CN116348613A - 固定细胞的高通量分析 - Google Patents

Abstract

提供了用于固定单细胞的高通量RNA分析或测序分析的方法和***。该方法和***利用条形码微载体，所述条形码微载体包括用可切割接头连接到多个分子条形码上的小载体珠粒，其中这些条形码微载体然后在具有单个细胞的***(例如，密封***)中结合。然后将分子条形码从所述载体珠粒中释放出来，与细胞中的mRNA退火。使用逆转录，然后由mRNA产生条形码cDNA，并裂解或消化细胞以释放条形码cDNA进行测序。

Description

固定细胞的高通量分析

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求以下申请的优先权权益：2020年7月31日提交的美国临时专利申请第63/059,964号和2021年5月5日提交的美国临时专利申请第63/184,712号。对于所有目的，这些相关申请的内容通过引用全部并入本文。

背景技术

对mRNA序列的了解提供了关于转录它的基因组DNA的有用信息。通过分析细胞中mRNA序列的整个集合，也称为转录组，可以分析所有基因的表达并确定与正常生理或疾病有关的细胞类型、功能和状态。这种信息在生物体的细胞和组织以及肿瘤细胞中可以是高度细胞独特的。因此，非常希望从多细胞组织或肿瘤的样品或包括细胞的复杂组合的样品中获得关于单细胞的这种测序信息。

发明内容

本文的公开包括一种单细胞RNA分析方法，该方法可包括：

将多个固定细胞加载到多个微孔中；

将多个条形码微载体加载到多个微孔中，其中至少5％的多个微孔中各自加载有多个固定细胞中的一个和多个条形码微载体中的一个，并且其中多个条形码微载体各自包括：

微珠，

多个分子条形码，该多个分子条形码各自包括相同的细胞条形码、多个分子条形码中不同的独特的分子标签(UMI)、PCR handle

和能够与多个固定细胞的信使核糖核酸(mRNA)靶标杂交的poly-A尾的poly-T序列，以及

多个可释放接头，该多个可释放接头各自与微珠相关联并与多个分子条形码中的一个连接；

从微孔中的微珠释放分子条形码，从而将分子条形码扩散到固定细胞中，并使分子条形码与固定细胞的mRNA靶标杂交；

对与分子条形码杂交的mRNA进行逆转录，以产生条形码互补脱氧核糖核酸(cDNA)；

汇集来自多个微孔的条形码cDNA；以及

分析条形码cDNA或其产物。

在一些实施方案中，该方法还包括密封多个微孔。分析条形码cDNA或其产物可包括对条形码cDNA或其产物进行测序以获得序列信息。

在一些实施方案中，该方法包括包括扩增条形码cDNA和对扩增的条形码cDNA或其产物进行测序，以获得序列信息。分析条形码cDNA或其产物可以包括：使用具有与测序信息中的各个mRNA靶标相关联的不同序列的多个UMI来确定各个mRNA靶标的表达谱。在一些实施方案中，表达谱包括mRNA靶标的绝对丰度、mRNA靶标的相对丰度或两者。在一些实施方案中，分析条形码cDNA包括：使用具有与测序信息中的各个mRNA靶标相关联的不同序列的多个UMI来确定各个mRNA靶标的多个扩增的条形码cDNA。

在一些实施方案中，至少10％、至少15％、至少25％、至少50％或至少75％的多个微孔各自加载有多个固定细胞中的一个和多个条形码微载体中的一个。在一些实施方案中，至少80％的多个微孔中各自加载有多个固定细胞中的一个和多个条形码微载体中的一个。在一些实施方案中，至少90％的多个微孔中各自加载有多个固定细胞中的一个和多个条形码微载体中的一个。

在一些实施方案中，该方法还包括使用化学固定产生多个固定细胞。化学固定可以包括：使用一种或多种交联固定剂、一种或多种沉淀固定剂、一种或多种氧化剂、一种或多种Hepes谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护效应(HOPE)固定剂或其组合进行固定。化学固定可以包括使用甲醛、多聚甲醛、戊二醛、甲醇、甘油或其组合进行固定。在一些实施方案中，多个固定细胞包括透性化细胞。

微珠可以是聚合微珠。微珠可以是凝胶微珠。在一些实施方案中，凝胶微珠在施加刺激时可降解，任选地，其中刺激包括热刺激、化学刺激、生物刺激、光刺激或其组合。在一些实施方案中，从微珠中释放分子条形码包括破坏凝胶微珠以释放分子条形码。微珠可以是磁性微珠。

多个固定细胞可以包括真核细胞、原核细胞、感染病毒的细胞或其组合。

在一些实施方案中，多个可释放接头各自与微珠可释放地关联、与多个分子条形码中的一个可释放地连接，或两者兼有。在一些实施方案中，从微珠中释放分子条形码包括切割可释放接头。切割可释放接头可以包括通过紫外光、化学切割、酶切或其组合切割可释放接头。

在一些实施方案中，分子条形码的5'端与可释放接头连接。在一些实施方案中，分子条形码的3'端与可释放接头连接。在一些实施方案中，分子条形码从5'端到3'端包括PCRhandle、细胞条形码、UMI和poly-T序列。在一些实施方案中，分子条形码从5'端到3'端包括PCR handle、UMI、细胞条形码和poly-T序列。在一些实施方案中，PCR handle和poly-T序列位于分子条形码的相对两端。在一些实施方案中，poly-T序列位于分子条形码的3'端。

在一些实施方案中，在不裂解或消化细胞的情况下对与分子条形码杂交的mRNA进行逆转录以产生条形码cDNA。在一些实施方案中，该方法还包括在产生条形码cDNA之后并且在汇集来自多个微孔的条形码cDNA之前裂解或消化固定细胞。

在一些实施方案中，密封多个微孔包括用物理结构密封多个微孔。物理结构可以包括薄膜(film)、膜(membrane)、载玻片或其组合。在一些实施方案中，密封多个微孔包括用油密封所述多个微孔。油可以包括氟化烃油。在一些实施方案中，多个微珠各自具有约10μm至约70μm的直径。在一些实施方案中，多个微孔各自具有约10μm至约100μm的直径(宽度)。在一些实施方案中，多个微孔包括约1,000个微孔至约500,000个微孔。在一些实施方案中，分析约100个细胞至约50,000个细胞的条形码cDNA。

本文还包括一种用于执行本文公开的任何高通量单细胞mRNA分析方法的***。例如，该***可以包括：a)包括多个微孔的微孔阵列；b)多个条形码微载体，c)用于密封微孔阵列的装置；d)用于切割可释放接头以从微珠释放分子条形码的装置；以及e)用于产生条形码cDNA的装置。该***还可以包括例如以下中的一个或多个：f)用于裂解或消化细胞以释放条形码cDNA的装置；g)用于收集条形码cDNA的装置；以及h)用于对条形码cDNA或扩增的条形码cDNA进行测序的装置。

本文包括通过切割、递送和条形码编码(MX-CDB)用于单细胞分析(例如，单细胞RNA测序)的多重检测平台。该平台提供了简化且可广泛采用的工作流程，极大地改善了基于微孔的scRNA-seq应用，以捕获和标记来自固定生物样品的数千个单细胞的mRNA，并准备用于测序。

本文还包括高通量单细胞mRNA分析方法。这些方法包括将固定透性化细胞和条形码微载体(即，条形码微珠)加载到具有微孔阵列基板的微流体装置中，其中分子条形码能够从微载体释放并与细胞的mRNA结合。在一些实施方案中，微孔阵列然后被密封，例如通过覆盖物，以产生包含加载的细胞和条形码微珠的密封微孔阵列。分子条形码从微载体中释放出来，并允许扩散到细胞中，以捕获并对细胞的mRNA进行条形码编码。进行逆转录反应以将条形码mRNA转换为条形码cDNA。裂解或消化细胞以释放可以进一步测序的条形码cDNA。另一方面，该方法适用于分析同一细胞中mRNA的绝对丰度和mRNA的相对丰度，以便比较不同细胞。

本文公开的一些实施方案提供了：一种高通量单细胞RNA分析方法，该方法包括：(a)将具有待分析的mRNA的固定细胞和条形码微载体加载到微孔阵列中，其中所述条形码微载体包括微珠、多个接头和多个分子条形码，其中分子条形码包括5'端和3'端，并且还包括PCR handle、细胞条形码、独特的分子标签(UMI)和poly-T序列，使得分子条形码是可切割的，并在接头被切割时从微珠中释放出来，并且其中释放的分子条形码在其3'端呈现poly-T序列；(b)密封包括固定细胞和条形码微载体的微孔阵列；(c)切割接头以从微珠中释放分子条形码，从而扩散到固定细胞中，以便分子条形码与要分析的mRNA结合；(d)通过用分子条形码逆转录mRNA来产生条形码cDNA；(e)裂解或消化细胞以释放条形码cDNA；(f)收集条形码cDNA；以及(g)对条形码cDNA进行测序。

在一些实施方案中，细胞是透性化细胞。在一些实施方案中，微珠是聚合物微珠。在一些实施方案中，微珠是磁性微珠。在一些实施方案中，PCR handle和poly-T序列位于分子条形码的相对端。当分子条形码被释放时，情况也是如此，它在相对端具有PCR handle和poly-T序列。在一些实施方案中，接头将微珠连接到分子条形码的5'端，所述分子条形码从5'端到3'端包括PCR handle、细胞条形码、UMI和poly-T序列。在一些实施方案中，接头将微珠连接到分子条形码的3'端，所述分子条形码从5'端到3'端包括PCR handle、细胞条形码、UMI和poly-T序列。在一些实施方案中，接头将微珠连接到分子条形码的5'端，所述分子条形码从5'端到3'端包括PCR handle、UMI、细胞条形码和poly-T序列。在一些实施方案中，接头将微珠连接到分子条形码的3'端，所述分子条形码从5'端到3'端包括PCR handle、UMI、细胞条形码和poly-T序列。在一些实施方案中，用油密封微孔阵列。

在一些实施方案中，微载体珠粒的直径为约10μm至约70μm。在一些实施方案中，微孔阵列包括直径(宽度)为约10μm至约100μm的微孔。在一些实施方案中，微孔阵列包括约1,000个微孔至约500,000个微孔。在一些实施方案中，同时处理约100个至约50,000个细胞。在一些实施方案中，微孔阵列加载的孔占用率为约5％至约20％。在一些实施方案中，阵列中大于约80％的微孔包含单个条形码微载体。在一些实施方案中，阵列中大于约90％的微孔包含单个条形码微载体。在一些实施方案中，通过紫外光切割可切割接头。在一些实施方案中，通过酶切法切割可切割接头。

一些实施方案包括用于执行本文公开的高通量单细胞mRNA分析方法的***。在一些实施方案中，该***包括(a)微孔阵列；(b)条形码微载体，其中所述条形码微载体包括微珠、多个接头和多个分子条形码，其中分子条形码包括5'端和3'端，并且还包括PCRhandle、细胞条形码、独特的分子标签(UMI)和poly-T序列，使得当接头被切割时，分子条形码是可切割的并从微珠中释放出来的，并且其中释放的分子条形码在其3'端呈现poly-T序列；(c)用于密封微孔阵列的装置；(d)用于切割接头以从微载体珠粒释放分子条形码从而扩散到固定细胞中以使分子条形码与待分析的mRNA结合的装置；

(e)通过逆转录待分析的mRNA来产生条形码cDNA的装置；(f)裂解或消化细胞以释放条形码cDNA的装置。在一些实施方案中，该***还包括(g)用于收集条形码cDNA的装置，或(h)用于对条形码cDNA进行测序的装置，或两者兼有。

在附图和下面的描述中阐述本说明书中描述的主题的一个或多个实施方案的细节。基于所述描述、附图和权利要求，其他特征、方面和优点将是显而易见的。此发明内容和以下的详细描述均无意定义或限制发明主题的范围。

附图说明

图1A和1B提供了批量RNA测序(图1A)与单细胞RNA测序(图1B)的说明性比较。

图2A、2B和2C说明MX-CDB scRNA-seq中单细胞和条形码微载体的分离。步骤1(图2A)：将细胞悬液加载到微孔阵列中以将细胞分离成单个细胞。步骤2(图2B)：将条形码微载体(即条形码微珠)加载到微孔阵列中，以实现微孔的微载体微孔占用率>80％。步骤3(图2C)：用覆盖物密封微孔阵列，覆盖物可以包括油层，以提供具有在微孔中分离的单个细胞和一个条形码微载体的微孔。

图3A、3B和3C进一步示出了MX-CDB工作流程的步骤。首先，将单个细胞和一个微珠分离并密封在单独的微孔中(图3A)。将分子条形码从微珠上切割并扩散到固定的透性化细胞中，以与细胞的mRNA结合。接下来进行细胞内逆转录以产生条形码cDNA(图3B)。然后将细胞裂解或消化以释放条形码cDNA，用于进行进一步测序(图3C)。

图4示出了本文公开的带有分子条形码的条形码微载体的非限制性示意图，该分子条形码通过可切割接头连接。从左到右示出了的是微珠、可切割接头和分子条形码，其中分子条形码包括PCR handle、细胞条形码、独特的分子标签(UMI)和poly-T序列。

