CN116348150A - 用于递送治疗剂的脂质缀合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开包含PK/PD调节剂的根据式(I)的化合物，其用于在体内将基于寡核苷酸的药剂(例如双链RNAi剂)递送至某些细胞类型(例如骨骼肌细胞)。本文公开的PK/PD调节剂，当缀合于基于寡核苷酸的治疗或诊断剂(比如RNAi剂)时，可增强所述组合物到所靶向的指定细胞的递送，以促进抑制这些细胞中的基因表达。

Description

用于递送治疗剂的脂质缀合物
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求2020年9月11日递交的美国临时申请第63/077,290号、2021年6月24日递交的美国临时申请第63/214,745号和2021年8月6日递交的美国临时申请第63/230,257号的权益。这些文件的每一项特此通过参考以其全部结合。
技术领域
本公开涉及脂质缀合物(本文也称为脂质PK/PD调节剂)，其用于在体内将基于寡核苷酸的药剂(例如双链RNAi剂)递送至某些细胞类型(例如骨骼肌细胞)，以抑制在这些细胞中表达的基因。
背景技术
基于寡核苷酸的药剂，比如反义剂和双链RNA干扰(RNAi)剂，已经显示出巨大前景，并有潜力彻底变革医学领域和患者有效治疗性治疗选择的可用性。然而，基于寡核苷酸的药剂，并且特别是双链治疗性RNAi剂的有效递送，长期以来一直是开发可行治疗药物的挑战。当试图实现基于寡核苷酸的药剂向肝外细胞(即非肝细胞)的特异性和选择性递送时，情况尤其如此。
尽管在过去几年中已经使用例如胆甾醇缀合物(其为非特异性的并且具有分布到各种不期望的组织和器官的已知缺点)和脂质-纳米颗粒(LNP)(其经常被报道具有毒性问题)进行了各种尝试以将基于寡核苷酸的药剂引导至某些肝外细胞类型，包括骨骼肌细胞、脂肪细胞、心肌细胞等，但迄今为止没有一种实现了合适的递送。因此，仍然需要一种递送媒介物以将基于寡核苷酸的药剂，并且特别是RNAi剂，引导至非肝细胞的细胞类型。
发明内容
本文公开了包含与基于寡核苷酸的药剂缀合(或连接)的脂质PK/PD调节剂的化合物。本文还公开了脂质PK/PD调节剂前体。
本发明的一个方面提供一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000021
其中R为-LA-RZ；LA为连接RZ与Z的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；Z为CH、苯基或N；L1和L2各自独立地为包含至少约5个聚乙二醇(PEG)单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L1和L2各自独立地包含约15-约100个PEG单元。在一些实施方案中，L1和L2各自独立地包含约20-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L1和L2各自独立地包含约20-约30个PEG单元。在其他实施方案中，L1和L2各自独立地包含约40-约60个PEG单元。并且，在一些实施方案中，L1和L2中的一个包含约20-约30个PEG单元和另一个包含约40-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自表1中显示的部分。
在一些实施方案中，LA选自表4中显示的部分。
在一些实施方案中，X和Y中至少一个为不饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为分支脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为包含约10-约25个碳原子的脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为胆甾醇基。在一些实施方案中，X和Y中至少一个选自表3中显示的部分。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表3中显示的部分。
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
本发明的另一方面提供一种式(Ia)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000031
其中R、L1、L2、X和Y中的每一个如式(I)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
在一些实施方案中，L1和L2独立地选自
Figure BDA0004172056550000032
Figure BDA0004172056550000033
其中每个p独立地为20、21、22、23、24或25；每个q独立地为20、21、22、23、24或25；和每个/>
Figure BDA0004172056550000034
表示与式(Ia)的X、Y或CH的连接点。
在一些实施方案中，LA为
Figure BDA0004172056550000035
和每个/>
Figure BDA0004172056550000036
表示与RZ或式(Ia)的CH的连接点。
在一些实施方案中，X和Y中的每一个为
Figure BDA0004172056550000037
和/>
Figure BDA0004172056550000038
表示与L1或L2的连接点。
本发明的另一方面提供一种式(Ib)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000039
其中R、L1、L2、X和Y中的每一个如式(I)或(Ia)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Ib1)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000041
其中R、L1、L2、X和Y如式(I)、(Ia)或(Ib)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000042
其中R、L1、L2、X和Y如式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ib1)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Id)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000043
其中RZ、Z、L1、L2、X和Y如式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(II)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000051
其中R、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的任何实施方案所定义；L12为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L1；L22为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L2；和R1、R2和R3各自独立地为氢或C1-6烷基。
在一些实施方案中，R为LA2-RZ；LA2为连接RZ与-C(O)-的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；R1、R2和R3各自独立地为氢或C1-6烷基；L12和L22各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L12和L22各自独立地包含约15-约100个PEG单元。在一些实施方案中，L12和L22各自独立地包含约20-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L12和L22各自独立地包含约20-约30个PEG单元。在其他实施方案中，L12和L22各自独立地包含约40-约60个PEG单元。并且，在一些实施方案中，L12和L22中的一个包含约20-约30个PEG单元和另一个包含约40-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L12和L22中的每一个独立地选自表5中显示的部分。
在一些实施方案中，X和Y中至少一个为不饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为分支脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为包含约10-约25个碳原子的脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为胆甾醇基。在一些实施方案中，X和Y中至少一个选自表6中显示的部分。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表6中显示的部分。
在一些实施方案中，LA2选自表7中显示的部分。
在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个为氢。
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
本发明的另一方面提供一种式(III)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000061
其中R、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(II)化合物的任何实施方案所定义；L13为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L1，或L13为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L12；L23为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L2，或L23为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L22；W1为-C(O)NR1-或-OCH2CH2NR1C(O)-，其中R1为氢或C1-6烷基；和W2为-C(O)NR2-或-OCH2CH2NR2C(O)-，其中R2为氢或C1-6烷基。
在一些实施方案中，R为LA3-RZ；LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；W1为-C(O)NR1-或-OCH2CH2NR1C(O)-，其中R1为氢或C1-6烷基；W2为-C(O)NR2-或-OCH2CH2NR2C(O)-，其中R2为氢或C1-6烷基；L13和L23各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L13和L23各自独立地包含约15-约100个PEG单元。在一些实施方案中，L13和L23各自独立地包含约20-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L13和L23各自独立地包含约20-约30个PEG单元。在其他实施方案中，L13和L23各自独立地包含约40-约60个PEG单元。并且，在一些实施方案中，L13和L23中的一个包含约20-约30个PEG单元和另一个包含约40-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L13和L23中的每一个独立地选自表8中显示的部分。
在一些实施方案中，X和Y中至少一个为不饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为分支脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为包含约10-约25个碳原子的脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为胆甾醇基。在一些实施方案中，X和Y中至少一个选自表9中显示的部分。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表9中显示的部分。
在一些实施方案中，LA3选自表10中显示的部分。
在一些实施方案中，R1和R2中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。在一些实施方案中，R1和R2中的每一个为氢。
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
本发明的另一方面提供一种式(IIIa)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000071
其中R、X和Y中的每一个如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(II)或(III)化合物的任何实施方案所定义；L13为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L1，L13为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L12，或L13如在式(III)化合物的任何实施方案所定义；L23为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L2，L23为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L22，或L13如在式(III)化合物的任何实施方案所定义；并且R1和R2中的每一个如在式(II)或(III)化合物的任何实施方案中所定义。
在一些实施方案中，R为LA3-RZ；LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；R1和R2各自独立地为氢或C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基、正丁基或正戊基)；L13和L23各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L13和L23中的每一个选自如表8所示的接头1-3和接头2-3。
在一些实施方案中，X和Y中的至少一个选自如表9所示的脂质3和脂质19。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自如表9所示的脂质3和脂质19。
在一些实施方案中，LA3选自如表10所示的栓系1-3、栓系2-3和栓系5-3。
在一些实施方案中，R1和R2中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。在一些实施方案中，R1和R2中的每一个为氢。
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
本发明的另一方面提供一种式(IIIb)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000081
其中R、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(II)、(III)或(IIIa)化合物的任何实施方案所定义；L13为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L1，L13为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L12，或L13如在式(III)或(IIIa)化合物的任何实施方案所定义；L23为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L2，L23为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L22，或L23如在式(III)或(IIIa)化合物的任何实施方案所定义；并且R1和R2中的每一个如在式(II)、(III)或(IIIa)化合物的任何实施方案中所定义。
在一些实施方案中，R为LA3-RZ；LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；R1和R2各自独立地选自氢或C1-6烷基；L13和L23各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L13和L23中的每一个为如表8所示的接头3-3。
在一些实施方案中，X和Y中的每一个为如表9所示的脂质3。
在一些实施方案中，LA3选自如表10所示的栓系3-3和栓系4-3。
在一些实施方案中，R1和R2中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。在一些实施方案中，R1和R2中的每一个为氢。
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
本发明的另一方面提供一种式(IV)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000091
其中R、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(II)、(III)、(IIIa)或(IIIb)化合物的任何实施方案所定义；L14为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的任何实施方案定义的L1，L14为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L12，或L14为如在式(III)、(IIIa)或(IIIb)化合物的任何实施方案定义的L13；L24为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的任何实施方案定义的式L2，L24为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L22，或L24为如在式(III)、(IIIa)或(IIIb)化合物的任何实施方案定义的L23。
在一些实施方案中，R为LA4-RZ；LA4为连接RZ与-C(O)-的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；L14和L24各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L14和L24各自独立地包含约15-约100个PEG单元。在一些实施方案中，L14和L24各自独立地包含约20-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L14和L24各自独立地包含约20-约30个PEG单元。在其他实施方案中，L14和L24各自独立地包含约40-约60个PEG单元。并且，在一些实施方案中，L14和L24中的一个包含约20-约30个PEG单元和另一个包含约40-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L14和L24中的每一个独立地选自表11中显示的部分。
在一些实施方案中，X和Y中至少一个为不饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为分支脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为包含约10-约25个碳原子的脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为胆甾醇基。在一些实施方案中，X和Y中至少一个选自表12中显示的部分。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表12中显示的部分。
在一些实施方案中，LA4选自表13中显示的部分。
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
本发明的另一方面提供一种式(IVa)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000101
其中X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IV)化合物的任何实施方案所定义；L14和L24如式(IV)化合物的任何实施方案中所定义；和RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在一些实施方案中，RZ包含基于寡核苷酸的药剂；L14和L24中的每一个独立地选自
Figure BDA0004172056550000102
和/>
Figure BDA0004172056550000111
其中每个/>
Figure BDA0004172056550000112
表示与式(IVa)的X、Y或/>
Figure BDA0004172056550000113
的连接点，每个*表示与L14或L24的连接点，每个p独立地为20、21、22、23、24或25；每个q独立地为20、21、22、23、24或25，和每个r独立地为2、3、4、5或6；并且X和Y中的每一个独立地选自
Figure BDA0004172056550000114
Figure BDA0004172056550000115
Figure BDA0004172056550000116
其中/>
Figure BDA0004172056550000117
表示与L14或L24的连接点。
在本发明的另一方面，化合物选自表14中显示的化合物或其药学上可接受的盐。在本发明的另一方面，化合物选自表16中显示的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供一种式(V)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000118
其中Z、L1、L2、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的任何实施方案所定义。J为LA5-RX；LA5为连接RX与Z的键或二价部分；和RX为用于与基于寡核苷酸的药剂缀合的反应性部分。
在一些实施方案中，J为LA5-RX；LA5为连接RX与Z的键或二价部分；RX为用于与基于寡核苷酸的药剂缀合的反应性部分；Z为CH、苯基或N；L1和L2各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，RX选自
Figure BDA0004172056550000121
其中/>
Figure BDA0004172056550000122
表示与LA5的连接点。
在一些实施方案中，LA5选自表18中显示的部分。
在本发明的另一方面，化合物选自表20中显示的化合物或其药学上可接受的盐。
本文还公开了制备式(I)化合物的方法。本发明的一个方面提供一种用于制备式(I)化合物的方法，其中方法包括将包含第一反应性部分的基于寡核苷酸的药剂与包含脂质和第二反应性部分的化合物缀合以形成式(I)化合物。在一些实施中，第一反应性部分选自二硫化物和炔丙基。在一些实施中，第二反应性部分选自马来酰亚胺、砜、叠氮化物和炔烃。
本发明的另一方面提供一种包含式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)中任何一种的化合物或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐和药学上可接受的赋形剂的药用组合物。
本发明的另一方面提供一种体内减少靶基因表达的方法，方法包括向细胞中引入式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)中任何一种的化合物或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中化合物包含与靶基因至少基本上互补的RNAi剂。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文所述那些类似或等效的方法和材料，但以下描述合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全部结合。如果发生冲突，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性的而不旨在为限制性的。
本发明的其他目的、特征、方面和优点将从以下详细描述、附图和从权利要求中显而易见。
具体实施方式
脂质PK/PD调节剂
本文描述了包含与基于寡核苷酸的药剂缀合的PK/PD调节剂的化合物，以提供向体内细胞递送有效载荷，比如RNA干扰(RNAi)剂。在不受任何特定理论约束的情况下，据信本文所述的化合物可调节相应递送媒介物的药代动力学和或药效学特性，从而增加细胞中RNAi诱导的靶基因敲低。本文所述的化合物可促进递送至某些细胞类型，包括但不限于骨骼肌细胞和脂肪细胞。
本发明提供一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000131
其中R为LA-RZ；LA为连接RZ与Z的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂(例如RNAi剂)；Z为CH、苯基或N；L1和L2各自独立地为包含至少约5个聚乙二醇(PEG)单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
如本文使用的和本领域技术人员应当理解的，聚乙二醇(PEG)单元是指式-(CH2CH2O)-的重复单元。应当意识到，在本文公开的化学结构中，PEG单元可描绘为-(CH2CH2O)-、-(OCH2CH2)-或-(CH2OCH2)-。还将意识到，指示重复PEG单元的数量的数字可置于描绘PEG单元的括号的任一侧。
在一些实施方案中，L1和L2各自独立地包含约15-约100个PEG单元。在一些实施方案中，L1和L2各自独立地包含约20-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L1和L2各自独立地包含约20-约30个PEG单元。在一些实施方案中，L1和L2各自独立地包含约40-约60个PEG单元。在一些实施方案中，L1和L2中的一个包含约20-约30个PEG单元和另一个包含约40-约60个PEG单元。例如，L1和L2可各自独立地包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个PEG单元。在一些实施方案中，L1和L2中的每一个包含连接接头中的两个PEG单元的一个或多个另外的二价部分(例如-C(O)-、-N(H)-、-N(H)-C(O)-、-C(O)-N(H)-、-S(O)2-、-S-和不同于PEG的其他二价部分)。例如，L1和L2中的每一个包含结构
Figure BDA0004172056550000142
其中每个X’独立地为不同于PEG单元的二价部分，和每个PEG为PEG单元。
在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自表1中显示的部分。
表1：本发明的实例L1和L2部分。
Figure BDA0004172056550000141
/>
Figure BDA0004172056550000151
其中，每个p独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；每个q独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；每个r独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和每个
Figure BDA0004172056550000152
表示与X、Y或Z的连接点，条件是：
(i)在接头1、6和11中，p+q+r≥5；
(ii)在接头2、3、7、8、9和10中，p+q≥5；和
(iii)在接头4和5中p≥5。
在一些实施方案中，每个p独立地为20、21、22、23、24或25；每个q独立地为20、21、22、23、24或25；和每个r独立地为2、3、4、5或6。在一些实施方案中，每个p独立地为23或24。在一些实施方案中，每个q独立地为23或24。在一些实施方案中，每个r为4。
在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自表2中显示的部分。
表2：本发明的实例L1和L2部分。
Figure BDA0004172056550000161
/>
Figure BDA0004172056550000171
其中
Figure BDA0004172056550000172
表示与X、Y或Z的连接点。
在一些实施方案中，L1和L2为相同的。在一些实施方案中，L1和L2为不同的。
在一些实施方案中，X和Y中至少一个为不饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中每一个为不饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中每一个为饱和脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为分支脂质。在一些实施方案中，X和Y中每一个为分支脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为直链脂质。在一些实施方案中，X和Y中每一个为直链脂质。在一些实施方案中，X和Y中至少一个为胆甾醇基。在一些实施方案中，X和Y中每一个为胆甾醇基。在一些实施方案中，X和Y为相同的。在其他实施方案中，X和Y为不同的。
在一些实施方案中，X和Y中至少一个包含约10-约45个碳原子。在一些实施方案中，X和Y中至少一个包含约10-约40个碳原子。在一些实施方案中，X和Y中至少一个包含约10-约35个碳原子。在一些实施方案中，X和Y中至少一个包含约10-约30个碳原子。在一些实施方案中，X和Y中至少一个包含约10-约25个碳原子。在一些实施方案中，X和Y中至少一个包含约10-约20个碳原子。
在一些实施方案中，X和Y各自独立地包含约10-约45个碳原子。在一些实施方案中，X和Y各自独立地包含约10-约40个碳原子。在一些实施方案中，X和Y各自独立地包含约10-约35个碳原子。在一些实施方案中，X和Y各自独立地包含约10-约30个碳原子。在一些实施方案中，X和Y各自独立地包含约10-约25个碳原子。在一些实施方案中，X和Y各自独立地包含约10-约20个碳原子。例如，X和Y可各自独立地包含10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个碳原子。
在一些实施方案中，X和Y中的至少一个选自表3中显示的部分。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表3中显示的部分。
表3：本发明的实例X和Y部分。
Figure BDA0004172056550000181
/>
Figure BDA0004172056550000191
/>
Figure BDA0004172056550000201
其中
Figure BDA0004172056550000202
表示与L1或L2的连接点。
在一些实施方案中，LA包含至少一个PEG单元。在一些实施方案中，LA没有任何PEG单元。在一些实施方案中，LA包含-C(O)-、-C(O)N(H)-、-N(H)C(O)-、任选取代的烷氧基或任选取代的亚烷基杂环基。在一些实施方案中，LA为键。
在一些实施方案中，LA选自表4中显示的部分。
表4：本发明的实例LA部分。
Figure BDA0004172056550000203
/>
Figure BDA0004172056550000211
/>
Figure BDA0004172056550000221
其中，m、n、o和a中的每一个独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和每个
Figure BDA0004172056550000222
表示与Z或RZ的连接点。
在一些实施方案中，每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、21、22、23或25；每个n独立地为2、3、4或5；每个a独立地为2、3或4；和每个o独立地为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13。在一些实施方案中，每个m独立地为2、4、8或24。在一些实施方案中，每个n为3。在一些实施方案中，每个o独立地为4、8或12。在一些实施方案中，每个a为3。
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为如本文所述的RNAi剂。
本发明的另一方面提供一种式(Ia)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000223
其中R、L1、L2、X和Y中的每一个如式(I)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
在一些实施方案中，X和Y各自独立地选自如表3所示的脂质3、脂质4、脂质5、脂质6、脂质7、脂质10、脂质12和脂质19，其中每个
Figure BDA0004172056550000224
表示与L1或L2的连接点。
在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自如表1所示的接头2、接头3、接头4和接头5，其中每个
Figure BDA0004172056550000225
表示与式(Ia)的X、Y或CH的连接点。在一些实施方案中，每个p为23。在一些实施方案中，每个q为24。
在一些实施方案中，LA选自如表4所示的栓系2、栓系3和栓系4。在一些实施方案中，每个m独立地为2、4、8或24。在一些实施方案中，每个n为4。在一些实施方案中，每个o独立地为4、8或12。
在一些实施方案中，L1和L2独立地选自
Figure BDA0004172056550000231
Figure BDA0004172056550000232
其中每个p独立地为20、21、22、23、24或25；每个q独立地为20、21、22、23、24或25；和每个/>
Figure BDA0004172056550000233
表示与式(Ia)的X、Y或CH的连接点。在一些实施方案中，每个p为24。在一些实施方案中，每个q为24。/>
在一些实施方案中，LA为
Figure BDA0004172056550000234
和每个/>
Figure BDA0004172056550000235
表示与RZ或式(Ia)的CH的连接点。
在一些实施方案中，X和Y中的每一个为
Figure BDA0004172056550000236
其中/>
Figure BDA0004172056550000237
表示与L1或L2的连接点。
在一些实施方案中，式(Ia)化合物选自如表14所示的LP 210a和LP 217a或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个R为LA-RZ；LA为连接RZ与化合物其余部分的键或二价部分；并且RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在一些实施方案中，式(Ia)化合物选自如表16所示的LP 210b和LP 217b或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
本发明的另一方面提供一种式(Ib)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000241
其中R、L1、L2、X和Y中的每一个如式(I)或(Ia)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
在一些实施方案中，X和Y各自独立地选自如表3所示的脂质3和脂质19，其中每个
Figure BDA0004172056550000242
表示与L1或L2的连接点。在一些实施方案中，X和Y各自为脂质3。在一些实施方案中，X和Y中每一个各自为脂质19。
在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自如表1所示的接头3、接头5和接头9，其中每个
Figure BDA0004172056550000243
表示与式(Ib)的X、Y或苯环的连接点。在一些实施方案中，每个p为23或24。在一些实施方案中，每个q为24。
在一些实施方案中，LA选自如表4所示的栓系5、栓系6、栓系7、栓系8和栓系14，其中每个
Figure BDA0004172056550000244
表示与RZ或式(Ib)的苯环的连接点。在一些实施方案中，每个m为2或4。在一些实施方案中，每个a为3。
本发明的另一方面提供一种式(Ib1)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000251
其中R、L1、L2、X和Y如式(I)、(Ia)或(Ib)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000252
其中R、L1、L2、X和Y如式(I)、(Ia)、(Ib)或(Ib1)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
在一些实施方案中，X和Y各自独立地选自如表3所示的脂质1、脂质2、脂质3、脂质5、脂质8、脂质9、脂质11、脂质12、脂质14、脂质15、脂质16、脂质17、脂质18、脂质19、脂质20、脂质21、脂质22、脂质23和脂质24，其中每个
Figure BDA0004172056550000253
表示与L1和L2的连接点。在一些实施方案中，X和Y中的每一个为脂质1、脂质2、脂质3、脂质5、脂质8、脂质9、脂质11、脂质12、脂质14、脂质15、脂质16、脂质17、脂质18、脂质19、脂质20、脂质21、脂质22、脂质23或脂质24。
在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自如表1所示的接头1、接头6、接头10、接头11和接头12，其中每个
Figure BDA0004172056550000254
表示与式(Ic)的X、Y或N的连接点。在一些实施方案中，每个p独立地为23或24。在一些实施方案中，每个q独立地为23或24。在一些实施方案中，每个r为4。
在一些实施方案中，LA选自如表4所示的栓系1、栓系9、栓系10、栓系11、栓系12和栓系13，其中每个
Figure BDA0004172056550000261
表示与RZ或式(Ic)的N的连接点。
本发明的另一方面提供一种式(Id)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000262
/>
其中RZ、Z、L1、L2、X和Y如式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(II)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000263
其中R、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的任何实施方案所定义；L12为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L1；L22为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L2；和R1、R2和R3各自独立地为氢或C1-6烷基。
在一些实施方案中，R为LA2-RZ；LA2为连接RZ与-C(O)-的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；R1、R2和R3各自独立地为氢或C1-6烷基；L12和L22各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L12和L22中的每一个独立地选自表5中显示的部分。
表5：本发明的实例L12和L22部分。
Figure BDA0004172056550000271
其中，p和q各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和每个
Figure BDA0004172056550000272
表示与X、Y、-NR2-或-NR3-的连接点，条件是：
(i)在接头1-2中，p+q≥5；和
(ii)在接头2-2中，p≥5。
在一些实施方案中，每个p独立地为20、21、22、23、24或25。在一些实施方案中，每个q为20、21、22、23、24或25。在一些实施方案中，每个p独立地为23或24。在一些实施方案中，每个p为23。在一些实施方案中，每个q为24。
在一些实施方案中，L12和L22为相同的。在其他实施方案中，L12和L22为不同的。
在一些实施方案中，X和Y中的至少一个选自表3中显示的部分，其中每个
Figure BDA0004172056550000273
表示与L12或L22的连接点。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表3中显示的部分，其中每个/>
Figure BDA0004172056550000274
表示与L12或L22的连接点。
在一些实施方案中，X和Y中的至少一个选自表6中显示的部分。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表6中显示的部分。
表6：式(II)化合物的实例X和Y部分。
Figure BDA0004172056550000281
其中
Figure BDA0004172056550000282
表示与L12或L22的连接点。
在一些实施方案中，LA2包含至少一个PEG单元。在一些实施方案中，LA2没有任何PEG单元。在一些实施方案中，LA2包含-C(O)-、-C(O)NH-、任选取代的烷氧基或任选取代的亚烷基杂环基。在一些实施方案中，LA2为键。
在一些实施方案中，LA2选自表7中显示的部分。
表7：本发明的实例LA2部分。
Figure BDA0004172056550000283
/>
Figure BDA0004172056550000291
其中m、n和o中的每一个独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和每个
Figure BDA0004172056550000292
表示与RZ或-C(O)-的连接点。
在一些实施方案中，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、21、22、23或25。在一些实施方案中，m为2、4、8或24。在一些实施方案中，n为2、3、4或5。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，o为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13。在一些实施方案中，o为4、8或12。
在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个为氢。
在一些实施方案中，式(II)化合物选自如表14所示的LP 38a、LP 39a、LP 43a、LP44a、LP 45a、LP 47a、LP 53a、LP 54a、LP 55a、LP 57a、LP 58a、LP 59a、LP 62a、LP 101a、LP104a和LP 111a或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个R为LA2-RZ；LA2为连接RZ与-C(O)-的键或二价部分；并且RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在一些实施方案中，式(II)化合物选自如表16所示的LP 38b、LP 39b、LP 41b、LP42b、LP 43b、LP 44b、LP 45b、LP 47b、LP 53b、LP 54b、LP 55b、LP 57b、LP 58b、LP 59b、LP60b、LP 62b、LP 101b、LP 104b、LP 106b、LP 107b、LP 108b、LP 109b和LP 111b或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
本发明的另一方面提供一种式(III)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000301
其中R、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(II)化合物的任何实施方案所定义；L13为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L1，或L13为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L12；L23为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L2，或L23为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L22；W1为-C(O)NR1-或-OCH2CH2NR1C(O)-，其中R1为氢或C1-6烷基；和W2为-C(O)NR2-或-OCH2CH2NR2C(O)-，其中R2为氢或C1-6烷基。
在一些实施方案中，R为LA3-RZ；LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；W1为-C(O)NR1-或-OCH2CH2NR1C(O)-，其中R1为氢或C1-6烷基；W2为-C(O)NR2-或-OCH2CH2NR2C(O)-，其中R2为氢或C1-6烷基；L13和L23各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L13和L23中的每一个独立地选自表8中显示的部分。
表8：本发明的实例L13和L23部分。
Figure BDA0004172056550000302
Figure BDA0004172056550000311
其中，p和q各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和每个
Figure BDA0004172056550000312
表示与X、Y、W1或W2的连接点；条件是：
(i)在接头1-3和接头3-3中，p+q≥5；和
(ii)在接头2-3中，p≥5。
在一些实施方案中，每个p独立地为20、21、22、23、24或25。在一些实施方案中，每个p独立地为23或24。在一些实施方案中，每个p为23。在一些实施方案中，每个p为24。在一些实施方案中，每个q独立地为20、21、22、23、24或25。在一些实施方案中，每个q为24。
在一些实施方案中，X和Y中的至少一个选自表3中显示的部分，其中每个
Figure BDA0004172056550000313
表示与L13或L23的连接点。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表3中显示的部分，其中每个/>
Figure BDA0004172056550000314
表示与L13或L23的连接点。
在一些实施方案中，X和Y中的至少一个选自表9中显示的部分。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表9中显示的部分。
表9：式(III)化合物的实例X和Y部分。
Figure BDA0004172056550000315
/>
Figure BDA0004172056550000321
其中
Figure BDA0004172056550000322
表示与L13或L23的连接点。
在一些实施方案中，LA3包含至少一个PEG单元。在一些实施方案中，LA3没有任何PEG单元。在一些实施方案中，LA3包含-C(O)-、-C(O)N(H)-、-N(H)C(O)-、任选取代的烷氧基或任选取代的亚烷基杂环基。在一些实施方案中，LA3为键。
在一些实施方案中，LA3选自表10中显示的部分。
表10：本发明的实例LA3部分。
Figure BDA0004172056550000323
其中，m和a中的每一个独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和每个
Figure BDA0004172056550000331
表示与RZ或式(III)的苯环的连接点。
在一些实施方案中，m为1、2、3、4、5、20、21、22、23或25。在一些实施方案中，m为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，m为2或4。在一些实施方案中，a为2、3、4或5。在一些实施方案中，a为3。
在一些实施方案中，R1和R2中的每一个独立地为氢或C1-3烷基(例如甲基、乙基或正丙基)。在一些实施方案中，R1和R2两者为氢。
在一些实施方案中，式(III)化合物选自如表14所示的LP 110a、LP 124a、LP 130a和LP 220a或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个R为LA3-RZ；LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；并且RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在一些实施方案中，式(III)化合物选自如表16所示的LP 110b、LP 124b、LP130b、LP 143b、LP 220b、LP 221b和LP 240b或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
本发明的另一方面提供一种式(IIIa)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000332
