗脱3次，收集滤液并使用0.45μm滤芯过滤。

(9)第二次超滤浓缩，除菌分装。

(10)冻干。

(11)干热灭活。

参考《中国药典》推荐方法，检测所得PCC制品活化的凝血因子活性(>220S)、凝血酶活性(-)、肝素含量(0.2IU每IU FIX)等关键质量指标，均符合药典标准。

对比例4

(1)去冷沉淀血浆制备：以新鲜冷冻人血浆为原料，经融浆，按0.2IU/mL血浆添加肝素后合并血浆，连续离心工序去除血浆中的冷沉淀，得到去冷沉淀的血浆离心上清液。

(2)A50凝胶第一次吸附：血浆温度控制在10-18℃，按照0.5-1.5g干凝胶/L血浆，向去冷沉淀血浆中加入平衡后的A50凝胶，搅拌吸附45min后停止搅拌，收集吸附后的A50凝胶。

(3)洗涤：取吸附后凝胶9.375g连同400目滤布平铺在烧杯底部，将洗涤缓冲液加入烧杯中搅拌后提起滤布，废弃洗涤液。

洗涤缓冲液配方：10-30mmol/L柠檬酸钠，0.1-0.3mol/L氯化钠。

洗涤方法：用2倍凝胶量的洗涤缓冲液洗涤血浆吸附后A50凝胶中的杂蛋白，洗涤2次，每次5min，每1min至少搅拌10s。

(4)洗脱：将洗脱缓冲液加入烧杯中搅拌后，收集并合并洗脱液。

洗脱缓冲液配方：10-30mmol/L的柠檬酸钠，0.5-2mol/L的氯化钠，pH为6.5-7.5。

洗脱方法：用5倍凝胶量的洗脱缓冲液洗脱A50凝胶目标蛋白，洗脱2次，每次15min，每1min至少搅拌10s，合并洗脱液。

(5)将洗脱液进行超滤、透析。

(6)S/D灭活并稀释：温和搅拌下将配置好的S/D灭活液缓慢加入超滤浓缩液中，添加完毕后搅拌30min；调整液温为24-26℃，灭活6h。

(7)第二次凝胶吸附：将SD灭活后蛋白溶液，按照0.2-0.6g干凝胶/L血浆，将SD灭活后蛋白液中加入平衡后的A50凝胶，搅拌吸附45min后，收集吸附后的A-50凝胶，上清废弃。

(8)将吸附后的A50凝胶用洗涤液冲洗10次，再用洗脱液洗脱3次，收集滤液并使用0.45μm滤芯过滤。

(9)第二次超滤浓缩，除菌分装。

(10)冻干。

(11)干热灭活。

参考《中国药典》推荐方法，检测所得PCC制品活化的凝血因子活性(>200S)、凝血酶活性(-)、肝素含量(0.2IU每IU FIX)等关键质量指标，均符合药典标准。

实施例2-实施例4与对比例4的实验结果显示，用本发明公开将肝素纳的添加时机后移至A50凝胶洗涤环节，出乎发明人预料，同样可以有效控制或抑制人凝血酶活化和凝血因子活化，同时可制备得到关键质量指标比如凝血因子活性(≥150S)、凝血酶活性(-)、肝素含量(≤0.5IU每IU FIX)等关键质量指标均符合中国药典标准的合格PCC制品。

基于以上实验结果，实施例2-实施例4与对比例4相比，本发明公开方法可避免在去冷沉淀血浆原料中添加肝素进而影响人免疫球蛋白、人血白蛋白或人纤维蛋白原等血制品的开发。

实施例5肝素加入时序考察

洗涤洗脱液配方同实施例1。

肝素添加量及加入时序及洗涤洗脱考察方案如下：

收集洗脱液，参考《中国药典》推荐方法，检活化的凝血因子活性、凝血酶活性、肝素含量。检测结果如下：

备注：凝血酶活性(﹢/﹣)，“﹢”表示有凝固或有纤原析出，“﹣”表示无凝固，无纤原析出。“吸附后血浆”指经A50凝胶吸附后的血浆。NA表示未检测该数据或无该数据。

上述实验结果显示：洗涤液体积在1-5倍凝胶体积间、0.2IU/g血浆浓度的肝素存在的情况下，洗脱液活化的凝血因子活性、凝血酶活性符合《中国药典》要求。

实施例1、实施例5的试验结果显示，洗涤阶段肝素的添加量是影响洗脱液活化的凝血因子活性的关键因素。在具体地实施方式中，较优的工艺条件是，尽可能快地完成肝素与吸附血浆后的A50凝胶的接触。

在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种制备凝血酶原复合物的方法，包括去冷沉淀血浆制备、阴离子交换剂吸附、洗涤、洗脱步骤，其中洗涤步骤使用洗涤液进行洗涤，洗脱步骤使用洗脱液进行洗脱，其特征在于，在所述洗涤液中加入凝血酶抑制剂，所述洗脱液中不加入凝血酶抑制剂；

进一步地，所述阴离子交换剂是DEAE Sephadex A50；

进一步地，所述洗涤液中加入的凝血酶抑制剂是肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.1IU/g血浆的肝素。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.14IU/g血浆的肝素。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.18IU/g血浆的肝素。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.20IU/g血浆的肝素。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不低于0.24IU/g血浆的肝素。

7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有不超过0.3IU/g或0.35IU/g或0.4IU/g或0.45IU/g或0.50IU/g血浆的肝素。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述洗涤步骤至少反复进行2次时，至少在其中一次洗涤步骤使用含有肝素或抗凝血酶III和肝素的混合物的洗涤液进行洗涤；

优选在第一次洗涤步骤使用含有肝素的洗涤液进行洗涤。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述洗涤液的洗涤体积是所述DEAESephadex A50平衡后凝胶体积的1-5倍，洗涤2-5次。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述洗涤液含有10-30mmol/L柠檬酸钠，0.1-0.3mol/L氯化钠，所述洗脱液含有10-30mmol/L柠檬酸钠，0.5-2mol/L氯化钠，pH为6.5-7.5。