图5A、5B、5C和5D示出了条形码微载体的四种非限制性变体。图5A示出了图4的条形码微载体，而图5B示出了图5A的相同分子条形码与其另一端的珠粒连接的变体。图5C和图5D分别示出了另外的变体，其中与图5A和5B相比交换了细胞条形码和UMI的位置。

图6A和6B示出了适用于本文公开的方法、组合物和试剂盒中的两个简化的条形码微载体的非限制性代表。在这些具有代表性的示意图中，为简单起见，仅示出了了三个独特的寡核苷酸序列。该方法允许细胞特异性细胞条形码(缩写为“CB1”和“CB2”)和独特的分子标签(缩写为“UMI1”、“UMI2”和“UMI3”)在随后的PCR扩增和测序中鉴定细胞和从其逆转录的mRNA多核苷酸或cDNA。所示出的是对第一个细胞(即细胞1和三种不同的UMI(“UMI1”、“UMI2”和“UMI3”))具有特异性的细胞条形码“CB1”，用于结合该细胞的mRNA(图6A)，以及对第二个细胞(如细胞2和三种不同的UMI(“UMI1”、“UMI2”和“UMI3”)具有独特的细胞条码“CB2”，用于结合该细胞的mRNA(图6B)。

图7A示出了加载有约10％的微孔单细胞覆盖率的微孔阵列。

图7B示出了微孔阵列加载有微珠，以确保一个微孔中只有一个微珠。

图8示出了PCR扩增后纯化的cDNA溶液的质量。

图9示出了纯化文库的质量。

图10示出了UMI计数vs.细胞条形码数量。

图11示出了了所确定细胞的基因数、UMI数和线粒体百分比分布的小提琴图

图12示出了PCR扩增后纯化的cDNA溶液的质量。

图13示出了纯化文库的质量。

图14示出了UMI计数vs.细胞条形码数量。

图15示出了所确定细胞的基因数、UMI数和线粒体百分比分布的小提琴图

在整体附图中，参考编号可以重复使用以表明所引用要素之间的对应关系。提供附图是为了说明本文描述的示例性实施方案而非用于限制本公开的范围。

具体实施方式

在下面的详细描述中，参考附图，其构成本文的一部分。在附图中，类似的符号通常标识相似的组件，除非上下文另有规定。详细描述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案并非是限制性的。可以利用其它实施方案，并且可以进行其它更改，而不偏离本文所呈现的主题的精神或范围。将容易理解，本公开的各个方面，如本文中概述并在附图中举例说明的，可以在各种不同的设置中被排列、置换、组合、分离和设计，所有这些都在此明确考虑并成为本文公开的一部分。

本文提及的所有专利、公开专利申请、其他出版物和来自GenBank的序列以及其他数据库均通过引用并入相关技术的全部内容。

定义

本文所用的术语“微载体”是指包含载体微珠(例如小载体珠粒)、例如经由可切割接头附着于一个或多个所需的独特的寡核苷酸序列(例如分子条形码)的构建体。

本文所用的术语“条形码微载体”是指包含分子条形码的微载体，或者可选地，包括至少PCR handle、细胞条形码、独特的分子标签(UMI)和poly-T序列的特异性寡核苷酸序列。

本文所用的术语“分子条形码”是指通过可切割的接头包含在条形码微载体中以鉴定多核苷酸的寡核苷酸。分子条形码可用于鉴定来自特定细胞(细胞条形码)或特定RNA链(独特的分子标签；UMI)的序列。在本发明的方法中，分子条形码还包括用于PCR扩增的元件，例如PCR handle，以及用于与mRNA序列退火的poly-T序列。分子条形码优选至少包括PCR handle、细胞条形码、独特的分子标签(UMI)和poly-T序列。本文公开的分子条形码在序列的相对端具有PCR handle和poly-T序列，例如PCR handle位于5'端，poly-T序列位于3'端。poly-T序列或PCR handle都可以通过接头连接到微珠。细胞条形码和独特的分子标签(UMI)不需要按特定顺序排列，只要它们位于相对的PCR handle和poly-T序列之间即可。

如本文所用的术语“独特的寡核苷酸序列”，或“寡核苷酸序列”或“寡核苷酸”是指符合本文使用的“分子条形码”定义的寡核苷酸序列。

本文所用的术语“细胞条形码”是指对其所附着的微珠具有特异性的分子条形码的核苷酸序列。在本发明的方法中，其中用微珠分离单个细胞，细胞条形码可用于鉴定随后PCR扩增和测序的核苷酸的相应单细胞。

本文所用的术语“可切割接头”是指可切割的化学连接部分、或具有将微珠连接到分子条形码的特定序列的可切割核苷酸序列。接头是可切割的，即可切割的接头，以便从微珠中释放分子条形码。可切割接头可以通过任何适当的方法或处理进行切割，包括但不限于用化学法、酶法、光(包括紫外、可见光和近红外波长)、机械力和热的方式。

本文所用的术语“固定细胞”是指已经用固定剂如甲醛溶液(其也称为***)处理的细胞。

本文中使用的术语“微珠”是指载体珠粒，其通常具有微米范围内的直径，例如约10μm至约70μm，并且分子条形码通过可切割接头附着在其上。

术语“通过切割、递送和条形码的多重检测”，缩写为“MX-CDB”是指本发明用于固定细胞的高通量单细胞分析的方法和***。

本文所用的术语“PCR handle”是指包括用于引物附着和PCR扩增目的的核苷酸序列。

本文所用的术语“可渗透的”是指细胞是可渗透的或多孔的，以允许将诸如寡核苷酸等物质转移到细胞中以与细胞内的RNA退火。

本文所用的术语“单细胞测序”是指从单个细胞获取序列信息的方法。本文所用的术语单细胞RNA测序(scRNA-seq)是指这种用于RNA的单细胞测序方法，例如信使RNA(mRNA)。

本文所用的术语“poly-T”是指这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列包括用于与细胞的mRNA核苷酸退火的连续胸腺嘧啶核苷酸。在本发明的方法中，poly-T序列位于分子条形码的任一端，并在可切割接头被切割后使分子条形码与细胞的mRNA核苷酸退火。

术语“独特的分子标签”，缩写为UMI，是指对RNA序列具有特异性的分子条形码的核苷酸序列，所述分子条形码通过其poly-T序列与该RNA序列结合。在本发明的方法中，UMI可用于在随后的PCR扩增和测序分析之后鉴定与给定分子条形码结合的RNA链。另一方面，UMI是用于检测和定量特异性mRNA转录物的分子标签。

单细胞RNA测序(scRNA-seq)正在成为研究复杂生物样品中细胞异质性和对这些细胞的亚型进行分类的重要工具。批量测序和单细胞测序的比较如图1A和1B所示。图1A示出了对混合细胞组进行的批量RNA测序提供了来自所有细胞的平均基因组信息。相反，单细胞测序可以从各单独的细胞中提取基因组信息(图1B)。因此，非常希望进行单细胞RNA测序，例如在临床环境中。

在过去的二十年中，在单细胞分离和基因测序领域取得了进展。这些单细胞分离技术包括手动分离单细胞、利用多孔样品板对样品进行多重检测、集成流体回路、液体处理机器人***、将细胞掺入液滴以及使用极小的皮孔(picowells)。一些研究人员采取的另一个方向是使用混合细胞样品的原位条形码编码，并通过复杂的数据分析技术分离单个细胞遗传数据。在微流体和高度多样化的分子条形码编码技术的帮助下，可以对数千个细胞进行测序，并以低成本同时鉴定各细胞的遗传信息。然而，大多数技术仅适用于活细胞，这阻碍了scRNA-seq在医学应用中的进展。

目前的高通量scRNA-seq技术通常需要使用新鲜且高活力的细胞，这意味着收集的样本一旦获得，就必须立即进行处理。这一要求给样品收集、运输和储存带来了更大的难度，并且还可能增加与将高通量scRNA-seq技术应用于医学样品相关的成本。因此，非常需要开发一种可用于固定细胞(例如用甲醛等固定剂处理的样品)的单细胞技术。本文公开了用于固定单细胞的高通量RNA分析或测序分析的这种方法和***。该方法和***利用条形码微载体，所述条形码微载体包括用可切割接头连接到多个分子条形码上的小载体珠粒，其中这些条形码微载体然后在密封***中与单个细胞结合。然后将分子条形码从载体珠粒中释放出来，与细胞中的mRNA退火。使用逆转录，然后由mRNA产生条形码cDNA，并裂解或消化细胞以释放条形码cDNA用于测序。

平台

本公开提供了通过切割、递送和条形码编码进行多重检测的平台，用于捕获固定细胞中的mRNA。该技术在本文中称为MX-CDB scRNA-seq，使用条形码微载体将分子条形码递送到微孔中分离的固定单细胞。包括细胞条形码和UMI的分子条形码可以捕获固定单细胞的mRNA用于转录组测序。该方法不需要新鲜的生物样品，可以降低样品收集、运输和储存的成本。该技术还与便携式微流体装置兼容，不需要任何特殊设备，便于样品处理。从微流体装置收集的最终产物是液体溶液中的cDNA。与其他scRNA-seq方法相比，最终产物稳定且易于回收。

目前的高通量scRNA-seq技术通常需要使用新鲜且高活力的细胞，这意味着收集的样本一旦获得，就必须立即进行处理。这一要求给样品收集、运输和储存带来了更大的困难，并且还可能增加将高通量scRNA-seq技术应用于医学样品的成本。

相比之下，细胞的固定(例如，细胞的甲醛溶液固定或细胞的甲醇固定)是一种简单、低成本且被广泛接受的生物样品储存方法。例如，一旦生物样品被甲醛溶液固定，它们就可以方便地运输，而不需要太多的护理，并且可以长期储存。本文公开的MX-CDB scRNA-seq方法和***能够与固定样品(例如，甲醛或甲醇固定样品)一起使用，使其与医学样品兼容。此外，目前大多数scRNA-seq技术都使用微珠来递送分子条形码以捕获从细胞释放的mRNA。从微流体装置中检索条形码微珠的效率可以决定数据的质量。在以下分子生物学反应中(如PCR扩增等中)微珠的存在会抑制反应效率。本文中，本文公开的MX-CDB scRNA-seq方法和***更简单地要求从微流体装置的液体中检索分子条形码。这种检索不仅简化了工作流程，还提高了捕获mRNA的效率和测序数据的质量。此外，对于大多数scRNA-seq方法，当从微流体中收集条形码微珠时，微珠通常捕获细胞的mRNA。这种mRNA相对脆弱，如果不格外小心处理，在此过程中很容易降解。相反，使用本文公开的MX-CDB scRNA-seq方法和***，从微流体中收集的产物已经是cDNA形式，其比mRNA更稳定且更易于处理和储存。

条形码微载体

本文公开的条形码微载体是包含载体珠粒(也称为微珠)、多个可切割接头和多个分子条形码的构建体，它们通过其接头与微珠连接。分子条码是具有特异性核苷酸序列的寡核苷酸，进一步包括至少四个序列段：PCR handle、细胞条形码、独特的分子标签(UMI)和poly-T序列。分子条形码序列可以具有四个以上的序列段，用于不同的目的。图4示出了条形码微载体的非限制性实例。示出了微珠通过可切割接头附着在分子条形码上。如图5A、5B、5C和5D进一步所示，分子条形码内序列的顺序在本发明的不同实施方案中可以变化，只要PCR handle和poly-T序列位于序列的两端。本发明的PCR handle位于分子条形码的5'端，poly-T序列位于3'端即可。因此，可切割接头可以通过PCR handle或poly-T序列将寡核苷酸序列连接到珠粒。分子条形码寡核苷酸序列的顺序为：5'-PCR handle-细胞条形码-UMI–poly-T序列–3'或5'-PCR handle-UMI–细胞条形码–poly-T–3'。分子条形码可以通过其3'端或5'端的可切割接头附着到微珠上。

微珠

载体珠粒也被称为微珠，是用于通过可切割接头锚定分子条形码的任何合适的载体珠粒，该可切割接头的尺寸也适合微阵列技术。微珠的尺寸可以变化，例如具有约10微米(μm)至约95μm的直径。例如，微珠的直径可以为：10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm，这些值中任意两个值之内的数字，或这些值中任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，微珠具有约10μm至约70μm的直径。

载体珠粒(即微珠)的材料可以变化。在一些实施方案中，载体珠粒由聚合物(例如聚苯乙烯)、金属、金属氧化物或磁性材料制成，其可任选地进一步包覆有聚合物。在一些实施方案中，珠粒包含两种或多种类型的材料。可以使用任何适当的方法对本发明的珠粒进行功能化以附着在接头上、或可以使用任何适当的方法用接头对本发明的珠粒进行功能化。

微珠可以是可溶解的、可降解的或可破坏的。微珠可以是聚合物微珠。微珠可以是凝胶珠，例如水凝胶微珠。在一些实施方案中，凝胶珠在施加刺激时可降解，包括但不限于热刺激、化学刺激、生物刺激、光刺激或其组合。

微珠可以是固体珠粒，例如磁珠。磁珠可以包括包覆或嵌入所述磁珠中的顺磁性材料(例如在表面上、在中间层中和/或与磁珠的其它材料混合)。顺磁性材料是指具有略大于1的磁化率(例如，在约1和约5之间)的材料。磁化率是衡量材料在外加磁场中被磁化的程度的量度。顺磁性材料包括但不限于镁、钼、锂、铝、镍、钽、钛、氧化铁、金、铜或其组合。