其中R、X和Y中的每一个如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(II)或(III)化合物的任何实施方案所定义；L13为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L1，L13为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L12，或L13如在式(III)化合物的任何实施方案中所定义；L23为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L2，L23为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L22，或L13如在式(III)化合物的任何实施方案所定义；和R1和R2中的每一个如在式(II)或(III)化合物的任何实施方案所定义。
在一些实施方案中，R为LA3-RZ；LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；R1和R2各自独立地为氢或C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基、正丁基或正戊基)；L13和L23各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L13和L23中的每一个选自如表8所示的接头1-3和接头2-3，其中每个
Figure BDA0004172056550000341
表示与式(IIIa)中X、Y、-NR1-或-NR2-的连接点，条件是：
(i)在接头1-3中，p+q≥5；和
(ii)在接头2-3中，p≥5。
在一些实施方案中，L13和L23中的一个为接头1-3和另一个为接头2-3。在一些实施方案中，L13和L23中的每一个为接头1-3。在一些实施方案中，L13和L23中的每一个为接头2-3。
在一些实施方案中，每个p独立地为23或24。在一些实施方案中，每个p为23。在一些实施方案中，每个p为24。在一些实施方案中，q为24。
在一些实施方案中，X和Y中的至少一个选自如表9所示的脂质3和脂质19，其中每个
Figure BDA0004172056550000342
表示与式(IIIa)中L13或L23的连接点。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自脂质3和脂质19。在一些实施方案中，X和Y中的一个为脂质3和另一个为脂质19。在一些实施方案中，X和Y中的每一个为脂质3。在一些实施方案中，X和Y中的每一个为脂质19。
在一些实施方案中，LA3选自如表10所示的栓系1-3、栓系2-3和栓系5-3，其中每个
Figure BDA0004172056550000351
表示与RZ或式(IIIa)的苯环的连接点。在一些实施方案中，LA3为栓系1-3。在一些实施方案中，LA3为栓系2-3。在一些实施方案中，LA3为栓系5-3。
在一些实施方案中，m为1、2、3、4、5、20、21、22、23或25。在一些实施方案中，m为1、2、3、4或5。在一些实施方案中，m为2或4。在一些实施方案中，a为2、3、4或5。在一些实施方案中，a为3。
在一些实施方案中，R1和R2中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。在一些实施方案中，R1和R2中的每一个为氢。
在一些实施方案中，式(IIIa)化合物选自如表14所示的LP 110a、LP 124a和LP130a或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个R为LA3-RZ；LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；并且RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在一些实施方案中，式(IIIa)化合物选自如表16所示的LP 110b、LP 124b、LP130b、LP 143b和LP 240b或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
本发明的另一方面提供一种式(IIIb)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000352
其中R、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(II)、(III)或(IIIa)化合物的任何实施方案所定义；L13为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L1，L13为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L12，或L13如在式(III)或(IIIa)化合物的任何实施方案中所定义；L23为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)或(Id)化合物的任何实施方案定义的L2，L23为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L22，或L23如在式(III)或(IIIa)化合物的任何实施方案所定义；和R1和R2中的每一个如在式(II)、(III)或(IIIa)化合物的任何实施方案所定义。
在一些实施方案中，R为LA3-RZ；LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；R1和R2各自独立地选自氢或C1-6烷基；L13和L23各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L13和L23中的每一个为如表8所示的接头3-3，其中每个
Figure BDA0004172056550000361
表示与X、Y或-C(O)-的连接点，条件是在接头3-3中，p+q≥5。
在一些实施方案中，p为23或24。在一些实施方案中，p为23。在一些实施方案中，p为24。在一些实施方案中，q为24。
在一些实施方案中，X和Y中的每一个为如表9所示的脂质3，其中每个
Figure BDA0004172056550000362
表示与L13或L23的连接点。
在一些实施方案中，LA3选自如表10所示的栓系3-3和栓系4-3，其中每个
Figure BDA0004172056550000363
表示与RZ或式(IIIb)的苯环的连接点。在一些实施方案中，LA3为栓系3-3。在一些实施方案中，LA3为栓系4-3。
在一些实施方案中，R1和R2中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。在一些实施方案中，R1和R2中的每一个为氢。
在一些实施方案中，式(IIIb)化合物为如表14所示的LP 220a或其药学上可接受的盐，其中R为LA3-RZ；LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；并且RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在一些实施方案中，式(IIIb)化合物选自如表16所示的LP 220b和LP 221b或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
本发明的另一方面提供一种式(IV)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000371
其中R、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(II)、(III)、(IIIa)或(IIIb)化合物的任何实施方案所定义；L14为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的任何实施方案定义的L1，L14为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L12，或L14为如在式(III)、(IIIa)或(IIIb)化合物的任何实施方案中定义的L13；L24为如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的任何实施方案定义的L2，L24为如对式(II)化合物的任何实施方案定义的L22，或L24为如在式(III)、(IIIa)或(IIIb)化合物的任何实施方案定义的L23。
在一些实施方案中，R为LA4-RZ；LA4为连接RZ与-C(O)-的键或二价部分；RZ包含基于寡核苷酸的药剂；L14和L24各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，L14和L24中的每一个独立地选自表11中显示的部分。
表11：本发明的实例L14和L24部分。
Figure BDA0004172056550000372
Figure BDA0004172056550000381
其中每个p独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；每个q独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；每个r独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和每个
Figure BDA0004172056550000382
表示与式(IV)的X、Y或/>
Figure BDA0004172056550000383
的连接点，其中每个*表示与L14或L24的连接点；条件是：
(i)在接头1-4、接头2-4和接头4-4中，p+q+r≥5；和
(ii)在接头3-4中，p+q≥5。
在一些实施方案中，每个p独立地为20、21、22、23、24或25。在一些实施方案中，每个p独立地为23或24。在一些实施方案中，每个p为23。在一些实施方案中，每个p为24。在一些实施方案中，每个q独立地为20、21、22、23、24或25。在一些实施方案中，每个q独立地为23或24。在一些实施方案中，每个q为24。在一些实施方案中，每个q为23。在一些实施方案中，每个r独立地为2、3、4、5或6。在一些实施方案中，每个r为4。
在一些实施方案中，X和Y中的至少一个选自表3中显示的部分，其中每个
Figure BDA0004172056550000384
表示与L14或L24的连接点。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表3中显示的部分，其中每个/>
Figure BDA0004172056550000385
表示与L14或L24的连接点。
在一些实施方案中，X和Y中的至少一个选自表12中显示的部分。在一些实施方案中，X和Y中的每一个独立地选自表12中显示的部分。
表12：式(IV)化合物的实例X和Y部分。
Figure BDA0004172056550000391
/>
Figure BDA0004172056550000401
其中
Figure BDA0004172056550000402
表示与L14或L24的连接点。
在一些实施方案中，LA4包含至少一个PEG单元。在一些实施方案中，LA4没有任何PEG单元。在一些实施方案中，LA4包含-C(O)-、-C(O)NH-、任选取代的烷氧基或任选取代的亚烷基杂环基。在一些实施方案中，LA4为键。
在一些实施方案中，LA4选自表13中显示的部分。
表13：本发明的实例LA4部分。
Figure BDA0004172056550000403
/>
Figure BDA0004172056550000411
其中每个
Figure BDA0004172056550000412
表示与RZ或式(IV)的-C(O)-的连接点。
在一些实施方案中，式(IV)化合物选自如表14所示的LP 1a、LP 28a、LP 29a、LP48a、LP 49a、LP 56a、LP 61a、LP 87a、LP 89a、LP 90a、LP 92a、LP 93a、LP 94a、LP 95a、LP102a、LP 103a、LP 223a、LP 225a、LP 246a、LP 339a、LP 340a、LP 357a和LP 358a或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个R为LA4-RZ；LA4为连接RZ与-C(O)-的键或二价部分；并且RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在一些实施方案中，式(IV)化合物选自如表16所示的LP 1b、LP 28b、LP 29b、LP48b、LP 49b、LP 56b、LP 61b、LP 87b、LP 89b、LP 90b、LP 92b、LP 93b、LP 94b、LP 95b、LP102b、LP 103b、LP 223b、LP 224b、LP 225b、LP 226b、LP 238b、LP 246b、LP 247b、LP 339b、LP 340b、LP 357b和LP 358b或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
本发明的另一方面提供一种式(IVa)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000421
其中X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)或(IV)化合物的任何实施方案所定义；L14和L24如在式(IV)化合物的实施方案中的任何一项所定义；和RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在一些实施方案中，RZ包含基于寡核苷酸的药剂；L14和L24中的每一个独立地选自
Figure BDA0004172056550000422
Figure BDA0004172056550000423
其中每个/>
Figure BDA0004172056550000424
表示与式(IVa)的X、Y或/>
Figure BDA0004172056550000425
的连接点，每个*表示与L14或L24的连接点，每个p独立地为20、21、22、23、24或25，每个q独立地为20、21、22、23、24或25，和每个r独立地为2、3、4、5或6；并且X和Y中的每一个独立地选自
Figure BDA0004172056550000426
Figure BDA0004172056550000427
Figure BDA0004172056550000428
其中/>
Figure BDA0004172056550000429
表示与L14或L24的连接点。
在一些实施方案中，每个p独立地为23或24。在一些实施方案中，每个p为23。在一些实施方案中，每个p为24。在一些实施方案中，每个q独立地为23或24。在一些实施方案中，每个q为24。在一些实施方案中，每个q为23。在一些实施方案中，每个r为4。
在一些实施方案中，式(IVa)化合物选自如表16所示的LP 339b、LP 340b、LP 357b和LP 358b或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在本发明的另一方面，化合物选自表14中显示的化合物或其药学上可接受的盐。
表14：本发明的实例化合物(化合物编号出现在结构之前)。
Figure BDA0004172056550000431
/>
Figure BDA0004172056550000441
/>
Figure BDA0004172056550000451
/>
Figure BDA0004172056550000461
/>
Figure BDA0004172056550000471
/>
Figure BDA0004172056550000481
/>
Figure BDA0004172056550000491
/>
Figure BDA0004172056550000501
/>
Figure BDA0004172056550000511
或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个R如在式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
在一些实施方案中，每个R为LA-RZ；LA为连接RZ与化合物其余部分的键或二价部分；并且RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在本发明的另一方面，化合物选自表15中显示的化合物或其药学上可接受的盐。
表15：本发明的实例化合物(化合物编号出现在结构之前)。
Figure BDA0004172056550000521
或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中R如在式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
在一些实施方案中，每个R为LA-RZ；LA为连接RZ与化合物其余部分的键或二价部分；并且RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在本发明的另一方面，化合物选自表16中显示的化合物或其药学上可接受的盐。
表16：本发明的实例化合物(化合物编号出现在结构之前)。
Figure BDA0004172056550000522
/>
Figure BDA0004172056550000531
/>
Figure BDA0004172056550000541
/>
Figure BDA0004172056550000551
/>
Figure BDA0004172056550000561
/>
Figure BDA0004172056550000571
/>
Figure BDA0004172056550000581
/>
Figure BDA0004172056550000591
/>
Figure BDA0004172056550000601
/>
Figure BDA0004172056550000611
/>
Figure BDA0004172056550000621
/>
Figure BDA0004172056550000631
或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
在本发明的另一方面，化合物选自表17中显示的化合物或其药学上可接受的盐。
表17：本发明的实例化合物(化合物编号出现在结构之前)。
Figure BDA0004172056550000632
或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐，其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
本发明的另一方面提供一种式(V)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000641
/>
其中R、L1、L2、X和Y如对式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的任何实施方案所定义；J为LA5-RX；LA5为连接RX与Z的键或二价部分；并且RX为用于与基于寡核苷酸的药剂缀合的反应性部分。
在一些实施方案中，J为LA5-RX；LA5为连接RX与Z的键或二价部分；RX为用于与基于寡核苷酸的药剂缀合的反应性部分。Z为CH、苯基或N；L1和L2各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
在一些实施方案中，LA5为如在式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)或(Ic)化合物的任何实施方案定义的LA。在一些实施方案中，LA5选自表18中显示的部分。
表18：本发明的实例LA5部分。
Figure BDA0004172056550000642
/>
Figure BDA0004172056550000651
其中m、n、o和a中的每一个独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和其中每个
Figure BDA0004172056550000652
表示与Z或RX的连接点。
在一些实施方案中，每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、21、22、23或25；每个n独立地为2、3、4或5；每个a独立地为2、3或4；和每个o独立地为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13。
在一些实施方案中，每个m独立地为2、4、8或24。在一些实施方案中，每个n为4。在一些实施方案中，每个o独立地为4、8或12。在一些实施方案中，每个a为3。
在一些实施方案中，RX选自
Figure BDA0004172056550000661
其中每个/>
Figure BDA0004172056550000662
表示与LA5的连接点。在一些实施方案中，RX为/>
Figure BDA0004172056550000663
在一些实施方案中，RX为/>
Figure BDA0004172056550000664
在一些实施方案中，RX为/>
Figure BDA0004172056550000665
在一些实施方案中，RX为/>
Figure BDA0004172056550000666
在一些实施方案中，J选自表19中显示的部分。
表19：本发明的实例J部分。
Figure BDA0004172056550000667
/>
Figure BDA0004172056550000671
/>
Figure BDA0004172056550000681
其中每个
Figure BDA0004172056550000682
表示与Z的连接点。
本发明的另一方面提供一种式(Va)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000691
/>
其中J、L1、L2、X和Y如式(V)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
在一些实施方案中，X和Y各自独立地选自如表3所示的脂质3、脂质4、脂质5、脂质6、脂质7、脂质10、脂质12和脂质19，其中每个
Figure BDA0004172056550000692
表示与L1或L2的连接点。
在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自如表1所示的接头2、接头3、接头4和接头5，其中每个
Figure BDA0004172056550000693
表示与式(Va)的X、Y或CH的连接点。在一些实施方案中，每个p为23。在一些实施方案中，每个q为24。
在一些实施方案中，LA5选自如表18所示的栓系2-5、栓系3-5和栓系4-5，其中每个
Figure BDA0004172056550000694
表示与RX或式(Va)的CH的连接点。在一些实施方案中，m为2、4、8或24。在一些实施方案中，n为4。在一些实施方案中，o为4、8或12。
在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自
Figure BDA0004172056550000695
Figure BDA0004172056550000696
其中每个p独立地为20、21、22、23、24或25；每个q独立地为20、21、22、23、24或25；和每个/>
Figure BDA0004172056550000698
表示与式(Va)的X、Y或CH的连接点。在一些实施方案中，每个p为24。在一些实施方案中，每个q为24。
在一些实施方案中，LA5为
Figure BDA0004172056550000701
其中每个/>
Figure BDA0004172056550000702
表示与RX或式(Va)的CH的连接点。
在一些实施方案中，X和Y中的每一个为
Figure BDA0004172056550000703
其中/>
Figure BDA0004172056550000704
表示与L1或L2的连接点。
在一些实施方案中，式(Va)化合物选自如表20所示的LP210-p或LP 217-p或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供一种式(Vb)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000705
其中J、L1、L2、X和Y如式(V)或(Va)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
在一些实施方案中，X和Y各自独立地选自如表3所示的脂质3和脂质19，其中每个
Figure BDA0004172056550000706
表示与L1或L2的连接点。在一些实施方案中，X和Y各自为脂质3。在一些实施方案中，X和Y各自为脂质19。
在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自如表1所示的接头3、接头5和接头9，其中每个
Figure BDA0004172056550000707
表示与式(Vb)的X、Y或苯环的连接点。在一些实施方案中，p为23或24。在一些实施方案中，q为24。
在一些实施方案中，LA5选自如表18所示的栓系5-5、栓系6-5、栓系7-5、栓系8-5和栓系13-5，其中每个
Figure BDA0004172056550000711
表示与RX或式(Vb)的苯环的连接点。在一些实施方案中，m为2或4。在一些实施方案中，a为3。
本发明的另一方面提供一种式(Vb1)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000712
其中J、L1、L2、X和Y如式(V)、(Va)或(Vb)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Vc)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000713
其中J、L1、L2、X和Y如式(V)、(Va)、(Vb)或(Vb1)化合物的实施方案中任何一项所定义。
在一些实施方案中，X和Y各自独立地选自如表3所示的脂质1、脂质2、脂质3、脂质5、脂质8、脂质9、脂质11、脂质12、脂质14、脂质15、脂质16、脂质17、脂质18、脂质19、脂质20、脂质21、脂质22、脂质23和脂质24，其中每个
Figure BDA0004172056550000714
表示与L1和L2的连接点。在一些实施方案中，X和Y中的每一个为脂质1、脂质2、脂质3、脂质5、脂质8、脂质9、脂质11、脂质12、脂质14、脂质15、脂质16、脂质17、脂质18、脂质19、脂质20、脂质21、脂质22、脂质23或脂质24。
在一些实施方案中，L1和L2中的每一个独立地选自如表1所示的接头1、接头6、接头10、接头11和接头12，其中每个
Figure BDA0004172056550000721
表示与式(Vc)的X、Y或N的连接点。在一些实施方案中，p独立地为23或24。
在一些实施方案中，q为24。在一些实施方案中，r为4。
在一些实施方案中，LA5选自如表18所示的栓系1-5、栓系9-5、栓系10-5、栓系11-5或栓系12-5，其中每个
Figure BDA0004172056550000722
表示与RZ或式(Vc)的N的连接点。
本发明的另一方面提供一种式(Vd)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000723
其中Z、L1、L2、X和Y如式(V)、(Va)、(Vb)、(Vb1)或(Vc)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Ve)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000724
其中Z、L1、L2、RX、LA5、X和Y如式(V)、(Va)、(Vb)、(Vb1)、(Vc)或(Vd)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Ve1)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000725
其中Z、L1、L2、LA5、X和Y如式(V)、(Va)、(Vb)、(Vb1)、(Vc)、(Vd)或(Ve)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Ve2)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000731
其中Z、L1、L2、LA5、X和Y如式(V)、(Va)、(Vb)、(Vb1)、(Vc)、(Vd)、(Ve)或(Ve1)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Ve3)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000732
其中Z、L1、L2、LA5、X和Y如式(V)、(Va)、(Vb)、(Vb1)、(Vc)、(Vd)、(Ve)、(Ve1)或(Ve2)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
本发明的另一方面提供一种式(Ve4)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550000733
其中Z、L1、L2、LA5、X和Y如式(V)、(Va)、(Vb)、(Vb1)、(Vc)、(Vd)、(Ve)、(Ve1)、(Ve2)或(Ve3)化合物的实施方案中的任何一项所定义。
在本发明的另一方面，化合物选自表20中显示的化合物或其药学上可接受的盐。
表20：本发明的实例化合物(化合物编号出现在结构之前)。
Figure BDA0004172056550000734
/>
Figure BDA0004172056550000741
/>
Figure BDA0004172056550000751
/>
Figure BDA0004172056550000761
/>
Figure BDA0004172056550000771
/>
Figure BDA0004172056550000781
/>
Figure BDA0004172056550000791
/>
Figure BDA0004172056550000801
/>
Figure BDA0004172056550000811
/>
Figure BDA0004172056550000821
/>
Figure BDA0004172056550000831
/>
Figure BDA0004172056550000841
或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐。
在本发明的另一方面，化合物选自表21中显示的化合物或其药学上可接受的盐。
表21：本发明的实例化合物(化合物名称出现在结构之前)。
Figure BDA0004172056550000842
/>
Figure BDA0004172056550000851
或这些化合物中任何一种的药学上可接受的盐。
本发明的另一方面提供一种用于制备式(I)化合物或其药学上可接受的盐的方法：
Figure BDA0004172056550000852
方法包括使包含第一反应性部分的基于寡核苷酸的药剂与包含脂质和第二反应性部分的化合物缀合以形成式(I)化合物。
在一些实施方案中，第一反应性部分选自二硫化物和炔丙基。在一些实施方案中，第一反应性部分为二硫化物。在一些实施方案中，第一反应性部分为炔丙基。
在一些实施方案中，第二反应性部分选自马来酰亚胺、砜、叠氮化物和炔烃。在一些实施方案中，第二反应性部分为马来酰亚胺。在一些实施方案中，第二反应性部分为砜。在一些实施方案中，第二反应性部分为叠氮化物。在一些实施方案中，第二反应性部分为炔烃。
本文所述式(V)、(Va)、(Vb)、(Vb1)、(Vc)、(Vd)、(Ve)、(Ve1)、(Ve2)、(Ve3)或(Ve4)化合物可称为“药代动力学和/或药效学调节剂前体”(在下文，“PK/PD调节剂前体”)。还应当意识到本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的一部分可称为“药代动力学和/或药效学调节剂”(在下文，“PK/PD调节剂”)。当用于指式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的一部分时，术语“PK/PD调节剂”是指不包括RZ(即基于寡核苷酸的药剂)在内的化合物部分。
PK/PD调节剂与基于寡核苷酸的药剂比如RNAi剂连接，以促进RNAi剂递送至期望的细胞或组织。可合成具有反应性部分(比如马来酰亚胺或叠氮基团)的PK/PD调节剂前体，这些反应性部分易于促进与RNAi剂上的一个或多个连接基团的连接。使这种PK/PD调节剂前体与RNAi剂连接的化学反应合成为本领域通常已知的。术语“PK/PD调节剂”和“脂质PK/PD调节剂”在本文可互换使用。
选自LP1-p、LP5-p、LP28-p、LP29-p、LP33-p、LP38-p、LP39-p、LP41-p、LP42-p、LP43-p、LP44-p、LP45-p、LP47-p、LP48-p、LP49-p、LP53-p、LP54-p、LP55-p、LP56-p、LP57-p、LP58-p、LP59-p、LP60-p、LP61-p、LP62-p、LP81-p、LP87-p、LP89-p、LP90-p、LP92-p、LP93-p、LP94-p、LP95-p、LP101-p、LP102-p、LP103-p、LP104-p、LP105-p、LP106-p、LP107-p、LP108-p、LP109-p、LP110-p、LP111-p、LP124-p、LP130-p、LP143-p、LP210-p、LP217-p、LP220-p、LP221-p、LP223-p、LP224-p、LP225-p、LP226-p、LP238-p、LP240-p、LP246-p、LP247-p、LP339-p、LP340-p、LP357-p和LP358-p的PK/PD调节剂前体可用作与RNAi剂连接的起始材料。可使用本领域任何已知的方法使PK/PD调节剂前体与RNAi剂共价连接。例如，在一些实施方案中，含有马来酰亚胺的PK/PD调节剂前体可与有义链3’端上含有二硫化物的部分反应。
在一些实施方案中，一种或多种PK/PD调节剂可与本文所述RNAi剂缀合。在一些实施方案中，一、二、三、四、五、六、七或更多种PK/PD调节剂可与本文所述RNAi剂缀合。
可使用本领域任何已知的方法使PK/PD调节剂前体与RNAi剂缀合。在一些实施方案中，包含马来酰亚胺部分的PK/PD调节剂前体可与包含二硫键的RNAi剂反应，以形成包含与RNAi剂缀合的PK/PD调节剂的化合物。可将二硫化物还原，并通过Michael加成反应加成至马来酰亚胺。一种实例反应方案如下所示：
Figure BDA0004172056550000871
其中RZZ包含RNAi剂，和
Figure BDA0004172056550000872
表示与本领域已知的任何合适基团的连接点。在以上反应方案的一些情况下，/>
Figure BDA0004172056550000873
连接于烷基比如己基(C6H13)。
在一些实施方案中，PK/PD调节剂前体可包含砜部分并且可与二硫化物反应。一种实例反应方案如下显示：
Figure BDA0004172056550000874
其中RZZ包含RNAi剂，和
Figure BDA0004172056550000875
表示与本领域已知的任何合适基团的连接点。在以上反应方案的一些情况下，/>
Figure BDA0004172056550000876
连接于烷基比如己基(C6H13)。/>
在一些实施方案中，PK/PD调节剂前体可包含叠氮化物部分并且根据以下一般反应方案与包含炔烃的RNAi剂反应以形成包含与RNAi剂缀合的PK/PD调节剂的化合物：
Figure BDA0004172056550000877
其中RZZ包含RNAi剂。
在一些实施方案中，PK/PD调节剂前体可包含炔烃部分并且根据以下一般反应方案与包含二硫化物的RNAi剂反应以形成包含与RNAi剂缀合的PK/PD调节剂的化合物：
Figure BDA0004172056550000881
其中RZZ包含RNAi剂，和
Figure BDA0004172056550000882
表示与本领域已知的任何合适基团的连接点。在以上反应方案的一些情况下，/>
Figure BDA0004172056550000883
连接于烷基比如己基(C6H13)。
在一些实施方案中，PK/PD调节剂可与有义或反义链的5’端、有义或反义链的3’端或RNAi剂的内部核苷酸缀合。在一些实施方案中，RNAi剂合成为在有义链3’端处具有含有二硫化物的部分，并且PK/PD调节剂前体可使用以上显示的任何适当的一般合成方案与有义链3’端缀合。
定义
如本文使用的术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”意指连接的核苷的聚合物，其每个核苷可独立地修饰或未修饰。
如本文使用的“RNAi剂”(也称为“RNAi触发剂”)意指含有RNA或RNA样(例如化学修饰的RNA)寡核苷酸分子的组合物，所述分子能够以序列特异性方式降解或抑制(例如在适当条件下降解或抑制)靶mRNA的信使RNA(mRNA)转录物的翻译。如本文使用的RNAi剂可通过RNA干扰机制(即通过与哺乳动物细胞的RNA干扰途径机制(RNA诱导的沉默复合物或RISC)的相互作用诱导RNA干扰)，或通过任何替代性机制或途径起作用。尽管据信如本文所用的术语RNAi剂主要通过RNA干扰机制起作用，但是公开的RNAi剂并不受约束于或受限于任何特定的作用途径或机制。本文公开的RNAi剂由有义链和反义链组成，并且包括但不限于：短(或小)干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和dicer底物。本文所述RNAi剂的反义链至少部分地与所靶向的mRNA互补。RNAi剂可包括一个或多个修饰的核苷酸和/或一个或多个非磷酸二酯键。
如本文使用的术语“脂质”是指可溶于非极性溶剂的部分和分子。术语脂质包括包含极性的水溶性头部基团和疏水性尾部的两亲性分子。脂质可属于天然或合成来源。脂质的非限制性实例包括脂肪酸(例如饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸)、甘油脂(例如单酰基甘油、二酰基甘油和三酰基甘油)、磷脂(例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸)、鞘脂(例如鞘磷脂)和胆甾醇酯。如本文使用的术语“饱和脂质”是指没有任何不饱和的脂质。如本文使用的术语“不饱和脂质”是指包含至少一(1)个不饱和度的脂质。如本文使用的术语“分支脂质”是指包含多于一个线性链的脂质，其中每个线性链共价连接于至少一个其他线性链。如本文使用的术语“直链脂质”是指没有任何分支的脂质。
如本文使用的术语“沉默”、“降低”、“抑制”、“下调”或“敲低”，当指代给定基因的表达时，意指与没有或尚未经这样处理的第二细胞、细胞群、组织、器官或受试者相比较，当用本文所述RNAi剂处理细胞、细胞群、组织、器官或受试者时，基因表达会降低，如通过从其中基因转录的细胞、细胞群、组织、器官或受试者中的基因转录的RNA水平或者从mRNA翻译的多肽、蛋白或蛋白亚基的水平测量。
如本文使用的术语“序列”和“核苷酸序列”意指以使用标准命名法的一系列字母描述的核碱基或核苷酸的演替或顺序。
如本文使用的“碱基”、“核苷酸碱基”或“核碱基”为其为核苷酸的组成部分的杂环嘧啶或嘌呤化合物，并且包括初级嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤以及初级嘧啶碱基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核碱基可进一步修饰为包括但不限于通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩大的碱基和氟化碱基(参见例如Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.编辑Wiley-VCH,2008)。这种修饰核碱基(包括包含修饰核碱基的亚磷酰胺化合物)的合成为本领域已知的。
如本文使用的，并且除非另外指明，否则术语“互补的”当用于相对于第二核碱基或核苷酸序列(例如RNAi剂反义链或单链反义寡核苷酸)描述第一核碱基或核苷酸序列(例如RNAi剂有义链或所靶向mRNA)时，意指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交(在哺乳动物生理条件(或类似的体外条件)下形成碱基对氢键)和在某些标准条件下形成双链体或双螺旋结构的能力。互补序列包含沃森-克里克碱基对或非沃森-克里克碱基对，并且至少在满足以上杂交要求的程度上包含天然或修饰的核苷酸或核苷酸模拟物。序列同一性或互补性与修饰无关。例如，对于确定同一性或互补性目的，如本文定义的a和Af与U(或T)互补并且与A相同。
如本文使用的“完美互补”或“完全互补”意指在杂交的核碱基或核苷酸序列分子中，第一寡核苷酸连续序列中的全部(100％)碱基将与第二寡核苷酸连续序列中相同数量的碱基杂交。连续序列可包含第一或第二多核苷酸序列的全部或一部分。
如本文使用的“部分互补”意指在杂交的核碱基或核苷酸序列分子中，第一寡核苷酸连续序列中的至少70％(但不是全部)碱基将与第二寡核苷酸连续序列中相同数量的碱基杂交。连续序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
如本文使用的“基本上互补”意指在杂交的核碱基或核苷酸序列分子中，第一寡核苷酸连续序列中的至少85％(但不是全部)碱基将与第二寡核苷酸连续序列中相同数量的碱基杂交。连续序列可包含第一或第二核苷酸序列的全部或一部分。
如本文使用的术语“互补”、“完全互补”、“部分互补”和“基本上互补”相对于RNAi剂的有义链和反义链之间或RNAi剂的反义链和靶mRNA序列之间的核碱基或核苷酸匹配使用。
如本文使用的，如应用于核酸序列的术语“基本上相同”或“基本同一性”意指与参考序列相比较，核苷酸序列(或核苷酸序列的一部分)具有至少约85％的序列同一性或更高，例如至少90％、至少95％或至少99％的同一性。序列同一性的百分比通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列来确定。通过确定两个序列中出现相同类型核酸碱基的位置数以得出匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数并将结果乘以100以得出序列同一性的百分比来计算百分比。本文公开的发明包括与本文公开的那些基本上相同的核苷酸序列。
如本文使用的术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等意指为受试者提供疾病的一种或多种症状的数量、严重程度和/或频次的缓解或减轻而采取的方法或步骤。如本文使用的“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”可包括预防性治疗(preventativetreatment)、管理、预防性治疗(prophylactic treatment)和/或抑制或减少受试者中疾病的一种或多种症状的数量、严重程度和/或频次。
如本文使用的短语“引入到细胞中”当指RNAi剂时，意指将RNAi剂功能性递送到细胞中。短语“功能性递送”意指使得RNAi剂具有预期的生物活性(例如基因表达的序列特异性抑制的方式)将RNAi剂递送至细胞。
如本文使用的术语“异构体”是指具有相同分子式但性质或其原子键合顺序或其原子空间排列不同的化合物。其原子空间排列不同的异构体称为“立体异构体”。彼此不为镜像的立体异构体称为“非对映异构体”，而为非重叠镜像的立体异构体称为“对映异构体”或有时称为光学异构体。键合于4个不相同取代基的碳原子称为“手性中心”。
如本文使用的，除非在结构中特别鉴定为具有特定构象，否则对于其中存在不对称中心并因此产生对映异构体、非对映异构体或其他立体异构构型的每个结构，本文公开的每个结构旨在表示所有这种可能的异构体，包括它们的光学纯和外消旋形式。例如，本文公开的结构旨在涵盖非对映异构体的混合物以及单个立体异构体。
如本文权利要求中使用的短语“由…组成”不包括权利要求中未明确规定的任何元素、步骤或成分。当在本文的权利要求中使用时，短语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制为明确规定的材料或步骤以及不会对要求保护的发明的基本和新颖特性产生实质性影响的那些。
本领域的普通技术人员将易于理解和意识到，本文公开的化合物和组合物可具有处于质子化或去质子化状态的某些原子(例如N、O或S原子)，这取决于其中放置化合物或组合物的环境。因此，如本文使用的，本文公开的结构设想某些官能团(比如OH、SH或NH)可以质子化或去质子化。本文的公开旨在涵盖所公开的化合物和组合物，无论其基于环境(比如pH)的质子化状态如何，如本领域普通技术人员将易于理解的。
当指两个化合物或分子之间的连接时，如本文使用的术语“连接的”或“缀合的”意指两个分子通过共价键连接或经非共价键(例如氢键或离子键)缔合。在一些实例中，当术语“连接的”或“缀合的”是指两个分子之间经非共价键的缔合时，两个不同分子之间的缔合在生理学上可接受的缓冲液(例如缓冲盐水)中的KD小于1×10-4M(例如小于1x10-5M、小于1x10-6M或小于1x10-7M)。除非说明，否则如本文使用的术语“连接的”和“缀合的”可指第一化合物和第二化合物之间的连接，无论是否有任何中间原子或原子基团。
如本文使用的连接基团为将一个分子或分子的一部分连接于另一个或第二分子或分子的第二部分的一个或多个原子。类似地，如本领域使用的术语支架有时可与连接基团互换使用。连接基团可包含任何数量的原子或官能团。在一些实施方案中，连接基团可不促进任何生物或药物反应，并且仅用于连接两个生物活性分子。
如本文使用的术语“烷基”是指含有1-12(例如1-8、1-6、1-4或1-3)个碳原子的饱和脂肪族烃基。烷基可为直形或分支的。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正庚基或2-乙基己基。
除非另外说明，否则使用如本文使用的符号
Figure BDA0004172056550000931
意指任何一个或多个基团可连接(linked)(或连接(connected))其上，这符合本文所述发明的范围。
如本文使用的术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并且可与之互换使用。术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与之互换使用，除非上下文另外明确指明。
如本文权利要求中使用的短语“由...组成”不包括权利要求中未明确规定的任何元素、步骤或成分。当在本文的权利要求中使用时，短语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制为明确规定的材料或步骤以及不会对要求保护的发明的基本和新颖特性产生实质性影响的那些。
基于寡核苷酸的药剂，包括RNAi剂
如本文使用的“基于寡核苷酸的药剂”为含有约10-50(例如10-48、10-46、10-44、10-42、10-40、10-38、10-36、10-34、10-32、10-30、10-28、10-26、10-24、10-22、10-20、10-18、10-16、10-14、10-12、12-50、12-48、12-46、12-44、12-42、12-40、12-38、12-36、12-34、12-32、12-30、12-28、12-26、12-24、12-22、12-20、12-18、12-16、12-14、14-50、14-48、14-46、14-44、14-42、14-40、14-38、14-36、14-34、14-32、14-30、14-28、14-26、14-24、14-22、14-20、14-18、14-16、16-50、16-48、16-46、16-44、16-42、16-40、16-38、16-36、16-34、16-32、16-30、16-28、16-26、16-24、16-22、16-20、16-18、18-50、18-48、18-46、18-44、18-42、18-40、18-38、18-36、18-34、18-32、18-30、18-28、18-26、18-24、18-22、18-20、20-50、20-48、20-46、20-44、20-42、20-40、20-38、20-36、20-34、20-32、20-30、20-28、20-26、20-24、20-22、22-50、22-48、22-46、22-44、22-42、22-40、22-38、22-36、22-34、22-32、22-30、22-28、22-26、22-24、24-50、24-48、24-46、24-44、24-42、24-40、24-38、24-36、24-34、24-32、24-30、24-28、24-26、26-50、26-48、26-46、26-44、26-42、26-40、26-38、26-36、26-34、26-32、26-30、26-28、28-50、28-48、28-46、28-44、28-42、28-40、28-38、28-36、28-34、28-32、28-30、30-50、30-48、30-46、30-44、30-42、30-40、30-38、30-36、30-34、30-32、32-50、32-48、32-46、32-44、32-42、32-40、32-38、32-36、32-34、34-50、34-48、34-46、34-44、34-42、34-40、34-38、34-36、36-50、36-48、36-46、36-44、36-42、36-40、36-38、38-50、38-48、38-46、38-44、38-42、38-40、40-50、40-48、40-46、40-44、40-42、42-50、42-48、42-46、42-44、44-50、44-48、44-46、46-50、46-48或48-50)个核苷酸或核苷酸碱基对的核苷酸序列。在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂具有至少部分地与细胞内表达的靶核酸或靶基因中的编码序列互补的核碱基序列。在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂，在递送至表达基因的细胞时，能够抑制基础基因的表达，并且在本文中称为“抑制表达的基于寡核苷酸的药剂”。在体外或体内均可抑制该基因表达。
“基于寡核苷酸的药剂”包括但不限于：单链寡核苷酸、单链反义寡核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、核酶、干扰RNA分子和dicer底物。在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为单链寡核苷酸，比如反义寡核苷酸。在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为双链寡核苷酸。在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为其为RNAi剂的双链寡核苷酸。
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂为“RNAi剂”，其如在本文中定义为含有RNA或RNA样(例如化学修饰的RNA)寡核苷酸分子的组合物，所述分子能够以序列特异性方式降解或抑制靶mRNA的信使RNA(mRNA)转录物的翻译。如本文使用的RNAi剂可通过RNA干扰机制(即通过与哺乳动物细胞的RNA干扰途径机制(RNA诱导的沉默复合物或RISC)的相互作用诱导RNA干扰)，或通过任何替代性机制或途径起作用。尽管据信如本文所用的术语RNAi剂主要通过RNA干扰机制起作用，但是公开的RNAi剂并不受约束于或受限于任何特定的作用途径或机制。本文公开的RNAi剂由有义链和反义链组成，并且包括但不限于：短(或小)干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和dicer底物。本文所述RNAi剂的反义链至少部分地与所靶向的mRNA互补。RNAi剂可包括一个或多个修饰的核苷酸和/或一个或多个非磷酸二酯键。
一般地，RNAi剂可至少由包括第一序列的有义链(也称为过客链(passengerstrand))和包括第二序列的反义链(也称为引导链)组成。RNAi剂有义和反义链的长度可各自为16-49个核苷酸。在一些实施方案中，RNAi剂的有义和反义链的长度独立地为17-26个核苷酸。在一些实施方案中，有义和反义链的长度独立地为19-26个核苷酸。在一些实施方案中，有义和反义链的长度独立地为21-26个核苷酸。在一些实施方案中，有义和反义链的长度独立地为21-24个核苷酸。有义和反义链可为相同长度或不同长度。RNAi剂包括至少部分地与靶基因中的序列互补的反义链序列，并且在递送至表达靶标的细胞时，RNAi剂可在体内或体外抑制一个或多个靶基因的表达。
通常基于寡核苷酸的药剂，并且特别是RNAi剂，可由修饰的核苷酸和/或一个或多个非磷酸二酯键组成。如本文使用的“修饰的核苷酸”为除核糖核苷酸(2’-羟基核苷酸)以外的核苷酸。在一些实施方案中，至少50％(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的核苷酸为修饰的核苷酸。如本文使用的修饰的核苷酸包括但不限于脱氧核糖核苷酸、核苷酸模拟物、脱碱基核苷酸、2’-修饰的核苷酸、3’至3’连接(反向)核苷酸、包含非天然碱基的核苷酸、桥接核苷酸、肽核酸、2’,3’-开环核苷酸模拟物(未锁核碱基类似物)、锁核苷酸、3’-O-甲氧基(2’核苷间连接的)核苷酸、2’-F-阿糖核苷酸、5’-Me,2’-氟核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、含有乙烯基膦酸酯的核苷酸和含有环丙基膦酸酯的核苷酸。2’-修饰的核苷酸(即在五元糖环的2’位具有除羟基以外的基团的核苷酸)包括但不限于2’-O-甲基核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-脱氧核苷酸、2’-甲氧基乙基(2’-O-2-甲氧基乙基)核苷酸、2’-氨基核苷酸和2’-烷基核苷酸。
此外，基于寡核苷酸的药剂比如RNAi剂的一个或多个核苷酸可通过非标准连接或骨架(即修饰的核苷间键或修饰的骨架)连接。修饰的核苷间键可为非含有磷酸酯的共价核苷间键。修饰的核苷间键或骨架包括但不限于5’-硫代磷酸酯基团、手性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如甲基膦酸酯或3’-亚烷基膦酸酯)、手性膦酸酯、次膦酸酯、磷酰胺(例如3’-氨基磷酰胺、氨基烷基磷酰胺或硫羰基磷酰胺)、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、吗啉代连接、具有正常3’-5’连接的硼代磷酸酯、硼代磷酸酯的2’-5’连接的类似物或具有反向极性的硼代磷酸酯，其中邻近的核苷单元对连接3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。
对于给定化合物中的所有位置不必一致地修饰。相反，可在单个基于寡核苷酸药剂中或者甚至在其单个核苷酸中掺入多于一个修饰。
RNAi剂有义链和反义链可通过本领域已知的方法合成和/或修饰。与RNAi剂相关的另外公开可见于例如修改的公开中，例如在Arrowhead Pharmaceuticals，Inc.的国际专利申请第PCT/US2017/045446(WO2018027106)号中，其也通过引用以其全部结合至本文中。
修饰的核苷酸
在一些实施方案中，RNAi剂含有一个或多个修饰的核苷酸。如本文使用的“修饰的核苷酸”为除核糖核苷酸(2’-羟基核苷酸)以外的核苷酸。在一些实施方案中，至少50％(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)的核苷酸为修饰的核苷酸。如本文使用的修饰的核苷酸可包括但不限于脱氧核糖核苷酸、核苷酸模拟物、脱碱基核苷酸(本文表示为Ab)、2’-修饰的核苷酸、3’至3’连接(反向)核苷酸(本文表示为invdN、invN、invn)、包含修饰的核碱基的核苷酸、桥接核苷酸、肽核酸(PNA)、2’,3’-开环核苷酸模拟物(未锁核碱基类似物，本文表示为NUNA或NUNA)、锁核苷酸(本文表示为NLNA或NLNA)、3’-O-甲氧基(2’核苷间连接的)核苷酸(本文表示为3’-OMen)、2’-F-阿糖核苷酸(本文表示为NfANA或NfANA)、5’-Me,2’-氟核苷酸(本文表示为5Me-Nf)、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸(本文表示为vpdN)、含有乙烯基膦酸酯的核苷酸和含有环丙基膦酸酯的核苷酸(cPrpN)。2’-修饰的核苷酸(即在五元糖环的2’位具有除羟基以外的基团的核苷酸)包括但不限于2’-O-甲基核苷酸(本文在核苷酸序列中表示为小写字母‘n’)、2’-脱氧-2’-氟核苷酸(本文也称为2’-氟核苷酸，并且本文表示为Nf)、2’-脱氧核苷酸(本文表示为dN)、2’-甲氧基乙基(2’-O-2-甲氧基乙基)核苷酸(本文也称为2’-MOE，并且本文表示为NM)、2’-氨基核苷酸和2’-烷基核苷酸。对于给定化合物中的所有位置不必一致地修饰。相反，可在单个靶RNAi剂中或者甚至在其单个核苷酸中掺入多于一个修饰。可通过本领域已知的方法合成和/或修饰靶RNAi剂有义链和反义链。一个核苷酸处的修饰与另一核苷酸处的修饰无关。
修饰的核碱基包括合成和天然核碱基，比如5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代嘌呤(例如2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶或5-丙炔基胞嘧啶)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-烷基(例如6-甲基、6-乙基、6-异丙基或6-正丁基)衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-烷基(例如2-甲基、2-乙基、2-异丙基或2-正丁基)和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶、胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶、6-偶氮胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(例如5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
在一些实施方案中，RNAi剂的所有或基本上所有核苷酸为修饰核苷酸。如本文使用的其中基本上所有存在的核苷酸均为修饰核苷酸的RNAi剂为在有义链和反义链两者中4个或更少个(即0、1、2、3或4个)核苷酸为核糖核苷酸(即未修饰)的RNAi剂。如本文使用的其中基本上所有存在的核苷酸均为修饰核苷酸的有义链为在有义链中两个或更少个(即0、1或2个)核苷酸为未修饰核糖核苷酸的有义链。如本文使用的其中基本上所有存在的核苷酸均为修饰核苷酸的反义链为在有义链中两个或更少个(即0、1或2个)核苷酸为未修饰核糖核苷酸的反义链。在一些实施方案中，RNAi剂的一个或多个核苷酸为未修饰核糖核苷酸。
修饰的核苷间键
在一些实施方案中，RNAi剂的一个或多个核苷酸通过非标准连接或骨架(即修饰的核苷间键或修饰的骨架)连接。修饰的核苷间键或骨架包括但不限于硫代磷酸酯基团(本文表示为小写字体“s”)、手性硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如甲基膦酸酯或3’-亚烷基膦酸酯)、手性膦酸酯、次膦酸酯、磷酰胺(例如3’-氨基磷酰胺、氨基烷基磷酰胺或硫羰基磷酰胺)、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、吗啉代连接、具有正常3’-5’连接的硼代磷酸酯、硼代磷酸酯的2’-5’连接的类似物或具有反向极性的硼代磷酸酯，其中邻近的核苷单元对连接3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。在一些实施方案中，修饰的核苷间键或骨架缺少磷原子。缺少磷原子的修饰的核苷间键包括(但不限于)短链烷基或环烷基糖间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间连接或者一个或多个短链杂原子或杂环糖间连接。在一些实施方案中，修饰的核苷间骨架包括(但不限于)硅氧烷骨架、硫化物骨架、亚砜骨架、砜骨架、甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架、亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架、含有烯烃的骨架、氨基磺酸酯骨架、亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架、磺酸酯和磺酰胺骨架、酰胺骨架和其他具有混合N、O、S和CH2组分的骨架。
在一些实施方案中，RNAi剂的有义链可含有1、2、3、4、5或6个硫代磷酸酯键，RNAi剂的反义链可含有1、2、3、4、5或6个硫代磷酸酯键，或者有义链和反义链两者均可独立地含有1、2、3、4、5或6个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，RNAi剂的有义链可含有1、2、3或4个硫代磷酸酯键，RNAi剂的反义链可含有1、2、3或4个硫代磷酸酯键，或者有义链和反义链两者均可独立地含有1、2、3或4个硫代磷酸酯键。
在一些实施方案中，RNAi剂有义链含有至少两个硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，至少两个硫代磷酸酯核苷间键位于从有义链的3’端开始1-3位的核苷酸之间。在一些实施方案中，一个硫代磷酸酯核苷间键位于有义链的5’端，和另一个硫代磷酸酯键位于有义链的3’端。在一些实施方案中，两个硫代磷酸酯核苷间键位于有义链的5’端，和另一个硫代磷酸酯键位于有义链的3’端。在一些实施方案中，有义链不包括核苷酸之间的任何硫代磷酸酯核苷间键，但是含有在5’和3’两个端的末端核苷酸和任选存在的反向脱碱基残基末端帽之间的1、2或3个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，靶向配体经硫代磷酸酯键连接于有义链。
在一些实施方案中，RNAi剂反义链含有4个硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，4个硫代磷酸酯核苷间键位于从反义链的5’端开始1-3位的核苷酸之间和从5’端开始19-21、20-22、21-23、22-24、23-25或24-26位的核苷酸之间。在一些实施方案中，3个硫代磷酸酯核苷间键位于从反义链的5’端开始1-4位之间，和4个硫代磷酸酯核苷间键位于从反义链的5’端开始20-21位之间。在一些实施方案中，RNAi剂反义链中含有至少3个或4个硫代磷酸酯核苷间键。
在一些实施方案中，RNAi剂含有一个或多个修饰的核苷酸和一个或多个修饰的核苷间键。在一些实施方案中，将2’-修饰的核苷与修饰的核苷间键组合。
靶向配体和靶向基团
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂也可与靶向配体或靶向基团缀合以形成本发明的化合物。靶向配体或靶向基团可增强与其附接的缀合物或RNAi剂的药代动力学或生物分布特性，以改善缀合物或RNAi剂的细胞特异性(在一些情况下包括器官特异性)分布和细胞特异性(或器官特异性)摄取。靶向基团可为一价、二价、三价、四价或对其指向的靶标具有更高价。代表性的靶向基团包括但不限于对细胞表面分子具有亲和力的化合物、细胞受体配体、半抗原、抗体、单克隆抗体、抗体片段和对细胞表面分子具有亲和力的抗体模拟物。在一些实施方案中，使用接头，比如PEG接头或者1、2或3个脱碱基和/或核糖醇(脱碱基核糖)残基，使靶向基团连接于RNAi剂，在一些情况下这些残基可用作接头。在一些实施方案中，靶向基团包含整合素靶向配体。
在一些实施方案中，靶向配体增强RNAi剂与感兴趣细胞上特定细胞受体结合的能力。在一些实施方案中，与本文所述RNAi剂缀合的靶向配体对整合素受体具有亲和力。在一些实施方案中，用于与本文公开的RNAi剂一起使用的合适的靶向配体对整合素α-v-β6具有亲和力。
在一些实施方案中，本文所述RNAi剂缀合于靶向基团。靶向基团包含两种或更多种靶向配体。
在一些实施方案中，本文公开的RNAi剂与一种或多种整合素靶向配体连接，其包括以下结构或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0004172056550001011
其中Xaa1为任选地具有N-末端帽的L-精氨酸、
Figure BDA0004172056550001012
其中/>
Figure BDA0004172056550001013
表示与G’的连接点；G’为L-甘氨酸或N-甲基-L-甘氨酸；D为L-天冬氨酸(L-天门冬氨酸)；L为L-亮氨酸；Xaa2为L-α氨基酸、L-β氨基酸或α,α-二取代氨基酸；Xaa3为L-α氨基酸、L-β氨基酸或α,α-二取代氨基酸；Xaa4为L-α氨基酸、L-β氨基酸或α,α-二取代氨基酸；Xaa5为L-α氨基酸、L-β氨基酸或α,α-二取代氨基酸；和/>
Figure BDA0004172056550001014
表示与RNAi剂的连接点。
在一些实施方案中，使用“点击”化学反应，使靶向配体与RNAi剂缀合。在一些实施方案中，用一个或多个含有炔烃的基团使RNAi剂官能化，并且靶向配体包括含有叠氮化物的基团。反应后，叠氮化物和炔烃形成***。一种实例反应方案如下所示：
Figure BDA0004172056550001015
其中TL包含靶向配体，和RZZZ包含RNAi剂。
RNAi剂可包含多于一个靶向配体。在一些实施方案中，RNAi剂包含1-20个靶向配体。在一些实施方案中，RNAi剂包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19个靶向配体至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个靶向配体。
在一些实施方案中，本文所述RNAi剂包含靶向基团，其包括2种或更多种靶向配体。在一些实施方案中，靶向基团可缀合于RNAi剂有义链的5’或3’端。在一些实施方案中，靶向基团可缀合于RNAi剂上的内部核苷酸。在一些实施方案中，靶向基团可由连接在一起的两种靶向配体组成，称为“双齿”靶向基团。在一些实施方案中，靶向基团可由连接在一起的三种靶向配体组成，称为“三齿”靶向基团。在一些实施方案中，靶向基团可由连接在一起的四种靶向配体组成，称为“四齿”靶向基团。
在一些实施方案中，RNAi剂可包含与有义链的3’或5’端缀合的靶向基团以及与内部核苷酸缀合的另外的靶向配体两者。在一些实施方案中，三齿靶向基团与RNAi剂有义链的5’端缀合，和至少一个靶向配体与有义链的内部核苷酸缀合。在进一步的实施方案中，三齿靶向基团与RNAi剂有义链的5’端缀合，和四个靶向配体与有义链的内部核苷酸缀合。
连接基团和递送剂
在一些实施方案中，基于寡核苷酸的药剂，比如本文所述RNAi剂，含有或缀合于一个或多个包括但不限于连接基团或递送剂的非核苷酸基团。非核苷酸基团可增强RNAi剂的靶向、递送或附接。表22中提供了连接基团的实例。非核苷酸基团可共价连接于有义链和/或反义链的3’和/或5’端。在一些实施方案中，RNAi剂含有连接于有义链的3’和/或5’端的非核苷酸基团。在一些实施方案中，非核苷酸基团连接于RNAi剂有义链的5’端。非核苷酸基团可经接头/连接基团直接或间接地连接于RNAi剂。在一些实施方案中，非核苷酸基团经不稳定的、可裂解的或可逆的键或接头连接于RNAi剂。
在一些实施方案中，非核苷酸基团增强与其连接的RNAi剂或缀合物的药代动力学或生物分布特性，以改善缀合物的细胞或组织特异性分布和细胞特异性摄取。在一些实施方案中，非核苷酸基团增强RNAi剂的内吞作用。
可合成本文所述RNAi剂，其在5’-末端和/或3’-末端具有反应性基团，比如氨基(本文也称为胺)。随后可使用本领域典型的方法，使用反应性基团附接靶向部分。
例如，在一些实施方案中，合成在RNAi剂有义链的5’-末端具有NH2-C6基团的本文公开的RNAi剂。末端氨基随后可与例如包括对一种或多种整合素(即和整合素靶向配体)具有亲和力的化合物或PK增强剂的基团反应以形成缀合物。在一些实施方案中，合成在RNAi剂有义链的5’-末端具有一个或多个炔基的本文公开的RNAi剂。末端炔基随后可与例如包括靶向配体的基团反应以形成缀合物。
在一些实施方案中，靶向基团包含整合素靶向配体。在一些实施方案中，整合素靶向配体包括对整合素α-v-β6具有亲和力的化合物。整合素靶向配体的使用可促进细胞特异性靶向于在其各自表面上具有相应整合素的细胞，并且整合素靶向性配体的结合可促进与其连接的RNAi剂进入到细胞比如骨骼肌细胞中。使用本领域通常已知的方法，可将靶向配体、靶向基团和/或PK/PD调节剂附接于RNAi剂的3’和/或5’端，和/或附接于RNAi剂上的内部核苷酸。在以下实施例3中描述靶向配体和靶向基团的制备，比如整合素αvβ6。
本公开的一些实施方案包括用于体内递送RNAi剂至骨骼肌细胞的药用组合物。这种药用组合物可包括例如与包含对整合素αvβ6具有亲和力的整合素靶向配体的靶向基团缀合的RNAi剂。在一些实施方案中，靶向配体由对整合素αvβ6具有亲和力的化合物组成。
在一些些实施方案中，合成存在连接基团的RNAi剂，其可然后促进RNAi剂与靶向配体、靶向基团、PK/PD调节剂或另外类型递送剂的共价连接。连接基团可连接于RNAi剂有义链或反义链的3’和/或5’端。在一些实施方案中，连接基团连接于RNAi剂有义链。在一些实施方案中，连接基团缀合于RNAi剂有义链的5’或3’端。在一些实施方案中，连接基团缀合于RNAi剂有义链的5’端。连接基团的实例包括但不限于：Alk-SMPT-C6、Alk-SS-C6、DBCO-TEG、Me-Alk-SS-C6和C6-SS-Alk-Me、反应性基团(如伯胺和炔烃)、烷基、脱碱基残基/核苷酸、氨基酸、三炔烃官能化基团、核糖醇和/或PEG基团。
接头或连接基团为两个原子之间的连接，其经一个或多个共价键将一个感兴趣的化学基团(比如RNAi剂)或片段连接于另一感兴趣的化学基团(比如靶向配体、靶向基团、PK/PD调节剂或递送剂)或片段。不稳定连接含有不稳定键。连接可任选地包括增加两个接合原子之间距离的间隔基。间隔基可进一步增加连接的柔韧性和/或长度。间隔基包括(但不限于)烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基；其每一个均可含有一个或多个杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸和糖类。间隔基为本领域众所周知的，并且前述列表并不意指限制描述的范围。
在一些实施方案中，靶向基团连接于RNAi剂而无需使用另外的接头。在一些实施方案中，靶向基团设计为具有易于存在以促进与RNAi剂的连接的接头。在一些实施方案中，当两种或更多种RNAi剂包括在组合物中时，两种或更多种RNAi剂可使用相同的接头连接于它们相应的靶向基团。在一些实施方案中，当两种或更多种RNAi剂包括在组合物中时，两种或更多种RNAi剂使用不同的接头连接于它们相应的靶向基团。
RNAi剂，无论是修饰的还是未修饰的，均可含有3’和/或5’靶向基团、连接基团和/或可与PK/PD调节剂缀合或者包含PK/PD调节剂。表3、4、8、9、14和15中列出的任何RNAi剂序列或在本文另行描述，其含有3’或5’靶向配体、靶向基团、PK/PD调节剂或连接基团，或者可不含有3’或5’靶向配体、靶向基团、连接基团或PK/PD调节剂，或者可含有不同的3’或5’靶向配体、靶向基团、连接基团或PK/PD调节剂，包括但不限于表22中描绘的那些。表24中列出的任何RNAi剂双链体，无论是修饰的还是未修饰的，均可进一步包含靶向配体、靶向基团、连接基团或PK/PD调节剂，并且靶向基团或连接基团可附接于RNAi剂双链体的有义链或反义链的3’或5’末端。
在一些实施方案中，连接基团可与本文所述RNAi剂有义链的5’或3’端合成缀合。在一些实施方案中，连接基团与RNAi剂有义链的5’端合成缀合。在一些实施方案中，缀合于RNAi剂的连接基团可为三炔烃连接基团。
某些修饰核苷酸和连接基团的实例提供于表22中。
表22：代表各种修饰核苷酸和连接基团的结构。
Figure BDA0004172056550001051
/>
Figure BDA0004172056550001061
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Figure BDA0004172056550001071
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Figure BDA0004172056550001081
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Figure BDA0004172056550001091
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Figure BDA0004172056550001101
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Figure BDA0004172056550001111
或者，可使用本领域已知的其他连接基团。
除将RNAi剂连接于一个或多个靶向配体、靶向基团和/或PK/PD调节剂之外或者作为替代，在一些实施方案中，可使用递送剂将RNAi剂递送至细胞或组织。递送剂为可改善RNAi剂向细胞或组织的递送的化合物，并且可包括或由以下组成(但不限于)：聚合物(比如两亲性聚合物、膜活性聚合物)、肽、蜂毒肽、蜂毒肽样肽(MLP)、脂质、可逆修饰的聚合物或肽或者可逆修饰的膜活性多胺。
在一些实施方案中，RNAi剂可与脂质、纳米颗粒、聚合物、脂质体、胶束、DPC或本领域可获得的其他递送***组合。RNAi剂也可化学缀合于靶向基团、脂质(包括但不限于胆甾醇和胆甾醇基衍生物)、纳米颗粒、聚合物、脂质体、胶束、DPC(参见例如WO 2000/053722、WO2008/022309、WO 2011/104169和WO 2012/083185、WO 2013/032829、WO 2013/158141，其每一个通过引用结合至本文中)或本领域可获得的其他递送***。
药用组合物
在一些实施方案中，本公开提供包括式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)中的一种或多种化合物、由其组成或基本上由其组成的药用组合物。
如本文使用的“药用组合物”包含药理学有效量的活性药用成分(API)和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂(赋形剂)为除活性药用成分(API，治疗性产物)以外意欲包括在药物递送***中的物质。赋形剂不以或不旨在以预期剂量发挥治疗作用。赋形剂可用于：a)助于药物递送***在制造期间的处理，b)保护、支持或增强API的稳定性、生物利用度或患者可接受性，c)助于产物鉴定；和/或d)增强API在储存或使用期间的整体安全性、有效性或递送的任何其他属性。药学上可接受的赋形剂可为或可不为惰性物质。
赋形剂包括但不限于：吸收增强剂、抗粘剂、消泡剂、抗氧化剂、黏合剂、缓冲剂、载体、包衣剂、色素、递送增强剂、递送聚合物、葡聚糖、右旋糖、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、矫味剂、助流剂、保湿剂、润滑剂、油、聚合物、防腐剂、盐水、盐、溶剂、糖类、悬浮剂、持续释放基质、甜味剂、增稠剂、张度剂、媒介物、憎水剂和湿润剂。
本文所述药用组合物可含有药用组合物中通常存在的其他另外组分。在一些实施方案中，另外组分为药用活性材料。药用活性材料包括但不限于：止痒剂、收敛剂、局部***或抗炎剂(例如抗组胺剂、苯海拉明等)、小分子药物、抗体、抗体片段、适体和/或疫苗。
药用组合物还可含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、气味剂、用于渗透压变化的盐、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。它们还可含有具有已知治疗益处的其他药剂。
可以多种方式施用药用组合物，这取决于是否期望局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可通过本领域通常已知的任何方式进行，比如但不限于局部(例如通过透皮贴剂)、肺部(例如通过吸入或吹入粉剂或气雾剂，包括通过喷雾器、气管内、鼻内)、表皮、透皮、口服或肠胃外。肠胃外施用包括但不限于静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注、皮下(例如经植入装置)、颅内、脑实质内、鞘内和脑室内施用。在一些实施方案中，本文所述药用组合物通过皮下注射施用。药用组合物可口服，例如以片剂、包衣片剂、糖衣丸、硬或软明胶胶囊剂、溶液剂、乳剂或混悬剂的形式施用。施用也可直肠，例如使用栓剂；局部或经皮，例如使用软膏剂、乳膏剂、凝胶剂或溶液剂；或肠胃外，例如使用可注射溶液剂进行。
适合于可注射用途的药用组合物包括无菌水溶液剂(当水溶性时)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液剂或分散体的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、
Figure BDA0004172056550001131
EL(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸盐缓冲盐水。其在制造和储存条件下应为稳定的，并且应保存起来以防微生物比如细菌和真菌的污染作用。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。可例如通过使用包衣(比如卵磷脂)，通过在分散体的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在许多情况下，优选的是在组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇(比如甘露醇、山梨醇)和氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，可实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液剂可通过将所需量的活性化合物与按需的以上列举的一种成分或组合一起掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备。通常，分散体通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和所需的来自那些以上列举的其他成分的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉剂的情况下，制备方法包括真空下干燥和冷冻干燥，从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何另外期望成分的粉剂。
适合于关节内施用的制剂可呈本文所述任何配体的无菌水性制剂的形式，其可以微晶形式存在，例如呈水性微晶混悬剂的形式。脂质体制剂或生物可降解聚合物***也可用于呈现本文所述用于关节内和眼科施用两者的任何配体。
活性化合物可用保护化合物免于从体内快速消除的载体来制备，比如控制释放制剂，包括植入剂和微囊化递送***。可使用生物可降解的生物相容性聚合物，比如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的方法为本领域技术人员显而易见的。脂质体混悬剂也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如如美国专利第4,522,811号所述。
药用组合物可含有药用组合物中通常存在的其他另外组分。这种另外组分包括但不限于：止痒剂、收敛剂、局部***或抗炎剂(例如抗组胺剂、苯海拉明等)。如本文使用的“药理学有效量”、“治疗有效量”或简单地“有效量”是指产生药理学、治疗性或预防性结果的药用活性剂的量。
含有式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的药物也为本发明的一个目的，用于制造这种药物的方法也是如此，其方法包括使一种或多种式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物，和如果需要，一种或多种具有已知治疗益处的其他物质转化为药学上可接受的形式。
所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物和包含本文公开的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的药用组合物可包装或包含在试剂盒、容器、包装或分配器中。式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物和包含式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的药用组合物可包装在预先填充的注射器或小瓶中。
治疗和抑制表达的方法
本文公开的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物可用于治疗患有从施用这种化合物中受益的疾病或障碍的受试者(例如人类或其他哺乳动物)。在一些实施方案中，本文公开的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物可用于治疗从降低和/或抑制靶mRNA表达和/或蛋白水平中受益的受试者(例如人类)，例如已诊断具有或患有与肌营养不良相关的症状的受试者。
在一些实施方案中，施用给受试者治疗有效量的一种或多种本文公开的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物。治疗受试者可包括治疗性和/或预防性治疗。施用给受试者治疗有效量的一种或多种本文公开的式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物。受试者可为人类、患者或人类患者。受试者可为成人、青少年、儿童或婴儿。本文所述药用组合物的施用可为对人或动物。
本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物可用于在患有与靶基因相关的疾病或障碍或患有至少部分由靶基因表达介导的疾病或障碍的受试者中治疗至少一种症状。在一些实施方案中，式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物用于治疗或管理患有受益于或至少部分由靶基因mRNA的减少介导的疾病或障碍的受试者的临床表现。施用给受试者治疗有效量的本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物中的一种或多种或组合物。在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用给待治疗的受试者包含本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的组合物。在一些实施方案中，施用给受试者预防有效量的所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物中的一种或多种，从而通过预防或抑制至少一种症状来治疗受试者。
在某些实施方案中，本公开提供用于在需要它的患者中治疗至少部分由靶基因表达介导的疾病、障碍、病症或病理状态的方法，其中方法包括施用给患者本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物中的任何一种。
在一些实施方案中，在施用本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的受试者中靶基因的基因表达水平和/或mRNA水平相对于施用化合物之前的受试者或未接受化合物的受试者降低至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％。受试者中的基因表达水平和/或mRNA水平在受试者的细胞、细胞群和/或组织中可降低。
在一些实施方案中，在施用本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物的受试者中靶蛋白水平相对于施用化合物之前的受试者或未接受化合物的受试者降低至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％。受试者中的蛋白水平在受试者的细胞、细胞群、组织、血液和/或其他流体中可降低。
靶mRNA水平和/或靶蛋白水平的降低可通过本领域已知的任何方法来评价。如本文使用的靶mRNA水平和/或蛋白水平的降低或减少在本文中统称为靶基因和/或蛋白水平的降低或减少或者抑制或降低靶基因的表达。
在一些实施方案中，本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物可用于制备用于治疗至少部分由靶基因表达介导的疾病、障碍或症状的药用组合物。在一些实施方案中，至少部分由靶基因表达介导的疾病、障碍或症状为肌营养不良。
在一些实施方案中，治疗受试者的方法取决于受试者的体重。在一些实施方案中，式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物可以约0.05mg/kg-约40.0mg/kg受试者体重的剂量施用。在其他实施方案中，式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物可以约5mg/kg-约20mg/kg受试者体重的剂量施用。
在一些实施方案中，式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物可以分割剂量施用，这意指在短时间段(例如少于24小时)内给予受试者两次剂量。在一些实施方案中，期望每天量的约一半在初始施用中施用，而期望每天量的剩余约一半在初始施用之后约4小时施用。
在一些实施方案中，本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物可一周一次(例如每周一次)施用。在其他实施方案中，本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物可两周一次(每隔一周一次)施用。
在一些实施方案中，本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物或含有这种化合物的组合物可用于治疗至少部分由靶基因表达介导的疾病、障碍或症状。在一些实施方案中，至少部分由靶基因表达介导的疾病、障碍或症状为肌营养不良。
本发明的另一方面提供一种在体内减少靶基因表达的方法，方法包括向细胞引入本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物，其中化合物包含与靶基因至少基本上互补的RNAi剂。在一些实施方案中，细胞为骨骼肌细胞。在一些实施方案中，细胞在受试者体内。在一些实施方案中，受试者已诊断患有通过减少靶基因表达来治疗、预防或改善的疾病或障碍。在一些实施方案中，疾病或障碍为选自杜氏肌营养不良、强直性肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良和埃默里-德赖弗斯肌营养不良的肌营养不良。
本发明的另一方面提供本文所述与基于寡核苷酸的药剂缀合的脂质PK/PD调节剂中的任何一种用于治疗、预防或改善疾病或障碍的用途。在一些实施方案中，疾病或障碍为选自杜氏肌营养不良、强直性肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良和埃默里-德赖弗斯肌营养不良的肌营养不良。
细胞、组织和非人类生物体
考虑包括本文所述式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物中至少一种的细胞、组织和非人类生物体。通过经本领域可获得的任何手段将式(I)、(Ia)、(Ib)、(Ib1)、(Ic)、(Id)、(II)、(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IV)或(IVa)化合物递送至细胞、组织或非人类生物体，可制备细胞、组织和非人类生物体。在一些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞，包括但不限于人类细胞。在一些实施方案中，细胞为骨骼肌细胞。
现用以下非限制性实施例来说明以上提供的实施方案和项目。
实施例
以下实施例不是限制性的，并且旨在说明本文所公开的某些实施方案。
除非另外明确说明，否则用于指代给定实施例的化合物的数字仅参考该特定实施例而非本文公开的任何其他实施例。例如，实施例4中“LP1-p的合成”的化合物1不同于且不指代实施例4中“LP-5p的合成”的化合物1。类似地，应当意识到，本文公开的特定化合物可在不同实施例中通过不同数字来标识。例如，实施例4中“LP223-p的合成”的化合物12与实施例4中“LP224-p的合成”的化合物3相同。在整个详细描述的各个表中公开的化合物(即LPXXa、LPXXb和LPXX-p，其中XX为数字)在本文的整个实施例中被一致地提及。
表23：实施例中使用的一些常见缩写。
Figure BDA0004172056550001191
Figure BDA0004172056550001201
应当意识到，除非另外明确说明，否则在本文的实施例中使用的术语“EDC”是指市售可获得的EDC盐酸盐。
实施例1.RNAi剂和组合物的合成。
以下描述用于合成某些RNAi剂及其缀合物的一般程序，其在本文阐述的非限制性实施例中加以说明。
RNAi剂的合成。RNAi剂可使用本领域通常已知的方法合成。为合成本文阐述的实施例中说明的RNAi剂，根据寡核苷酸合成中使用的固相亚磷酰胺技术合成了RNAi剂的有义和反义链。根据规模，使用
Figure BDA0004172056550001202
(Bioautomation)、/>
Figure BDA0004172056550001203
(Bioautomation)或Oligopilot 100(GE Healthcare)。合成在由可控孔度玻璃(CPG,
Figure BDA0004172056550001204
或/>
Figure BDA0004172056550001205
得自Prime Synthesis,Aston,PA,USA)或聚苯乙烯(得自Kinovate,Oceanside,CA,USA)制成的固体支撑物上进行。所有RNA和2’-修饰RNA亚磷酰胺均购自Thermo Fisher Scientific(Milwaukee,WI,USA)、ChemGenes(Wilmington,MA,USA)或Hongene Biotech(Morrisville,NC,USA)。具体地讲，以下使用的2’-O-甲基亚磷酰胺包括如下：(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲酰基)-2’-O-甲基-腺苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5’-O-二甲氧基-三苯甲基-N4-(乙酰基)-2’-O-甲基-胞苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺、(5’-O-二甲氧基三苯甲基-N2-(异丁酰基)-2’-O-甲基-鸟苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺和5’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-尿苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2’-脱氧-2’-氟-亚磷酰胺和2’-O-炔丙基亚磷酰胺与2’-O-甲基亚磷酰胺携带相同的保护基团。5’-二甲氧基三苯甲基-2’-O-甲基-肌苷-3’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺购自GlenResearch(Virginia)。反向脱碱基(3’-O-二甲氧基三苯甲基-2’-脱氧核糖-5’-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基氨基)亚磷酰胺购自ChemGenes。以下使用的UNA亚磷酰胺包括如下：5’-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N6-(苯甲酰基)-2’,3’-开环-腺苷、2’-苯甲酰基-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5’-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N-乙酰基-2’,3’-开环-胞嘧啶、2’-苯甲酰基-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺、5’-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-N-异丁酰基-2’,3’-开环-鸟苷、2’-苯甲酰基-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺和5’-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’,3’-开环-尿苷、2’-苯甲酰基-3’-[(2-氰基乙基)-(N,N-二异丙基)]-亚磷酰胺。为引入硫代磷酸酯键，采用3-苯基1,2,4-噻唑啉-5-酮(POS,得自PolyOrg,Inc.,Leominster,MA,USA)在无水乙腈中的100mM溶液或氢化黄原素(TCI America,Portland,OR,USA)在吡啶中的200mM溶液。
也市售购置TFA aminolink亚磷酰胺(ThermoFisher)以引入(NH2-C6)反应性基团接头。将TFA aminolink亚磷酰胺溶解于无水乙腈中(50mM)并加入分子筛
Figure BDA0004172056550001211
5-苄硫基-1H-四唑(BTT,250mM在乙腈中)或5-乙硫基-1H-四唑(ETT,250mM在乙腈中)用作活化剂溶液。偶联时间为10min(RNA)、90sec(2’O-Me)和60sec(2’F)。合成含有三炔烃的亚磷酰胺以引入相应的(TriAlk#)接头。当与本文某些实施例中呈现的RNAi剂结合使用时，将含有三炔烃的亚磷酰胺溶解于无水二氯甲烷或无水乙腈中(50mM)，同时所有其他亚酰胺溶解于无水乙腈中(50mM)并加入分子筛/>
Figure BDA0004172056550001212
5-苄硫基-1H-四唑(BTT,250mM在乙腈中)或5-乙硫基-1H-四唑(ETT,250mM在乙腈中)用作活化剂溶液。偶联时间为10min(RNA)、90sec(2’O-Me)和60sec(2’F)。/>
对于一些RNAi剂，在有义链的3’末端引入接头，比如C6-SS-C6或6-SS-6基团。预先加载的树脂为市售获得的具有相应接头。或者，对于一些有义链，使用dT树脂并然后经标准亚磷酰胺合成添加相应的接头。
支撑物结合的寡聚物的裂解和脱保护。固相合成结束之后，将干燥的固体支撑物在30℃下用1:1体积在水中的40重量(wt.)％甲胺溶液和28％-31％氢氧化铵溶液(Aldrich)处理1.5小时。蒸发溶液并将固体残余物以水重构(参见以下)。
纯化。使用
Figure BDA0004172056550001221
SuperQ-5PW 13μm柱(可得自Tosoh Biosciences)和Shimadzu LC-8***，通过阴离子交换HPLC纯化粗品寡聚物。缓冲液A为20mM Tris,5mMEDTA,pH 9.0并含有20％乙腈，和缓冲液B与缓冲液A相同(添加1.5M氯化钠)。记录260nm下的UV迹线。合并适当的级分，然后使用装有Sephadex G25细粉(可得自Sigman Aldrich)的GE Healthcare XK 16/40柱，用100mM碳酸氢铵(pH 6.7)和20％乙腈或过滤水的运行缓冲液在尺寸排阻HPLC上运行。
退火。通过在1×PBS(磷酸盐缓冲盐水,1×,Corning,Cellgro)中合并等摩尔RNA溶液(有义和反义)来混合互补链以形成RNAi剂。将一些RNAi剂冻干并储存于-15至-25℃下。通过在1×PBS中于UV-Vis光谱仪上测量溶液吸光度来确定双链体浓度。然后将溶液在260nm下的吸光度乘以转换因子和稀释因子以确定双链体浓度。使用的转换因子为0.037mg/(mL·cm)或从实验确定的消光系数计算。
三炔烃骨架的合成后缀合。在退火之前或之后，RNAi剂的5’或3’胺官能化有义链可缀合于三炔烃骨架。以下描述三炔烃骨架与退火双链体的缀合：胺官能化双链体以约50-70mg/mL溶解于90％DMSO/10％ H2O中。加入40eq三乙胺(TEA)，然后加入3eq三炔烃-PNP。一旦完成，将缀合物在1x磷酸盐缓冲盐水/乙腈(1:14比率)的溶剂***中沉淀两次并干燥。
实施例2.连接基团的合成
L4的合成
Figure BDA0004172056550001231
在室温下向化合物1(3.00g)在DMF中的溶液中加入Cs2CO3(7.71g)。然后缓慢加入化合物2(1.85mL)。所得反应混合物在N2(g)下搅拌过夜。然后通过LC-MS证实近乎完全转化为期望的产物。反应混合物用NaHCO3(10mL)淬灭。产物用EtOAc(5x10mL)提取并然后用水(3x8mL)和盐水(8mL)洗涤。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001234
纯化残余物，梯度为己烷至EtOAc(0-30％)，其中产物以14％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供白色固体。LC-MS：计算值[M+H]+191.06m/z，观测值191.23m/z。
Figure BDA0004172056550001232
在正常大气压下于室温下向化合物3(2.87g)的1:1THF/水中的溶液中加入LiOH(1.08g)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到化合物3完全转化。经EtOAc提取残余的起始材料，并然后用6N HCl将水相酸化至pH为约3。化合物4破碎成白色固体并经真空下过滤且用水洗涤。由于其湿/粘性质，需要溶剂将固体转移至圆底烧瓶；经MeOH和DCM转移材料。由于在任一溶剂和组合中的溶剂化较差，材料不能经Na2SO4干燥。真空下浓缩化合物4，提供白色蓬松的结晶固体并且直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+H]+177.05m/z，观测值177.19m/z。
Figure BDA0004172056550001233
在室温下向化合物4(1.00g)和5(1.04g)在DMF(10.0mL)中的溶液中于N2(g)下加入EDC(1.20g)。使反应混合物搅拌直至通过LC-MS观察到完全转化。由于过夜搅拌之后无法成功地观察产物，反应混合物用NaHCO3淬灭。经LC-MS证实所得沉淀含有起始材料并经真空下过滤，尝试在MeOH/DCM中重新悬浮，并然后真空下浓缩。然后混合物重新溶解于DMF中，经Na2SO4干燥，经真空下过滤并用DMF冲洗。将EDC重新加入到DMF中的滤液(即化合物4和5)中，并使生成的混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物直接浓缩并与MeOH和PhMe共沸进行分离。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001242
纯化残余物并用DCM中的0-20％ MeOH洗脱。在0％ B下洗脱L4，提供白色固体。LC-MS：计算值[M+H]+325.04m/z，观测值325.35m/z。
实施例3.靶向配体的合成
αvβ6肽1的合成
Figure BDA0004172056550001241
/>
Figure BDA0004172056550001251
通过修饰如上所述以4.1mmol规模利用Fmoc-Peg5-CO2H预先加载的2-Cl-Trt树脂(0.79mmol/g)在CS Bio肽合成仪上使用一般法Fmoc肽化学获得的Arg-Gly-Asp(tBu)-Leu-Ala-Abu-Leu-Cit-Aib-Leu-Peg5-CO2-2-Cl-Trt树脂1-1制备αvβ6肽1。从树脂裂解后，肽1-2转化成四氟苯基酯1-3，并且粗品产物用于下一步骤而无需纯化。