在多个条形码微载体中，微珠的尺寸可以是均匀的，或者也可以是不均匀的。在一些实施方案中，多个条形码微载体中的微珠的平均直径或中值直径约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、45μm、50μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、90μm或95μm。

在一些实施方案中，微珠的尺寸可以使得至多一个微珠，而不是两个微珠，可以容纳在一个微孔中。在不同的实施方案中，微珠的大小或尺寸(例如，长度、宽度、深度、半径或直径)可以不同。在一些实施方案中，一个或各个微珠的大小或尺寸为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，一个或各个珠粒的大小或尺寸为约5μm至约100μm。在一些实施方案中，微珠可以具有约10μm至约70μm的尺寸。在一些实施方案中，微珠可以具有约30μm的尺寸。在一些实施方案中，多个微珠各自具有约10μm至约70μm的直径。

在不同的实施方案中，一个或各个微珠的体积可以不同。一个或各个微珠的体积可以为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：5μm³、6μm³、7μm³、8μm³、9μm³、10μm³、20μm³、30μm³、40μm³、50μm³、60μm³、70μm³、80μm³、90μm³、100μm³、200μm³、300μm³、400μm³、500μm³、600μm³、700μm³、800μm³、900μm³、1000μm³、10000μm³、100000μm³、1000000μm³，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。在不同的实施方案中，多个条形码微载体中微珠的平均或中位数体积可以不同。例如，一个或各个微珠的体积可以是约1μm³至约1000000μm³。

可释放接头

接头(例如，可切割/可释放接头)可以是，例如，可切割以从微珠中释放分子条形码。可切割接头可以通过任何适当的方法或处理进行切割，包括但不限于化学法、酶法、光(包括紫外、可见光和近红外波长)、机械和热的方式。接头可以是任何合适的可切割接头，包括但不限于化学接头，包括脂肪族、杂脂族、芳香族、杂芳族、肽或多肽接头，或其任何取代变体，或包含连续核苷酸的核苷酸或多核苷酸接头。在一些实施方案中，接头是或包括化学接头，例如能够被光切割的化学接头，也称为光解作用。在一些实施方案中，接头是或包括可以被限制性内切酶酶切的核苷酸或多核苷酸接头。

在一些实施方案中，可切割接头包括光切割接头。如本文中所使用的，光切割接头是指可以通过暴露于电磁辐射(例如，紫外光、可见光和近红外波长)而从与其连接的化学基团被切割的接头。光切割所述接头所需的光波长取决于所用光切割接头的结构和性质。这里本领域已知的任何可光切割接头都可以使用。光切割接头的实例包括但不限于：含有邻硝基苄基部分、对硝基苄基部分、间硝基苄基部分、硝基吲哚啉部分、溴羟基香豆素部分、溴羟基喹啉部分、羟基苯酰基部分、二甲氧基安息香部分或其任意组合的化学分子。

在一些实施方案中，可释放接头可与微珠可释放地关联，可与多个分子条形码中的一个可释放地连接，或两者兼有。例如，当释放时，可释放接头或其一部分可以连接到分子条形码、微珠或两者上。

分子条形码

本文描述的微珠通过可切割接头与多个分子条形码相关联(例如，附着)，所述分子条形码各自包括相同的细胞条形码、多个分子条形码中不同的独特的分子标签(UMI)、PCR handle和能够与多个固定细胞的信使核糖核酸(mRNA)靶标的poly-A尾杂交的poly-T序列。在一些实施方案中，分子条形码的5'端与可释放接头连接。在一些实施方案中，分子条形码的3'端与可释放接头连接。分子条形码和可释放接头之间的连接可以是共价连接或通过非共价键(例如离子键、氢键或范德华相互作用)的非共价连接。

如本领域技术人员所理解的那样，加载到微孔中的多个分子条形码的分子条形码(例如细胞条形码、PCR handle、UMI、poly-T序列和/或任何另外的序列)中包括的各种序列的构成可以根据例如所需的特定构成和/或序列的各种组分的添加顺序而变化。本文中描述的分子条形码可以在序列的相对端具有PCR handle和poly-T序列。例如，PCR handle可以在5'端，poly-T序列可以在3'端。poly-T序列或PCR handle均可以通过接头连接到微珠。细胞条形码和UMI不需要按特定顺序排列，只要它们位于相对的PCR handle和poly-T序列之间即可。在一些实施方案中，分子条形码从5'端到3'端包括PCR handle、细胞条形码、UMI和poly-T序列。在一些实施方案中，分子条形码从5'端到3'端包括PCR handle、UMI、细胞条形码和poly-T序列。

如本领域普通技术人员所理解的那样，可以由各种不同的形式产生分子条形码，包括预先设计的多核苷酸条形码、随机合成的条形码序列、基于微阵列的条形码合成、随机N-mers或其组合。

在一些实施方案中，多个分子条形码包括、包括约、至少包括、至少包括约、至多包括、或至多包括约如下数量的分子条形码：1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、50000000，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。

多个分子条形码的分子条形码可以是任何合适的长度，例如4至500个核苷酸的长度。在一些实施方案中，多个分子条形码中的分子条形码可以是约2至约500个核苷酸的长度、约2至约100个核苷酸的长度、约2至约50个核苷酸的长度、约2至40个核苷酸的长度、约4至约20个核苷酸的长度、或约6至16个核苷酸的长度。在一些实施方案中，多个分子条形码的分子条形码约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、85、90、95、100、120、150、200、250、300、400或500个核苷酸的长度，或者这些值中任意两个值之间的数值或范围的长度。

在一些实施方案中，微珠包括、包括约、至少包括、至少包括约、至多包括、或至多包括约如下数量的分子条形码：1、5、10、50、100、1000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。

PCR Handle

本文所用的PCR Handle是包括用于引物连接和PCR扩增目的的核苷酸序列。例如，PCR handle存在于分子条形码的5'端。例如，PCR handle可以是引物结合位点或包含引物序列。引物结合序列可以是测序引物序列(或测序引物结合序列)或PCR引物序列(或PCR引物结合序列)。例如，测序引物是Read 1序列。在一些实施方案中，附着在各磁珠上的多个分子条形码各自均包含相同的PCR handle。

细胞条形码

本文所用的细胞条形码是对与其相关联的微珠具有特异性的分子条形码的核苷酸序列。在本文公开的用微珠分离单个细胞的方法中，细胞条形码可用于鉴定随后PCR扩增和测序的核苷酸的相应单个细胞。细胞条形码可以是对应于cDNA来源的单个细胞的、用于条形码编码和鉴定目的的任何合适的核苷酸序列。对于给定的条形码微载体，细胞条形码是连接到微珠的多个分子条形码中的相同序列。

附着在具有包括相同序列的细胞条形码的微珠上的分子条形码的数量(或百分比)可以变化。在一些实施方案中，附着在具有包括相同序列的细胞条形码的微珠上的分子条形码的数量为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、10000000，或者这些值中任意两个值之间的数值或范围。在一些实施方案中，附着在具有包括相同序列的细胞条形码的微珠上的分子条形码的百分比为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或者这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，附着在微珠上的两个(或多个)分子条形码的细胞条形码包含相同的序列。在一些实施方案中，附着在微珠上的多个分子条形码各自均包含相同的细胞条形码。

细胞条形码对于条形码微载体可以是独特的(或基本上独特的)。具有包括独特的序列的细胞条形码的条形码微载体的数量(或百分比)可以不同。在一些实施方案中，数量为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000、或者这些值中任意两个值之间的数值或范围的条形码微载体的细胞条形码可以包含不同的序列。在一些实施方案中，百分比为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％，82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、或这些值中任意两个值之间的数值或范围的条形码微载体的细胞条形码可以包含不同的序列。例如，附着在两个条形码微载体上的两个分子条形码的细胞条形码可以包含不同的序列。

条形码微载体的细胞条形码(或条形码微载体的各细胞条形码或所有条形码微载体的所有细胞条形码)的长度可以变化。在一些实施方案中，条形码微载体的细胞条形码(或条形码微载体的各细胞条形码或所有条形码微载体的所有细胞条形码)的长度为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为如下数值的核苷酸：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，细胞条形码的长度至少可以为6个核苷酸。

多个条形码微载体中的独特的细胞条形码序列的数量可以不同。在一些实施方案中，多个条形码微载体中的独特的细胞条形码序列的数量为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000，或者这些值中任意两个值之间的数值或范围。

独特的分子标签

本文所用的独特的分子标签(UMI)是分子条形码的核苷酸序列，其用作分子标签以检测和定量不同的mRNA转录物。UMI对于分子条形码通过其poly-T序列结合的mRNA序列具有特异性。在本发明的方法中，UMI可用于鉴定给定分子条形码所结合的mRNA链，随后进行后续分析，例如测序。

附着在具有不同序列的微珠上的分子条形码的UMI的数量(或百分比)可以变化。例如，附着在具有不同序列的微珠上的分子条形码的UMI的数量可以为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000，8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。在一些实施方案中，附着在具有不同序列的微珠上的分子条形码的UMI的百分比为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或者这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，附着在多个微珠中的微珠上的两个分子条形码的UMI可以包括不同的序列。

附着在具有包括特定序列(或相同序列)的UMI的微珠上的分子条形码的数量可以变化。在一些实施方案中，附着在具有包括特定序列(或相同序列)的UMI的微珠上的分子条形码的数量为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，附着在微珠上的两个分子条形码的UMI可以包括特定的序列(或相同的序列)。

附着在不同微珠上的分子条形码可以具有包括特定序列(或相同序列)的UMI。在一些实施方案中，其上附着有具有包括特定序列(或相同序列)的UMI的分子条形码的微珠的数量为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000，200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000，或者这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，附着在所述微珠的两个微珠上的两个分子条形码的UMI可以包括相同的序列。

条形码微载体的UMI(或条形码微载体的各UMI或所有条形码微载体的所有UMI)的长度可以变化。例如，条形码微载体(或条形码微载体的各UMI或所有条形码微载体的所有UMI)的UMI的长度为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为如下数量的核苷酸：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。在一些实施方案中，UMI的长度可以是至少6个核苷酸。

条形码微载体的独特的UMI序列的数量可以变化。例如，独特的UMI序列的数量为、约为、至少为、至少约为、至多为或至多约为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000，400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000，或者这些值中任意两个值之间的数值或范围。

Poly-T序列

Poly-T序列是包含用于通过与mRNA核苷酸的poly-A尾杂交而与细胞的mRNA核苷酸退火的连续胸腺嘧啶核苷酸的核苷酸序列。在本发明的方法中，poly-T序列位于分子条形码的3'端，并且在可切割接头被切割后，分子条形码寡核苷酸序列与细胞的mRNA核苷酸退火。本文中使用的poly-T序列通常具有约3至约50个重复胸腺嘧啶核苷酸，例如约10至约35个重复胸腺嘧啶核苷酸，以及约16至约30个重复胸腺嘧啶核苷酸。

在一些实施方案中，附着在条形码微载体上的分子条形码的poly-dT可以是相同的(例如，相同数量的dT)。在一些实施方案中，附着在条形码微载体上的分子条形码的poly-dT可以是不同的(例如，不同数量的dT)。附着在具有相同poly-dT序列的条形码微载体上的多个分子条形码的分子条形码的百分比可以变化。在一些实施方案中，附着在具有相同poly-dT序列的条形码微载体上的多个分子条形码中的分子条形码的百分比为、约为、至少为、至少约为、至多为、至多约为：50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、87％、88％、89％、90％、91％、92、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、100％或这些值中任意两个值之间的数值或范围。

poly-dT序列的长度可以变化。在一些实施方案中，poly-dT序列的长度为、约为、至少为、至少约为、至多为、至多约为如下数量的核苷酸：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63，64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，poly-dT序列的长度至少为10个核苷酸。

核酸靶点和细胞

根据本文描述的方法和***，用于加载到多个微孔中的多个固定细胞可以从任何感兴趣的生物体例如原核生物界(细菌)、原生生物界、真菌界、植物界和动物界获得。例如，多个固定细胞可以包括真核细胞、原核细胞、感染病毒的细胞或其组合。在一些实施方案中，多个固定细胞的细胞可以是哺乳动物细胞，特别是人类细胞如T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、干细胞、癌细胞或感染病毒的细胞。在一些实施方案中，细胞可以是免疫细胞。例如，细胞可以是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞或其组合。多个固定细胞可以是相同种类的，也可以是不同种类的。

在一些实施方案中，细胞是癌细胞。核酸靶标可以是癌基因(或疾病相关基因)，或者是其RNA(例如mRNA)产物。本文描述的方法因此可以确定癌基因(或疾病相关基因)、基因突变和突变丰度谱(例如，RNA表达谱)。

在一些实施方案中，细胞被病毒感染。核酸靶标可以是病毒的基因，或是其核酸产物(例如RNA)。病毒可以是RNA病毒。核酸靶标可以包括病毒基因的RNA。本文描述的方法因此可以确定细胞谱(例如，RNA表达谱)和病毒的核酸谱(例如，RNA表达谱)。

在一些实施方案中，表达谱包括mRNA靶标的绝对丰度、mRNA靶标的相对丰度或两者。丰度可以是出现次数或频率。在一些实施方案中，核酸靶标分子的绝对丰度可以包括核酸靶标的分子的出现次数。在一些实施方案中，核酸靶标分子的相对丰度可以包括：相对于总核酸靶标的分子的出现次数或相对于不同于所述核酸靶标的另一核酸靶标的分子的出现次数，所述核酸靶标的分子的出现次数。

分子条形码能够结合的不同核酸靶标(例如不同基因的mRNA或不同序列的mRNA)的数量在不同的实施方案中可以是不同的。在一些实施方案中，附着在微珠(或各微珠)上的分子条形码能够结合的不同核酸靶标的数量为、约为、至少为、至少约为、至多为、至多约为：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43，44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、50000、100000、1000000、5000000，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。附着在微珠(或各微珠)上的一个分子条形码可以与核酸靶标的分子(或拷贝)结合。附着在微珠(或各微珠)上的分子条形码可以与核酸靶标的分子(或拷贝)结合。

在一些实施方案中，多个固定细胞可以在加载之前被稀释，以确保大多数微孔至多包括一个具有低的双联(doublets)的细胞(一个微孔中有多于一个的细胞)。可以制备稀释液，使其达到所需的细胞浓度。细胞浓度可以在1x10⁴个细胞/mL和1x10⁶个细胞/mL之间(例如约为、至少为、至少约为、至多为、至多约为：1x10⁴、2x10⁴、3x10⁴、4x10⁴、5x10⁴、6x10⁴、7x10⁴、8x10⁴、9x10⁴、1x10⁵、1.5x10⁵、2x10⁵、2.5x10⁵、3x10⁵、3.5x10⁵、4x10⁵、4.5x10⁵、5x10⁵、5.5x10⁵、6x10⁵、6.5x10⁵、7x10⁵、7.5x10⁵、8x10⁵、8.5x10⁵、9x10⁵、1x10⁶或这些值中任意两个值之间的数值或范围)个细胞/mL。在一些实施方案中，细胞浓度为约1x10⁵至3x10⁵(例如约为、至少为、至少约为、至多为、至多约为：1x10⁵、1.1x10⁵、1.2x10⁵、1.3x10⁵、1.4x10⁵、1.5x10⁵、1.6x10⁵、1.7x10⁵、1.8x10⁵、1.9x10⁵、2.0x10⁵、2.1x10⁵、2.2x10⁵、2.3x10⁵、2.4x10⁵、2.5x10⁵、2.6x10⁵、2.7x10⁵、2.8x10⁵、2.9x10⁵、3.0x10⁵，或这些值中任意两个值之间的数值或范围)。

本文所述的细胞可以从细胞样品中获得。包括细胞的细胞样品可以从任何来源获得，包括临床样品及其衍生物、生物样品及其衍生物、法医样品及其衍生物、环境样品及其衍生物、以及它们的组合。可以从任何体液中收集细胞样品，包括但不限于任何生物体的血液、尿液、血清、淋巴液、唾液、***和***分泌物、汗液和***。细胞样品可以是实验操作的产物，包括纯化、细胞培养、细胞分离、细胞分离、细胞定量、细胞分选、样品稀释或任何其他细胞样品处理方法。可以通过分离任何生物体的任何活检组织来获得细胞样品，包括但不限于皮肤、骨骼、毛发、大脑、肝脏、心脏、肾脏、脾脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肺和食道。

微孔加载

本文描述的方法、***和组合物涉及使用微孔，例如微孔阵列中的微孔。本文所用的术语“微孔”是指体积小于1mL的孔。微孔阵列可以含有许多按行和列排列的微孔。微孔的大小和间距可能因不同的应用而异。微孔可以含有相同类型或不同类型的一个或两个颗粒或多个颗粒。

包括多个微孔阵列的微孔阵列可以由本领域技术人员将理解的任何合适的材料形成。例如，包括多个微孔的微孔阵列可以由选自如下的材料形成：硅、玻璃、陶瓷、弹性体如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、热固性聚酯、热塑性聚合物如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、特氟龙、聚氨酯(PU)、纸、水凝胶、复合材料如环烯烃共聚物、或其组合。

在一些实施方案中，微孔阵列可以包括与多个微孔流体连通的入口。微孔阵列还可以包括与多个微孔流体连通的出口。可以将样品、游离试剂和/或封装在微胶囊中的试剂引入微孔。所述试剂可包括限制性内切酶、连接酶、聚合酶、荧光团、寡核苷酸条形码、寡核苷酸探针、衔接头、缓冲液、dNTP、ddNTP以及执行本文所述方法所需的其它试剂。样品和试剂可以通过流动通道从入口灌注以输送到微孔阵列，并且废物可以从出口推出并除去。

在一些实施方案中，微孔阵列可以在开放孔条件下操作。微孔阵列顶部没有封闭的流动通道。可以通过直接在微孔阵列表面添加和去除来自由交换试剂。可以将样品、游离试剂和/或封装在微胶囊中的试剂引入微孔。所述试剂可包括限制性内切酶、连接酶、聚合酶、荧光团、寡核苷酸条形码、寡核苷酸探针、衔接头、缓冲液、dNTP、ddNTP以及执行本文所述方法所需的其它试剂。

微孔的尺寸可以使得它至多可以容纳一个微珠(和一个细胞)，而不是两个微珠。在不同的实施方案中微孔的大小或尺寸(例如，长度、宽度、深度、半径或直径)可以不同。在一些实施方案中，多个微孔中的一个、一个或多个或各个微孔的大小或尺寸为、约为、至少为、至少约为、至多为、至多约为：2微米(μm)、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm、160μm、170μm、180μm、190μm、200μm、210μm、220μm、230μm、240μm、250μm、260μm、270μm、280μm、290μm、300μm，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如多个微孔中的一个、一个或多个或各个微孔的大小或尺寸为约5μm至约100μm。在一些实施方案中，多个微孔各自具有约10μm至约100μm的直径(宽度)。在一些实施方案中，多个微孔的微孔具有约10μm至约100μm的平均或中值直径(宽度)。

在不同的实施方案中多个微孔中的一个、一个或多个或各个微孔的体积可以不同。多个微孔中的一个、一个或多个或各个微孔的体积可以为、约为、至少为、至少约为、至多为、或至多约为：5μm³、6μm³、7μm³、8μm³、9μm³、10μm³、20μm³、30μm³、40μm³、50μm³、60μm³、70μm³、80μm³、90μm³、100μm³、200μm³、300μm³、400μm³、500μm³、600μm³、700μm³、800μm³、900μm³、1000μm³、10000μm³、100000μm³、1000000μm³，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，多个微孔中的一个、一个或多个或各个微孔的体积为约5μm³至约1000000μm³。

微孔阵列中的微孔的数量可以变化。在一些实施方案中，微孔的数量为、约为、至少为、至少约为、至多为、或至多约为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000，或者这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，微孔的数量可以为至少1000个微孔。在一些实施方案中，多个微孔包括约1,000个微孔至约500,000个微孔。

包括单个细胞和单个条形码微载体的多个微孔的百分比可以变化。在一些实施方案中，包括单个细胞和单个条形码微载体的多个微孔的百分比为、约为、至少为、至少约为、至多为、或至多约为：5％、8％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，多个微孔中至少50％的微孔可以包括多个固定细胞的单个细胞和多个条形码微载体的单个条形码微载体。在一些实施方案中，至少5％、至少10％、至少15％、至少25％、至少50％或至少75％的多个微孔各自都加载有多个固定细胞中的一个和多个条形码微载体中的一个。在一些实施方案中，至少80％的多个微孔中各自加载有多个固定细胞中的一个和多个条形码微载体中的一个。在一些实施方案中，多个微孔中的至少90％各自被加载有多个固定细胞中的一个和多个条形码微载体中的一个。

不包括多个固定细胞中的细胞、或包括多个固定细胞中的两个或更多个细胞的多个微孔的百分比可以变化。在一些实施方案中，不包括多个固定细胞中的细胞、或包括多个固定细胞中的两个或更多个细胞的多个微孔的百分比为、约为、至少为、至少约为、至多为、或至多约为：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％，34％、35％、36％、37％、38％，39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、60％、70％、80％、90％、95％，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，多个微孔中至多10％的微孔可以包括多个固定细胞中的两个或更多个细胞。作为另一示例，多个微孔中至多95％的微孔可以不包括多个固定细胞中的细胞。

不包括条形码微载体的多个微孔、或包括多个条形码微载体中的两个或更多个条形码微载体的多个微孔的百分比可以变化。在一些实施方案中，不包括条形码微载体的多个微孔、或包括多个条形码微载体中的两个或更多个条形码微载体的多个微孔的百分比为、约为、至少为、至少约为、至多为、或至多约为：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％，31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，多个微孔中至多10％的微孔可以包括多个条形码微载体中的两个或更多个条形码微载体。例如，多个微孔中至多10％的微孔可以不包括多个条形码微载体中的条形码微载体。

加载到多个微孔中的条形码微载体的总数可以变化。在一些实施方案中，加载到多个微孔中的条形码微载体的数量为、约为、至少为、至少约为、至多为、或至多约为：100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000、500000、600000、700000、800000、900000、1000000、2000000、3000000、4000000、5000000、6000000、7000000、8000000、9000000、10000000、20000000、30000000、40000000、50000000，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，加载到多个微孔中的条形码微载体的数量可以为至少80,000个条形码微载体。

在一些实施方案中，将条形码微载体加载到微孔中使得各自加载有一个条形码微载体的微孔的百分比为、约为、至少为、至少约为、至多为、或至多约为：5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％，76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。例如，至少80％的多个微孔可以各自加载有一个条形码微载体。在一些实施方案中，至少90％的多个微孔可以各自加载有一个条形码微载体。

方法和***

本文提供了用于固定生物样品的高通量单细胞mRNA分析方法和***。在一些实施方案中，该方法包括将透化的固定细胞(例如，在溶液中，例如磷酸盐缓冲盐水，即“PBS”)、条形码微载体和用于mRNA逆转录的逆转录混合物(mixer)加载到微孔阵列中。

在一些实施方案中，该方法包括使用具有微孔阵列的微流体装置的高通量单细胞mRNA分析方法，其中将单个细胞与条形码微载体一起分离，所述条形码微载体包括微珠和通过可切割接头附着到所述微珠的多个分子条形码。分子条形码，也称为“独特的寡核苷酸序列”可以从珠粒中释放并允许扩散到细胞中以捕获细胞的mRNA或对细胞的mRNA进行条形码编码。可以进行逆转录反应以将条形码mRNA转换为条形码cDNA。细胞可以被裂解或消化以释放可以测序的条形码cDNA。

如图6A和6B所示，可以通过两个核苷酸序列段(sequence segment)来鉴定mRNA序列和由此产生的cDNA：细胞条形码(图中缩写为CB1或CB2)和UMI。细胞条形码对微孔中存在的细胞或珠粒具有特异性。图6A所示的微珠1具有细胞条形码“CB1”，而图6B所示的微珠2具有细胞条形码“CB2”。各条形码微载体包括多个接头和多个分子条形码。对于给定的条形码微载体，多个可切割寡核苷酸序列各自中的细胞条形码是相同的，如标号“CB1”和“CB2”所示，而多个分子条形码各自的UMI是不同的。以这种方式，与一个独特的寡核苷酸序列结合的同一单细胞中的各mRNA序列均用独特的UMI进行鉴定。可以理解，各微载体中使用的UMI序列集可以是相同的，也可以是不同的。

条形码微载体可以是微珠，例如聚合物珠粒。认为条形码微载体已经进行了条形码编码，因为它们具有多个分子条形码或寡核苷酸，其中各寡核苷酸包括连接到微载体的表面的独特的核苷酸序列。如图4所示，具有独特的核苷酸序列的寡核苷酸具有至少四段：用于捕获mRNA的具有多个寡核苷酸(dT)(polyT)的序列段；用于标记微载体的序列段，也称为细胞条形码，其中标记序列段对于相同的微载体是相同的，而对于不同的微载体是不同的；用于特异性地鉴定不同的捕获mRNA的序列段，也称为UMI；以及例如用于PCR扩增的PCRhandle序列段。一旦从微载体上切割，polyT序列段就会暴露以捕获细胞RNA的polyA尾。在条形码微载体上的微珠和分子条形码的各种组分的非限制性顺序包括：

(1)珠粒、接头、PCR handle、细胞条形码、UMI和poly T；

(2)珠粒、接头、PCR handle、UMI、细胞条形码和poly T；

(3)珠粒、接头、Poly-T、UMI、细胞条形码和PCR handle；

(4)珠粒、接头、Poly-T、细胞条形码、UMI和PCR handle。

寡核苷酸或分子条形码与微载体的连接可以是可切割的。可切割接头可以是可切割的化学部分，或者是具有独特的序列的可切割核苷酸序列，其可以被限制性内切酶识别。可切割接头可以通过任何适当的方法或处理进行切割，包括但不限于化学法、酶法、光(包括紫外、可见光和近红外波长)、机械和热的方式。在一些实施方案中，条形码微载体珠粒的直径为约10μm至约70μm。