最终脱保护通过用脱保护混合物TFA/TIS/H2O＝90:5:5(80mL)将粗品肽1-3处理1.5小时来完成。将反应混合物滴加至甲基叔丁基醚(700mL)中，并通过离心收集所得沉淀。团粒用另外的甲基叔丁基醚(500mL)洗涤。残余物通过反相(RP)-HPLC(Phenomenex GeminiC18 250x50mm,10微米,60mL/min,在含有0.1％ TFA的水中的30-45％ACN梯度，每次运行约1克粗品)纯化，得到4.25g纯肽1-4(αvβ6肽1)。
αvβ6肽6的合成
Figure BDA0004172056550001261
通过修饰如上所述以0.2mmol规模利用Fmoc-Peg5-CO2H预先加载的2-Cl-Trt树脂(0.85mmol/g)在Symphony肽合成仪上使用一般法Fmoc肽化学获得的GBA-Gly-Asp(tBu)-Leu-Ala-Abu-Leu-Cit-Aib-Leu-Peg5-CO2-2-Cl-Trt树脂6-1制备αvβ6肽6。从树脂裂解后，肽6-2转化成四氟苯基酯6-3，并使用***DCM中的20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001262
上纯化，梯度15-100％，25分钟，得到160mg纯肽6-3。最终脱保护通过用脱保护混合物TFA/TIS/H2O＝90:5:5(80mL)将粗品肽6-3处理1.5小时来完成。将反应混合物滴加至甲基叔丁基醚(700mL)中，并通过离心收集所得沉淀。团粒用另外的甲基叔丁基醚(500mL)洗涤。残余物通过使用以下条件的HPLC纯化进行纯化：ACN(TFA 0.1％)在H2O(TFA 0.1％)27-57％中，25分钟，产量94mg。计算值MW 1527.76，1/2M＝763.88。实测值：MS(ES,pos)：1529.48[M+1]+；765.39[M+2]2+。
αvβ6化合物45，(S)-3-(4-(4-((14-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氧基)萘-1-基)苯基)-3-(2-(5-((4-甲基吡啶-2-基)氨基)戊酰氨基)乙酰氨基)丙酸的合成
Figure BDA0004172056550001271
在室温下向化合物1(0.50g)在DMF中的溶液中于N2(g)下加入Cs2CO3(0.94g)。然后缓慢滴加化合物2(0.49g)。反应混合物搅拌过夜。然后通过LC-MS证实约50％转化为期望的产物。反应混合物用NaHCO3(10mL)淬灭。产物用EtOAc(3x15mL)提取并然后用水(3x10mL)和盐水(10mL)洗涤。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤和浓缩。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001273
纯化残余物，梯度为己烷中的0-70％ EtOAc，其中产物以16％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供透明的油(0.35g,45.0％产率)。LC-MS：计算值[M+H]+323.19m/z，观测值328.38m/z。
Figure BDA0004172056550001272
在正常大气压下于室温下向化合物3(0.35g)在1:1THF/水中的溶液中加入LiOH(0.078g)。在室温下搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。1小时之后，反应混合物用6N HCl酸化至pH为约3。产物用EtOAc(3x15mL)提取。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，提供为透明无色油的化合物4(0.32g,94.9％产率)。无需分离。LC-MS：计算值[M+H]+309.17m/z，观测值309.24m/z。
Figure BDA0004172056550001281
在室温下向化合物5(1300mg,7.42mmol,1.0equiv.)、化合物6(2295mg,7.792mmol,1.05equiv.)和二异丙基乙胺(3.878mL,22.262mmol,3.0equiv.)的无水DMF(10mL)中的溶液中加入TBTU(2859mg,8.905mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时。反应混合物用饱和NaHCO3水溶液(5mL)淬灭并且水相用乙酸乙酯(3x5mL)提取。合并的有机相经无水Na2SO4干燥并浓缩。产物通过
Figure BDA0004172056550001283
纯化，用DCM中的2-4％ MeOH洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+415.08，实测值415.29。产量：0.19g，6.04％。/>
Figure BDA0004172056550001282
将化合物7(3.20g,7.705mmol,1.0equiv.)、化合物8(3.12g,11.558mmol,1.5equiv.)、XPhos Pd G2(121mg,0.154mmol,0.02equiv.)和K3PO4(3.27g,15.411mmol,2.0equiv.)在圆底烧瓶中混合。用螺口盖隔垫密封烧瓶，并然后排空且用氮气回填(该过程总共重复3次)。然后，经注射器加入THF(20mL)和水(4mL)。反应混合物用氮气鼓泡10分钟并在40℃下保持3小时。反应混合物用饱和NaHCO3水溶液(20mL)淬灭，并且水相用乙酸乙酯(3×20mL)提取。合并的有机相经Na2SO4干燥并浓缩。化合物9通过
Figure BDA0004172056550001294
纯化，并用DCM中的2-4％ MeOH洗脱。
Figure BDA0004172056550001291
在室温下向化合物9(1.61g,3.364mmol,1.0equiv.)和化合物10(1.75g,4.205mmol,1.25equiv.)在无水DMF(10mL)中的溶液中加入碳酸铯(2.19g,6.728mmol,2.0equiv.)。反应混合物在50℃下保持2小时。反应混合物用水(20mL)淬灭并用乙酸乙酯(3x10mL)提取。合并有机相，经无水Na2SO4干燥并浓缩。化合物11通过
Figure BDA0004172056550001292
纯化，并用DCM中的2-4％ MeOH洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+724.35，实测值724.60。
Figure BDA0004172056550001293
在室温下向化合物11(1880mg,2.597mmol,1.0equiv.)在无水二氧六环(3mL)中的溶液中加入二氧六环中的HCl(3.25mL,12.986mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时。去除溶剂并且化合物12直接使用无需纯化。LC-MS：计算值[M+H]+624.30，实测值624.41。
Figure BDA0004172056550001301
在室温下向化合物12(0.10g)和4(0.049g)在DMF中的溶液中加入TBTU(0.058g)并然后加入DIPEA(0.079mL)。反应搅拌1小时直至通过LC-MS观察到完全转化。然后反应混合物用NaHCO3(10mL)淬灭。产物用EtOAc(3x15mL)提取并然后用水(3x10mL)和盐水(10mL)洗涤。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001302
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-70％)，其中化合物13以23％ B洗脱。真空下浓缩产物，提供透明无色的油(0.088g,产率63.6％.)。
Figure BDA0004172056550001303
在室温下向化合物13(0.088g)在DCM中的溶液中加入TFA(0.22mL)。反应混合物在室温下搅拌5小时直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe共沸并真空下浓缩。无需分离。浓缩提供为透明无色的油的化合物14(0.10g,产率113％)。LC-MS：计算值[M+H]+814.41m/z，观测值814.63m/z。
Figure BDA0004172056550001311
在正常大气压下于室温下向化合物14(0.10g)在1:1THF/水中的溶液中加入LiOH(0.0078g)。在室温下搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。4小时之后，反应混合物用6N HCl酸化至pH为约3。产物用20％ CF3CH2OH/DCM(3x15mL)提取。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并浓缩，提供为浅黄色固体的化合物15(0.104g,产率119％)。LC-MS：计算值[M+H]+800.39m/z，观测值800.76m/z。
实施例4.脂质PK/PD调节剂前体的合成
LP1-p的合成
Figure BDA0004172056550001312
在室温下向化合物1(2630mg,1.142mmol,1.0equiv.)、化合物2(428mg,1.256mmol,1.1equiv.)和二异丙基乙胺(0.597mL,3.427mmol,3.0equiv.)在无水DMF(10mL)中的溶液中加入TBTU(440mg,1.371mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时并然后浓缩。化合物3通过
Figure BDA0004172056550001313
纯化，用DCM中的12-17％ MeOH洗脱。LC-MS：计算值[M+4H]+/4 656.66，实测值656.65。
Figure BDA0004172056550001321
在室温下向化合物3(1150mg,0.438mmol,1.0equiv.)的固体中加入HCl在二氧六环中的溶液(5.478mL,21.910mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持30分钟并然后浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+3H]+/3 841.88，实测值842.56，计算值[M+4H]+/4 631.66，实测值632.41。
Figure BDA0004172056550001322
/>
在室温下向化合物5(175mg,0.203mmol,1.0equiv.)和化合物4(1095mg,0.427mmol,2.1equiv.)在无水DCM(10mL)中的溶液中加入TEA(0.144mL,1.018mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持3小时并真空下去除溶剂。通过
Figure BDA0004172056550001323
纯化LP1-p，用DCM中的10-17％ MeOH洗脱。LC-MS：计算值[M+6H]+/6 946.60，实测值947.10，计算值[M+7H]+/7 811.51，实测值811.35。
LP5-p的合成
Figure BDA0004172056550001331
DMF中的化合物1(105mg,0.198mmol)用TBTU(4equiv.)处理并搅动5分钟。随后加入DIEA(8equiv.)并将混合物加入到预先溶胀的2-氯三苯甲基树脂上的1摩尔当量的乙胺二胺中。搅动30分钟之后，树脂用DMF洗涤3次并然后用DMF中的2％肼处理10分钟。使用与化合物1的偶联相同的程序重复棕榈酸(202mg,0.789mmol)的偶联。完成后，树脂用3份DCM洗涤并用TFA在DCM中的1％溶液处理10分钟。重复TFA处理并用3份DCM洗涤树脂。去除所有挥发物并且使用粗品化合物2而无需进一步纯化。产量126mg(81％)。
Figure BDA0004172056550001332
向在DMF(1mL)中含有化合物2(23mg,37μmol)和DIEA(14.1μL,81μmol)的混合物中加入NHS-PEG24-MAL(化合物3,61.5mg,0.0441mmol)并将反应混合物搅拌30分钟。完成后，将粗品LP5-p干燥加载到硅胶上并分离，在DCM中的MeOH梯度洗脱。产量15mg(21％)。
LP28-p的合成
Figure BDA0004172056550001341
在室温下向化合物1(80mg)和2(60.2mg)在DMF中的溶液中加入TBTU(90.3mg)和然后加入DIPEA(0.147mL)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经20-30分钟通过
Figure BDA0004172056550001342
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-80％，等度洗脱，并然后至100％)，其中化合物3以68％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+2567.65m/z，观测值1301.78(+2/2,+H2O)m/z。
Figure BDA0004172056550001343
在室温下向化合物3(100.4mg)中加入4M HCl/二氧六环(14.3mg)。在室温下搅拌反应混合物。反应混合物搅拌过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe共沸并真空下浓缩过夜，提供为油的化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+2467.60m/z，观测值1243.32m/z。
Figure BDA0004172056550001344
Figure BDA0004172056550001351
制备化合物4(97.9mg)和TEA(0.016mL)在无水DCM中的溶液并在鼓泡氮气气氛下搅拌。然后将化合物5(15.8mg)加入到反应混合物中。在室温下搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001352
纯化残余物并用DCM中的0-20％ MeOH梯度(0-100％ B)洗脱。LP28-p以67％B洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+5562.48m/z，观测值1409.68(+4/4,+H2O)m/z。
LP29-p的合成
Figure BDA0004172056550001353
在室温下向化合物1(40mg)和2(334mg)在DMF中的溶液中加入TBTU(50.1mg)和然后加入DIPEA(0.082mL)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经20-30分钟通过
Figure BDA0004172056550001354
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-80％)，其中化合物3以71％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+2539.62m/z，观测值1288.21(+2/2,+H2O)m/z。
Figure BDA0004172056550001361
在室温下向化合物3(147mg)中加入4M HCl/二氧六环(21.2mg)。在室温下搅拌反应混合物。搅拌反应混合物过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe共沸并真空下浓缩过夜，提供为油的化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+2439.57m/z，观测值611.16(+4/4)m/z。
Figure BDA0004172056550001362
制备化合物4(143mg)和TEA(0.024mL)在无水DCM中的溶液并在鼓泡氮气气氛下搅拌。然后将化合物5(23.4mg)加入到反应混合物中。在室温下搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。
然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001363
纯化残余物并用DCM中的0-20％ MeOH梯度洗脱(0-100％ B)。LP29-p以54％ B洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+5506.42m/z，观测值1854.41(+3/3,+H2O)m/z。
LP33-p的合成
Figure BDA0004172056550001371
在室温下向化合物1(2.00g,4.45mmol)和2(1.07g,6.68mmol)在无水DCM中的溶液中加入NEt3(1.86mL,13.4mmol)。搅拌反应直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经45分钟通过
Figure BDA0004172056550001372
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％ B)，其中化合物3以8％ B洗脱。浓缩化合物3，提供白色固体。LC-MS：计算值[M+H]+573.46m/z，观测值573.60m/z。
Figure BDA0004172056550001373
/>
在室温下向化合物3(317mg,0.553mmol)中加入4M HCl/二氧六环(1.383mL)。在室温下搅拌反应混合物。搅拌反应混合物过夜直至经LC-MS证实完全转化。在高真空下浓缩反应混合物过夜，提供为透明和无色油腻残余物的化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+473.40m/z，观测值473.58m/z。
Figure BDA0004172056550001381
向化合物4(282mg,0.553mmol)和5(1.35g,0.526mmol)在无水DCM中的溶液中于N2(g)下加入NEt3(0.386mL)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经45分钟通过
Figure BDA0004172056550001382
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％)，其中LP33-p以46％ B洗脱。浓缩LP33-p，提供白色固体。LC-MS：计算值[M+H]+2879.76m/z，观测值960.98(+3/3)m/z。
LP38-p的合成
Figure BDA0004172056550001383
在室温下向化合物1(35mg)和2(299mg)在DMF中的溶液中加入TBTU(43.8mg)和然后加入DIPEA(0.071mL)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经20-30分钟通过
Figure BDA0004172056550001391
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％)，其中化合物3以56％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+2539.62m/z，观测值1288.07(+2/2,+H2O)m/z。/>
Figure BDA0004172056550001392
在室温下向化合物3(186mg)中加入4M HCl/二氧六环(26.7mg)。在室温下搅拌反应混合物。反应混合物搅拌过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe共沸并真空下浓缩过夜，提供为油的化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+2439.57m/z，观测值1220.97(+2/2)m/z。
Figure BDA0004172056550001393
在室温下向化合物4(181mg)、TBTU(24mg)和DIEA(0.033mL)在DMF中的溶液中加入化合物5(8.7mg)。搅拌反应直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经20-30分钟通过
Figure BDA0004172056550001394
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％MeOH(0-100％)，其中化合物6以65％ B洗脱。真空下浓缩化合物6，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+5089.22m/z，观测值1036.24(+5/5,+H2O)m/z。/>
Figure BDA0004172056550001401
在室温下向化合物6(130mg)中加入4M HCl/二氧六环(9.3mg)。在室温下搅拌反应混合物。反应混合物搅拌过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe共沸并真空下浓缩过夜，提供为油的化合物7。LC-MS：计算值[M+H]+4989.17m/z，观测值1248.58(+4/4)m/z。
Figure BDA0004172056550001402
Figure BDA0004172056550001411
在室温下制备化合物7(128mg)和NEt3(0.018mL)在无水DCM中于鼓泡N2(g)下的溶液。然后缓慢加入化合物8(10.3mg)。使得搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经30分钟通过
Figure BDA0004172056550001412
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％)，其中LP38-p以100％ B洗脱。浓缩LP38-p，提供白色固体。LC-MS：计算值[M+H]+5299.28m/z，观测值1786.62(+3/3,+H2O)m/z。
LP39-p的合成
Figure BDA0004172056550001413
/>
Figure BDA0004172056550001421
将Boc保护的PEG23-胺1(Quanta Biodesign Limited,200mg,0.17mmol)与氯甲酸胆甾醇酯2(77mg,0.17mmol)和Et3N(48μL,0.341mmol)在5mL的DCM中一起搅拌1.5h。真空下去除溶剂，残余物与SiO2(1g)混合并加载于
Figure BDA0004172056550001422
上。使用***DCM中的0-20％MeOH纯化化合物3，梯度为0-80％，40分钟。计算值MW 1586.09,M+18＝1604.09,(M+2x18)/2＝811.05实测值：MS(ES,pos):1603.55[M+NH4]+,811.07[M+2NH4]2+。
使产物3脱Boc保护并将所得盐酸盐4(62mg,0.04mmol)与五氟苯基酯5(24mg,0.04mmol)和Et3N(14μL,0.1mmol)在DCM(5mL)中一起搅拌1.5小时。真空下去除溶剂，残余物与SiO2(400mg)混合并加载于
Figure BDA0004172056550001431
上。纯化产物6，使用***DCM中的0-20％MeOH，梯度为0-70％，30分钟。产量57mg。计算值MW 1893.44，M+18＝1911.44，(M+2x18)/2＝964.72实测值：MS(ES,pos)：1911.00[M+NH4]+，964.46[M+2NH4]2+。/>
产物6用二氧六环中的4M HCl(10mL)于室温下处理4小时。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯2次，干燥产物7并直接用于下一步骤。
将固体TBTU(50mg,0.156mmol)加入到Boc保护的PEG23-胺1(Quanta BiodesignLimited,152mg,0.13mmol)、棕榈酸8(33mg,0.13mmol)和DIEA(68μL,0.39mmol)在DMF(9mL)中的溶液中。反应混合物经声波处理以溶解固体并在室温下搅拌16小时。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯2次，将残余物溶解于氯仿(50mL)中，用NaHCO3(2x10mL)和盐水(10mL)洗涤。干燥(Na2SO4)化合物9，真空下浓缩，并使用***DCM：在DCM中的20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001433
上(SiO2)纯化，梯度0-80％，20min。计算值MW 1411.85，M+18＝1429.85，(M+1+18)/2＝715.43实测值：MS(ES,pos)：1429.24[M+NH4]+，715.41[M+H+NH4]2+。
9用HCl/二氧六环溶液进行脱Boc保护并且化合物10直接用于下一步骤。
衍生物7(60mg,0.028mmol)与盐酸盐10(42mg,0.03mmol)、TBTU(11mg,0.034mmol)和DIEA(18μL,0.1mmol)在DCM:DMF＝1:1(8mL)中一起搅拌3小时。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯2次，并使固体悬浮于CHCl3(50mL)中。悬浮液用2％ NaHCO3和盐水洗涤2次。真空下浓缩后，产物11在
Figure BDA0004172056550001432
上(在DCM中的0-20％ MeOH，梯度0-70％，35分钟)纯化。
产物11(51mg,0.0162mmol)与DMF中的Et3N(20％,3mL)一起搅拌16小时，真空下去除含有Et3N的溶剂，从残余物中蒸发甲苯3次，得到脱保护的胺12。计算值MW 2908.81，(M+1+18)/2＝1463.91，(M+1+18x2)/3＝981.94实测值：MS(ES,pos):1463.69[M+H+NH4]2+，981.99[M+H+2NH4]3+。
胺12(47mg,0.0162mmol)与NHS酯13(21mg,0.0147mmol)和Et3N(6μL,0.041mmol)在DCM(4mL)中的混合物一起搅拌16小时。真空下去除溶剂，并使用***DCM中的0-20％MeOH在
Figure BDA0004172056550001441
上纯化产物LP39-p，梯度0-100％，40分钟。计算值MW 4188.28，(M+2+18)/3＝1402.76，(M+3+18x2)/4＝1052.32实测值：MS(ES,pos)：1402.71[M+2H+NH4]3+，1052.32[M+3H+NH4]4+。
LP41-p的合成
Figure BDA0004172056550001442
在室温下向化合物1(40.0mg)、TBTU(50.1mg)和DIEA(0.098mL)在DMF中的溶液中加入化合物2(298mg)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经20-30分钟通过
Figure BDA0004172056550001443
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％ B)，其中化合物3以43％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+2539.62m/z，观测值1287.83(+2/2,+H2O)m/z。
Figure BDA0004172056550001451
在室温下向化合物1(260mg)中加入4M HCl/二氧六环(37.4mg)。在室温下搅拌反应混合物。搅拌反应混合物过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe共沸并真空下浓缩过夜，提供为油的化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+2439.57m/z，观测值1220.61(+2/2)m/z。
Figure BDA0004172056550001452
在室温下向化合物4(253mg)、TBTU(36.1mg)和DIEA(0.045mL)在DMF中的溶液中加入化合物5(11.9mg)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经30分钟通过
Figure BDA0004172056550001453
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(10-30，35，然后100％)，其中化合物6以35％ B洗脱。真空下浓缩化合物6，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+5089.22m/z，观测值1715.43(+3/3,+H2O)m/z。/>
Figure BDA0004172056550001461
在室温下向化合物6(35.4mg)中加入4M HCl/二氧六环(2.5mg)。在室温下搅拌反应混合物。搅拌反应混合物过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe/MeOH共沸并在高真空下浓缩过夜，提供为油的化合物7。LC-MS：计算值[M+H]+4989.17m/z，观测值1676.42(+HCl,+3/3)m/z。
Figure BDA0004172056550001462
Figure BDA0004172056550001471
/>
在室温下制备化合物7(35mg)和NEt3(0.005mL)在无水DCM中于鼓泡N2(g)下的溶液。然后缓慢加入化合物8(3.2mg)。使得搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经30分钟通过
Figure BDA0004172056550001472
纯化残余物，梯度为0-20％ MeOH/DCM(10-30％，40％，50％，70％，然后100％ B)，其中LP41-p以100％ B洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+5837.84m/z，观测值1079.90(+5/5)m/z。
LP42-p的合成
Figure BDA0004172056550001473
在室温下向化合物1(40mg)、TBTU(50.1mg)和DIEA(0.098mL)在DMF中的溶液中加入化合物2(298mg)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经20-30分钟通过
Figure BDA0004172056550001474
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(10-100％ B)，其中化合物3以43％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+2539.62m/z，观测值1287.83(+2/2,+H2O)m/z。
Figure BDA0004172056550001475
在室温下向化合物3(260mg)中加入4M HCl/二氧六环(37.4mg)。在室温下搅拌反应混合物。反应物搅拌过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe共沸并真空下浓缩过夜，提供为油的化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+2439.57m/z，观测值1220.61(+2/2)m/z。
Figure BDA0004172056550001481
在室温下向化合物4(253mg)、TBTU(36.1mg)和DIEA(0.045mL)在DMF中的溶液中加入化合物5(11.9mg)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经30分钟通过
Figure BDA0004172056550001482
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(10-30，35，然后100％)，其中化合物6以35％ B洗脱。真空下浓缩化合物6，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+5089.22m/z，观测值1715.43(+3/3,+H2O)m/z。/>
Figure BDA0004172056550001491
在室温下向化合物6(28.2mg)中加入4M HCl/二氧六环(2.0mg)。在室温下搅拌反应混合物。反应混合物搅拌过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe/MeOH共沸并在高真空下浓缩过夜,提供油。LC-MS：计算值[M+H]+4989.17m/z，观测值1000.21(+5/5)m/z。
Figure BDA0004172056550001492
/>
Figure BDA0004172056550001501
在室温下制备化合物7(27.9mg)和NEt3(0.004mL)在无水DCM中于鼓泡N2(g)下的溶液。然后缓慢加入化合物8(3.4mg)。使得搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经30分钟通过
Figure BDA0004172056550001502
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(25-50％，然后100％ B)，其中LP42-p以100％ B在5min之后洗脱。以100％ B。LC-MS：计算值[M+H]+5563.44m/z，观测值946.45(+6/6,+水)m/z。
LP43-p的合成
Figure BDA0004172056550001503
在室温下向化合物1(3.0g,1.303mmol,1.0equiv.)、化合物2(0.401g,1.564mmol,1.2equiv.)和二异丙基乙胺(0.681mL,3.91mmol,3.0equiv.)在DMF(20mL)中的溶液中加入TBTU(0.502g,1.564mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持3小时。浓缩反应混合物。化合物3通过
Figure BDA0004172056550001504
纯化，用二氯甲烷中的12-18％甲醇洗脱。结构通过1H-NMR证实。
Figure BDA0004172056550001505
在室温下向化合物3(2060mg,0.811mmol,1.0equiv.)的固体中加入HCl在二氧六环中的溶液(4.055mL,16.219mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并真空下去除溶剂。化合物4直接使用无需进一步纯化。结构通过1H-NMR证实。
Figure BDA0004172056550001511
在室温下向化合物4(2030mg,0.819mmol,1.0equiv.)、化合物5(257mg,0.983mmol,1.2equiv.)和二异丙基乙胺(0.428mL,2.459mmol,3.0equiv.)在无水DMF(10mL)中的溶液中加入TBTU(315mg,0.983mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜。浓缩反应混合物。化合物6通过
Figure BDA0004172056550001512
纯化，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：[M+2H]/2，计算值1341.84，实测值1342.69。
Figure BDA0004172056550001513
在室温下向化合物6(1430mg,0.530mmol,1.0equiv.)在THF(20mL)和水(20mL)中的溶液中加入氢氧化锂(63.8mg,2.664mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持3小时。反应混合物用HCl溶液淬灭并将pH调价至3.0。水相用DCM(3x20mL)提取。合并的有机相经Na2SO4干燥并浓缩。化合物7直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+2H]/2计算值1334.83，实测值1335.49。
Figure BDA0004172056550001521
在室温下向化合物7(110mg,0.0412mmol,1.0equiv.)、化合物8(103mg,0.0412mmol,1.00equiv.)和二异丙基乙胺(0.022mL,0.123mmol,3.0equiv.)在DMF(2mL)中的溶液中加入TBTU(15.9mg,0.0495mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并然后浓缩。化合物9通过
Figure BDA0004172056550001522
纯化，用二氯甲烷中的16-20％甲醇洗脱。LC-MS：[M+5H]/5计算值1023.44，实测值1024.00。
Figure BDA0004172056550001523
在室温下向化合物9(84mg,0.0164mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(0.205mL,0.0821mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物10直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+5H]/5计算值1003.44，实测值1004.07。
Figure BDA0004172056550001531
在室温下向化合物10(125mg,0.0247mmol,1.0equiv.)和化合物11(116mg,0.0272mmol,1.10equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.017mL,0.123mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并然后浓缩。LP43-p通过
Figure BDA0004172056550001532
纯化，用二氯甲烷中的18-20％甲醇洗脱。LC-MS：[M+5H]/5计算值1065.46，实测值1066.13。
LP44-p的合成
Figure BDA0004172056550001533
Figure BDA0004172056550001541
如以上LP43-p(LP43-p合成中的化合物7)合成中的步骤所示合成化合物1。在室温下向化合物1(135mg,0.0506mmol,1.0equiv.)、化合物2(129mg,0.0506mmol,1.00equiv.)和二异丙基乙胺(0.026mL,0.151mmol,3.0equiv.)在DMF(2mL)中的溶液中加入TBTU(19.5mg,0.0607mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并然后浓缩。化合物3通过
Figure BDA0004172056550001542
纯化，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：[M+5H]/5计算值1035.06，实测值1035.40。
Figure BDA0004172056550001543
在室温下向化合物3(100mg,0.0193mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(0.242mL,0.966mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。
LC-MS：[M+5H]/5计算值1015.05，实测值1015.71。
Figure BDA0004172056550001551
在室温下向化合物4(95mg,0.0186mmol,1.0equiv.)和化合物5(8mg,0.0186mmol,1.0equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.013mL,0.0930mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并然后真空下去除溶剂。LP44-p通过
Figure BDA0004172056550001552
纯化，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+5H]/5 1077.74，实测值1079。
LP45-p的合成
Figure BDA0004172056550001553
向棕榈酸1(30mg,0.1170mmol)在DMF(2.0mL)与Boc-PEG47-NH2 2(269mg,0.1170mmol)的溶液中加入TBTU(45.1mg,0.1404mmol)和DIPEA(60uL)。搅拌反应混合物过夜之后，加入水并使用DCM:20％ TFE提取化合物3且经Na2SO4干燥。过滤之后，真空下去除溶剂至干并通过快速色谱法(DCM:20％ MeOH)纯化化合物3。
Figure BDA0004172056550001561
向化合物3中加入2mL的4N HCl:二氧六环并在无水条件下搅拌反应混合物直至通过LC-MS测定完成：C16-PEG47-NH2的[M+H]+计算值2301m/z，实测值2302。
Figure BDA0004172056550001562
向C16-PEG47-NH2 4(206mg,0.0.0845mmol)溶液中的Fmoc-Glu(OtBu)-Opfp 5(50mg,0.0845mmol)中加入NEt3(29uL)，同时在DCM(5.0mL)中搅拌。当反应混合物测定完成时，真空下去除溶剂至干并通过快速色谱法(DCM:20％ MeOH)纯化粗品化合物6。
Figure BDA0004172056550001563
向化合物6中加入2mL的4N HCl:二氧六环并在无水条件下搅拌直至通过LC-MS测定完成：计算值2866.0[M+H]+，实测值2867。
Figure BDA0004172056550001571
在Boc-PEG47-NH2 9(269mg,0.1170mmol)与TBTU(45.1mg,0.1404mmol)和DIPEA(60uL)的溶液中，在于DMF(2.0mL)中搅拌的同时加入化合物8(30mg,0.1170mmol)。所得悬浮液搅拌过夜之后，加入水并使用DCM:20％ TFE提取产物且经Na2SO4干燥。过滤之后，真空下去除溶剂至干并通过快速色谱法(DCM:20％ MeOH)纯化化合物10。计算值[M+H]+为2614.32m/z，实测值2615.32。
Figure BDA0004172056550001572
向化合物10中加入2mL的4N HCl:二氧六环。在无水条件下搅拌反应混合物直至测定完成。产物11用于下一步骤而无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550001581
向DMF(5.0mL)与化合物11(98mg,0.1914mmol)的溶液中的化合物7(100mg,0.0375mmol)中加入TBTU(14.4mg,0.045mmol)和DIPEA(20uL)。所得悬浮液搅拌过夜之后，加入水并使用DCM:20％TFE提取且经Na2SO4干燥。过滤之后，真空下去除溶剂至干并通过快速色谱法(DCM:20％ MeOH)纯化。向其中加入2mL的4N HCl:二氧六环并在无水条件下搅拌反应混合物直至通过LC-MS测定完成，得到化合物12。LC-MS：计算值[M+H]+为5134.26m/z，实测值5135。
Figure BDA0004172056550001582
/>
Figure BDA0004172056550001591
在室温下向化合物13(10mg,0.0235mmol,1.0equiv.)和化合物12(120mg,0.0235mmol,1.0equiv.)的无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(17μL,0.1175mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并真空下去除溶剂。通过
Figure BDA0004172056550001592
纯化LP45-p，用二氯甲烷中的10-17％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+6H]+5474.38，实测值5475.01。
LP47-p的合成
Figure BDA0004172056550001593
/>
Figure BDA0004172056550001601
将固体TBTU(50mg,0.156mmol)加入到Boc保护的Peg23-胺2(Quanta BiodesignLimited,150mg,0.13mmol)、二十碳五烯酸1(39mg,0.13mmol)和DIEA(68μL mL,0.39mmol)在DMF(9mL)中的溶液中。反应混合物经声波处理以溶解固体并在室温下搅拌16小时。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯2次，将残余物溶解于氯仿(50mL)中，用NaHCO3(2x10mL)和盐水(10mL)洗涤。干燥(Na2SO4)产物，真空下浓缩，并使用***DCM中的0-20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001611
上(SiO2)纯化，梯度0-80％，20分钟。用HCl在二氧六环中的4M溶液去除Boc基团，得到盐酸盐4。计算值MW 1357.76，(M+2)/2＝679.88实测值：MS(ES,pos)：1358.29[M+H]+，679.77[M+2H]2+。
盐酸盐4(167mg,0.123mmol)与五氟苯基酯5(73mg,0.123mmol)和Et3N(43μL,0.31mmol)在DCM(5mL)中一起搅拌2小时。真空下去除溶剂，残余物与SiO2(1g)混合并加载于
Figure BDA0004172056550001612
上。使用***DCM中的0-20％ MeOH纯化产物6，梯度0-50％，25分钟。产量169mg。计算值MW 1765.23，M+18＝1783.23，(M+1+18)/2＝892.12。实测值：MS(ES,pos)：1782.78[M+NH4]+，891.97[M+H+NH4]2+。
用二氧六环中的HCl处理产物6以得到游离酸7并直接用于下一步骤。计算值MW3002.84，(M+2x18)/2＝1519.42，(M+3x18)/3＝1018.95。实测值：MS(ES,pos)：1519.39[M+2NH4]2+，1019.17[M+H+2NH4]3+。
衍生物7(47mg,0.028mmol)与盐酸盐8(42mg,0.03mmol)、TBTU(11mg,0.034mmol)和DIEA(18μL,0.1mmol)在DCM:DMF＝1:1(8mL)中一起搅拌3小时。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯2次，并将固体悬浮于CHCl3(50mL)中。悬浮液用2％ NaHCO3和盐水洗涤2次。真空下浓缩后，在
Figure BDA0004172056550001613
上(DCM中的0-20％MeOH，梯度0-70％，35min)纯化产物9。
产物9(49mg,0.0162mmol)与Et3N在DMF(20％,3mL)中一起搅拌16小时，真空下去除含有Et3N的溶剂。从残余物中蒸发甲苯3次，得到脱保护的胺10，其直接用于下一步骤。
胺10(45mg,0.0162mmol)与NHS酯11(21mg,0.0147mmol)和Et3N(6μL,0.041mmol)在DCM(4mL)中的混合物一起搅拌16h。真空下去除溶剂，并使用***DCM：DCM中的20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001614
上纯化产物LP47-p，梯度0-100％，40min。计算值MW 4060.07，(M+3x18)/3＝1371.36，(M+4x18)/4＝1033.02实测值：MS(ES,pos)：1371.76[M+3NH4]3+，1033.70[M+4NH4]4+。
LP48-p的合成
Figure BDA0004172056550001621
在室温下向化合物1(27.5mg)、TBTU(26.6mg)和DIEA(0.022mL)在DMF中的溶液中加入化合物2(173mg)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用12-g硅胶柱作为固定相经20分钟通过
Figure BDA0004172056550001622
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(10-100％)，其中化合物3以66％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+2615.65m/z，观测值1326.52(+2/2,+H2O)m/z。/>
Figure BDA0004172056550001623
在室温下向化合物3(56.7mg)中加入4M HCl/二氧六环(7.9mg)。在室温下搅拌反应混合物。反应物搅拌过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe/MeOH共沸并在高真空下浓缩过夜，提供为白色固体的化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+2515.60m/z，观测值1259.91(+2/2)m/z。
Figure BDA0004172056550001631
在室温下制备化合物4(55.4mg)和NEt3(0.015mL)在无水DCM中于鼓泡N2(g)下的溶液。然后缓慢加入化合物5(8.9mg)。使得搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。经4-g硅胶柱作为固定相经20分钟通过
Figure BDA0004172056550001632
纯化残余物，梯度为0-20％ MeOH/DCM(10％ B-100％ B)，其中LP48-p以100％B洗脱。浓缩LP48-p，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+5558.48m/z，观测值1152.98(+5/5,+H2O)m/z。
LP49-p的合成
Figure BDA0004172056550001633
Figure BDA0004172056550001641
在室温下向化合物1(31.3mg)、TBTU(33.4mg)和DIEA(0.023mL)在DMF中的溶液中加入化合物2(199mg)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相经30分钟通过
Figure BDA0004172056550001642
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(10-100％)，其中化合物3以57％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+2583.65m/z，实测值1311.03(+2/2,+H2O)m/z。
Figure BDA0004172056550001643
在室温下向化合物3(70mg)中加入4M HCl/二氧六环(9.9mg)。反应混合物在室温下搅拌过夜直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe共沸并真空下浓缩过夜，提供为油的化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+2483.59m/z，观测值841.32(+2/2,+H2O)m/z。
Figure BDA0004172056550001644
/>
在室温下制备化合物4(68.3mg)和NEt3(13.7mg)在无水DCM中于鼓泡N2(g)下的溶液。然后缓慢加入化合物5(11.2mg)。使得搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。经4-g硅胶柱作为固定相经20分钟通过
Figure BDA0004172056550001651
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(10％ B-100％ B)，其中LP49-p以100％ B洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+5594.97m/z，观测值1418.68(+4/4,+H2O)m/z。
LP53-p的合成
Figure BDA0004172056550001652
在室温下向化合物1(706mg)和2(4.00g)在DCM中的溶液中加入TBTU(670mg)和然后加入DIPEA(0.908mL)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物用于分离。使用液体注射经40分钟通过
Figure BDA0004172056550001653
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％)。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。
Figure BDA0004172056550001654
/>
Figure BDA0004172056550001661
在室温下向化合物3(4.00g)中加入25mL 4M HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌1.5小时直至经LC-MS证实完全转化。然后真空下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM中，然后加入化合物5(189mg)、HBTU(588mg)和DIPEA(0.797mL)。在室温下搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。
直接浓缩反应混合物。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001662
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％ B)，提供化合物6。
Figure BDA0004172056550001663
Figure BDA0004172056550001671
在室温下向化合物6(2.00g)中加入20mL 4M HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌1.5h直至经LC-MS证实完全转化。真空下浓缩反应物。将残余物溶解于DCM中，然后加入化合物7(170mg)和DIPEA(148mg)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
产物LP53-p通过标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水)提取。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001672
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％ B)。/>
LP54-p的合成
Figure BDA0004172056550001673
Figure BDA0004172056550001681
油酸1(491mg,1.736mmol)与Boc-氨基-PEG47衍生物2、TBTU(670mg,2.086mmol)和DIEA(908μL,5.21mmol)在DMF(50mL)中一起搅拌4小时。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯3次并将残余物悬浮于CHCl3(150mL)中。所得悬浮液用H2O、(2次)2％ NaHCO3、盐水洗涤，用无水Na2SO4处理。浓缩混合物，提供产物3，将其真空下干燥。产量4.391g。计算值MW2566.24，(M+2×18)/2＝1301.12，(M+3×18)/3＝873.41实测值：MS(ES,pos)：1301.79[M+2NH4]2+，874.08[M+3NH4]3+。
化合物3通过用冰冷的4M HCl/二氧六环溶液(5mL)处理，然后在室温下搅拌1小时而转化成胺盐酸盐4。浓缩反应混合物并真空下干燥，通过从产物蒸发甲苯2次去除残余的HCl。所得胺盐酸盐4与Boc-Glu-OH(197mg,0.796mmol)、TBTU(594mg,1.85mmol)和DIEA(1mL,5.74mmol)在DMF:DCM＝1:1(60mL)中一起搅拌16小时。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯3次并将残余物悬浮于CHCl3(300mL)中。悬浮液用H2O、(2次)2％ NaHCO3、盐水洗涤，用无水Na2SO4干燥。使用***DCM中的0-20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001682
上纯化产物5，梯度0-100％，45分钟。产量2.72g。计算值MW 5143.46，(M+3x18)/3＝1732.49，(M+4x18)/4＝1303.87实测值：MS(ES,pos)：1733.46[M+3NH4]3+，1304.55[M+4NH4]4+。
化合物5(2.72g,0.529mmol)在4M HCl/二氧六环溶液(30mL)中搅拌1小时，真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯2次并且所得干燥盐酸盐6与NHS-酯7(212mg,0.5mmol)和Et3N在DCM(45mL)中一起搅拌16h。反应混合物用CHCl3稀释3倍，用H2O和盐水洗涤，干燥(Na2SO4)，浓缩并且产物LP54-p使用***DCM中的0-20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001691
上纯化，梯度0-100％，55分钟。产量440mg。计算值MW 5353.65，(M+3x18)/3＝1802.55，(M+4x18)/4＝1356.41实测值：MS(ES,pos)：1803.19[M+3NH4]3+，1357.24[M+4NH4]4+。
LP55-p的合成
Figure BDA0004172056550001692
在室温下向化合物1(297mg)和2(2.00g)在DCM中的溶液中加入TBTU(307mg)和然后加入DIPEA(0.454mL)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。产物通过标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水洗涤)提取并经Na2SO4干燥。粗品化合物3直接用于下一步骤。
Figure BDA0004172056550001693
Figure BDA0004172056550001701
在室温下向化合物3(2.00g)中加入20mL 4M HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌1.5h直至经LC-MS证实完全转化。真空下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM中，然后加入DIPEA(0.0403mL)，然后使用注射泵(在2-3小时内)缓慢加入化合物5(160mg在DCM中)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
产物使用标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水)提取。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001702
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％MeOH(0-100％ B)，得到化合物6。
Figure BDA0004172056550001703
在室温下向化合物6(1.22g)中加入10mL 4M HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌1.5h直至经LC-MS证实完全转化。真空下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM中，然后加入化合物7(105mg)和DIPEA(148mg)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
产物LP55-p使用标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水)提取。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001704
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％ B)。
LP56-p的合成
Figure BDA0004172056550001711
在室温下向化合物1(150mg,0.0652mmol,1.0equiv.)、化合物2(20mg,0.0717mmol,1.1equiv.)和二异丙基乙胺(0.034mL,0.195mmol,3.0equiv.)在无水DMF(3mL)中的溶液中加入TBTU(25.1mg,0.0782mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时并然后浓缩。化合物3通过
Figure BDA0004172056550001712
纯化，用二氯甲烷中的12-18％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1283.32，实测值1283.87。/>
Figure BDA0004172056550001713
在室温下向化合物3(82mg,0.0320mmol,1.0equiv.)的固体中加入HCl在二氧六环中的溶液(0.4mL,1.597mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持30分钟并真空下去除溶剂。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1233.29，实测值1233.69。
Figure BDA0004172056550001721
在室温下向化合物5(13mg,0.0151mmol,1.0equiv.)和化合物4(77.7mg,0.0310mmol,2.05equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.011mL,0.0757mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并浓缩溶剂。通过
Figure BDA0004172056550001722
纯化LP56-p，用二氯甲烷中的12-18％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+5H]+/5 1112.49，实测值1112.34，计算值[M+6H]+/6 927.24，实测值927.97。
LP57-p的合成
Figure BDA0004172056550001723
在室温下向化合物1(787mg)、TBTU(985mg)和DIEA(662mg)在DMF中的溶液中加入化合物2(3.06g)。反应混合物搅拌过夜直至通过LC-MS观察到完全转化。然后反应混合物用NaHCO3洗涤并用20％三氟乙醇/DCM提取。使用80-g硅胶柱作为固定相经45min通过
Figure BDA0004172056550001731
纯化残余物，梯度为DCM至DCM中的20％ MeOH(0-100％)，其中化合物3以28％ B洗脱。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。LC-MS：计算值[M+H]+1411.95m/z，观测值724.80(+2/2,+H2O)m/z。
Figure BDA0004172056550001732
在室温下向化合物3(1.27g)中加入4M HCl/二氧六环(329mg)。在室温下搅拌反应混合物直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe/MeOH共沸并在高真空下浓缩过夜，提供为白色固体的化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+1311.90m/z，观测值657.59(+2/2)m/z。
Figure BDA0004172056550001733
在室温下向化合物4(1.22g)、TBTU(348mg)和DIEA(0.3825mL)在DMF中的溶液中加入化合物5(109mg)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后反应混合物用NaHCO3洗涤，用20％2,2,2-三氟乙醇(TFE)/DCM提取，用NH4Cl溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并真空下浓缩。使用硅胶作为固定相经30分钟通过
Figure BDA0004172056550001734
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％)，其中化合物6以51％ B洗脱。收集洁净和不纯的级分并浓缩。不纯的级分经DCM至20％ MeOH/DCM(0-100％ B)再次分离，其中化合物6以54％ B洗脱并以纯的级分收集和浓缩。真空下浓缩提供为白色油状残余物的化合物6。LC-MS：计算值[M+H]+2833.89m/z，观测值727.56(+4/4,+H2O)m/z。
Figure BDA0004172056550001741
在室温下向化合物6(130mg)中加入4M HCl/二氧六环(16.7mg)。在室温下搅拌反应混合物直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe/MeOH共沸并在高真空下浓缩过夜，提供为白色固体的化合物7。LC-MS：计算值[M+H]+2769.81m/z，实测值694.07(+HCl,+4/4)m/z。
Figure BDA0004172056550001742
在室温下制备化合物7(127mg)和TEA(0.026mL)在无水DCM中于鼓泡N2(g)下的溶液。然后缓慢加入化合物8(24.8mg)。使得搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。经12-g硅胶柱作为固定相经20分钟通过
Figure BDA0004172056550001743
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0％ B-100％ B)，其中LP57-p以100％ B洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+3132.00m/z，观测值1584.89(+3/3,+H2O)m/z。
LP58-p的合成
Figure BDA0004172056550001751
在室温下向化合物1(606mg)和2(2.00g)在DCM中的溶液中加入TBTU(657mg)和然后加入DIPEA(0.891mL)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。使用液体注射经40分钟通过
Figure BDA0004172056550001752
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％MeOH(0-100％)。真空下浓缩化合物3，提供白色油状残余物。/>
Figure BDA0004172056550001753
在室温下向化合物3(2.20g)中加入5mL 4M HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌1.5h直至经LC-MS证实完全转化。真空下浓缩反应物。将残余物溶解于DCM中，然后加入化合物4(171mg)、TBTU(567mg)和DIPEA(0.770mL)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
产物使用标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水)提取。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001754
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％MeOH(0-100％ B)。
Figure BDA0004172056550001761
在室温下向化合物5(1.34g)中加入10mL 4M HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌1.5小时直至经LC-MS证实完全转化。真空下浓缩反应物。将残余物溶解于DCM中，然后加入化合物6、TBTU(172mg)和DIPEA(0.234mL)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
产物LP58-p使用标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水)提取。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550001762
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％ B)。
LP59-p的合成
Figure BDA0004172056550001763
/>
Figure BDA0004172056550001771
芥酸2f(587mg,1.736mmol)与Boc-氨基peg47衍生物1b、TBTU(670mg,2.086mmol)和DIEA(908μL,5.21mmol)在DMF(50mL)中一起搅拌4h。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯3次，并将残余物悬浮于CHCl3(150mL)中。所得悬浮液用H2O、(2次)2％ NaHCO3、盐水洗涤，并用无水Na2SO4处理。分离产物3f，浓缩并真空下干燥。产量4.391g。计算值MW 1494.00，M+18＝1512.00，(M+2x18)/2＝765.00。实测值：MS(ES,pos)：1512.53[M+NH4]+，765.72[M+2NH4]2+。
用HCl在二氧六环中的4M溶液去除Boc保护基团，得到盐酸盐4f(1.192g,.834mmol)，其直接用于下一步骤而无需纯化。将DCM(30mL)中的五氟苯基酯10(493mg,0.834mmol)和Et3N(290μL,2.084mmol)与盐酸盐4f混合。搅拌2h之后，反应混合物用CHCl3(150mL)稀释，用H2O、水性3％ NaHCO3和盐水洗涤。干燥的产物11c(1.539g)直接用于下一步骤。
化合物11c(1.539g,0.834mmol)在4M HCl/二氧六环溶液(20mL)中搅拌4h。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯2次，得到干燥脱保护的酸12c(1.52g,0.827mmol)。该酸与胺盐酸盐4c(1.114g,0.827mmol,如以上LP39的合成所示那样合成)、TBTU(318.6mg,0.992mmol)和DIEA(532μL,3.05mmol)在DCM:DMF＝1:2(30mL)的混合物中一起搅拌16h。真空下去除溶剂，残余的DMF用3次另外的蒸发甲苯去除。将残余物悬浮于CHCl3(150mL)中，用H2O、(2次)3％NaHCO3和盐水洗涤。用Na2SO4干燥后，浓缩产物13e并使用***DCM：DCM中的20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001781
上纯化，梯度0-100％，55min。产量1.429g。计算值MW3038.96，(M+2x18)/2＝1537.48，(M+3x18)/3＝1030.99实测值：MS(ES,pos)：1537.97[M+2NH4]2+，1031.66[M+3NH4]3+。
产物13e如以上LP39的程序所述脱Fmoc保护。将产物14e干燥并如以上LP39的程序所述与NHS酯15c反应。使用
Figure BDA0004172056550001782
纯化分离产物16e(LP59-p)。计算值MW 3215.13，(M+2x18)/2＝1625.57，(M+3x18)/4＝1089.71。实测值：MS(ES,pos)：1626.30[M+2NH4]2+，1090.58[M+3NH4]3+。
LP60-p的合成
Figure BDA0004172056550001783
Figure BDA0004172056550001791
向化合物1(278mg)和2(1.00g)在DCM中的溶液中加入化合物3(DIPEA,0.223mL)。搅拌反应混合物直至通过TLC观察到2完全转化。产物使用标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水)提取并经Na2SO4干燥。粗品化合物4直接用于下一步骤。
Figure BDA0004172056550001792
在室温下向化合物5(2500mg,2.130mmol,1.0equiv.)和化合物6(655mg,2.556mmol,1.2equiv.)的无水DCM(10mL)中的溶液中加入EDC HCl(630mg,3.195mmol,1.5equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜。浓缩反应混合物。通过
Figure BDA0004172056550001793
纯化产物，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+1411.95，实测值1413.64。/>
Figure BDA0004172056550001794
在室温下向化合物7(2100mg,1.487mmol,1.0equiv.)的固体中加入HCl在二氧六环中的溶液(7.438mL,29.75mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并浓缩溶剂。化合物8直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+H]+1311.90，实测值1312.95。
Figure BDA0004172056550001801
在室温下向化合物8(1210mg,0.897mmol,1.0equiv.)和化合物9(539mg,1.032mmol,1.15equiv.)的无水DCM(10mL)中的溶液中加入三乙胺(0.381mL,2.692mmol,3.0equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时。有机相用饱和NH4Cl和饱和NaHCO3水溶液洗涤。有机相经Na2SO4干燥并浓缩。化合物10通过
Figure BDA0004172056550001802
分离并用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+1719.07，实测值1719.42。/>
Figure BDA0004172056550001803
在室温下向化合物10(1100mg,0.639mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4MHCl(3.199mL,12.796mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持8小时。浓缩反应混合物。化合物11直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+H]+计算值1663.01，实测值1664.00。
Figure BDA0004172056550001811
在室温下向化合物11(1060mg,0.637mmol,1.0equiv.)、化合物12(970mg,0.637mmol,1.00equiv.)和二异丙基乙胺(0.444mL,2.549mmol,4.0equiv.)在DMF(10mL)中的溶液中加入TBTU(245mg,0.764mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时。浓缩反应混合物。残余物用饱和氯化铵和碳酸氢钠水溶液洗涤。化合物13通过
Figure BDA0004172056550001812
纯化，用二氯甲烷中的10-20％甲醇洗脱。LC-MS：[M+2H]/2计算值1565.50，实测值1567.13。/>
Figure BDA0004172056550001813
Figure BDA0004172056550001821
在室温下向化合物13(1.05g)在4mL的DMF中的溶液中加入1mL的TEA。反应混合物搅拌过夜并真空下去除溶剂，得到化合物14。使用化合物14而无需进一步纯化。
在室温下向化合物14(585mg)在6mL DCM中的溶液中加入化合物15(124mg)和TEA(0.085mL)。反应混合物搅拌过夜。产物使用标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水)提取并经Na2SO4干燥。LP60-p用柱色谱法进一步纯化。
LP61-p的合成
Figure BDA0004172056550001822
在室温下向化合物1(124mg,0.0539mmol,1.0equiv.)、化合物2(19.5mg,0.0646mmol,1.2equiv.)和二异丙基乙胺(0.028mL,0.161mmol,3.0equiv.)在无水DMF(2mL)中的溶液中加入TBTU(20.8mg,0.0646mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭。水相用DCM(3x10mL)提取，并经Na2SO4干燥合并的有机相且浓缩。化合物3通过
Figure BDA0004172056550001833
纯化，用二氯甲烷中的10-12％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1270.31，实测值1269.15。
Figure BDA0004172056550001831
在室温下向化合物3(56mg,0.0220mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(0.276mL,1.102mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+2H]/2计算值1220.28，实测值1221.63。
Figure BDA0004172056550001832
Figure BDA0004172056550001841
在室温下向化合物5(10mg,0.0116mmol,1.0equiv.)和化合物6(59.1mg,0.0239mmol,2.05equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.008mL,0.0931mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持4小时并真空下去除溶剂。LP61-p通过
Figure BDA0004172056550001842
纯化，用二氯甲烷中的12-15％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+6H]+/6 918.57，实测值919.69。
LP62-p的合成
Figure BDA0004172056550001843
在室温下向化合物1(1500mg,0.6517mmol,1.0equiv.)和化合物2(200mg,0.782mmol,1.2equiv.)在无水DCM(10mL)中的溶液中加入EDC HCl(192mg,0.997mmol,1.5equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并然后浓缩。化合物3通过
Figure BDA0004172056550001844
纯化，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1270.31，实测值1271.43。
Figure BDA0004172056550001845
在室温下向化合物3(1300mg,0.511mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(6.397mL,25.588mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+2H]/2计算值1220.28，实测值1221.87。
Figure BDA0004172056550001851
在室温下向化合物4(1350mg,0.mmol,1.0equiv.)和化合物5(327mg,0.626mmol,1.15equiv.)在无水DCM(10mL)中的溶液中加入三乙胺(0.231mL,1.625mmol,3.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并然后浓缩。化合物6通过
Figure BDA0004172056550001852
纯化，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+3H]/3 949.58，实测值950.77。
Figure BDA0004172056550001853
在室温下向化合物1(1500mg,0.6517mmol,1.0equiv.)和化合物7(265mg,0.782mmol,1.2equiv.)在无水DCM(10mL)中的溶液中加入EDC HCl(192mg,0.997mmol,1.5equiv.)。反应混合物在室温下保持3小时并然后浓缩。产物化合物8通过
Figure BDA0004172056550001854
纯化，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1311.35，实测值1311.87。
Figure BDA0004172056550001861
在室温下向化合物6(1220mg,0.428mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(2.142mL,8.568mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持5小时。然后浓缩反应混合物。化合物9直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+3H]/3计算值930.89，实测值932.29。
Figure BDA0004172056550001862
在室温下向化合物9(800mg,0.286mmol,1.0equiv.)、化合物10(在常规脱保护条件下从化合物8制备；733mg,0.286mmol,1.00equiv.)和二异丙基乙胺(0.150mL,0.859mmol,3.0equiv.)在DMF(10mL)中的溶液中加入TBTU(110mg,0.344mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持3小时。然后浓缩反应混合物。化合物11通过
Figure BDA0004172056550001873
纯化，用二氯甲烷中的10-20％甲醇洗脱。LC-MS：[M+5H]/5计算值1059.46，实测值1060.94。
Figure BDA0004172056550001871
在室温下向化合物11(914mg,0.172mmol,1.0equiv.)在无水DMF(4mL)中的溶液中加入三乙胺(1mL)。反应混合物在室温下保持过夜并真空下去除溶剂。化合物12直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+5H]/5计算值1015.05，实测值1016.41。
Figure BDA0004172056550001872
在室温下向化合物12(875mg,0.172mmol,1.0equiv.)和化合物13(97.5mg,0.189mmol,1.1equiv.)在无水DCM(20mL)中的溶液中加入三乙胺(0.073mL,0.517mmol,3.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并浓缩溶剂。LP62-p通过
Figure BDA0004172056550001881
纯化，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+5H]/5 1094.68，实测值1095.98。
LP87-p的合成
Figure BDA0004172056550001882
将固体TBTU(50mg,0.156mmol)加入到Boc-保护的PEG47-胺1a(Quanta BiodesignLimited,300mg,0.13mmol)、亚油酸2a(37mg,0.13mmol)和DIEA(68μL mL,0.39mmol)在DMF(9mL)中的溶液中。将反应混合物经声波处理以溶解固体并在室温下搅拌16小时。真空下去除溶剂，并从残余物中蒸发甲苯2次，将残余物溶解于氯仿(50mL)中，用NaHCO3(2x10mL)和盐水(10mL)洗涤。干燥(Na2SO4)产物，真空下浓缩并使用***DCM中的0-20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001883
上(SiO2)纯化，梯度0-80％，20分钟。计算值MW 2564.22，(M+2x18)/2＝1300.1，(M+3x18)/3＝872.74实测值：MS(ES,pos)：1299.74[M+2NH4]2+，873.04[M+3NH4]3+。化合物3a(195mg,0.0764mmol)通过用冰冷的4M HCl/二氧六环溶液(5mL)处理，然后在室温下搅拌1小时而转化成胺盐酸盐4b。浓缩反应混合物并真空下干燥，通过从产物蒸发甲苯2次去除残余的HCl。将干燥的胺盐酸盐溶解于无水DMF(5mL)中，加入双-NHS酯5(28mg,0.033mmol)和Et3N(28uL,0.198mmol)并在室温下搅拌3小时。真空下去除溶剂，从残余物中蒸发甲苯2次并使用***DCM中的0-20％ MeOH在/>
Figure BDA0004172056550001891
上纯化产物6a(LP87-p)，梯度0-100％，30min。计算值MW 5556.9，(M+3x18)/3＝1870.50，(M+4x18)/4＝1407.23实测值：MS(ES,pos):1870.50[M+3NH4]3+，1407.40[M+4NH4]4+。
LP89-p的合成
Figure BDA0004172056550001892
向25mL烧结肽合成容器中加入2-氯三苯甲基氯树脂1(0.4589g,1.46mmol/g,0.670mmol)。树脂在DCM中溶胀并在加入Fmoc-N-酰氨基-PEG24-酸(0.9170g,0.670mmol,1eq.)和二异丙基乙胺(DIEA)(0.584mL,3.35mmol,5eq)之前排空。将烧瓶振摇1小时，之后加入甲醇(0.367mL，0.8mL/g树脂)以覆盖任何剩余的三苯甲基树脂。40分钟之后，排空烧瓶并用DCM洗涤三次，DMF洗涤两次，DCM洗涤两次和MeOH洗涤三次(每次洗涤约5mL)。树脂在高真空下干燥过夜。
树脂负载：将11.5mg树脂悬浮于0.8mL DMF中并溶胀15分钟。加入0.2mL哌啶并使得混合物静置15分钟。在DMF中进行10x稀释并获得UV-vis光谱，A＝2.66(大约)。树脂负载计算为0.297mmol/g，总共919mg树脂，规模为0.273mmol。
Figure BDA0004172056550001901
将树脂2悬浮于DCM/DMF/哌啶1:1:2(9.6mL)中。在振摇30分钟之后，排空溶液并用DMF(4x9.2mL)洗涤树脂。
Figure BDA0004172056550001902
Fmoc-N-酰氨基-PEG24-酸(0.7473g,0.5460mmol,2eq)、TBTU(0.1753g,0.5460mmol,2eq)和DIEA(0.190mL,1.092mmol,4eq)在DMF(7.6mL)中合并并混合2-3分钟，然后将溶液加入到合成烧瓶中的树脂中。烧瓶振摇1小时，之后从橙色树脂中排空橙黄色溶液。树脂用DMF和MeOH(各3x8.6mL)洗涤，然后在高真空下干燥过夜。1.277g树脂，理论值1.227g。在微裂解后通过LC-MS观察产物质量。
Figure BDA0004172056550001903
Figure BDA0004172056550001911
树脂用DMF中的20％哌啶(12.3mL)处理30分钟，然后用DMF(4x12.3mL)洗涤。
Figure BDA0004172056550001912
将山萮酸(0.186g,0.546mmol,2.0eq)、TBTU(0.175g,0.546mmol,2eq)和DIEA(0.190mL,1.092mmol,4eq)溶解于DMF(10.7mL)中。将溶液加入到树脂中。溶液小瓶用DMF冲洗并加入到树脂(2x1mL)中。混合物振摇75分钟，然后排空并用DMF、THF和MeOH(各3x13mL)洗涤。树脂在高真空下干燥(90分钟)。得到1.351g，理论值1.254g。在微裂解后以LC-MS观察产物质量(并且没有起始材料质量)。
Figure BDA0004172056550001913
树脂用DCM(11mL)和AcOH(1.1mL)处理30分钟，然后排空。该裂解总共重复4次，然后用8mL CH2Cl2、1mL AcOH和1mL 2,2,2-三氟乙醇处理树脂，振摇30分钟并排空。该裂解重复第2次。合并来自所有裂解的溶液并浓缩，得到530.8mg，其通过柱色谱法纯化。
将粗品化合物加载到硅胶柱(24g)上并以CH2Cl2中的0-20％MeOH洗脱。合并洁净的级分，得到69.9mg的目标化合物。
Figure BDA0004172056550001921
向小瓶中加入N-mal-N-双(PEG4)胺TFA盐(10.7mg,0.0128mmol,1eq)、酸-PEG24-酰氨基-PEG24-C22(69.9mg,0.0269mmol,2.1eq)、TBTU(10.3mg,0.0320mmol,2.5eq)、NEt3(5.4uL,0.0385mmol,3eq)和CH2Cl2(1mL)。反应混合物搅拌24小时，然后加入NEt3(5.4uL,0.0385mmol,3eq)。约50小时之后，浓缩反应混合物并通过柱色谱法(DCM中的0-30％ MeOH)纯化，得到32.8mg的LP89-p(44％)。
LP90-p的合成
Figure BDA0004172056550001931
将固体TBTU(50mg,0.156mmol)加入到Boc保护的PEG-胺1a(Quanta BiodesignLimited,300mg,0.13mmol)、单保护的二十二碳烷酸2b(56mg,0.13mmol)和DIEA(68uL mL,0.39mmol)在DMF(9mL)中的溶液中。反应混合物在室温下搅拌16小时。真空下去除溶剂并从残余物中蒸发甲苯3次。将残余物取于DCM 30(mL)中，与SiO2(1.6g)混合并加载于
Figure BDA0004172056550001932
上。使用***DCM中的0-20％ MeOH纯化产物，梯度0-100％，45分钟。计算值MW 2710.45，(M+2x18)/2＝1373.22,(M+3x18)/3＝921.48。实测值：MS(ES,pos)：1373.18[M+2NH4]2+，921.37[M+3NH4]3+。
化合物3b(238mg,0.088mmol)通过用冰冷的4M HCl/二氧六环溶液(6mL)处理，然后在室温下搅拌4小时而转化成氨基酸盐酸盐4b。浓缩反应混合物并真空下干燥，通过从残余物中蒸发甲苯2次去除残余的HCl。
将干燥的胺盐酸盐4b溶解于无水DCM(5mL)中，加入双-NHS酯5(34.2mg,0.04mmol)和Et3N(55uL,0.4mmol)并在室温下搅拌3小时。真空下去除溶剂，并使用***DCM中的0-20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001941
上纯化产物6b(LP90-p)，梯度0-100％，40min。计算值MW5737.13，(M+3x18)/3＝1930.38，(M+4x18)/4＝1452.28。实测值：MS(ES,pos)：1930.45[M+3NH4]3+，1452.29[M+4NH4]4+。
LP91-p的合成
Figure BDA0004172056550001942
Figure BDA0004172056550001951
将固体TBTU(335mg,1.043mmol)加入到Boc-保护的PEG47-胺1a(2g,0.869mmol)、山萮酸2g(296mg,0.87mmol)和DIEA(454uL mL,2.067mmol)在DMF(16mL)中的溶液中。反应混合物经声波处理以溶解固体并在室温下搅拌16小时。真空下去除溶剂并从残余物中蒸发甲苯两次。将残余物溶解于氯仿(150mL)中并用NaHCO3(2x30mL)和盐水(30mL)洗涤。干燥(Na2SO4)产物3g，真空下浓缩并使用***DCM中的0-20％ MeOH在
Figure BDA0004172056550001952
上(SiO2)纯化，梯度0-80％，35分钟。计算值MW 2624.36，(M+2x18)/2＝1330.18，(M+3x18)/4＝892.79。实测值：MS(ES,pos)：1330.58[M+2NH4]2+，893.21[M+3NH4]3+。
化合物3g(1.862g)如以上LP39-p的程序所述通过用二氧六环溶液中的4M HCl(10mL)处理而转化成胺盐酸盐4g。
如LP54-p制备中所述将干燥盐4g(227mg,0.089mmol)的等分式样与Boc-Asp-OH(10mg,0.043mmol)、TBTU(32mg,0.099mmol)和DIEA(96uL,0.55mmol)合并，得到化合物17，产量152mg(0.029mmol)。如以上LP54-p合成中所述14c的制备，该产物用HCl/二氧六环溶液处理，得到盐酸盐18(产率100％)，直接用于下一步骤。计算值MW 5145.57，(M+3)/3＝1716.19，(M+4)/4＝1287.23。实测值：MS(ES,pos)：1715.91[M+3H]3+，1287.23[M+4H]4+。
如以上LP54-p合成中对16c所述，盐酸盐18(0.029mmol)与四氟苯基酯20(QuantaBiodesign,15mg,0.032mmol)和Et3N(12uL,0.087mmol)合并。产物21(LP91-p)在
Figure BDA0004172056550001961
上纯化。产量40mg。计算值MW 5455.87，(M+4)/4＝1364.97，(M+5)/5＝1092.17。实测值：MS(ES,pos):1364.66[M+4H]4+，1092.05[M+4H]4+。
LP92-p的合成
Figure BDA0004172056550001962
在室温下向化合物1(140mg,0.0608mmol,1.0equiv.)、化合物2(20.8mg,0.0669mmol,1.1equiv.)和二异丙基乙胺(0.032mL,0.182mmol,3.0equiv.)在无水DMF(3mL)中的溶液中加入TBTU(23.4mg,0.073mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时。浓缩反应混合物。化合物3通过
Figure BDA0004172056550001963
纯化，用二氯甲烷中的12-18％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1297.33，实测值1297.19。
Figure BDA0004172056550001964
在室温下向化合物3(90mg,0.0347mmol,1.0equiv.)的固体中加入HCl在二氧六环中的溶液(0.434mL,1.734mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持30分钟并然后浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1247.30，实测值1247.98。
Figure BDA0004172056550001971
在室温下向化合物5(14mg,0.0163mmol,1.0equiv.)和化合物4(84.6mg,0.0334mmol,2.05equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.012mL,0.0815mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并真空下去除溶剂。LP92-p通过
Figure BDA0004172056550001972
纯化，用二氯甲烷中的12-18％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+5H]+/51123.70，实测值1124.10，计算值[M+6H]+/6 936.58，实测值937.22。
LP93-p的合成
Figure BDA0004172056550001981
向顺式-11-二十碳烯酸1(30mg,0.0979mmol)在Boc-PEG47-NH22(223mg,0.1mmol)于DMF(2.0mL)中的溶液中加入TBTU(37.2mg,0.115mmol)和DIPEA(50uL)。所得悬浮液搅拌过夜之后，加入水。混合物使用DCM:20％ TFE提取并经Na2SO4干燥合并的有机相。过滤之后，真空下去除溶剂至干并且粗品产物通过快速色谱法(DCM中的20％ MeOH)纯化。在无水条件下向产物中加入2mL的4N HCl:二氧六环直至通过LC-MS确定脱保护完成：计算值[M+H]+为2550.28m/z，实测值2551。
Figure BDA0004172056550001982
Figure BDA0004172056550001991
在室温下向化合物4(19mg,0.0221mmol,1.0equiv.)和化合物3(16mg,0.0454mmol,2.05equiv.)的无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(16uL,0.1106mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并真空下去除溶剂。LP93-p通过
Figure BDA0004172056550001993
纯化，用二氯甲烷中的10-17％甲醇洗脱。
LP94-p的合成
Figure BDA0004172056550001992
向在DMF(2.0mL)溶液中的二高-γ-亚麻酸1(30mg,0.0979mmol)中加入Boc-PEG47-NH2 2(225mg,0.1mmol)、TBTU(37.7mg,0.117mmol)和DIPEA(50uL)。所得悬浮液搅拌过夜之后，加入水。混合物使用DCM:20％ TFE提取并经Na2SO4干燥合并的有机相。过滤之后，浓缩溶剂至干并且粗品产物通过快速色谱法(DCM:20％ MeOH)纯化。在无水条件下向产物中加入2mL的4N HCl:二氧六环直至通过LC-MS确定脱保护完成：计算值[M+H]+为2560.28m/z，实测值2561.01。
Figure BDA0004172056550002001