在一些实施方案中，本公开的微孔阵列包括约1,000个微孔至约500,000个微孔。微孔可以是圆形、方形、矩形、三角形或蜂窝状。本文包括其它微孔形状、腔室和通道。在一些实施方案中，微孔阵列包括直径(宽度)为约10μm至约100μm的微孔。

在一些实施方案中，本文提供的方法和***是高通量的，例如可以同时处理相同或不同细胞类型的、约100个细胞至约50,000个细胞。在一些实施方案中，将约10,000至约20,000个细胞加载到微孔阵列上。

本文提供的方法可用于研究不同的细胞类型并且不限于特定的细胞类型。

在一些实施方案中，微孔阵列加载有细胞以实现约5％至约15％的孔占用率。这种加载水平有助于最大限度地减少具有两个或更多细胞的微孔数量。换句话说，这种加载水平有助于确保这些微孔仅含单个细胞。

在一些实施方案中，大于约80％的阵列微孔包括单个条形码微载体。在一些实施方案中，大于约90％的阵列微孔包括单个条形码微载体。条形码微载体的这些加载水平有助于确保大多数微孔含有条形码微载体。

因此，将约5％至约15％的细胞加载与大于约80％或大于约90％的条形码微载体加载相结合，有助于确保大多数微孔中含有单个细胞也含有单个条形码微载体。

如图2A、2B和2C所示，对于MX-CDB的scRNA-seq方法和***，将材料加载到微孔中。首先，将细胞悬液加载到微孔阵列中以将细胞分离成如图2A所示的单个细胞。接着，将条形码微珠加载到微孔阵列中以实现具有微珠的微孔的微孔占用率>80％、或者可选地>90％，如图2B所示。然后用覆盖物密封微孔阵列，该覆盖物可以包括油层、玻璃层或聚合物层，以提供在微孔内既含有分离的单细胞也含有一个微珠的一些微孔，如图2C所示。

在一些实施方案中，本公开的方法任选地包括用覆盖物密封微孔阵列，以产生密封的微孔阵列，该微孔阵列包括透化的固定细胞、条形码微载体和逆转录混合物。覆盖物可以是物理结构，包括但不限于包括薄膜、膜、载玻片或其组合或是薄膜、膜、载玻片或其组合的物理结构。物理结构的非限制性实例包括单层或双层的PDMS薄膜或载玻片(带或不带手动夹具)。物理结构可以是可渗透的、半渗透的或不可渗透的。在一些实施方案中，物理结构为纳米孔膜。在一些实施方案中，微孔或微孔阵列没有用纳米多孔膜密封。覆盖物可以是流体屏障。例如，覆盖物可以是油，用于分离和密封细胞、微载体和反应溶液的水性混合物。如果选择的油密度高于细胞样品的水相，以便它可以推开所有水溶液并密封微孔，则可以使用油。但由于微孔的表面张力和微观尺寸，油不能流入微孔。在一些实施方案中，油是氟化烃油。

图3A、3B和3C示出了本文公开的方法和***的一些步骤。一旦将单个细胞和一个微珠密封在单独的微孔中(图3A，另见图2C)，则从微珠上切割条形码并使其扩散到固定的透性化细胞中，以与细胞的mRNA结合。接下来进行细胞内逆转录以产生条形码cDNA(FIB.3B)。然后将细胞裂解或消化以释放条形码cDNA，用于进行进一步测序(图3C)。

在一些实施方案中，切割步骤包括将密封的微孔阵列与细胞、微载体和反应溶液的混合物暴露在紫外光下以光切割寡核苷酸与微珠的连接(例如，用波长为300nm至350nm的近紫外光照射，适当地照射约5分钟或更长时间)，即光解。在另一个实施方案中，切割步骤包括使用酶来消化寡核苷酸与微载体的连接(例如，用限制性内切酶消化在寡核苷酸与微载体的连接中的特异性序列)。

在切割步骤之后，微流体装置可以孵育一段时间(例如，约30分钟至90分钟)以允许释放的寡核苷酸扩散到透性化的固定细胞中从而与细胞mRNA结合。例如，从微载体释放的寡核苷酸的polyT序列将与细胞mRNA的polyA尾结合。在一些实施方案中，升高的温度可用于促进扩散和结合(例如，从约40℃至50℃)。

在一些实施方案中，所述方法还包括使用逆转录过程将寡核苷酸捕获的mRNA逆转录成cDNA中。

在一些实施方案中，该方法还包括用细胞裂解或消化缓冲液裂解或消化固定细胞以释放在逆转录过程中产生的cDNA。裂解或消化缓冲液可包括去垢剂、盐或酶，或其混合物。

在一些实施方案中，该方法还包括收集从微流体装置产生的cDNA(如从微流体装置收集液体，其中所述液体含有通过逆转录产生的cDNA)。

在一些实施方案中，收集的cDNA通过聚合酶链式反应(PCR)扩增并在文库制备用于测序之前纯化。然后使用本领域已知的任何适当的测序方法对制备的cDNA片段进行测序。

在一些实施方案中，单细胞mRNA定量用于确定单细胞中RNA核苷酸的绝对丰度。另一方面，可以量化多个细胞中RNA核苷酸的相对丰度。这些量可用于RNA分析或转录组学，以用于在任何合适的细胞样品中进行转录组分析的目的。

在以下各节中进一步描述本文公开的方法和***的一个或多个步骤。

细胞固定和透化

本文公开了用于固定多个细胞以产生多个固定细胞的方法。本文中使用的术语“固定(fix或fixation)”是指保存生物材料如组织、细胞、细胞器和分子免于腐烂和/或降解的过程。固定可以使用本领域已知的任何常规方案来完成。在一些实施方案中，固定可以是使用固定试剂(例如，含有至少一种固定剂的试剂)的化学固定。

本文公开的方法可以包括将多个细胞与固定剂接触。细胞可以与固定试剂接触合适的时间段，该时间段可能因如温度、样品性质和固定剂的选择而变化。例如，细胞样品可以与固定试剂接触的时间约为、至少为、至少约为、至多为、至多约为：24小时、18小时、12小时、8小时、6小时、4小时、2小时、60分钟、45分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟或2分钟、或这些值中任意两个值之间的数值或范围。

细胞可以在不同的温度下接触固定试剂，这取决于所使用的方案和试剂。例如，在一些实施方案中，细胞样品可以在-22℃至55℃的温度范围内接触固定试剂，其中感兴趣的特定范围包括但不限于：50℃至54℃、40℃至44℃、35℃至39℃、28℃至32℃、20℃至26℃、0℃至6℃和-18℃至-22℃。在一些实施方案中，细胞样品可以在-20℃、4℃、室温(例如22℃至25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃的温度下接触固定试剂。

固定试剂的非限制性实例包括交联固定剂、沉淀固定剂、氧化固定剂、Hepes-谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护作用(HOPE)固定剂或其组合。固定试剂可以含有一种以上的固定剂。可以使用通过共价键化学接合两个或多个分子的交联固定剂和本领域已知的大范围的交联试剂。合适的交联固定剂的实例包括但不限于醛类(例如，甲醛，通常也称为“***”；多聚甲醛，甲醛的聚合形式；和戊二醛)、酰亚胺酯、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)酯等。合适的沉淀固定剂的实例包括但不限于醇类(例如，甲醇、乙醇等)、丙酮、乙酸等。在一些实施方案中，固定剂是甲醛(即多聚甲醛或***)。固定试剂中甲醛的合适最终浓度为0.1％至10％，如1％至8％、1％至4％、1％至2％、3％至5％或3.5％至4.5％。在一些实施方案中，包括多个细胞的细胞样品被固定在终浓度为4％的多聚甲醛中。在一些实施方案中，细胞样品与含有甲醛、多聚甲醛、戊二醛或其组合的固定试剂接触。在一些实施方案中，细胞与甘油、乙酸、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和甲醇接触，例如细胞首先与甘油、乙酸和NAC接触，然后进行甲醇处理。

本文包括的方法可进一步包括透化细胞。细胞的固定和细胞透化可以在一步中或在不同的各个步骤中进行。在一些实施方案中，多个固定细胞包括透性化细胞。本文所用的术语“透化”是指使细胞(例如细胞膜)可渗透诸如化学底物、酶、寡核苷酸之类的试剂，从而试剂(例如分子条形码)能够通过细胞的脂质双层膜的过程。术语“可渗透的”可以是表示特定试剂相对于其他试剂的渗透性(例如，特定尺寸)的相对术语。因此，在一些实施方案中，透性化细胞对于某些试剂可渗透，但对于其他试剂不可渗透。在一些实施方案中，核酸分子(例如分子条形码)的透性化细胞的渗透性高于一种或多种类型的大分子(例如蛋白质)。

透性化细胞可以通过例如使细胞与能够渗透或戳入(porating)细胞膜的化学试剂接触来产生。例如，化学试剂可以包括去垢剂。本文所用的术语“去垢剂”是指两亲性(部分亲水性/极性和部分疏水性/非极性)表面活性剂或两亲性表面活性剂的混合物。去垢剂可根据其极性部分的电荷大致分类为“阴离子”(带负电荷；实例包括但不限于烷基苯磺酸盐和胆汁酸，例如脱氧胆酸)、“阳离子”(带正电荷；实例包括但不限于季铵盐和吡啶鎓基去垢剂)、“非离子”(无电荷；实例包括但不限于聚氧乙烯/PEG基去垢剂，例如Tween和Triton，和基于糖苷的去垢剂，如HEGA和MEGA)和“两性离子”(由于去垢剂分子上的正电荷和负电荷数量相等，因此不带电荷；实例包括但不限于CHAPS和酰胺基磺基甜菜碱型去垢剂)。在一些实施方案中，用于透化细胞的适当的去垢剂包括十二烷基硫酸钠(SDS)、洋地黄皂苷、Leucoperm、Saponin、Tween 20、Triton X-100和本领域技术人员可确认的另外的去垢剂。可以以本领域技术人员所理解的浓度范围提供去垢剂。例如，可将0.001％至1％的去垢剂、0.05％至0.5％的去垢剂或0.1％至0.3％的去垢剂用于透化(例如，0.1％Saponin、0.2％Tween 20、0.1-0.5％Triton X-100)。在一些实施方案中，能够透化细胞的化学试剂可以包括一种或多种有机固定剂(如丙酮、甲醇、乙醇)和/或酶。

在一些实施方案中，相同的试剂可用作固定试剂和透化试剂。例如，在一些实施方案中，固定试剂可以是有机溶剂，例如甲醇和丙酮。有机溶剂可以同时透化和固定细胞，因为有机溶剂溶解细胞膜中的脂质，使细胞具有渗透性，并且还可以凝固蛋白质使细胞固定。因此，固定多个细胞可以产生多个固定细胞，还包括透性化细胞。

在一些实施方案中，为了透化细胞，包括多个细胞的细胞样品可以在宽范围的时间内接触透化试剂，这可以取决于温度、样品的性质以及透化试剂的选择。例如，细胞样品可以与透化试剂接触的时间约为、至少为、至少约为、至多为、至多约为：24小时、18小时、12小时、8小时、6小时、4小时、2小时、60分钟、45分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟或2分钟，或这些值中任意两个值之间的数值或范围。细胞样品可以在不同温度下与透化试剂接触，具体取决于使用的方案和试剂。例如，在一些实施方案中，细胞样品可以与透化试剂在-82℃至55℃的温度范围内接触，包括但不限于：50℃至54℃、40℃至44℃、35℃至39℃、28℃至32℃、20℃至26℃、0℃至6℃、-18℃至-22℃和-78℃至-82℃。在一些实施方案中，细胞样品可以与透化试剂在-80℃、-20℃、4℃、室温(例如22℃至25℃)、30℃、37℃、42℃或52℃的温度下接触。

加载细胞和条形码微载体

在一些实施方案中，该方法包括将多个固定细胞加载到多个微孔中。该方法还包括将多个条形码微载体加载到多个微孔中。例如，可以通过泵送、抽取、灌注或“流动”不同的液体试剂从入口通过微流体装置的流动通道来完成条形码微载体和/或固定细胞的加载。加载条形码微载体可以与固定细胞的加载按顺序(例如之前或之后)或同时进行。在开放孔形式中，可以通过将细胞和/或条形码微载体直接添加到微阵列表面来完成固定细胞和/或条形码微载体的加载。

在一些实施方案中，可以使用分区来执行加载多个固定细胞和/或多个条形码微载体。本文中使用的术语“分区”是指将颗粒(例如，细胞或条形码微载体)引入可用于将一个颗粒与另一个颗粒隔离或分离的容器(例如，微孔)中。这种容器是用名词“分区”来指代的。

可以使用本领域技术人员已知的各种方法进行分区，例如，使用微流体、孔、微孔、多孔板、多孔阵列等。例如，可以通过使用微孔阵列中的流动通道在多个分区(例如微孔)上稀释和分配细胞和/或条形码微载体。例如，细胞和/或条形码微载体可以被稀释并直接分配到开放孔形式微孔阵列的多个分区(例如微孔)上。