在室温下向化合物4(19mg,0.0221mmol,1.0equiv.)和化合物3(112mg,0.0454mmol,2.05equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(16uL,0.1106mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并真空下去除溶剂。LP94-p通过
Figure BDA0004172056550002002
纯化，用二氯甲烷中的10-17％甲醇洗脱。/>
LP95-p的合成
Figure BDA0004172056550002003
在室温下向化合物1(150mg,0.0652mmol,1.0equiv.)、化合物2(20mg,0.0717mmol,1.1equiv.)和二异丙基乙胺(0.034mL,0.195mmol,3.0equiv.)在无水DMF(3mL)中的溶液中加入TBTU(25.1mg,0.0782mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时。然后浓缩反应混合物。化合物3通过
Figure BDA0004172056550002011
纯化，用二氯甲烷中的12-18％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1281.30，实测值1281.71。
Figure BDA0004172056550002012
在室温下向化合物3(80mg,0.0312mmol,1.0equiv.)中加入HCl在二氧六环中的溶液(0.390mL,1.561mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持30分钟并真空下去除溶剂。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1231.27，实测值1231.65。
Figure BDA0004172056550002013
在室温下向化合物5(13mg,0.0151mmol,1.0equiv.)和化合物4(77.5mg,0.0310mmol,2.05equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.011mL,0.0757mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持30分钟并真空下去除溶剂。LP95-p通过
Figure BDA0004172056550002021
纯化，用二氯甲烷中的12-18％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+5H]+/51110.88，实测值1111.62，计算值[M+6H]+/6925.90，实测值926.41。
LP101-p的合成
Figure BDA0004172056550002022
在室温下向化合物1(250mg,0.213mmol,1.0equiv.)、化合物2(65mg,0.255mmol,1.20equiv.)和二异丙基乙胺(0.111mL,0.629mmol,3.0equiv.)在无水DMF(3mL)中的溶液中加入TBTU(102mg,0.319mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜。化合物3通过
Figure BDA0004172056550002023
纯化，用二氯甲烷中的6-12％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+1411.95，实测值1411.95。
Figure BDA0004172056550002024
在室温下向化合物3(200mg,0.141mmol,1.0equiv.)的固体中加入HCl在二氧六环中的溶液(0.708mL,2.833mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并真空下去除溶剂。产物直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+H]+1311.90，实测值1312.32。
Figure BDA0004172056550002025
Figure BDA0004172056550002031
在室温下向化合物5(100mg,0.0404mmol,1.0equiv.)、化合物4(111mg,0.0829mmol,2.05equiv.)和二异丙基乙胺(35mL,0.202mmol,3.0equiv.)在无水DMF(3mL)中的溶液中加入TBTU(32.5mg,0.101mmol,2.5equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并然后浓缩。化合物6通过
Figure BDA0004172056550002032
纯化，用二氯甲烷中的6-10％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1417.44，实测值1418.19。
Figure BDA0004172056550002033
在室温下向化合物6(80mg,0.0282mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(0.353mL,1.411mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物7直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+2H]/2计算值1367.41，实测值1368.26。
Figure BDA0004172056550002041
在室温下向化合物7(78mg,0.0281mmol,1.0equiv.)和化合物8(12mg,0.0281mmol,1.0equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.020mL,0.140mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并浓缩溶剂。LP101-p通过
Figure BDA0004172056550002042
分离，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+3H]/3 1015.31，实测值1015.71。
LP102-p的合成
Figure BDA0004172056550002043
在室温下向化合物1(124mg,0.0539mmol,1.0equiv.)、化合物2(19.5mg,0.0646mmol,1.2equiv.)和二异丙基乙胺(0.028mL,0.161mmol,3.0equiv.)在无水DMF(2mL)中的溶液中加入TBTU(20.8mg,0.0646mmol,1.2equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭。水相用DCM(3x10mL)提取，并且合并的有机相经Na2SO4干燥并浓缩。化合物3通过
Figure BDA0004172056550002051
纯化，用二氯甲烷中的10-12％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+2H]+/2 1281.76，实测值1282.19。/>
Figure BDA0004172056550002052
在室温下向化合物3(66mg,0.0257mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(0.322mL,1.287mmol,50equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+2H]/2计算值1231.75，实测值1232.01。
Figure BDA0004172056550002053
在室温下向化合物5(11mg,0.0128mmol,1.0equiv.)和化合物4(64mg,0.0256mmol,2.00equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(0.009mL,0.064mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并浓缩溶剂。LP102-p通过
Figure BDA0004172056550002061
分离，用二氯甲烷中的12-18％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+6H]+/6 926.20，实测值926.41。
LP103-p的合成
Figure BDA0004172056550002062
向在溶液DMF(2.0mL)中的化合物1(35mg,0.1170mmol)中加入Boc-PEG47-NH2 2(269mg,0.1170mmol)、TBTU(45.1mg,0.1404mmol)和DIPEA(60uL)。所得悬浮液搅拌过夜之后，加入水。混合物使用DCM:20％ TFE提取并且合并的有机相经Na2SO4干燥。过滤之后，真空下去除溶剂至干并且粗品产物3通过快速色谱法(DCM:20％MeOH)纯化。在无水条件下向产物中加入2mL的4N HCl:二氧六环直至通过LC-MS确定脱保护完成：计算值[M+H]+为2483.59m/z，实测值2484.01。
Figure BDA0004172056550002071
在室温下向化合物4(10mg,0.0116mmol,1.0equiv.)和化合物5(59.3mg,0.0239mmol,2.05equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入三乙胺(8uL,0.0582mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并真空下去除溶剂。LP103-p通过
Figure BDA0004172056550002072
分离，用二氯甲烷中的10-17％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+6H]+/6 933，实测值934，计算值[M+7H]+/7 800，实测值801。
LP104-p的合成
Figure BDA0004172056550002073
Figure BDA0004172056550002081
化合物1(以上LP87的程序所示的合成)与Fmoc-Glu-OH如以上LP54-p的程序所述缀合。计算值MW 5261.56，(M+3x18)/3＝1771.86，(M+4x18)/4＝1333.39实测值：MS(ES,pos)：1771.98[M+3NH4]3+，1333.57[M+4NH4]4+。
如以上LP39-p的合成中对化合物11所述，对化合物2进行脱Fmoc保护。如以上合成LP39-p的程序所述，所得产物3与活化酯化合物4缀合。在
Figure BDA0004172056550002082
纯化后分离LP104-p。计算值MW 5349.62，(M+3x18)/3＝1801.21，(M+4x18)/4＝1355.41。实测值：MS(ES,pos)：1801.87[M+3NH4]3+，1355.92[M+4NH4]4+。
LP106-p的合成
Figure BDA0004172056550002091
向在DCM(4mL)中的化合物1(200mg,0.676mmol)中加入TEA(218uL,1.56mmol)，然后加入化合物2(198mg,0.879mmol)并且混合物在室温下搅拌1小时。完成后，去除所有挥发物并且粗品化合物3使用4N HCl脱保护，提供酸5，其随后使用无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002092
将粗品化合物5(假定60mg,0.1014mmol)溶解于DMF(1mL)中，用TBTU(71.6mg,0.223mmol)处理并搅拌5分钟。随后加入化合物4(668mg,0.273mmol)和DMF(1mL)中的DIEA(91.8uL,0.527mmol)并使混合物在室温下搅拌16小时。完成后去除所有挥发物并使用WatersTM Phenomenex C18 Gemini柱(10u,50mm x 250mm)分离化合物6，洗脱梯度为水(0.1％ TFA)中的MeOH(0.1％ TFA)。
Figure BDA0004172056550002101
将化合物6(23.5mg,0.0532mmol)和化合物7(29.9mg,0.0586mmol)溶解于12.0mLDMF中并且容器用N2鼓泡5分钟。然后，加入固定化铜(337mg,0.0532mmol)和抗坏血酸钠(31.6mg,0.1597mmol)并且反应混合物在40℃下搅拌过夜。
滤除树脂和其他固体。真空下浓缩滤液并通过HPLC纯化，得到LP106-p。
LP107-p的合成
Figure BDA0004172056550002102
Figure BDA0004172056550002111
将化合物1(982mg,如以上LP38-p的程序所示合成)溶解于10mL DCM中。加入化合物2(90mg)和三乙胺(0.081mL)。反应混合物在室温下搅拌5-8小时直至完成。产物使用1NHCl提取和然后饱和NaHCO3提取，然后盐水洗涤，并且最后用Na2SO4干燥。LP107-p使用柱色谱法进一步纯化。
LP108-p的合成
Figure BDA0004172056550002112
在室温下向化合物1(595mg,1.610mmol,1.0equiv.)、化合物2(8377mg,3.382mmol,2.10equiv.)和二异丙基乙胺(1.122mL,6.443mmol,4.0equiv.)在无水DMF(100mL)中的溶液中加入TBTU(1241mg,3.865mmol,2.4equiv.)。反应混合物在室温下保持3小时。然后浓缩反应混合物。残余物用饱和氯化铵和碳酸氢钠水溶液洗涤。化合物3通过
Figure BDA0004172056550002121
纯化，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：[M+5H]/5，计算值1043.05，实测值1044.38。
Figure BDA0004172056550002122
在室温下向化合物1(104mg,0.0199mmol,1.0equiv.)在无水DMF(1.6mL)中的溶液中加入TEA(0.4mL)。反应混合物在室温下保持过夜并真空下去除溶剂。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+5H]/5计算值998.63，实测值999.97。
Figure BDA0004172056550002123
在室温下向化合物4(99mg,0.198mmol,1.0equiv.)和化合物5(134mg,0.238mmol,1.2equiv.)在无水DCM(3mL)中的溶液中加入三乙胺(0.006mL,0.0397mmol,2.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并真空下去除溶剂。LP108-p通过
Figure BDA0004172056550002131
分离，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+5H]/5 1088.48，实测值1089.86。
LP109-p的合成
Figure BDA0004172056550002132
/>
在室温下向化合物1(595mg,1.610mmol,1.0equiv.)、化合物2(8377mg,3.382mmol,2.10equiv.)和二异丙基乙胺(1.122mL,6.443mmol,4.0equiv.)在无水DMF(100mL)中的溶液中加入TBTU(1241mg,3.865mmol,2.4equiv.)。反应混合物在室温下保持3小时。然后浓缩反应混合物。残余物用饱和氯化铵和碳酸氢钠水溶液洗涤。化合物3通过
Figure BDA0004172056550002133
纯化，用二氯甲烷中的12-20％甲醇洗脱。LC-MS：[M+5H]/5，计算值1043.05，实测值1044.38。
Figure BDA0004172056550002141
在室温下向化合物3(100mg)中加入DMF中的20％ NEt3(0.053mL)。在室温下搅拌反应混合物直至经LC-MS证实完全转化。反应混合物与PhMe/MeOH共沸并在高真空下浓缩过夜，得到粗品化合物4。LC-MS：计算值[M+H]+4989.17m/z，观测值1262.31(+4/4,+H2O)m/z。
Figure BDA0004172056550002142
/>
在室温下制备化合物4(95.7mg)和NEt3在无水DCM(0.008mL)中于鼓泡N2(g)下的溶液。然后缓慢加入化合物5(14.2mg)。使得搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到完全转化。然后直接浓缩反应混合物。经12-g硅胶柱作为固定相经20分钟通过
Figure BDA0004172056550002154
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0％ B-100％ B)，其中LP109-p以100％ B洗脱，提供洁净和不纯的级分。收集两种洁净的积分并浓缩。将不纯的级分浓缩并再次经受反应条件以促进进一步转化。经DCM中的0-20％ MeOH(0％ B-100％ B)梯度洗脱分离提供改善但有些不纯的LP109-p(以88％ B洗脱)。LC-MS：计算值[M+H]+5614.51m/z，观测值1422.64(+4/4,+H2O)m/z。
LP110-p的合成
Figure BDA0004172056550002151
在室温下向化合物1(4.00g)在20mL DMF中的溶液中加入化合物2(4.50g)和3(11.6g)。反应混合物搅拌过夜。产物通过标准处理(1N NaOH,盐水)提取并用Na2SO4干燥。TLC显示化合物2通过NaOH去除。化合物4直接用于下一步骤。
Figure BDA0004172056550002152
在室温下向化合物4(3.04g)在100mL MeOH中的溶液中加入NaOH(1.03g)溶液。反应混合物搅拌过夜。浓缩反应混合物以去除MeOH。水相用乙酸乙酯提取以去除任何未反应的起始材料。将混合物酸化至pH为3，然后用乙酸乙酯提取，使用Na2SO4干燥并浓缩以产生为白色固体的化合物5。化合物5直接用于下一步骤。
Figure BDA0004172056550002153
Figure BDA0004172056550002161
在室温下向在DCM中的化合物1(2.9mg)中加入2当量DIPEA(0.006mL)。化合物6(45mg)、TBTU(6.3mg)和2当量DIPEA(0.006mL)在室温下搅拌30分钟。使用注射泵(在2-3小时内)实现将活化酸混合物缓慢加入到PEG溶液中。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
产物使用标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3,盐水)提取。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550002162
纯化残余物，梯度为DCM中的0-20％MeOH(0-100％ B)。
Figure BDA0004172056550002163
在室温下向化合物7(27mg)中加入1.5mL 4M HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌1.5h直至经LC-MS证实完全转化。真空下浓缩反应混合物。将粗品化合物8溶解于DCM中，并加入化合物9(2.7mg)和TEA(1.1mg)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550002171
纯化LP110-p，梯度为DCM至DCM中的20％MeOH(0-100％ B)。
LP111-p的合成
Figure BDA0004172056550002172
在室温下向化合物1(2500mg,2.130mmol,1.0equiv.)和化合物2(655mg,2.556mmol,1.2equiv.)在无水DCM(10mL)中的溶液中加入EDC HCl(630mg,3.195mmol,1.5equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜。浓缩反应混合物。化合物3通过
Figure BDA0004172056550002173
纯化，用二氯甲烷中的8-18％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+H]+1411.95，实测值1412.80。/>
Figure BDA0004172056550002174
在室温下向化合物3(2400mg,1.699mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(8.499mL,33.997mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+H]/+计算值1311.90，实测值1312.95。
Figure BDA0004172056550002181
在室温下向化合物5(300mg,0.812mmol,1.0equiv.)、化合物4(2.299g,1.705mmol,2.10equiv.)和二异丙基乙胺(0.566mL,3.248mmol,4.0equiv.)在无水DMF(10mL)中的溶液中加入TBTU(625mg,1.949mmol,2.4equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。然后浓缩反应混合物。残余物用饱和氯化铵和碳酸氢钠水溶液洗涤。化合物6通过
Figure BDA0004172056550002182
纯化，用二氯甲烷中的10-18％甲醇洗脱。LC-MS：[M+2H]/2，计算值1478.45，实测值1479.89。/>
Figure BDA0004172056550002183
在室温下向化合物6(1690mg,0.571mmol,1.0equiv.)在无水DMF(8mL)中的溶液中加入三乙胺(2mL)。反应混合物在室温下保持过夜并真空下去除溶剂。化合物7直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+2H]/2计算值1367.41，实测值1368.88。
Figure BDA0004172056550002191
在室温下向化合物7(1563mg,0.571mmol,1.0equiv.)和化合物2(381mg,0.743mmol,1.3equiv.)在无水DCM(10mL)中的溶液中加入TEA(0.162mL,1.143mmol,2.0equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜并真空下去除溶剂。LP111-p通过
Figure BDA0004172056550002192
纯化，用二氯甲烷中的8-16％甲醇洗脱。LC-MS：计算值[M+3H]/3 1044.67，实测值1046.18。
LP124-p的合成
Figure BDA0004172056550002201
在室温下向化合物1(760mg)中加入2mL的4M HCl/二氧六环。在室温下搅拌反应混合物。反应混合物搅拌1.5小时直至经LC-MS证实完全转化。真空下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM中，并加入化合物3(84.1mg)、4(207mg)和5(0.281mL)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
产物通过标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水)提取。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550002202
纯化化合物6，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％ B)。
Figure BDA0004172056550002203
Figure BDA0004172056550002211
/>
在室温下向化合物6(250mg)中加入4mL 4M HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌2小时直至经LC-MS证实完全转化。真空下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM中，然后加入化合物7(52.9mg)和8(0.036mL)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550002212
纯化LP124-p，梯度为DCM中的0-20％MeOH(0-100％ B)。
LP130-p的合成
Figure BDA0004172056550002213
在室温下向化合物1(1.89g)中加入5mL的4M HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌1.5小时直至经LC-MS证实完全转化。真空下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM中，并加入化合物2(209mg)、3(516mg)和4(0.70mL)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
产物通过标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水)提取。使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550002214
纯化化合物5，梯度为DCM中的0-20％ MeOH(0-100％ B)。/>
Figure BDA0004172056550002221
在室温下向化合物5(800mg)中加入5mL的4N HCl/二氧六环。反应混合物在室温下搅拌2小时直至经LC-MS证实完全转化。然后真空下浓缩反应混合物。将残余物溶解于DCM中，然后加入化合物2(169mg)和3(0.116mL)。在室温下搅拌反应混合物直至通过TLC观察到完全转化。
使用硅胶作为固定相通过
Figure BDA0004172056550002222
纯化LP130-p，梯度为DCM至DCM中的20％MeOH(0-100％ B)。
LP143-p的合成
Figure BDA0004172056550002223
在压力容器中将化合物1(500mg)溶解于10mL无水THF中并加入K2CO3(398mg)。作为极小量DMF中的溶液加入化合物2(983mg)并将容器加盖且安置反应混合物在40℃下搅拌过夜。然后，使得反应混合物冷却至室温。滤除固体并在真空下浓缩反应混合物。化合物3使用快速色谱法纯化，用己烷中的0-100％ EtOAc洗脱。
Figure BDA0004172056550002231
将化合物3(1070mg)溶解于4mL在二氧六环中的4M HCl中并且搅拌直至去除所有Boc。然后浓缩反应混合物。化合物4使用快速色谱法纯化，用DCM中的0-20％ MeOH洗脱。
Figure BDA0004172056550002232
在压力容器中将化合物5(1000mg)溶解于5mL无水DMF中并加入K2CO3(1.315g)。然后，加入极小量DMF中的化合物6(850mg)并将反应混合物加盖且在40℃下搅拌。然后，使得反应混合物冷却至室温。滤除固体并然后真空下浓缩反应混合物。化合物7使用快速色谱法纯化，用己烷中的0-100％ EtOAc洗脱。
Figure BDA0004172056550002233
将H3PO4(0.594mL)加入到化合物7(900mg)在20mL甲苯中的搅拌着的溶液中。反应混合物在室温下搅拌过夜。然后反应混合物用水(30mL)稀释并用乙酸乙酯(30mL)洗涤3次。合并的有机层经硫酸钠干燥并浓缩。
Figure BDA0004172056550002241
将化合物8(100mg)和TBTU(149mg)溶解于2mL DMF中并搅拌5分钟。然后，将TEA(0.152mL)和化合物4(142mg)加入到混合物中并且反应混合物在室温下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯(10mL)稀释并用饱和氯化铵(3x10mL)洗涤。有机层经硫酸钠干燥并浓缩。化合物9使用快速色谱法纯化，用0-100％己烷-乙酸乙酯和然后DCM/MeOH 0-20％洗脱。
Figure BDA0004172056550002242
将化合物9(197mg)溶解于4mL THF中。然后，加入LiOH(43mg)和水(0.4mL)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS证实脱保护。反应混合物用
Figure BDA0004172056550002243
15淬灭。滤除Amberlyst并浓缩反应混合物。化合物10使用快速色谱法纯化，用含有0.1％ HOAc添加剂的己烷中的0-100％乙酸乙酯洗脱。
Figure BDA0004172056550002244
化合物10(380mg)与TBTU(424mg)在4mL DMF中混合5分钟.。然后，加入化合物11(2.12g)和接着DIPEA(0.542mL)。在室温下搅拌反应混合物并如下加入推进剂：在2小时时50％ TBTU和50％DIPEA，在3小时时25％ TBTU和50％ DIPEA，在4小时时50％ DIPEA，在5小时时50％ DIPEA。6.5小时之后淬灭反应混合物。反应混合物用DCM中的20％ TFE(15mL)稀释并用饱和氯化铵洗涤两次(15mL)。有机层经硫酸钠干燥并浓缩。然后化合物12通过HPLC纯化。
Figure BDA0004172056550002251
在0℃下将mCPBA(70％纯,12mg)加入到化合物12(28mg)在1mL DCM中的搅拌着的溶液中。使得反应混合物温热至室温搅拌过夜并经LCMS监测。混合物用DCM中的20％ TFE(5mL)稀释，然后用饱和亚硫酸钠(2X5mL)洗涤并用饱和碳酸氢钠(5mL)洗涤一次。有机层经硫酸钠干燥。通过LC-MS证实LP143-p的正确质量。
LP210-p的合成
Figure BDA0004172056550002252
Figure BDA0004172056550002261
将化合物1(0.2g,0.08mmol)和TBTU(0.0542g,0.735mmol)溶解于DCM(5mL)中并加入NEt3(0.0244mL,0.175mmol)。在单独的小瓶中，化合物2(0.007g,0.037mmol)和NEt3(0.0244mL,0.175mmol)在DCM(1mL)中一起搅拌。所得溶液搅拌10分钟。10分钟之后，将化合物2的溶液加入到化合物1的溶液中。所得混合物搅拌90分钟并然后通过LC-MS检查。反应混合物用5mL水淬灭并搅拌5分钟。分离层，并且有机层用饱和NaHCO3(aq)(2x20mL)、水(20mL)、饱和NH4Cl(aq)(2x20mL)、饱和NaCl(aq)(2x20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到为蜡状类白色固体的粗品化合物3(约200mg)。粗品产物通过硅胶色谱法纯化，用DCM中的0-20％ MeOH洗脱。合并纯的级分，得到50(27％产率)为白色固体的化合物3。
Figure BDA0004172056550002262
将化合物3(0.05g,0.010mmol)溶解于1:1MeOH/THF(5mL)中，并加入LiOH(0.042g,1.74mmol)和水(100μL,5.55mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜并通过LC-MS检查。蒸发掉有机物并用约10mL水稀释所得悬浮液。所得悬浮液用3M HCl(aq)酸化至pH为1并用DCM(3x25mL)提取。合并的有机物用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩并真空下干燥，得到49mg(98％产率)为类白色固体的化合物4。使用产物而无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002271
将化合物4(0.05g,0.010mmol)和COMU(0.0063g,0.015mmol)溶解于DCM(1mL)中并加入NEt3(13.7μL,0.098mmol)，所得溶液搅拌10分钟。在单独的小瓶中，将化合物5溶解于DCM(0.3mL)中。10分钟之后，将化合物5的溶液加入到含有1807-019的溶液中。所得溶液搅拌2小时。反应混合物用1M HCl(aq)(10mL)淬灭并且有机层用10mL DCM稀释。分离层，并且有机层用1M HCl(aq)(20mL)、饱和NHCO3(aq)(1x20mL)、饱和NaCl(aq)(1x20mL)进一步洗涤，经Na2SO4干燥。浓缩并真空下干燥，得到94mg为类白色固体的粗品LP210-p。粗品产物通过硅胶色谱法纯化，用DCM中的0-20％MeOH洗脱。合并含有纯LP210-p的级分并浓缩，得到7mg(13.3％产率)。
LP217-p的合成
Figure BDA0004172056550002281
将化合物1(0.265g,0.105mmol)和COMU(0.0542g,0.735mmol)溶解于DCM(5mL)中并加入NEt3(0.1mL,0.74mmol)。所得溶液搅拌10分钟。10分钟之后，将化合物2(0.010g,0.049mmol)加入到反应中。所得混合物搅拌过夜并通过LC-MS检查。反应混合物用5mL水淬灭并搅拌5分钟。分离层，并且有机层用饱和NaHCO3(aq)(2x20mL)、水(20mL)、2M HCl(aq)(2x20mL)、饱和NaCl(aq)(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到为蜡状类白色固体的粗品化合物3(约350mg)。粗品化合物3通过硅胶色谱法(DCM中的2-20％ MeOH)纯化。合并含有化合物3的级分，得到为类白色固体的89mg(36％产率)。
Figure BDA0004172056550002282
Figure BDA0004172056550002291
将化合物3(0.089g,0.017mmol)溶解于1:1MeOH/THF(5mL)中并加入LiOH(0.042g,1.74mmol)和水(180μL,9.85mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜并通过LC-MS检查。蒸发掉有机物并用约10mL水稀释所得悬浮液。悬浮液用3M HCl(aq)酸化至pH为1并用DCM(3x25mL)提取。合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩并真空下干燥，得到81mg(91％产率)为类白色固体的化合物4。使用产物而无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002292
将化合物4(0.081g,0.016mmol)和COMU(0.010g,0.024mmol)溶解于DCM(1mL)中并加入NEt3(44.2μL,0.32mmol)。所得溶液搅拌10分钟。在单独的小瓶中，将化合物5溶解于DCM(0.3mL)中。10分钟之后，将化合物5的溶液加入到含有化合物4的溶液中。所得混合物搅拌2小时。反应混合物用1M HCl(aq)(10mL)淬灭并且有机层用10mL DCM稀释。分离层，并且有机层用1M HCl(aq)(20mL)、饱和NHCO3(aq)(1x20mL)、饱和NaCl(aq)(1x20mL)进一步洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩并真空下干燥，得到94mg为类白色固体的粗品LP217-p。粗品产物通过硅胶色谱法(DCM中的0-20％ MeOH)纯化。合并含有纯LP217-p的级分并浓缩，得到24mg(28％产率)。
LP220-p的合成
Figure BDA0004172056550002301
向化合物2(3.3381mmol,4.0140g)和TEA(4.0058mmol,0.4054g,0.558mL)在DCM中的溶液中加入化合物1(3.5050mmol,0.9634g,1.059mL)。搅拌反应混合物直至通过LC-MS观察到化合物2完全转化。通过标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水洗涤,并经Na2SO4干燥)纯化残余物。使用化合物3而无需进一步纯化。产量：4.5g。
Figure BDA0004172056550002302
在室温下向化合物5(29.7354mmol,5.0000g)在50mL DMF中的溶液中加入化合物4(65.4178mmol,13.7502g)和Cs2CO3(118.9414mmol,38.7535g)。反应混合物在60℃下搅拌过夜。通过标准处理(1N NaOH，盐水洗涤,并经Na2SO4干燥)纯化反应混合物。通过硅胶色谱法纯化化合物6并浓缩，得到6.0g。
Figure BDA0004172056550002311
将化合物3(1.0500mmol,1.5129g)溶解于8mL 4N HCl/二氧六环中并在室温下搅拌5小时。去除HCl之后，加入化合物2(1.0000mmol,1.2020g)、COMU(1.2000mmol,0.5139g)和DCM中的TEA(3.0000mmol,0.3035g,0.418mL)。搅拌反应混合物直至通过TLC观察到化合物2完全转化。通过标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水洗涤,并经Na2SO4干燥)纯化残余物。化合物7通过硅胶色谱法纯化并浓缩，得到2.28g。
Figure BDA0004172056550002312
在室温下向NaOH在5mL MeOH中的溶液中加入在20mL DCM中的化合物6(1.0000mmol,0.4545g)。反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物酸化至pH为3。产物用Na2SO4干燥，得到0.200g化合物8，使用其而无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002313
在室温下将化合物7(0.7707mmol,1.9800g)溶解于10mL 4N HCl/二氧六环中。去除溶剂并且产物置于真空下2小时，得到1.50g化合物9，使用其而无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002321
将化合物10(0.0782mmol,0.0300g)溶解于1mL DCM中，并加入0.5mL TFA且混合物搅拌2小时。去除TFA并且化合物11在真空下干燥1小时。将化合物8(0.0822mmol,0.0362g)、COMU(0.0939mmol,0.0402g)和TEA(0.2347mmol,0.0237g,0.033mL)溶解于5mL DCM中持续5min，然后加入DCM中的化合物11。搅拌反应混合物直至通过TLC观察到化合物11完全转化。化合物12通过硅胶色谱法纯化，得到0.0135g。
Figure BDA0004172056550002322
将化合物12(0.0191mmol,0.0135g)溶解于1mL DCM中，加入0.5mL的TFA并且混合物搅拌1小时。去除TFA并且化合物13在真空下干燥1小时。将化合物9(0.0398mmol,0.1000g)、COMU(0.0477mmol,0.0204g)和TEA(0.1194mmol,0.0121g,0.017mL)溶解于3mLDCM中持续5min，然后加入DCM中的化合物13。搅拌混合物直至通过TLC观察到化合物13完全转化。LP220-p通过硅胶色谱法纯化，得到0.0400g。
LP221-p的合成
Figure BDA0004172056550002331
将二硫化碳(75.0045mmol,5.7101g,4.532mL)缓慢加入到化合物1(25mmol,4.20g)和氢氧化钾在EtOH(150mL)中的溶液中。反应混合物回流24小时。完成后，减压蒸发溶剂并将残余物溶解于水中。使用HCl将水溶液酸化至pH 2。产物用EtOAc提取，并通过硅胶色谱法(使用EtOAc/己烷)纯化。纯化之后，得到3.5g为橙色固体的化合物2。
Figure BDA0004172056550002332
将在THF(40mL)中的化合物2(10.0000mmol,2.1021g)冷却至0℃。加入CH3I(11.0000mmol,1.5609g,0.685mL)和然后TEA(10.1000mmol,1.0221g,1.408mL)。反应混合物搅拌4小时。完成后，溶剂通过NH4Cl淬灭。有机相用盐水洗涤，干燥并通过硅胶色谱法纯化，得到1.5g化合物3。
Figure BDA0004172056550002333
在室温下向化合物4(6.8679mmol,1.5391g)在10mL DMF中的溶液中加入化合物3(3.1218mmol,0.7000g)和Cs2CO3(9.3654mmol,3.0514g)。反应混合物在60℃下搅拌过夜。反应混合物通过标准处理(1N NaOH，盐水洗涤,并经Na2SO4干燥)和硅胶色谱法纯化，得到1.0g化合物5。
Figure BDA0004172056550002341
搅拌化合物5(0.2000mmol,0.1021g)和mCPBA(0.9998mmol,0.1725g)在DCM中的混合物直至通过TLC观察到mCPBA完全转化。反应混合物通过标准处理(1N HCl，饱和NaHCO3，盐水洗涤，并经Na2SO4干燥)和硅胶色谱法纯化，得到0.05g化合物6。
Figure BDA0004172056550002342
将化合物6(0.0191mmol,0.0104g)溶解于1mL DCM中，并加入0.5mL的TFA且混合物搅拌1小时。去除所有TFA，并且化合物7在真空下干燥1小时。将化合物8(0.0398mmol,0.1000g)、COMU(0.0477mmol,0.0204g)和TEA(0.1990mmol,0.0201g,0.028mL)溶解于3mLDCM中持续5分钟，然后加入DCM中的化合物7。搅拌反应混合物直至通过TLC观察到化合物7完全转化。残余物通过硅胶色谱法纯化，得到0.016g的LP221-p。
LP223-p的合成
Figure BDA0004172056550002351
在室温下向化合物1(741mg,2.442mmol,1.0equiv.)、化合物2(528mg,2.930mmol,1.20equiv.)和二异丙基乙胺(1.276mL,7.327mmol,3.0equiv.)在无水DMF(10mL)中的溶液中加入TBTU(980mg,3.052mmol,1.25equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时。有机相用饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)淬灭并用EtOAc(2x10mL)提取。合并有机相，经Na2SO4干燥并浓缩。化合物3通过
Figure BDA0004172056550002352
纯化并用己烷中的40-80％ EtOAc洗脱。LC-MS：[M+H]+，计算值466.25，实测值466.72。
Figure BDA0004172056550002353
在室温下向化合物3(990mg,2.126mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(6.38mL,25.518mmol,12equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物4直接使用而无需进一步纯化。LC-MS：[M+H]/+计算值266.14，实测值266.43。
Figure BDA0004172056550002354
Figure BDA0004172056550002361
在室温下向化合物4(100mg,0.295mmol,1.0equiv.)、化合物5(755mg,0.606mmol,2.05equiv.)和二异丙基乙胺(0.257mL,0.025mmol,5.0equiv.)在无水DCM溶液(10mL)中的溶液中加入COMU(278mg,0.650mmol,2.20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。反应混合物用饱和氯化铵(10mL)和碳酸氢钠水溶液(10mL)洗涤。有机相经无水Na2SO4干燥并浓缩。化合物6通过
Figure BDA0004172056550002362
纯化，用DCM中的8-18％ MeOH洗脱。LC-MS：[M+3H]/3，计算值907.86，实测值907.61。
Figure BDA0004172056550002363
在室温下向化合物6(550mg,0.202mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(1.01mL,4.040mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物7直接使用而无需进一步纯化。LC-MS：[M+H]/+计算值841.16，实测值842.20。
Figure BDA0004172056550002371
在室温下向化合物1(490mg,0.188mmol,1.0equiv.)、化合物5(482mg,0.387mmol,2.05equiv.)和二异丙基乙胺(0.164mL,0.944mmol,5.0equiv.)在无水DCM(10mL)中的溶液中加入COMU(177mg,0.415mmol,2.20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。反应混合物用饱和氯化铵(10mL)和碳酸氢钠水溶液(10mL)洗涤。有机相经无水Na2SO4干燥并浓缩。化合物8通过
Figure BDA0004172056550002372
纯化，用DCM中的8-20％ MeOH洗脱。LC-MS：[M+5H]/5，计算值960.18，实测值961.74。
Figure BDA0004172056550002373
在室温下向化合物1(670mg,0.134mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(0.673mL,2.691mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物9直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+5H]/5计算值956.16，实测值957.66。
Figure BDA0004172056550002381
在室温下向化合物9(650mg,0.134mmol,1.0equiv.)和化合物10(106mg,0.301mmol,2.25equiv.)在无水DCM(20mL)中的溶液中加入TEA(0.095mL,0.669mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时并浓缩溶剂。化合物11通过
Figure BDA0004172056550002382
分离，用DCM中的8-20％ MeOH洗脱。LC-MS：计算值[M+5H]/5 1051.45，实测值1053.44。
Figure BDA0004172056550002383
Figure BDA0004172056550002391
在室温下向化合物11(460mg,0.0875mmol,1.0equiv.)在THF(5mL)和水(5mL)中的溶液中加入LiOH(10.5mg,0.437mmol,5.0equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。反应混合物pH通过加入HCl调节至3.0并用DCM(2x10mL)提取。合并的有机相经无水Na2SO4干燥并浓缩。化合物12直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+5H]+/5 1048.65，实测值1050.68。
Figure BDA0004172056550002392
在室温下向化合物12(100mg,0.0191mmol,1.0equiv.)、化合物13(4.8mg,0.021mmol,1.1equiv.)和二异丙基乙胺(0.010mL,0.0572mmol,3.0equiv.)在无水DCM(3mL)中的溶液中加入COMU(10.2mg,0.0238mmol,1.25equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)洗涤。有机相经无水Na2SO4干燥并浓缩。LP223-p通过
Figure BDA0004172056550002393
纯化，用DCM中的8-20％ MeOH洗脱。LC-MS：[M+5H]/5，计算值1090.47，实测值1091.85。
LP224-p的合成
Figure BDA0004172056550002394
在室温下向化合物1(12mg,0.0313mmol,1.0equiv.)在DCM(1mL)中的溶液中加入TFA(0.5mL)。反应混合物在室温下保持30分钟并然后浓缩。化合物2直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+H]+计算值284.06，实测值284.26。
Figure BDA0004172056550002401
在室温下向化合物3(150mg,0.0286mmol,1.0equiv.,来自LP223-p合成的化合物12)、化合物2(12.5mg,0.0315mmol,1.1equiv.)和二异丙基乙胺(0.015mL,0.0859mmol,3.0equiv.)在无水DCM(3mL)中的溶液中加入COMU(15.3mg,0.0358mmol,1.25equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)洗涤。有机相经无水Na2SO4干燥并浓缩。LP224-p通过
Figure BDA0004172056550002403
纯化，用DCM中的8-16％ MeOH洗脱。LC-MS：[M+5H]/5，计算值1101.66，实测值1103.13。
LP225-p的合成
Figure BDA0004172056550002402