在一些实施方案中，将多个固定细胞加载到多个分区(例如微孔)中包括将多个固定细胞分区到多个微孔中，使得多个微孔的一个微孔至多包括一个细胞(例如，没有细胞或单个细胞)。在一些实施方案中，将多个条形码微载体加载到多个分区(例如微孔)中包括将多个条形码微载体分区至多个微孔，使得多个微孔的一个微孔至多包括一个条形码微载体(例如，没有条形码微载体或单个条形码微载体)。在一些实施方案中，可以通过混合多个固定细胞和多个条形码微载体以形成混合物，然后将混合物分区至多个微孔，从而共分区多个固定细胞和多个条形码微载体。

在一些实施方案中，可以通过在微孔阵列中使用流体流来实现多个固定细胞和/或多个条形码微载体的分区。例如，分区可以包括将一个或多个包括多个固定细胞和/或多个条形码微载体的溶液(按顺序或同时地在混合物中)通过微孔阵列的入口流入多个微孔中。

密封微孔

在一些实施方案中，该方法包括密封多个微孔以产生包括加载的细胞和条形码微载体的密封微孔阵列。例如，在一些实施方案中，微孔阵列可以用覆盖物密封，以提供具有在微孔中分离的单个细胞和一个条形码微载体的微孔。覆盖物可以是物理结构，包括但不限于包括薄膜、膜、载玻片或其组合或是薄膜、膜、载玻片或其组合的物理结构。物理结构的非限制性实例包括单层或双层的PDMS薄膜或载玻片(带或不带手动夹具)。物理结构可以是可渗透的、半渗透的或不可渗透的。在一些实施方案中，物理结构为纳米孔膜。在一些实施方案中，微孔或微孔阵列没有用纳米多孔膜密封。覆盖物可以是流体屏障。例如，覆盖物可以是油，用于分离和密封细胞、微载体和反应溶液的水性混合物。如果选择的油密度高于细胞样品的水相，以便它可以推开所有水溶液并密封微孔，则可以使用油。但由于微孔的表面张力和微观尺寸，油不能流入微孔。在一些实施方案中，油是氟化烃油。在一些实施方案中，用于密封微孔的覆盖物可以是与微孔中的样品流体(例如水)基本不混溶的液体或气体，从而提供表面化学控制并防止溶液在通道内的蒸发和微孔之间的交叉污染。

在一些实施方案中，覆盖物包括氟化流体。在一些实施方案中，覆盖物包括非氟化流体(例如，矿物油)。例如，可用作覆盖物的物质包括但不限于碳氟化合物、全氟化碳、烷基和芳基碳氟化合物、卤代碳氟化合物、氟化醇、氟化油、液体含氟聚合物包括全氟聚醚、全氟辛基溴、全氟辛烷、十八氟十氢萘、1-(1,2,2,3,3,4,4,5,5,6,6-十一碳-氟环己基)乙醇、C₆F₁₁C₂H₄OH、Flourinert(3M)、Krytox油、Fomblin油、Demnum油、矿物油和烷烃。在一些实施方案中，油包括氟化烃油。如本领域技术人员将理解的，在一些实施方案中，可以将另外的物质(例如表面活性剂)添加到覆盖物中以控制覆盖液的表面张力和润湿性能。

可以通过使覆盖液流过微孔阵列的入口来完成微孔的密封。从微珠中释放分子条形码并对核酸靶标进行条形码编码后，可以去除密封，以便可以汇集细胞的内容物。在一些实施方案中，可以通过从入口灌注缓冲液(例如盐水缓冲液)以通过微孔阵列的流动通道将覆盖液从出口推出，从而去除密封。

在一些实施方案中，可以通过对微流体装置的顶层加压和变形以产生微孔与顶层的物理密封从而完成微孔的密封。例如，微流体装置的PDMS顶层可以通过由但不限于机械力、静水压力、气动力产生的压力而被压下。

释放分子条形码

该方法可以包括从密封微孔中的微珠中释放分子条形码。释放的分子条形码可以通过渗透性或多孔脂质双层膜扩散到固定细胞中，并与固定细胞的核酸靶标杂交以启动条形码编码过程，例如无需裂解或消化细胞。在一些实施方案中，在微孔密封后释放分子条形码，以防止微孔之间的交叉污染。

在一些实施方案中，从微珠中释放分子条形码包括破坏微珠。例如，微珠可以是凝胶珠，并且当凝胶珠被破坏(例如溶解)时，与凝胶珠相关联的分子条形码可以释放并扩散到固定细胞中。在一些实施方案中，从微珠中释放分子条形码包括切割将分子条形码与微珠连接的可释放接头。可切割接头可以在不同的条件设定下切割、消化或降解，以释放分子条形码。根据可切割接头的结构和性质，可以通过例如将条形码微载体暴露于酶、合适的温度、合适的pH、光、化学试剂、超声处理、剪切应力或其任何组合来释放分子条形码。在使用化学接头的一些实施方案中，切割接头可以包括将条形码微载体与能够在适当时间段的条件下化学切割化学接头的化学试剂接触。在使用核苷酸或多核苷酸接头的一些实施方案中，切割接头可包括使条形码微载体与能够在适当时间内条件下酶切核苷酸或多核苷酸接头的限制性内切酶进行接触。

在使用光切割接头的一些实施方案中，切割接头包括将微孔暴露于电磁辐射(例如，紫外光、可见光和近红外波长)达合适的暴露时间段。确切的波长或波长范围和曝光时间段取决于具体的可光切割接头和所使用的电磁辐射类型。例如，分子条形码的释放可以在约10nm至400nm的波长范围内发生。在一些实施方案中，分子条形码的释放发生在约380nm至780nm的波长范围内。在一些实施方案中，分子条形码的释放可以在约780nm至1000nm的波长范围内发生。曝光时间段可以约为、至少为、至少约为、至多为、至多约为：2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、2小时，或者这些值中任意两个值之间的数值或范围。

在分子条形码被释放之后，微流体装置可以在一定温度下孵育一段适当的时间(例如，30分钟至90分钟)，以使释放的分子条形码扩散到透化的固定细胞中并与细胞核酸杂交。例如，从微载体释放的寡核苷酸的polyT序列将与细胞mRNA的polyA尾结合。孵育温度可以是室温(例如，22℃至25℃)。在一些实施方案中，可以提高孵育温度以促进扩散和结合。例如，孵育温度可以提高到约30℃至50℃，任选地提高到40℃至50℃。

条形码寡核苷酸延伸

在一些实施方案中，该方法包括对与细胞相关的核酸(例如mRNA靶标)进行条形码编码。对与细胞相关的核酸进行条形码编码可以包括使用核酸靶标作为模板延伸附着在条形码微载体上并与核酸靶标(例如mRNA靶标)杂交的分子条形码，从而产生单链条形码核酸。例如，条形码核酸可以通过使用逆转录酶的逆转录产生。例如，条形码的核酸可以通过使用DNA聚合酶产生。与细胞相关的核酸的条形码编码可以包括从单链条形码核酸中产生双链条形码核酸。

延伸单链条形码核酸可以包括使用模板转换寡核苷酸来延伸单链条形码核酸。例如，逆转录酶可用于通过延伸与RNA杂交的分子条形码来产生cDNA。将分子条形码延伸至RNA的5'端后，逆转录酶可以将一个或多个具有胞嘧啶(Cs)碱基的核苷酸(例如，两个或三个)添加到cDNA的3'端。模板转换寡核苷酸(TSO)可以包括一个或多个在TSO的3'端具有鸟嘌呤(G)碱基的核苷酸(例如，两个或三个)。具有鸟嘌呤碱基的核苷酸可以是核糖核苷酸。TSO的3'端的鸟嘌呤碱基可以与cDNA的3'端的胞嘧啶碱基杂交。逆转录酶可以使用TSO作为模板进一步延伸cDNA，以产生在其3'-端具有TSO序列的cDNA。同样，条形码核酸可以在其3'端包括TSO序列。

在一些实施方案中，对与分子条形码杂交的mRNA进行逆转录以产生条形码cDNA而不裂解或消化细胞。从微珠释放的分子条形码可以穿过透性化细胞的可渗透或多孔脂质双层膜(例如，细胞膜或核被膜)，并与细胞内的RNA退火以启动条形码编码过程。

在一些实施方案中，该方法可以包括在产生条形码核酸之后以及在汇集来自多个微孔的条形码核酸以释放细胞内容物之前裂解或消化固定细胞。裂解或消化固定细胞可以包括使一种或多种裂解剂与细胞接触。裂解剂的实例包括生物活性试剂，例如裂解酶，或基于表面活性剂的裂解溶液，包括非离子表面活性剂如TritonX-100和Tween 20，以及离子表面活性剂，例如十二烷基硫酸钠(SDS)。裂解方法包括但不限于热、声学、电或机械细胞破坏。消化剂包括蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬酰胺肽裂解酶。

汇集条形码核酸

在一些实施方案中，该方法包括在对核酸靶标进行条形码编码之后和在分析条形码核酸或其产物之前，从多个微孔中汇集条形码核酸。在一些实施方案中，在产生双链条形码核酸之后进行条形码核酸的汇集。汇集的条形码核酸可以是单链或双链。在一些实施方案中，该方法包括在延伸杂交至与细胞相关联的核酸靶标的分子条形码以产生单链条形码核酸之后，汇集条形码核酸。双链条形码核酸可以由单链条形码核酸批量产生。在一些实施方案中，该方法可以包括在产生双链条形码核酸之后汇集条形码核酸。双链条形码核酸可以由分区中的单链条形码核酸产生。

在一些实施方案中，不汇集在分区中的微珠(例如，不从分区中移除)。在一些实施方案中，从微孔中与条形码核酸一起汇集微珠。汇集的条形码核酸(例如，条形码cDNA)可以在测序文库构建之前进行纯化和/或扩增。可以选择具有所需长度的汇集的条形码核酸。

条形码核酸扩增

该方法可包括扩增条形码核酸(例如，条形码cDNA)以产生扩增的条形码核酸。扩增条形码核酸可以包括使用聚合酶链式反应(PCR)扩增条形码核酸以产生扩增的条形码核酸。例如，分子条形码可以包括第一聚合酶链式反应(PCR)引物结合序列。第一PCR引物结合序列和TSO序列可用于扩增条形码核酸，例如条形码cDNA。包括第一PCR引物结合序列的序列的第一引物和包括TSO序列的第二引物可用于扩增条形码核酸，例如条形码cDNA。

测序文库构建

可在测序之前对条形码核酸(例如，条形码cDNA或其产物)进行进一步处理以产生经过处理的条形码核酸。例如，该方法可以包括条形码核酸的片段化、片段化条形码核酸的末端修复、已被末端修复以促进连接到衔接头的片段化条形码核酸的加A尾、以及将连接(例如，通过连接和/或PCR)附着至测序引物序列(例如，Read 1序列和Read 2序列)，样品索引(例如，对给定样品文库具有特异性的短序列)和/或流细胞结合序列(例如，P5和/或P7)。还可以进行另外的PCR扩增。这个过程也可以称为测序文库构建。

在一些实施方案中，该方法包括片段化(例如，通过酶促片段化、机械力、化学处理)条形码核酸或其产物以产生片段化的条形码核酸。片段化可以通过任何合适的过程进行，例如物理片段化、酶片段化或两者的组合。例如，条形码核酸可以使用声学、雾化、离心力、流体动力学进行物理剪切。在一些实施方案中，使用诸如限制性内切酶(例如限制性核酸内切酶)的酶进行条形码核酸的片段化。

片段化可以产生所需大小的片段，以用于后续测序。片段化核酸的所需大小由下一代测序仪器的局限性和本领域技术人员所理解的特定测序应用决定。例如，当使用Illumina技术时，片段化的核酸可以具有约50个碱基至约1,500个碱基的长度。在一些实施方案中，片段化的条形码核酸具有约100bp至1,000bp的长度。在一些实施方案中，片段化的条形码核酸具有约400bp至700bp的长度。

片段化的条形码核酸可以进行末端修复和加A尾(加入一个或多个腺嘌呤碱基)以形成A突出端(overhang)。该A突出端允许含有一个或多个胸腺嘧啶突出碱基的衔接头与片段化的条形码核酸进行碱基配对。

片段化的条形码核酸可以通过添加另外的序列(例如，衔接头)来进一步处理，以用于基于特定测序平台的测序。衔接头可以通过使用连接酶和/或PCR的连接而附着到片段化的条形码核酸上。例如，片段化的条形码核酸可以通过添加测序引物序列来处理。测序引物序列可以包括Read 1序列和Read 2序列。在例如末端修复和加A尾之后，可以使用连接酶将包含引物序列的双链衔接头连接至片段化的条形码核酸。衔接头可以包括可以与通过加A尾添加的一个或多个A碱基杂交的一个或多个胸腺嘧啶(T)碱基。

所述衔接头可以包括用于通过特定测序仪器进行片段识别的平台特异性序列。例如，衔接头可以包括用于将片段化的条形码核酸附着到Illumina平台的流动孔的序列，例如P5序列、P7序列或其部分。不同的衔接头序列可用于本领域技术人员所理解的不同下一代测序仪器。

在一些实施方案中，对条形码核酸或其产物进行测序，包括对条形码核酸的产物进行测序。条形码核酸的产物可以包括由测序文库构建过程的任何步骤产生的经过处理的核酸，例如扩增的条形码核酸、片段化的条形码核酸、包括另外的序列(诸如本文描述的测序引物序列和/或衔接头序列)的片段化的条形码核酸。

分析

该方法可以包括分析条形码核酸(例如条形码cDNA)或其产物。在一些实施方案中，本文公开的方法和***可以允许对约100个细胞至约50,000个细胞的条形码核酸进行高通量单细胞分析。

在一些实施方案中，分析条形码核酸或其产物包括对条形码核酸或其产物进行测序以获得序列信息。如本文所用，“序列”可以指序列、其互补序列(例如，反向、互补或反向互补)、全长序列、子序列或其组合。条形码核酸的核酸序列可以各自包括分子条形码的序列(例如，细胞条形码和UMI)和与细胞相关联的核酸靶标的序列或其反向互补序列。

可以使用本领域技术人员可确认的任何合适的测序方法进行条形码核酸的测序。例如，条形码核酸的测序可以使用高通量测序、焦磷酸测序、合成测序、单分子测序、纳米孔测序、连接测序、杂交测序、下一代测序、大规模并行测序、引物步移以及本领域已知的和适合于使用本文描述的方法产生的条形码核酸测序的任何其他测序方法进行。

所获得的核酸序列可以进行本领域技术人员所理解的任何下游测序后数据分析。序列数据可以经过质量控制过程，以去除衔接头序列、低质量读长、不需要的碱基和/或过滤掉污染物。从质量控制中获得的高质量数据可以被映射或比对到参考基因组或从头组装。

在一些实施方案中，分析条形码核酸(cDNA)或其产物包括使用具有与测序信息中的每个mRNA靶标相关联的不同序列的多个UMI来确定与细胞相关的核酸靶标的一个或多个核酸靶标中各自的谱(例如表达谱)。谱可以是转录组谱。表达谱可以包括绝对丰度或相对丰度。表达谱可以包括mRNA表达谱。谱可以是一个细胞的谱。谱可以是两个不同种类型细胞的谱。

在一些实施方案中，分析条形码核酸包括使用与测序信息中的各个mRNA靶标相关联的具有不同序列的多个UMI来确定一个或多个mRNA靶标中各自的扩增的条形码cDNA的数量。

在一些实施方案中，分析测序信息可以包括确定与具有不同序列的UMI相关联的核酸靶标或其部分的序列。例如，分析测序信息可以包括确定一个或多个突变的存在(例如***、删除或置换)和各突变的丰度(例如，频率或频次)。例如，突变可以与癌症有关。例如，分析测序信息可以包括确定病毒的一个或多个变体各自的存在以及各变体的丰度(例如，频率或频次)。例如，变体可以影响病毒的传播性或影响病毒引起的疾病的严重程度。例如，分析测序信息可以包括确定细胞中目的基因的序列(例如，TCRα和TCRβ)。

***和试剂盒

本文的公开还包括用于单细胞分析(single-cell profiling)或单细胞分析(single cell analysis)的组合物、***和试剂盒。在一些实施方案中，用于单细胞分析的组合物包括本公开的多个条形码微载体。在一些实施方案中，用于单细胞分析的试剂盒包括含有本公开的多个条形码微载体的组合物。试剂盒可以包括使用组合物进行单细胞测序或单细胞分析的说明书。

本文的公开包括用于执行本文公开的高通量单细胞mRNA分析方法的***。在一些实施方案中，该***包括含有多个微孔的微孔阵列、多个条形码微载体、用于密封微孔阵列的装置、用于切割可释放接头以从微珠释放分子条形码的装置、以及用于产生条形码cDNA的装置。在一些实施方案中，该***还可以包括用于裂解或消化细胞以释放条形码cDNA的装置。在一些实施方案中，该***可以包括用于收集条形码cDNA的装置。在一些实施方案中，该***可以包括用于对条形码cDNA或扩增的条形码cDNA进行测序的装置。

实施例

在以下实施例中进一步详细公开了上面讨论的实施方案的一些方面，其不意欲以任何方式限制本公开的范围。

实施例1

MX-CDB scRNA-seq工作流程

本发明的MX-CDB scRNA-seq方法利用以微孔阵列为平台的微流体装置来分离单细胞和条形码微载体。微孔阵列由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。微孔的尺寸由条形码微载体的大小和细胞的大小决定。使用由直径约35μm的聚合物微珠制成的条形码微载体。本文中使用的微孔阵列的直径约为45μm，深度约为45μm，以保证在一个微孔中只有一个珠粒与分离的细胞接触。尺寸的选择也有助于在逆转录过程后从液体溶液中的消化细胞中收集释放的cDNA。

在本研究中，具有35,000个微孔的微孔阵列用于在单次运行中对约1,000个至3,000个细胞进行测序，其中该阵列以约5％至约10％的孔占用率加载以减少一个微孔中的细胞双联或多联。

微流体装置的制造

PDMS微流体装置由硅橡胶薄膜组装而成，该硅橡胶薄膜具有夹在PDMS微孔阵列基板和可紫外线穿透的玻璃载玻片顶部之间的限定的流动通道。PDMS微孔阵列基板通过软光刻从硅模具复制，该硅模的顶部有柱阵列。在PDMS微孔阵列基板的顶部放置具有限定流动通道的图案化硅橡胶薄膜的薄层(厚度约500μm)。将具有两个通孔作为入口和出口的可紫外线穿透的载玻片放置在硅橡胶薄膜的顶部。入口和出口与流动通道的两端相匹配。然后液体可以从入口通过流动通道灌入出口。在这种情况下，可以将样品和试剂输送到微孔阵列中，并且可以将废液从微流体装置中推出并被移除。

微流体装置预充

在使用前进行微流体装置的预充(priming)，以增加表面亲水性并避免气泡截留在微流体装置中。乙醇(100％)用于冲洗表面并去除微孔中截留的气泡。然后将预充液灌注到流动通道中，以在室温下处理微孔阵列约30分钟。预充后，将磷酸盐缓冲盐水(PBS)灌入微流体流动通道以除去预充液。

细胞的制备

在37℃、5％CO₂的条件下，在具有10％胎牛血清(FBS)和青霉素及链霉素(PS)的DMEM中培养NIH/3T3小鼠成纤维细胞和K562人白血病细胞。从细胞培养瓶中收集细胞，以500g离心3分钟以形成细胞团。将细胞团重悬于含有RNase抑制剂的1mL PBS中。将细胞悬液通过40μm细胞筛网以去除细胞簇。然后在血细胞计数器下计数细胞，稀释至1x10⁵细胞/mL。对于混合细胞实验，以1:1的比例混合3T3细胞和K562细胞。

细胞固定

从细胞培养瓶中收集细胞并以500g离心约3分钟以形成细胞团。将细胞团重悬于含有RNase抑制剂的1mL的4％对甲醛溶液中。静置约10分钟进行细胞固定。固定后，将0.5％的Trition X-100加入细胞溶液中以透性化细胞，允许静置约10分钟以透化。将细胞以500g离心约3分钟，并用RNase抑制剂重悬于PBS中。将细胞悬液通过40μm细胞筛网以去除细胞簇。在血细胞计数器下计数细胞，将样品稀释至约1x10⁵细胞/mL的浓度。

加载细胞

将100μL细胞悬液移液到微流体装置的入口以填充流动通道。从微流体装置的入口和出口均移除多余的液体，以使流动通道内的流动停止。重力作用使悬浮液中的细胞逐渐沉淀(沉降)到微孔中。约2分钟后，用PBS冲洗流动通道，以除去未沉淀(沉降)到微孔中的多余细胞(图7A)。

加载珠粒

用移液管将条形码微珠(也称为条形码微载体，浓度约为在50μL PBS溶液中80,000微珠)缓慢加载到微流体装置中，以覆盖流动通道的一半。接下来，将100μL PBS缓慢加载到微流体装置中，从而用条形码微珠完全覆盖整个流动通道。重要的是要确保约>80％、或甚至>90％的微孔阵列含有至少一个微珠。用PBS洗掉多余的珠粒(图7B)。

切割寡核苷酸

加载珠粒后，使用逆转录(RT)缓冲液、从Thermo Fisher Scientific获得的Maxima H minus kit冲洗流动通道一次，然后将带有模板转换引物的RT混合物添加到流动通道中。接下来，将100μL Fluorinert^TM油(一种氟化烃油)添加到微流体装置中以密封微孔。入口和出口处多余的液体被移除，以使流动通道内的流动停止。

将微流体装置暴露于300nm至350nm近紫外光下约5cm的距离约15分钟，以切割寡核苷酸与微珠之间的连接。然后将微流体装置在室温下静置约1小时，以进行寡核苷酸扩散和mRNA捕获。

逆转录和模板转换

在mRNA捕获后，将微流体装置在42℃下孵育约90分钟以允许原位逆转录并向cDNA中加入模板转换引物。为了防止溶液在通道内蒸发，将整个装置保持在密封的湿室内。

逆转录反应完成后，将盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液与RNase抑制剂灌入流动通道中以除去密封油和多余的反应溶液。

细胞消化

在加载细胞消化缓冲液之前，将含有Trition X-100和RNase抑制剂的PBS灌注通过装置。接下来，将100μl的细胞消化缓冲液(含有蛋白酶的磷酸盐缓冲液)加入流动通道中，以在55℃下消化固定细胞约2小时从而释放cDNA。从微流体装置中收集含有释放的cDNA的所得裂解物。

纯化和PCR扩增

从微流体装置收集的裂解物具有悬浮的cDNA。用磁珠纯化收集的细胞裂解物中的cDNA，以将裂解物中悬浮的cDNA捕获到磁珠上。磁珠选择性地捕获具有所需序列长度(即，～1000bp)的cDNA。然后将具有选定cDNA的磁珠与PCR溶液混合，并进行PCR以扩增捕获的cDNA。

纯化和生物分析仪分析

PCR之后，用磁珠再次纯化具有扩增cDNA的产物以选择长度为～1000bp的所需序列。然后使用荧光计测量纯化溶液中的cDNA浓度，并使用Agilent Bioanalyzer 2100表征纯化溶液的质量。

在一种情况下，PCR产物的cDNA浓度约为16ng/μL。PCR产物的纯化cDNA溶液的质量如图8所示。

文库构建和测序

然后输入纯化溶液中的cDNA用于标准的Nextera标记和扩增反应，以构建用于测序的文库。使用定制引物代替i5索引引物和i7索引引物，从而仅扩增含有细胞条形码和UMI的那些片段。然后使用磁珠再次纯化文库产物。用荧光计测量文库的cDNA浓度，并用Labchip GXII Touch HT机器表征文库的质量(图9)。这些文库在NovaSeq 6000测序仪上测序。

测序数据分析

通过使用DropSeq工具进行包括条形码/UMI鉴定在内的转录组比对。简而言之，Read 2测序数据包括PCR引物、细胞条形码和UMI序列，而Read 1测序数据含有捕获的mRNA的转录物信息。用PCR引物序列过滤序列数据以去除不正确的序列。然后，将过滤后的读长与相应物种(小鼠；人；人-小鼠混合物)的参比转录组进行比对以提取基因表达矩阵。

通过使用Seurat进行进一步的数据分析。通过选择具有以下特征的细胞来确定细胞数：(1)UMI数大于500；(2)基因数在500和8000之间；且(3)读长大于10000。在该实验中，估计的细胞数量约为1200，中位数基因约为600，并且中位数UMI约为600。UMI计数与细胞条形码数的关系如图10所示。所确定细胞的基因数、UMI数和线粒体百分比分布的小提琴图如图11所示。

实施例2

细胞的制备

在37℃、5％CO₂的条件下，在具有10％胎牛血清(FBS)和青霉素及链霉素(PS)的DMEM中培养NIH/3T3小鼠成纤维细胞和U-87人胶质母细胞瘤细胞。对于混合细胞实验，3T3细胞和U-87细胞以1:1的比例混合。

细胞固定

在细胞培养烧瓶中用胰蛋白酶解离细胞。一旦细胞开始解离，将固定混合物(甘油、乙酸和75％NAC)加载到细胞培养烧瓶中。将细胞在室温下固定20分钟，然后加入甲醇并在4℃下孵育20分钟以进行透化。然后将收集的细胞以1000g离心5分钟从而形成细胞团。将细胞团重悬于具有RNase抑制剂的PBS中。将细胞悬液通过40μm细胞筛网以去除细胞簇。在血细胞计数器下计数细胞，将样品稀释至约1x10⁵细胞/mL的浓度。

加载细胞

将100μL细胞悬液移液至微流体装置的入口以填充流动通道。从微流体装置的入口和出口中均除去多余的液体，以使流动通道内的流动停止。重力作用使悬浮液中的细胞逐渐沉淀(沉降)到微孔中。约2分钟后，用PBS冲洗流动通道，以去除未沉淀(沉降)到微孔中的多余细胞。

加载珠粒

用移液管将条形码微珠(也称为条形码微载体，浓度约为在50μL PBS溶液中80,000微珠)缓慢加载到微流体装置中，以覆盖流动通道的一半。接下来，将100μL PBS缓慢加载到微流体装置中，从而用条形码微珠完全覆盖整个流动通道。有利的是确保约>80％、或甚至>90％的微孔阵列含有至少一个微珠。用PBS洗掉多余的珠粒。