Figure BDA0004172056550002411
在室温下向化合物1(80mg,0.130mmol,1.0equiv.)、化合物2(652mg,0.267mmol,2.05equiv.)和二异丙基乙胺(0.068mL,0.391mmol,3.0equiv.)在无水DCM(10mL)中的溶液中加入COMU(134mg,0.312mmol,2.40equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜。化合物3通过
Figure BDA0004172056550002412
纯化，用DCM中的8-16％ MeOH洗脱。LC-MS：[M+5H]/5，计算值1091.89，实测值1093.41。
Figure BDA0004172056550002413
在室温下向化合物3(340mg,0.0623mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(0.311mL,1.245mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+5H]/5计算值1071.88，实测值1073.36。
Figure BDA0004172056550002414
在室温下向化合物4(100mg,0.0185mmol,1.0equiv.)和化合物5(3.9mg,0.0204mmol,1.10equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入TEA(0.008mL,0.0556mmol,3.0equiv.)。反应混合物在室温下保持2小时并浓缩溶剂。LP225-p通过
Figure BDA0004172056550002421
分离，用DCM中的13-20％ MeOH洗脱。LC-MS：计算值[M+5H]/5 1102.48，实测值1104.45。
LP226-p的合成
Figure BDA0004172056550002422
在室温下向化合物1(80mg,0.130mmol,1.0equiv.)、化合物2(652mg,0.267mmol,2.05equiv.)和二异丙基乙胺(0.068mL,0.391mmol,3.0equiv.)在无水DCM(10mL)中的溶液中加入COMU(134mg,0.312mmol,2.40equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜。化合物3通过
Figure BDA0004172056550002423
纯化，用DCM中的8-16％ MeOH洗脱。LC-MS：[M+5H]/5，计算值1091.89，实测值1093.41。
Figure BDA0004172056550002424
在室温下向化合物3(340mg,0.0623mmol,1.0equiv.)中加入二氧六环中的4M HCl(0.311mL,1.245mmol,20equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时并然后浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+5H]/5计算值1071.88，实测值1073.36。
Figure BDA0004172056550002431
在室温下向化合物4(80mg,0.0148mmol,1.0equiv.)、化合物5(1.9mg,0.0163mmol,1.1equiv.)和二异丙基乙胺(0.008mL,0.0445mmol,3.0equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入COMU(7.9mg,0.0185mmol,1.25equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)洗涤。有机相经无水Na2SO4干燥并浓缩。LP226-p通过
Figure BDA0004172056550002432
纯化，用DCM中的15-20％ MeOH洗脱。LC-MS：[M+5H]/5，计算值1091.28，实测值1093.41。
LP238-p的合成
Figure BDA0004172056550002433
Figure BDA0004172056550002441
在室温下向化合物1(5.00g,22.50mmol)和Cs2CO3(25.66g,78.75mmol)在无水DMF(80mL)中的悬浮液中加入碘甲烷(4.20mL,67.50mmol)。反应混合物在室温下搅拌48小时。反应混合物用水(200mL)淬灭并用EtOAc(3x100mL)提取混合物。合并有机相并用水和盐水洗涤。有机层经无水Na2SO4干燥并浓缩。得到为浅黄色固体的化合物2，5.41g，96％。化合物2直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+H]计算值251.05，实测值251.18。
Figure BDA0004172056550002442
向化合物2(5.41g,21.62mmol)在THF/H2O(50mL/50mL)中的溶液中加入LiOH(2.59g,108.08mmol)。反应混合物在室温下搅拌1小时。真空下去除THF之后，通过[C]HCl将pH调节至约2。然后EtOAc(3x60mL)用于提取。合并有机层，用盐水洗涤，然后经无水Na2SO4干燥并浓缩。得到为类白色固体的化合物3，5g，98％。化合物3直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+H]237.03，实测值237.26。
Figure BDA0004172056550002443
在室温下向化合物3(5.81g,24.60mmol)在THF/DMF(80mL/20mL)中的溶液中加入EDC(7.07g,36.90mmol)、DMAP(0.30g,2.46mmol)和化合物4(6.13g,36.90mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。真空下去除溶剂之后，将残余物加载于120g柱上并用己烷中的0-50％EtOAc洗脱化合物5。得到为白色固体的化合物5，9.36g，99％。LC-MS：计算值[M+H]385.03，实测值385.46。
Figure BDA0004172056550002451
在0℃下向化合物5(2.29g,5.96mmol)在DCM(110mL)中的溶液中加入70％m-CPBA(5.14g,27.79mmol)。反应混合物在室温下搅拌6小时。在室温下加入另外的1.8g m-CPBA。反应混合物在室温下搅拌过夜。过滤之后，真空下去除溶剂。残余物从DCM/EtOAc(50mL/50mL)重结晶两次。得到为白色针状结晶的化合物6，1.93g，78％。LC-MS：计算值[M+H]417，实测值417。
Figure BDA0004172056550002452
Figure BDA0004172056550002461
在0℃下向化合物7(10.00g,4.34mmol)在DCM(100mL)中的溶液中加入棕榈酰氯(1.31g,4.78mmol)和TEA。反应混合物在室温下搅拌过夜并然后真空下去除溶剂。残余物通过硅胶色谱法(使用DCM中的0-20％ MeOH)纯化。得到为白色固体的化合物8，10.0g，90％。
Figure BDA0004172056550002462
将化合物8(9.56g,3.76mmol)溶解于25mL 4N HCl/二氧六环中并在室温下搅拌1小时。去除所有溶剂并且残余物真空下干燥2小时。将残余物重新溶解于150mL DCM中并加入TEA，然后加入化合物9(1.10g,1.79mmol)和COMU(1.69g,3.94mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。标准处理(1N HCl，饱和碳酸氢钠，盐水洗涤)之后，去除DCM。化合物10通过120g柱(使用DCM中的0-20％ MeOH)纯化，得到5.90g，60％。
Figure BDA0004172056550002463
将化合物10(4.50g,0.82mmol)溶解于20mL 4N HCl/二氧六环中并在室温下搅拌1小时。去除所有溶剂并且残余物真空下干燥2小时。将残余物重新溶解于100mL DCM中并加入TEA和然后化合物6(0.69g,1.65mmol)。反应混合物在室温下搅拌过夜。通过1N HCl洗涤去除TEA并浓缩有机层。粗品LP238-p通过硅胶色谱法(使用DCM中的0-20％ MeOH)纯化。得到2.80g(60％)为浅黄色固体的LP238-p。
LP240-p的合成
Figure BDA0004172056550002471
在室温下向化合物1(880mg,3.647mmol,1.0equiv.)和Cs2CO3(1.782g,5.471mmol,1.50equiv.)在无水DMF(10mL)中的悬浮液中加入化合物2(0.843g,4.012mmol,1.10equiv.)。反应混合物在室温下保持3小时。反应混合物用水(20mL)淬灭并且混合物用乙酸乙酯(2x10mL)提取。合并的有机相用盐水(1x20mL)和水(1x20mL)洗涤。有机相通过无水Na2SO4干燥并浓缩。化合物3直接使用无需进一步纯化。LC-MS：[M+H]+计算值280.09，实测值280.39。
Figure BDA0004172056550002472
在室温下向化合物3(1000mg,3.581mmol,1.0equiv.)在THF(10mL)和水(10mL)中的溶液中加入LiOH(686mg,19.978mmol,8.0equiv.)。反应混合物在室温下保持1小时。反应混合物pH通过加入HCl调节至1.0。产物用乙酸乙酯(2x10mL)提取。合并的有机相经无水Na2SO4干燥并浓缩。化合物4直接使用无需进一步纯化。LC-MS：计算值[M+H]+252.05，实测值251.31。
Figure BDA0004172056550002481
在室温下向化合物4(5mg,0.0199mmol,1.0equiv.)、化合物5(100mg,0.0408mmol,2.05equiv.)和二异丙基乙胺(0.017mL,0.0995mmol,5.0equiv.)在无水DCM(2mL)中的溶液中加入COMU(20.5mg,0.0478mmol,2.40equiv.)。反应混合物在室温下保持过夜。LP240-p通过
Figure BDA0004172056550002482
纯化，用DCM中的8-20％ MeOH洗脱。LC-MS：[M+5H]/5,计算值1019.43，实测值1020.79。
LP246-p的合成
Figure BDA0004172056550002483
将化合物1(0.5g,0.401mmol)和COMU(0.206g,0.481mmol)溶解于DCM(10mL)中并加入NEt3(0.168mL,1.2mmol)。所得溶液搅拌10分钟。10分钟之后，将1-氨基十六烷(0.102g,0.42mmol)加入到化合物1和COMU的溶液中。所得溶液搅拌90分钟并通过LC-MS检查。反应混合物用5mL水淬灭并搅拌5分钟。分离层并用1M HCl(aq)(2x15mL)、饱和NaHCO3(aq)(2x20mL)、水(20mL)、饱和NaCl(aq)(2x20mL)洗涤有机层，经Na2SO4干燥并浓缩，得到泡沫状浅黄色固体。粗品产物通过硅胶色谱法(DCM中的0-20％ MeOH)纯化。合并化合物2的纯级分，得到为白色固体的515mg(87％产率)。
Figure BDA0004172056550002491
将化合物2(0.515g,0.35mmol)溶解于DCM(4mL)中，冷却至0℃并加入TFA(1mL,13mmol)。加入TFA之后，使得反应混合物温热至室温。所得溶液搅拌90分钟并然后通过LC-MS分析。反应混合物用加入饱和NaHCO3(aq)淬灭直至观察不到冒泡并搅拌5分钟。分离层，并用饱和NaHCO3(aq)(2x20mL)、水(20mL)、饱和NaCl(aq)(20mL)洗涤有机层，经Na2SO4干燥并浓缩，得到为泡沫状白色固体的化合物3 0.4674g(97.4％产率)。
Figure BDA0004172056550002492
将tBoc-酰氨基-PEG24-COOH(0.524g,0.42mmol)和COMU(0.180g,0.42mmol)溶解于DCM(10mL)中并加入NEt3(0.488mL,3.5mmol)。所得溶液搅拌10分钟。10分钟之后，将化合物3(0.480g,0.35mmol)加入到tBoc-酰氨基-PEG24-COOH的溶液中。所得溶液搅拌1小时并通过LC-MS检查。反应混合物用5mL水淬灭并搅拌5分钟。分离层，并且有机层用1M HCl(1x15mL)、饱和NaHCO3(aq)(2x20mL)、水(20mL)、1M HCl(1x20mL)、饱和NaCl(aq)(2x20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到泡沫状浅黄色固体(约900mg)。粗品产物通过硅胶色谱法(DCM中的0-20％ MeOH)纯化。化合物4以DCM中的4％ MeOH洗脱。合并化合物4的纯级分，得到为浅粉色固体的0.780g(85.7％)。
Figure BDA0004172056550002493
Figure BDA0004172056550002501
将化合物4(0.78g,0.3mmol)溶解于DCM(4mL)中，冷却至0℃，并加入TFA(1mL,13mmol)。加入TFA之后，使得反应混合物温热至室温。所得溶液搅拌3小时并通过LC-MS检查。反应混合物用加入饱和NaHCO3(aq)淬灭直至观察不到冒泡并搅拌5分钟。分离层并且有机层用饱和NaHCO3(aq)(2x20mL)、水(20mL)、饱和NaCl(aq)(20mL)洗涤，经Na2SO4干燥并浓缩，得到为泡沫状白色固体的化合物50.741g(98.9％产率)。化合物5用于下一步骤而无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002502
/>
Figure BDA0004172056550002511
将N-Boc-N-双-PEG4-酸(化合物6,0.0339g,0.055mmol)和COMU(0.0473g,0.11mmol)溶解于DCM(3mL)中并加入NEt3(0.167mL,1.20mmol)。所得溶液搅拌10分钟。10分钟之后，将化合物5(0.30g,0.12mmol)加入到化合物6的溶液中。所得溶液搅拌1小时。浓缩反应混合物并直接加载到硅胶柱上用于纯化。粗品产物通过硅胶色谱法(DCM中的0-20％MeOH)纯化。化合物7开始用DCM中的6％ MeOH洗脱。大部分纯的化合物7用DCM中的12％MeOH洗脱。合并化合物7的纯级分，得到为类白色固体的264mg(86％产率)。
Figure BDA0004172056550002521
将化合物7(100mg,0.041mmol)溶解于DCM(2mL)中并加入TFA(1mL,8.64mmol)。反应混合物搅拌2小时并通过LC-MS检查。反应混合物用饱和NaHCO3(aq)淬灭并用DCM稀释。分离层并用饱和NaCl(aq)(20mL)洗涤有机层，经Na2SO4干燥并浓缩，得到0.09g为浅黄色固体的化合物8(86％产率)。化合物8直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002522
将化合物8(0.090g,0.016mmol)溶解于DCM(3mL)中并加入NEt3(22.9μL,0.164mmol)和然后加入3-叠氮基丙酸NHS-酯(化合物9,0.0174g,0.082mmol)。反应混合物搅拌4小时并通过LC-MS检查。浓缩反应混合物并直接加载到硅胶柱上用于纯化。粗品产物通过硅胶色谱法(可得自Teledyne Isco的4g Redisep
Figure BDA0004172056550002531
柱，DCM中的0-20％MeOH)纯化。LP246-p用DCM中的16％ MeOH洗脱。合并LP246-p的纯级分，得到0.019g类白色固体(20.7％产率)。
LP247-p的合成
Figure BDA0004172056550002532
将化合物2(11.2mg,0.047mmol)和COMU(20mg,0.047mmol)溶解于DCM(3mL)中并加入NEt3(16.7μL,0.12mmol)。所得溶液搅拌10分钟。10分钟之后，将化合物1(130mg,0.024mmol,来自LP246-p合成的化合物8)在DCM(2mL)中的溶液加入到化合物2/COMU的溶液中。所得溶液搅拌1小时并通过LC-MS检查。反应混合物用5mL水淬灭并搅拌5分钟。分离层并用1M HCl(aq)(1x15mL)、饱和NaHCO3(aq)(3x20mL)、饱和NaCl(aq)(20mL)洗涤有机层，经Na2SO4干燥并浓缩，得到透明液体。粗品产物通过硅胶色谱法(可得自Teledyne Isco的4gRedisep
Figure BDA0004172056550002533
柱，DCM中的0-20％ MeOH)纯化。化合物3用DCM中的12％ MeOH洗脱。合并化合物3的纯级分，得到为类白色固体的0.086g(63.6％产率)。
Figure BDA0004172056550002541
将化合物3(0.086g,0.015mmol)溶解于DCM(3mL)中并加入mCPBA(0.0131g,0.076mmol)。所得溶液搅拌过夜。浓缩反应混合物并直接加载到硅胶柱上。粗品产物通过硅胶色谱法(可得自Teledyne Isco的4g Redisep
Figure BDA0004172056550002542
柱，DCM中的0-20％ MeOH)纯化。LP247-p用DCM中的12％ MeOH洗脱。合并LP247-p的纯级分，得到为类白色固体的0.041mg(47.4％产率)。
LP339-p的合成
Figure BDA0004172056550002543
将Boc-酰氨基-PEG23-胺2(8.00g,6.82mmol)溶解于DCM(250mL)中并加入三乙胺(2.85mL,20.45mmol)和然后叠氮基-PEG24-NHS酯1(9.95g,7.84mmol)。在室温下搅拌反应混合物。2小时之后，如通过LC-MS测定的没有剩余起始材料。浓缩反应混合物并直接加载到硅胶柱上用于纯化。粗品产物通过硅胶色谱法(2％ MeOH:98％ DCM至20％ MeOH:80％ DCM)纯化。合并含有产物的级分，得到14.3克(90％产率)为白色固体的化合物3。
Figure BDA0004172056550002551
将N-Boc-PEG23-酰氨基-PEG24-叠氮化物3(10.0g,4.296mmol)、1-十八炔4(1.183g,4.726mmol)、五水硫酸铜(0.268g,1.074mmol)、三((1-羟基-丙基-1H-1,2,3-***-4-基)甲基)胺(THPTA)(0.653g,1.504mmol)和抗坏血酸钠(1.872g,9.451mmol)溶解于DMF(500mL)中并加入三乙胺(0.290mL,2.148mmol)。将反应混合物加热至60℃。2小时之后，通过LC-MS观察到没有起始材料。浓缩反应混合物，并且残余物用二氯甲烷稀释且通过多孔漏斗过滤。浓缩滤液并直接加载到硅胶柱上用于纯化。粗品产物通过硅胶色谱法(0％MeOH:100％ DCM至20％ MeOH:80％ DCM)纯化。产物以8％ MeOH/92％ DCM洗脱。合并纯的级分，得到9.5g(86％产率)为浅黄色固体的化合物5。
Figure BDA0004172056550002552
将N-Boc-PEG23-酰氨基-PEG24-***-C16 5(0.358g,0.139mmol)溶解于DCM(4mL)中并加入三氟乙酸(0.9mL,11.8mmol)。1小时之后，通过LC-MS观察到没有起始材料。浓缩反应混合物并真空下干燥数小时，得到0.325mg(90.9％产率)为浅黄色固体的化合物6。产物直接用于下一步反应无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002553
Figure BDA0004172056550002561
将N-Boc-N-双-PEG4-酸7(0.0372g,0.061mmol)和COMU(0.052g,0.121mmol)溶解于DCM(5mL)中并加入TEA(0.395mL,2.84mmol)。所得溶液搅拌10分钟。在单独的小瓶中，搅拌氨基-PEG23-酰氨基-PEG24-***-C16的TFA盐6(0.325g,0.126mmol)在DCM(5mL)和TEA(0.5mL,3.60mmol)中的溶液。将N-Boc-N-双-PEG4-酸7的溶液加入到氨基-PEG23-酰氨基-PEG24-***-C16 6的溶液中。反应混合物搅拌过夜。浓缩反应混合物并直接加载到硅胶柱上用于纯化。粗品产物通过硅胶色谱法(4％MeOH:96％DCM至20％MeOH:80％DCM)纯化。合并纯的级分，得到89mg(26.5％产率)为浅黄色固体的化合物8。
Figure BDA0004172056550002562
将N-Boc-双-PEG4-酰氨基-PEG23-酰氨基-PEG24-***-C16 8(5.9g,1.066mmol)溶解于DCM(100mL)中并加入TFA(20mL,262.3mmol)。2小时之后，通过LC-MS观察到没有起始材料。浓缩反应混合物，得到为浓黄色液体的化合物9。化合物9直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002571
将氨基-双-PEG4-酰氨基-PEG23-酰氨基-PEG24-***-C16的TFA盐9(5.89g,1.066mmol)溶解于THF(100mL)中并加入TEA(1.5mL,10.66mmol)和TFP-砜10(1.33g,3.20mmol)。22小时之后，LC-MS表明95％转化为产物。浓缩反应混合物，重悬于甲苯中，并在纯化之前再次浓缩。粗品产物通过硅胶色谱法(5％ MeOH:95％ DCM至20％MeOH:80％ DCM)纯化。产物用8％ MeOH:92％ DCM洗脱。合并纯的级分并得到3.000g(49.5％产率)为米色固体的LP339-p。
LP340-p的合成
Figure BDA0004172056550002572
Figure BDA0004172056550002581
将氢化钠(矿物油中的60％分散体,1.93g,48.21mmol)加载于干燥的1L圆底烧瓶中，用MTBE洗涤并悬浮于无水二氧六环(200mL)中。干燥加入十六醇1(11.2g,46.2mmol)并在50℃下搅拌1小时。加入Peg3-甲苯磺酸酯2(15g,40.17mmol)，并且反应混合物在105℃下加热17小时。反应混合物在冰浴中冷却并加入H2O(125mL)。混合物用MTBE提取，并且有机层用H2O、盐水洗涤，并经干燥Na2SO4。化合物3在
Figure BDA0004172056550002582
上纯化，使用220g SiO2柱，洗脱剂：溶剂A-己烷,，溶剂B-EtOAc；B＝0-30％，50min。产量，11.1g，64％。计算值MW 443.67，实测值：MS(ES,pos)：444.67[M+H]+，461.5[M+NH4]+，466.54[M+Na]+。
叠氮化物3(11.1g,25mmol)与MeOH(70mL)中的Pd/C(10％(1g))在1个大气压下于氢气氛下搅拌17小时。反应混合物过滤，浓缩并真空下干燥。化合物4在
Figure BDA0004172056550002583
上纯化，使用80g SiO2柱，洗脱剂：溶剂A-DCM，溶剂B-DCM中的20％MeOH；B＝0-50％在50min内。产量4.66g。计算值：MW 417.7。实测值：MS(ES,pos):418.1[M+H]+。
将TBTU(4.8g,14.9mmol)加入到胺4(5.94g,14.2mmol)、Boc-(Peg 24)-酸5(16.95g,13.6mmol)和DIEA(7.1mL,40.8mmol)在DMF(100mL)中的悬浮液中。反应混合物搅拌3小时，浓缩并且残余的DMF通过与甲苯共蒸发3次去除。将粗品化合物6溶解于CHCl3(500mL)中，用1％ HCl、NaHCO3、盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并且直接用于下一步骤无需进一步纯化。计算值：MW 1646.14。实测值：MS(ES,pos):1646.99[M+H]+，1664.99[M+NH4]+。
化合物6(10.14g,6.16mmol)在4M HCl二氧六环溶液(45mL)中搅拌50分钟。浓缩反应混合物并且残余物通过与甲苯共蒸发2次干燥。将生成的脱保护Peg-胺盐酸盐溶解于DMF(60ml)中，然后加入DIEA(4.29mL,24.6mmol)和酸5(7.674g,6.157mmol)，然后加入TBTU(2.175g,6.77mmol)。反应混合物搅拌4小时。浓缩反应混合物并且残余物通过与甲苯共蒸发3次干燥。将产物化合物7溶解于CHCl3(500mL)中，用1％ HCl、NaHCO3、盐水洗涤并经Na2SO4干燥。化合物7直接用于下一步骤无需进一步纯化。计算值：MW 2774.49。实测值：MS(ES,pos)：1405.24[M+2NH4]2+，1397.20[M+H+Na]2+，1388.67[M+2H]2+。
化合物7(15.22g,5.49mmol)在4M HCl二氧六环溶液(55mL)中搅拌50分钟。浓缩反应混合物并且残余物通过与甲苯共蒸发2次干燥。将生成的脱保护Peg-胺盐酸盐溶解于DCM(100mL)中。Boc-氨基-双(Peg4-酸)8(1.68g,2.74mmol)在含有TEA(2.2mL,15.8mmol)和COMU(2.47g,5.76mmol)的DCM(15mL)中搅拌3分钟，并然后加入到脱保护Peg-胺盐酸盐的溶液中。反应混合物搅拌3小时并去除溶剂。将残余物溶解于氯仿(300mL)中，用1％ HCl、NaHCO3、盐水洗涤并经Na2SO4干燥。化合物9在
Figure BDA0004172056550002591
上纯化，使用SiO2柱(220g)，洗脱剂溶剂A-DCM，溶剂B-DCM中的20％ MeOH；B＝0-100％在50min内。产量9.75g，(60％)。计算值：MW 5926.42。实测值：MS(ES,pos)：1483.26[M+3H+NH4]4+，1458.53.74[M+4H]4+，1186.91[M+5H]+5。
化合物9(9.75g,1.644mmol)在4M HCl二氧六环溶液(60mL)中搅拌50分钟。浓缩反应混合物并且残余物通过与甲苯共蒸发2次干燥。将生成的胺盐酸盐溶解于THF(150mL)中并加入TEA(1.38mL,9.86mmol)和然后加入砜-TFP酯10(1.711g,4.11mmol)。反应混合物搅拌16小时，并真空下去除溶剂。将残余物溶解于氯仿(300mL)中，用1％ HCl、盐水洗涤并经Na2SO4干燥。LP340-p在
Figure BDA0004172056550002601
上纯化，使用SiO2柱(120g)，洗脱剂溶剂A-DCM，溶剂B-DCM中的20％ MeOH；B＝0-100％在60min内。产量7.58g，(75％)。计算值：MW 6077.54。实测值：MS(ES,pos)：1534.03[M+H+Na+2NH4]4+，1227.47[M+2H+Na+2NH4]5+。
LP357-p的合成
Figure BDA0004172056550002602
将Boc-PEG47-NH2 2(1g,0.435mmol,1.0equiv)溶解于20mL DCM中。加入十六烷基异氰酸酯1(140mg,0.522mmol,1.2equiv)和TEA(2.0equiv)并且反应混合物在室温下搅拌12小时。去除DCM并经24g柱纯化来纯化化合物3 0.967g(86.5％)，使用0-20％MeOH/DCM作为流动相。
Figure BDA0004172056550002603
将化合物3(0.967g,0.376mmol)溶解于15mL的4N HCl/二氧六环中并在室温下搅拌1小时。去除HCl/二氧六环并将生成的脱保护胺溶解于DCM中。加入化合物4(110mg,0.179mmol)、COMU(169mg,0.394mmol)和TEA(10.0equiv)并且反应混合物在室温下搅拌过夜。真空下去除溶剂。通过24g柱纯化化合物5(0.8g,80.9％产率)，使用0-20％ MeOH/DCM作为流动相。
Figure BDA0004172056550002611
将化合物5(0.95g,0.172mmol)溶解于15mL的4N HCl/二氧六环中并在室温下搅拌1小时。真空下去除HCl/二氧六环。将所得脱保护胺溶解于THF中，然后加入化合物6(0.15g,0.345mmol)和TEA(10.0equiv)。反应混合物在室温下搅拌过夜。真空下去除溶剂。通过24g柱纯化LP357-p(0.6g,61％)，使用0-20％ MeOH/DCM作为流动相。
LP358-p的合成
Figure BDA0004172056550002612
将PtO2(0.3986g)加入到化合物1(4.00g)在无水MeOH和丙酮中的溶液中。反应混合物在氢气氛下搅拌2天。使用
Figure BDA0004172056550002613
和二氧化硅滤除铂催化剂。然后真空下浓缩溶液，得到化合物2，其直接用于下一步骤而无需纯化。产量：3.99g。/>
Figure BDA0004172056550002614
将化合物2(4.07g)加入到化合物3(0.53g)和TEA(0.53g)在THF中的溶液中。搅拌反应混合物直至通过LC-MS和/或TLC观察到2完全转化。反应混合物用MeOH淬灭。粗品产物在经DCM液体负载(80g柱，DCM(A)至20％MeOH(B)溶剂***，梯度：5％B至100％B经60min)的
Figure BDA0004172056550002621
***上纯化。化合物4以25％B洗脱。产量：2.92g。
Figure BDA0004172056550002622
在室温下将化合物4(2.92g)溶解于HCl在二氧六环中的溶液(4M)(24.9mL)中。搅拌反应混合物直至经LC-MS观察到化合物4完全转化。真空下浓缩反应混合物，得到为白色粉末的化合物5。化合物5直接用于下一步骤无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002623
化合物6(0.32g)和5(2.81g)、COMU(1.07g)和TEA(2.08mL)在DCM中于室温下搅拌过夜。监测pH以确保HCl被中和并且反应混合物保持碱性。反应混合物用1N HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，并且真空下去除DCM。化合物7经80g柱(溶剂***：DCM(A)和20％MeOH(B)，梯度：5％B 5min，5％B至100％B经60min)纯化。化合物7以45％B洗脱。产量2.26g。
Figure BDA0004172056550002631
在室温下将化合物7(2.26g)溶解于HCl在二氧六环中的溶液(4M)(25.5mL)中。搅拌反应混合物直至经LC-MS观察到化合物7完全转化。真空浓缩反应混合物，得到为白色粉末的化合物8。化合物8直接用于下一步骤而无需进一步纯化。
Figure BDA0004172056550002632
将化合物8(2.22g)和TEA(1.42mL)溶解于50mL无水THF中，并加入化合物9(0.35g)。反应混合物搅拌12小时。浓缩反应混合物并使用两种溶剂***(EtOAc/己烷然后经MeOH/DCM)通过硅胶以两部分(12和24克柱)纯化粗品LP358-p。第一梯度(EtOAc/己烷)：0％ B3分钟，0％B至100％B经10min。第二梯度(DCM/MeOH)：5％B 5分钟，15％B持续5分钟，15％B至100％B经20min)。产物LP358-p在第二梯度期间以30％B洗脱。在第一梯度期间回收砜试剂(即化合物9)。产量1.92g。
实施例5.连接基团和靶向配体与RNAi剂的缀合
A.活化酯连接基团的缀合
使用以下程序将如以上表22所示具有DBCO-NHS或L1-L10结构的连接基团与具有胺官能化有义链的RNAi剂缀合，比如C6-NH2、NH2-C6或多个(NH2-C6)，如以上表22所示。将通过冻干干燥的退火的RNAi剂以25mg/mL溶解于DMSO和10％水(v/v％)中。然后将50-100当量的TEA和3当量的活化酯接头加入到溶液中。使得溶液反应1-2小时，同时通过RP-HPLC-MS监测(流动相A：100mM HFIP，14mM TEA；流动相B：乙腈，在WatersTM XBridge C18柱上，WatersCorp.)。
然后通过加入12mL乙腈和0.4mL PBS并将固体离心为团粒来沉淀产物。然后将团粒重新溶解于0.4mL的1XPBS和12mL乙腈中。所得团粒在高真空干燥1小时。
B.靶向配体与炔丙基接头的缀合
在退火之前或之后，5’或3’三齿炔烃官能化有义链与αvβ6整合素配体缀合。以下实施例描述αvβ6整合素配体与退火双链体的缀合：在去离子水中制备0.5M三(3-羟丙基***基甲基)胺(THPTA)、0.5M五水硫酸Cu(II)(Cu(II)SO4·5H2O)和2M抗坏血酸钠溶液的储备溶液。制备αvβ6整合素配体在DMSO中的75mg/mL溶液。在含有三炔烃官能化双链体(3mg,75μL,40mg/mL在去离子水中，约15,000g/mol)的1.5mL离心管中，加入25μL的1M Hepes pH 8.5缓冲液。涡旋之后，加入35μL的DMSO并涡旋溶液。向反应中加入αvβ6整合素配体(6eq/双链体，2eq/炔烃，约15μL)并涡旋溶液。使用pH试纸检查pH并证实pH为约8。在单独的1.5mL离心管中，50μL的0.5M THPTA与10uL的0.5M Cu(II)SO4·5H2O混合，涡旋，并在室温下温育5min。5min之后，将THPTA/Cu溶液(7.2μL,6eq 5:1THPTA:Cu)加入到反应小瓶中并涡旋。之后立即将2M抗坏血酸盐(5μL，每双链体50eq，每炔烃16.7)加入到反应小瓶中并涡旋。一旦反应完成(一般地在0.5-1h内完成)，立即通过非变性阴离子交换色谱法纯化反应混合物。
实施例6.脂质PK/PD调节剂前体的缀合
在退火之前或之后和在一种或多种靶向配体缀合之前或之后，一种或多种脂质PK/PD调节剂前体可与本文公开的RNAi剂连接。以下描述用于使脂质PK/PD调节剂前体与本文描绘的实施例中阐述的构建体连接的一般缀合方法。
A.含有马来酰亚胺的脂质PK/PD调节剂前体的缀合
以下描述通过进行二硫苏糖醇还原二硫化物然后硫醇-Michael加成相应的含有马来酰亚胺的脂质PK/PP调节剂前体，用于将含有马来酰亚胺的脂质PK/PD调节剂前体与RNAi剂的(C6-SS-C6)或(6-SS-6)官能化有义链连接的一般方法：在小瓶中，将官能化有义链以50mg/mL溶解于灭菌水中。然后加入每种20当量的0.1M Hepes pH 8.5缓冲液和二硫苏糖醇。使得混合物反应1小时，然后使缀合物在乙腈和PBS中沉淀，并将固体离心成团粒。
将团粒以固体浓度为30mg/mL置于DMSO/水的70/30混合物中。然后，以1.5当量加入含有马来酰亚胺的脂质PK/PD调节剂前体。使得混合物反应30分钟。在AEX-HPLC上(流动相A：25mM TRIS pH＝7.2，1mM EDTA，50％乙腈；流动相B：25mM TRIS pH＝7.2，1mM EDTA，500mM NaBr，50％乙腈；固相TSKgel-30；1.5cmx10cm)纯化产物。通过旋转蒸发器去除溶剂，并使用2x10mL灭菌水交换以3K旋转柱脱盐。使用冻干来干燥固体产物并储存供以后使用。
B.含有砜的脂质PK/PD调节剂前体的缀合
在小瓶中，将官能化有义链以50mg/mL溶解于灭菌水中。然后加入每种20当量的0.1M Hepes pH 8.5缓冲液和二硫苏糖醇。使得混合物反应1小时，然后使缀合物在乙腈和PBS中沉淀，并将固体离心成团粒。
将团粒以固体浓度为30mg/mL置于DMSO/水的70/30混合物中。然后，以1.5当量加入含有砜的脂质PK/PD调节剂前体。用N2吹扫小瓶并在搅拌的同时加热至40℃。使得混合物反应1小时。在AEX-HPLC上(流动相A：25mM TRIS pH＝7.2，1mM EDTA，50％乙腈；流动相B：25mM TRIS pH＝7.2，1mM EDTA，500mM NaBr，50％乙腈；固相TSKgel-30；1.5cmx10 cm)纯化产物。通过旋转蒸发器去除溶剂，并使用2x10mL灭菌水交换以3K旋转柱脱盐。使用冻干来干燥固体产物并储存供以后使用。
C.含有叠氮化物的脂质PK/PD调节剂前体的缀合
将1摩尔当量负载有Cu(I)的TG-TBTA树脂称重到玻璃小瓶中。小瓶用N2吹扫15分钟。然后，将官能化有义链以100mg/mL溶解于单独小瓶中的灭菌水中。然后将2当量含有叠氮化物的脂质PK/PD调节剂前体(在DMF中50mg/mL)加入到小瓶中。然后加入TEA、DMF和水直至最终反应条件为33mM TEA、60％ DMF和20mg/mL缀合产物。然后经注射器将溶液与树脂一起转移至小瓶中。移除N2吹扫并密封小瓶且在40℃下移动至搅拌板。使得混合物反应16小时。使用0.45μm过滤器滤除树脂。
使用AEX纯化(流动相A：25mM TRIS pH＝7.2，1mM EDTA，50％乙腈；流动相B：25mMTRIS pH＝7.2，1mM EDTA，500mM NaBr，50％乙腈；固相TSKgel-30；1.5cmx10 cm)来纯化产物。使用旋转蒸发器去除乙腈，并使用2x10mL灭菌水交换以3K旋转柱脱盐。使用冻干来干燥固体产物并储存供以后使用。
D.含有炔烃的脂质PK/PD调节剂前体的缀合
以下描述通过进行二硫苏糖醇还原二硫化物然后加成到含有炔烃的PK/PP调节剂前体，用于将活化的含有炔烃的脂质PK/PD调节剂前体与RNAi剂的(C6-SS-C6)或(6-SS-6)官能化有义链连接的一般方法：在小瓶中，将10mg包含(C6-SS-C6)或(6-SS-6)官能化有义链的siRNA以50mg/mL溶解于灭菌水中。然后加入每种20当量的0.1M Hepes pH 8.5缓冲液和二硫苏糖醇(1M在灭菌水中)。使得混合物反应1小时，然后使用流动相A为100mM HFIP、14mM和TEA，和流动相B为乙腈，使用以下配方，其中％B表示流动相B的量而其余部分为流动相A，在WatersTM XBridge BEH C4柱上纯化。
时间 ％B
0 3
8 70
10 90
11 90
11.1 3
13 3
通过加入12mL乙腈和0.4mL 1XPBS，并将所得固体离心成团粒来一次性沉淀产物。将团粒重新溶解于0.4mL 1XPBS和12mL乙腈中。团粒在高真空下干燥1小时。
将团粒以固体浓度为30mg/mL置于小瓶中的DMSO/水的70/30混合物中。然后，相对于siRNA以2当量加入含有炔烃的脂质PK/PD调节剂前体。然后加入10当量TEA。用N2吹扫小瓶，并在搅拌的同时将反应混合物加热至40℃。使得混合物反应1小时。使用TSKgel-30(可得自Tosoh Biosceinces，1.5cm x 10cm)填充柱，使用流动相A为25mM TRIS pH＝7.2、1mMEDTA、50％乙腈和流动相B为25mM TRIS pH＝7.2、1mM EDTA、500mM NaBr、50％乙腈，使用以下配方，其中％B表示流动相B的量而其余部分为流动相A，使用阴离子交换HPLC纯化产物。
时间 ％B
4 10
7 80
10.5 80
11 10
14 10
收集含有产物的级分，并使用旋转蒸发器去除乙腈。产物使用2x10mL灭菌水交换以3K旋转柱脱盐。然后使用冻干来干燥产物并储存供以后使用。
实施例7.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
根据本领域已知并且通常用于如本文实施例1中阐述的寡核苷酸合成的一般程序，根据基于固相的亚磷酰胺技术合成包括有义链和反义链的肌生成抑制蛋白RNAi剂。用于这一和以下实施例的RNAi剂具有如以下表24所示的结构。
表24.用于以下实施例的双链体
Figure BDA0004172056550002681
在以上表24中，AS表示反义链，SS表示有义链；a、c、g、i和u分别表示2’-O-甲基腺苷、胞苷、鸟苷、肌苷和尿苷。Af、Cf、Gf和Uf分别表示2’-氟腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷；s表示硫代磷酸酯键；(invAb)表示反向脱碱基脱氧核糖残基(参见表22)；dT表示2’-脱氧胸苷-3’-磷酸酯；cPrp表示环丙基膦酸酯，参见表22；aAlk表示2’-O-炔丙基腺苷-3’-磷酸酯，参见表22；cAlk表示2’-O-炔丙基胞苷-3’-磷酸酯，参见表22；gAlk表示2’-O-炔丙基鸟苷-3’-磷酸酯，参见表22；tAlk表示2’-O-炔丙基-5-甲基尿苷-3’-磷酸酯，参见表22；uAlk表示2’-O-炔丙基尿苷-3’-磷酸酯，参见表22；(C6-SS-C6)参见表22；(NH2-C6)s参见表22；和LA2具有以下结构：
Figure BDA0004172056550002691
其中/>
Figure BDA0004172056550002692
表示与RNAi剂其余部分的连接点。
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或2mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表25.实施例7的小鼠给药组.
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 2mpk AD06569-LP1 第1天单次注射
3 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP1b 第1天单次注射
4 2mpk avb6-Pep1-AD06569-nEm 第1天单次注射
5 2mpk avb6-Pep1-AD06569-LP1b 第1天单次注射
6 2mpk avb6-Pep1-AD06569-LP29b 第1天单次注射
7 2mpk avb6-Pep1-AD06569-LP33b 第1天单次注射
8 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP28b 第1天单次注射
9 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP56b 第1天单次注射
10 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP89b 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与小分子靶向配体化合物SM45b或肽1的缀合。根据实施例5完成与炔丙基接头L4的缀合反应之后(结构如表22所示)，靶向配体αvβ6化合物45具有以下在本文实施例中称为SM45b的结构：
Figure BDA0004172056550002701
其中/>
Figure BDA0004172056550002702
表示与RNAi剂的其余部分的连接点。RNAi剂还合成为在3’端具有(C6-SS-C6)基团，以促进与脂质PK/PD调节剂前体缀合。/>
第2和8-10组包含根据以上实施例5中描述的程序使用L4与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体SM45。第4-7组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体Pep1。第2、3和5-10组中的每一个均包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。第4组作为对照组与N-乙基马来酰亚胺(nEm)缀合。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白来确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表26所示。
表26.来自实施例7的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002703
Figure BDA0004172056550002711
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表27显示测定结果。
表27.实施例7的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002712
实施例8.在小鼠中体内施用靶向MSTN的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或2 mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表28.实施例8小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP1 第1天单次注射
3 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP90 第1天单次注射
4 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP94 第1天单次注射
5 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP93 第1天单次注射
6 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP92 第1天单次注射
7 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP91 第1天单次注射
8 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP95 第1天单次注射
9 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP5 第1天单次注射
10 2mpk SM45b-(L4)-AD06569-LP87 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与小分子靶向配体化合物45b的缀合。RNAi剂还合成为在3’端具有(C6-SS-C6)基团，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2-10组包含根据以上实施例5中描述的程序使用接头4与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体SM45。第2-10组中的每一个均包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白来确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表29所示。
表29.来自实施例8的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002721
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表30显示测定结果。
表30.实施例8的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002722
Figure BDA0004172056550002731
实施例9.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或2mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表31.实施例9小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP38b 第1天单次注射
3 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP101b 第1天单次注射
4 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP41b 第1天单次注射
5 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP104b 第1天单次注射
6 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP53b 第1天单次注射
7 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP43b 第1天单次注射
8 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP44b 第1天单次注射
9 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP102b 第1天单次注射
10 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP103b 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。RNAi剂还合成为在3’端具有(C6-SS-C6)基团，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2-10组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2-10组中的每一个均包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白来确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表32所示。
表32.来自实施例9的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002741
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表33显示测定结果。
表33.实施例9的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002742
实施例10.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或2mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表34.实施例10小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP38b 第1天单次注射
6 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP54b 第1天单次注射