切割寡核苷酸

加载珠粒后，使用逆转录(RT)缓冲液、从Thermo Fisher Scientific获得的Maxima H minus kit冲洗流动通道一次，然后将RT混合物添加到流动通道中。接下来，将100μL Fluorinert^TM油(一种氟化烃油)添加到微流体装置中以密封微孔。入口和出口处多余的液体均被移除，以使流动通道内的流动停止。

将微流体装置暴露于300nm至350nm近紫外光下约5cm的距离约15分钟，以切割寡核苷酸与微珠之间的连接。然后将微流体装置在室温下静置约1小时，以允许寡核苷酸扩散和mRNA捕获。

逆转录和模板转换

在捕获mRNA之后，将微流体装置在42℃下孵育约90分钟以允许原位逆转录。为了防止溶液在通道内蒸发，将整个装置保持在密封的湿室内。

逆转录反应完成后，将盐水-柠檬酸钠(SSC)缓冲液与RNase抑制剂灌注到流动通道中，以除去密封油和多余的反应溶液。

细胞消化

在加载细胞消化缓冲液之前，将含有Trition X-100和RNase抑制剂的PBS灌注通过装置。接下来，将100μl细胞消化缓冲液(含有蛋白酶的磷酸盐缓冲液)添加到流动通道中，以在55℃下消化固定细胞约2小时从而释放cDNA。从微流体装置中收集含有释放的cDNA的所得裂解物。

纯化、模板转换和PCR扩增

从微流体装置收集的裂解物具有悬浮的cDNA。用磁珠纯化收集的细胞裂解物中的cDNA，以将裂解物中的悬浮的cDNA捕获到磁珠中。磁珠选择性捕获具有所需序列长度(即，～1000bp)的cDNA。然后将具有选定cDNA的磁珠与模板转换混合物混合，并在室温下孵育30分钟，然后在42℃下混合90分钟。模板转换后，将磁珠转移到PCR溶液中，从而对捕获的cDNA进行PCR扩增。

纯化和生物分析仪分析

PCR之后，再次用磁珠纯化具有扩增的cDNA的产物，以选择长度为～1000bp的所需序列。然后使用荧光计测量纯化溶液中的cDNA浓度，并使用Agilent Bioanalyzer 2100表征纯化溶液的质量。

在一种情况下，PCR产物的cDNA浓度为约69ng/μL。PCR产物的纯化cDNA溶液的质量如图12所示。

文库构建和测序

然后输入纯化溶液中的cDNA用于标准的Nextera标记和扩增反应，以构建用于测序的文库。使用定制引物代替i5索引引物和i7索引引物，从而仅扩增含有细胞条形码和UMI的那些片段。然后使用磁珠再次纯化文库产物。用荧光计测量文库的cDNA浓度，并用Agilent Bioanalyzer 2100表征文库的质量(图13)。这些文库在NovaSeq 6000测序仪上测序。

测序数据分析

通过使用DropSeq工具进行包括条形码/UMI鉴定在内的转录组比对。简而言之，Read 2测序数据包括PCR引物、细胞条形码和UMI序列，而Read 1测序数据含有捕获的mRNA的转录物信息。用PCR引物序列过滤序列数据以去除不正确的序列。然后，将过滤后的读长与相应物种(小鼠；人；人-小鼠混合物)的参比转录组进行比对以提取基因表达矩阵。

通过使用Seurat进行进一步的数据分析。通过选择具有以下特征的细胞来确定细胞数：(1)UMI数大于1000；(2)基因数在500和8000之间；且(3)读长大于10000。在该实验中，估计的细胞数量约为2200，中位数基因约为700，并且中位数UMI约为1400。UMI计数与细胞条形码数的关系如图14所示。所确定细胞的基因数、UMI数和线粒体百分比分布的小提琴图如图15所示。

术语

在至少一些先前描述的实施方案中，在一个实施方案中使用的一个或多个要素可以互换地用于另一个实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员可以理解，可以在不脱离要求保护的主题范围的情况下对上述方法和结构进行各种其它省略、添加和修改。所有这些修改和更改都旨在落入所附权利要求所定义的主题范围内。

关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用，本领域技术人员可以根据上下文和/或应用将复数翻译为单数和/或将单数翻译为复数。为清楚起见，本文会明确设定各种单数/复数排列。除非上下文另有明确规定，否则如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式的“一个”、“一种”、和“所述”包括复数引用。除非另有说明，否则本文对“或”的任何引用均旨在包括“和/或”。

本领域人员将理解，一般而言，本文中使用的术语，特别是在所附权利要求书中(例如，所附权利要求的正文)通常旨在作为“开放”术语(例如，“包括(include)”一词应解释为“包括但不限于”，“具有”一词应当解释为“至少具有”，“包括(including)”一词应该解释为“包括但不限于”等)。本领域人员将进一步理解，如果意欲引入特定数量的权利要求陈述，则这种意图将在权利要求中明确陈述，并且在没有这种陈述的情况下，不存在这种意图。例如，为了帮助理解，以下所附权利要求可能含有使用前置性短语“至少一个”和“一个或一个以上”来引入权利要求的陈述。但是，此类短语的使用不应被解释为暗示了通过不定冠词“一个”或“一种”引入的权利要求陈述将包含此类引入的权利要求陈述的任何特定权利要求限制为仅包含一个此类陈述的实施方案，即使同一权利要求包括前置性短语“一个或一个以上”或“至少一个”和不定冠词如“一个”或“一种”(例如“一个”和/或“一种”应解释为表示“至少一个”或“一个或一个以上”)；使用定冠词来介绍权利要求陈述时也是如此。此外，即使明确提到了引入的权利要求陈述的特定数量，本领域技术人员将认识到，这种陈述应被解释为是指陈述的数量至少为该数量(例如，没有其他修饰语而仅提到“两次陈述”，是指至少两次陈述，或两次或两次以上的陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的约定的情况下，一般而言，这种结构的意图是本领域技术人员能够理解该约定(例如，“具有A、B和C中的至少一个的***”将包括但不限于仅具有A的***、仅具有B的***、仅具有C的***、A和B一起的***、A和C一起的***、B和C一起的***、和/或A和B和C一起的***，等等)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的约定的情况下，通常这种结构意欲指在本领域技术人员能够理解的约定意义(例如，“具有A、B和C中的至少一个的***”将包括但不限于仅具有A的***、仅具有B的***、仅具有C的***、A和B一起的***、A和C一起的***、B和C一起的***、和/或A和B和C一起的***，等等)。本领域人员将进一步理解，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，呈现两个或多个替代术语的实质上任何转折词和/或短语都应被理解为考虑包括术语中的一个、术语中任一个或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，在本公开的特征或方面是根据马库什组描述的情况下，本领域技术人员将认识到，本公开也因此是根据马库什组的任何单个成员或成员的亚组描述的。

正如本领域技术人员将理解的那样，对于任何和所有目的，例如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以很容易地被理解为充分描述，并且能够将相同的范围分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实施例，本文讨论的各范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。正如本领域技术人员也将理解的那样，所有语言如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所列举的数值并指代其随后可分解为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员理解的，范围包括各单独的要件。因此，例如，具有1至3个条目的组是指具有1、2或3个条目的组。同样，具有1至5个条目的组是指具有1、2、3、4或5个条目的组，依此类推。

虽然本文已经公开了各个方面和实施方案，但其它方面和实施方案对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文公开的各个方面和实施方案仅用于说明而非限制目的，以下权利要求表明了真正的范围和精神。

Claims (44)

1.一种单细胞RNA分析方法，包括：

将多个固定细胞加载到多个微孔中；

将多个条形码微载体加载到所述多个微孔中，其中至少5％的所述多个微孔中各自加载有所述多个固定细胞中的一个和所述多个条形码微载体中的一个，并且其中所述多个条形码微载体各自包括：

微珠，

多个分子条形码，所述多个分子条形码各自包括相同的细胞条形码、多个分子条形码中不同的独特的分子标签(UMI)、PCR handle和能够杂交到所述多个固定细胞的信使核糖核酸(mRNA)靶标的poly-A尾的poly-T序列，以及

多个可释放接头，所述多个可释放接头各自与所述微珠相关联并与所述多个分子条形码中的一个连接；

从所述微孔中的所述微珠释放所述分子条形码，从而将所述分子条形码扩散到所述固定细胞中，并使所述分子条形码与所述固定细胞的mRNA靶标杂交；

对与所述分子条形码杂交的mRNA进行逆转录，以产生条形码互补脱氧核糖核酸(cDNA)；

汇集来自所述多个微孔的条形码cDNA；以及

分析所述条形码cDNA或其产物。

2.根据权利要求1所述的方法，还包括密封多个微孔。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中分析所述条形码cDNA或其产物包括对所述条形码cDNA或其产物进行测序以获得序列信息。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，包括扩增所述条形码cDNA和对扩增的条形码cDNA或其产物进行测序，以获得序列信息。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中分析所述条形码cDNA或其产物包括：使用具有与所述测序信息中的各个mRNA靶标相关联的不同序列的多个UMI来确定各个mRNA靶标的表达谱。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述表达谱包括mRNA靶标的绝对丰度、mRNA靶标的相对丰度或两者。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中分析所述条形码cDNA包括：使用具有与所述测序信息中的各个mRNA靶标相关联的不同序列的多个UMI来确定各个mRNA靶标的多个扩增的条形码cDNA。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中至少10％、至少15％、至少25％、至少50％或至少75％的所述多个微孔各自加载有所述多个固定细胞中的一个和所述多个条形码微载体中的一个。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中至少80％的所述多个微孔中各自加载有所述多个固定细胞中的一个和所述多个条形码微载体中的一个。

10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中至少90％的所述多个微孔中各自加载有所述多个固定细胞中的一个和所述多个条形码微载体中的一个。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，还包括使用化学固定产生所述多个固定细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述化学固定包括：使用一种或多种交联固定剂、一种或多种沉淀固定剂、一种或多种氧化剂、一种或多种Hepes谷氨酸缓冲液介导的有机溶剂保护效应(HOPE)固定剂或其组合进行固定。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述化学固定包括使用甲醛、多聚甲醛、戊二醛、甲醇、甘油或其组合进行固定。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述多个固定细胞包括透性化细胞。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述微珠为聚合微珠。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述微珠为凝胶微珠。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述凝胶微珠在施加刺激时可降解，任选地，其中所述刺激包括热刺激、化学刺激、生物刺激、光刺激、机械刺激或其组合。

18.根据权利要求16至17中任一项所述的方法，其中从所述微珠中释放所述分子条形码包括破坏所述凝胶微珠以释放所述分子条形码。

19.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述微珠为磁性微珠。

20.根据权利要求1至19任一项所述的方法，其中所述多个固定细胞包括真核细胞、原核细胞、感染病毒的细胞或其组合。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中多个可释放接头各自与所述微珠可释放地关联、与所述多个分子条形码中的一个可释放地连接，或两者兼有。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中从所述微珠中释放分子条形码包括切割所述可释放接头。

23.根据权利要求22所述的方法，其中切割所述可释放接头包括通过紫外光、化学切割、酶切或其组合切割可释放接头。

24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述分子条形码的5'端与所述可释放接头连接。

25.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述分子条形码的3'端与所述可释放接头连接。

26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述分子条形码从5'端到3'端包括PCR handle、细胞条形码、UMI和poly-T序列。

27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述分子条形码从5'端到3'端包括PCR handle、UMI、细胞条形码和poly-T序列。

28.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述PCR handle和所述poly-T序列位于所述分子条形码的相对两端。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述poly-T序列位于所述分子条形码的3'端。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中在不裂解或消化细胞的情况下对与所述分子条形码杂交的mRNA进行逆转录以产生条形码cDNA。

31.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，还包括在产生所述条形码cDNA之后并且在汇集来自所述多个微孔的所述条形码cDNA之前裂解或消化所述固定细胞。

32.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中密封所述多个微孔包括用物理结构密封所述多个微孔。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述物理结构包括薄膜、膜、载玻片或其组合。

34.根据权利要求2至31中任一项所述的方法，其中密封所述多个微孔包括用油密封所述多个微孔。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述油包括氟化烃油。

36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述多个微珠各自具有约10μm至约70μm的直径。

37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述多个微孔各自具有约10μm至约100μm的直径(宽度)。

38.根据权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述多个微孔包括约1,000个微孔至约500,000个微孔。

39.根据权利要求1至38中任一项所述的方法，其中分析约100个细胞至约50,000个细胞的条形码cDNA。

40.一种用于执行根据权利要求1至39中任一项所述的高通量单细胞mRNA分析方法的***。

41.根据权利要求40所述的***，包括：

a)包括多个微孔的微孔阵列；

b)多个条形码微载体，

c)用于密封所述微孔阵列的装置；

d)用于切割所述可释放接头以从所述微珠释放所述分子条形码的装置；以及

e)用于产生条形码cDNA的装置。

42.根据权利要求41所述的***，还包括f)用于裂解或消化细胞以释放所述条形码cDNA的装置。

43.根据权利要求42所述的***，还包括g)用于收集所述条形码cDNA的装置。

44.根据权利要求42至43中任一项所述的***，还包括h)用于对所述条形码cDNA或扩增的条形码cDNA进行测序的装置。

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