7 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP93b 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。RNAi剂还合成为在3’端具有(C6-SS-C6)基团，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2和6-8组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2和6-7组中的每一个均包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白来确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表35所示。
表35.来自实施例10的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002751
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表36显示测定结果。
表36.实施例10的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002761
实施例11.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或2mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表37.实施例11小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP38b 第1天单次注射
3 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP42b 第1天单次注射
4 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP61b 第1天单次注射
5 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP48b 第1天单次注射
6 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP49b 第1天单次注射
7 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP47b 第1天单次注射
8 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP45b 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。RNAi剂还合成为在3’端具有(C6-SS-C6)基团，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2-8组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2-8组中的每一个均包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表38所示。
表38.来自实施例11的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002771
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表39显示测定结果。
表39.实施例11的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002772
实施例12.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或1.5mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表40.实施例12小鼠的给药组。
Figure BDA0004172056550002773
Figure BDA0004172056550002781
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。RNAi剂还合成为在3’端具有(C6-SS-C6)基团，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2组包含根据以上实施例5中描述的程序使用接头4与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体化合物45b。第3-10组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2-10组中的每一个均包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白确定来相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表41所示。
表41.来自实施例12的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002782
/>
Figure BDA0004172056550002791
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表42显示测定结果。
表42.实施例12的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002792
实施例13.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或2mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表43.实施例13小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP41b 第1天单次注射
4 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP106b 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。RNAi剂还合成为在3’端具有(C6-SS-C6)基团，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2和4组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2和4组包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白来确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表44所示。
表44.来自实施例13的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002801
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表45显示测定结果。
表45.实施例13的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002802
实施例14.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或2mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表46.实施例14小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP38b 第1天单次注射
3 2mpk Avb6-Pep1-AD07724-LP107b 第1天单次注射
4 2mpk Avb6-Pep1-AD07724-LP108b 第1天单次注射
5 2mpk Avb6-Pep1-AD07724-LP109b 第1天单次注射
8 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP110b 第1天单次注射
9 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP111b 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569和AD07724，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。还合成了在3’端具有(C6-SS-C6)基团的AD06569，以促进与脂质PK/PD调节剂前体缀合。合成了具有末端uAlk(参见表22)残基的AD07724，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2-9组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2-9组中的每一个包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白来确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表47所示。
表47.来自实施例14的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002811
Figure BDA0004172056550002821
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表48显示测定结果。
表48.实施例14的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002822
实施例15.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或2mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表49.实施例15小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP38b 第1天单次注射
3 2mpk Avb6-Pep1-AD07724-LP108b 第1天单次注射
4 2mpk Avb6-Pep1-AD07909-LP108b 第1天单次注射
5 2mpk Avb6-Pep1-AD07910-LP108b 第1天单次注射
6 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP143b 第1天单次注射
7 2mpk Avb6-Pep6-AD06569-LP143b 第1天单次注射
8 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP57b 第1天单次注射
9 2mpk Avb6-Pep6-AD06569-LP130b 第1天单次注射
10 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP124b 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569、AD07724、AD07909和AD07910，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。还合成了在3’端具有(C6-SS-C6)基团的AD06569，以促进与脂质PK/PD调节剂前体缀合。合成了具有末端含有炔烃的核苷酸(参加表22)的AD07724、AD07909和AD07910，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2-6、8和10组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第7和9组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽6。第2-10组中的每一个包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白来确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表50所示。
表50.来自实施例15的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002831
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表51显示测定结果。
表51.实施例15的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002832
/>
Figure BDA0004172056550002841
实施例16.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据表52中阐述的以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或1mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表52.实施例16小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 1mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP29b 第1天单次注射
3 1mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP217b 第1天单次注射
4 1mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP220b 第1天单次注射
5 1mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP221b 第1天单次注射
6 1mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP223b 第1天单次注射
7 1mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP224b 第1天单次注射
8 1mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP225b 第1天单次注射
9 1mpk Avb6-Pep1-AD08257-LP226b 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569和AD08257。AD06569在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。还合成了在3’端具有(C6-SS-C6)基团的AD06569，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。AD08257在有义链的5’末端包括(NH2-C6)基团，以促进与靶向配体的缀合。还合成了在3’端具有LA2基团的AD08257，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2-9组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2-9组中的每一个包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白来确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表53所示。
表53.来自实施例16的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002851
从肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表54显示测定结果。
表54.实施例16的给药组中肱三头肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002852
实施例17.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据表55中阐述的给药组注射等渗盐水(媒介物对照)、0.75mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物或2mpk包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表55.实施例17小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 0.75mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP29b 第1天单次注射
3 0.75mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP210b 第1天单次注射
4 0.75mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP220b 第1天单次注射
5 0.75mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP238b 第1天单次注射
6 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP29b 第1天单次注射
7 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP210b 第1天单次注射
8 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP220b 第1天单次注射
9 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP238b 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。AD06569还合成为在3’端具有(C6-SS-C6)基团，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2-9组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2-9组中的每一个包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白来确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表56所示。
表56.来自实施例17的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002861
Figure BDA0004172056550002871
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表57显示测定结果。
表57.实施例17的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002872
/>
实施例18.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据表58中阐述的给药组注射等渗盐水(媒介物对照)、0.75mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物或2mpk包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表58.实施例18小鼠的给药组。
Figure BDA0004172056550002873
Figure BDA0004172056550002881
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569和AD08257。AD06569在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。还合成了在3’端具有(C6-SS-C6)基团的AD06569，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。AD08257在有义链的5’末端包括(NH2-C6)基团，以促进与靶向配体的缀合。还合成了在3’端具有LA2基团的AD08257，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2-9组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2-9组中的每一个包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表59所示。
表59.来自实施例18的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002882
Figure BDA0004172056550002891
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表60显示测定结果。
表60.实施例18的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达.
Figure BDA0004172056550002892
实施例19.在小鼠中体内施用靶向Mstn的RNAi触发剂
在研究第1天，小鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)、2mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物或2mpk的对照化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表61.实施例19小鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第1天单次注射
2 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-LP29b 第1天单次注射
3 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-nEm 第1天单次注射
4 2mpk AD06569 第1天单次注射
5 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-双-C16 第1天单次注射
6 2mpk Avb6-Pep1-AD06569-双-PEG47 第1天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体的缀合。还合成了在3’端具有(C6-SS-C6)基团的AD06569，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2、3、5和6组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2组包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的PK/PD调节剂。第3组包括根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的封端马来酰亚胺。第4组包括不含靶向配体或PK/PD调节剂的RNAi剂。第5组包括具有双-C16不具有邻近脂质的含PEG部分的PK/PD调节剂。第5组RNAi剂的有义链3’端根据以上实施例6中描述的程序与具有以下结构的含有马来酰亚胺的PK/PD调节剂前体缀合：
Figure BDA0004172056550002901
第6组包括不具有脂质部分和具有双-PEG47部分的PK/PD调节剂。第6组RNAi剂有义链的3’端根据以上实施例6中描述的程序与具有以下结构的含有马来酰亚胺PK/PD调节剂前体缀合：
Figure BDA0004172056550002902
每组(n＝4)给药四(4)只小鼠。第1、8、15和22天将小鼠放血并收集血清。在研究第22天处死小鼠。通过ELISA测定血清中的小鼠肌生成抑制蛋白确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表62所示。
表62.来自实施例19的小鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002903
Figure BDA0004172056550002911
如表62所示，第2组的邻近脂质部分的双PEG部分(即LP 29b)显示出超过第3组的封端马来酰亚胺、第4组的“裸”RNAi剂、第5组不含PEG的PK/PD调节剂和第6组不含脂质的PK/PD调节剂改善的MSTN敲低。
实施例20.在食蟹猴中体内施用靶向MSTN的RNAi触发剂
根据本领域已知并且通常用于如本文实施例1中阐述的寡核苷酸合成的一般程序，根据基于固相的亚磷酰胺技术合成包括有义链和反义链的肌生成抑制蛋白RNAi剂。在研究第1、7和28天，食蟹猴(cynomolgus macaque)(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))灵长类动物(本文称为“食蟹猴(cynos)”)根据以下给药组注射10mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物：
表63.实施例20食蟹猴的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 10mpkαvβ6肽1-Mstn(AD06569)-LP29b 在第1、7和28天注射
合成了具有针对靶标MSTN基因的核苷酸序列的实施例20中的RNAi剂，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体αvβ6肽1的缀合。RNAi剂在有义链的3’末端进一步包括二硫化物官能团(C6-SS-C6)，以促进与上文所示结构LP 29b的PK/PD调节剂的缀合。
每组(n＝2)给药两(2)只食蟹猴。在第-28、-21、-14、-7和第1天(给药前)采集血清样品。然后根据如表22中阐述的相应组施用给猴子。然后在第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天、第50天、第57天、第64天、第71天、第78天、第85天、第99天、第113天和第134天收集血清。对血清样品进行ELISA测定，以确定血清中食蟹猴肌生成抑制蛋白的量。第1组血清样品中的平均肌生成抑制蛋白如以下表64所示。
表64：实施例20的第1组血清中的平均食蟹猴肌生成抑制蛋白，归一化为第1天.
Figure BDA0004172056550002921
如表64所示，使用本文所述化合物可实现靶基因的稳健和持久敲低。
实施例21.在食蟹猴中体内施用靶向MSTN的RNAi触发剂
根据本领域已知并且通常用于如本文实施例1中阐述的寡核苷酸合成的一般程序，根据基于固相的亚磷酰胺技术合成包括有义链和反义链的肌生成抑制蛋白RNAi剂。在研究第1天，食蟹猴(cynomolgus macaque)(食蟹猕猴(Macaca fascicularis))灵长类动物(本文称为“食蟹猴(cynos)”)根据以下给药组注射5mg/kg、10mg/kg(mpk)或20mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物：
表65.实施例21食蟹猴的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 5mpkαvβ6肽1-Mstn(AD06569)-LP29b 第1天单次注射
2 10mpkαvβ6肽1-Mstn(AD06569)-LP29b 第1天单次注射
3 20mpkαvβ6肽1-Mstn(AD06569)-LP29b 第1天单次注射
合成了具有针对靶标MSTN基因的核苷酸序列的实施例21中的RNAi剂，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与靶向配体αvβ6肽1的缀合。肌生成抑制蛋白RNAi剂在有义链的3’末端进一步包括二硫化物官能团(C6-SS-C6)，以促进与上文所示结构LP29b的PK/PD调节剂的缀合。
每组(n＝2)给药两(2)只食蟹猴。在第-14、-7天和第1天(给药前)采集血清样品。然后根据如表24中阐述的相应组施用给猴子。然后在第8天、第15天、第22天、第29天、第36天、第43天、第50天、第57天、第64天、第71天、第92天、第106天和第120天收集血清。对血清样品进行ELISA测定，以确定血清中食蟹猴肌生成抑制蛋白的量。血清样品中的平均肌生成抑制蛋白如以下表66所示。
表66：实施例21的给药组血清中的平均食蟹猴肌生成抑制蛋白，归一化为第1天。
Figure BDA0004172056550002931
/>
Figure BDA0004172056550002941
如表66可观察到的，对于增加本发明化合物的剂量，可观察到剂量反应效应。
实施例22.在大鼠中体内施用靶向MSTN的RNAi触发剂
在研究第1天，大鼠根据以下给药组注射等渗盐水(媒介物对照)或1mg/kg(mpk)包含如本文所述RNAi剂的在等渗盐水中配制的本发明化合物，其中AD06569具有以上表24所示的结构。
表67.实施例22大鼠的给药组。
组别 包含RNAi剂的本发明化合物和剂量 给药方案
1 盐水 第一天单次注射
2 1mpk avb6-Pep1-AD06569-LP238b 第一天单次注射
3 1mpk avb6-Pep1-AD06569-LP357b 第一天单次注射
4 1mpk avb6-Pep1-AD06569-LP358b 第一天单次注射
5 1mpk avb6-Pep1-AD06569-LP241b 第一天单次注射
6 1mpk avb6-Pep1-AD06569-LP339b 第一天单次注射
7 1mpk avb6-Pep1-AD06569-LP340b 第一天单次注射
8 1mpk avb6-Pep1-AD06569-LP247b 第一天单次注射
9 1mpk avb6-Pep1-AD06569-nEm 第一天单次注射
合成了具有靶向于MSTN基因的核苷酸序列的RNAi剂AD06569，并在有义链的5’末端包括官能化胺反应性基团(NH2-C6)，以促进与小分子靶向配体化合物45b的缀合。RNAi剂还合成为在3’端具有(C6-SS-C6)基团，以促进与脂质PK/PD调节剂前体的缀合。
第2-9组包含根据以上实施例5中描述的程序与有义链的5’端缀合的αvβ6整合素配体肽1。第2-8组中的每一个均包含根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的具有如上文所示结构的脂质PK/PD调节剂。第3组包括根据以上实施例6中描述的程序与有义链的3’端缀合的封端马来酰亚胺。
每组(n＝4)给药四(4)只大鼠。第1、8、15和22天将大鼠放血并收集血清。在研究第22天处死大鼠，并从腓肠肌和肱三头肌中分离总肌生成抑制蛋白mRNA。从右前肢采集肱三头肌。将每个样品在percellys管中快速冷冻并储存于-80℃冰箱中直至测定完成。通过ELISA测定血清中的大鼠肌生成抑制蛋白确定相对MSTN表达。血清中的平均相对肌生成抑制蛋白表达如以下表68所示。
表68.来自实施例22的大鼠血清的平均相对MSTN表达。
Figure BDA0004172056550002951
从腓肠肌和肱三头肌收集的组织用于TaqMan测定，以确定这些组织中MSTN的相对量。以下表69显示测定结果。
表69.实施例22的给药组中肱三头肌和腓肠肌的相对表达。
Figure BDA0004172056550002952
等同物和范围
在权利要求中，冠词“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”可意指一个或多于一个，除非相反地指明或从上下文中显而易见。如果一个、多于一个或所有的组成员存在于、用于或以其他方式与给定产品或过程相关，除非相反地指明或从上下文中显而易见，则认为在组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是满足的。本发明包括其中组的恰好一个成员存在于、用于或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。本发明包括其中多于一个或所有组成员存在于、用于或以其他方式与给定产品或过程相关的实施方案。
此外，本发明包括所有变化、组合和排列，其中来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、元素、条款和描述性术语被引入到另外的权利要求中。例如，可修改依赖于另外的权利要求的任何权利要求，以包括在依赖于相同基本权利要求的任何其他权利要求中发现的一个或多个限制。在元素作为列表呈现的情况下，例如，以马库什组格式，还公开了元素的每个子组，并且可从组中去除任何一种或多种元素。应当理解，通常，在本发明或本发明的方面称为包括特定元素和/或特征的情况下，本发明的某些实施方案或本发明的方面由这种元素和/或特征组成或基本上由其组成。为简单起见，这些实施方案在本文中没有用同样的话具体阐述。还应注意，术语“包含”和“含有”旨在为开放的，并且允许包含另外的元素或步骤。在给定范围的情况下，则包括端点。此外，除非另外指明或以其他方式从上下文和本领域普通技术人员的理解中显而易见，否则表示为范围的值可假定在本发明的不同实施方案中所述范围内的任何特定值或子范围，直到范围下限单位的十分之一，除非上下文另外明确规定。
本申请涉及各种已发布的专利、已公开的专利申请、期刊文章和其他出版物，其全部均通过引用结合至本文中。如果任何结合的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。另外，落入现有技术内的本发明的任何特定实施方案可明确地排除在任何一项或多项权利要求之外。因为这种实施方案认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使本文没有明确地阐述排除，它们也可被排除。出于任何原因，无论是否与现有技术的存在相关，本发明的任何特定实施方案均可排除在任何权利要求之外。
其他实施方案
应当理解尽管本发明已结合其详述进行描述，但以上描述旨在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改处于随附权利要求的范围内。
<110> Arrowhead Pharmaceuticals Inc.
<120> 用于递送治疗剂的脂质缀合物
<130> 267602-496699
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<150> 63/214,745
<151> 2021-06-24
<150> 63/230,257
<151> 2021-08-06
<160> 10
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD06569 反义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端环丙基磷酸酯
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(11)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<400> 1
uguuacagca agaucaugac c 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD06569 有义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端 (NH2-C6) 修饰有硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(9)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(21)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(24)
<223> C6-SS-C6连接的核苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> 2'-脱氧胸苷-3'-磷酸酯
<400> 2
nggucaugau cuugcuguaa cant 24
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD07724 反义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端环丙基磷酸酯
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(11)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<400> 3
uguuacagca agaucaugac c 21
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD07724 有义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端 (NH2-C6) 修饰有硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(9)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(22)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> 2'-O-炔丙基尿苷-3'-磷酸酯
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (25)..(25)
<223> 2'-脱氧胸苷-3'-磷酸酯
<400> 4
nggucaugau cuugcuguaa canut 25
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD07909 反义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端环丙基磷酸酯
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(11)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<400> 5
uguuacagca agaucaugac c 21
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD07909 有义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端 (NH2-C6) 修饰有硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(9)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(22)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> 2'-O-炔丙基尿苷-3'-磷酸酯
<400> 6
nggucaugau cuugcuguaa canu 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD07910 反义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端环丙基磷酸酯
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(4)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(5)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (6)..(6)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (7)..(11)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(21)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<400> 7
uguuacagca agaucaugac c 21
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD07910 有义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端 (NH2-C6) 修饰有硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(9)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(21)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(22)
<223> 2'-O-炔丙基腺苷-3'-磷酸酯
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<400> 8
nggucaugau cuugcuguaa can 23
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD08257 反义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端环丙基磷酸酯
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(2)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (3)..(3)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (4)..(4)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (5)..(11)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (12)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(13)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (14)..(14)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(21)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (15)..(15)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (16)..(16)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (17)..(17)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (18)..(18)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (19)..(19)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (20)..(20)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (21)..(21)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<400> 9
uguuacagca agaucaugac c 21
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AD08257 有义链
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 5'端 (NH2-C6) 修饰有硫代磷酸酯键
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(2)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (1)..(1)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (2)..(9)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (10)..(12)
<223> 2'-氟相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (13)..(22)
<223> 2'-O-甲基相应核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (22)..(23)
<223> 硫代磷酸酯连接的核苷
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 反向脱碱基脱氧核糖残基
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (23)..(23)
<223> 3'端 LA2修饰
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> n 是 a, c, g, t 或 u
<400> 10
nggucaugau cuugcuguaa can 23

Claims (130)

1.一种式(I)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000011
其中
R为-LA-RZ；
LA为连接RZ与Z的键或二价部分；
RZ包含基于寡核苷酸的药剂；
Z为CH、苯基或N；
L1和L2各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和
X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
2.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中L1和L2各自独立地包含约15-约100个PEG单元。
3.权利要求1或权利要求2的化合物或药学上可接受的盐，其中L1和L2各自独立地包含约20-约60个PEG单元。
4.权利要求1-3中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中L1和L2各自独立地包含约20-约30个PEG单元。
5.权利要求1-3中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中L1和L2各自独立地包含约40-约60个PEG单元。
6.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中L1和L2中的一个包含约20-约30个PEG单元和另一个包含约40-约60个PEG单元。
7.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中L1和L2中的每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000012
Figure FDA0004172056540000021
其中，
每个p独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；
每个q独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；
每个r独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和
每个
Figure FDA0004172056540000031
表示与X、Y或Z的连接点，条件是：
(i)在接头1、6和11中，p+q+r≥5；
(ii)在接头2、3、7、8、9和10中，p+q≥5；和
(iii)在接头4和5中，p≥5。
8.权利要求7的化合物或药学上可接受的盐，其中
每个p独立地为20、21、22、23、24或25；
每个q独立地为20、21、22、23、24或25；和
每个r独立地为2、3、4、5或6。
9.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中式(I)化合物为式(Ia)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000032
10.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中式(I)化合物为式(Ib)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000033
11.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中式(I)化合物为式(Ic)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000041
12.权利要求1-11中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为不饱和脂质。
13.权利要求1-12中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为饱和脂质。
14.权利要求1-13中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为分支脂质。
15.权利要求1-14中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为直链脂质。
16.权利要求1-15中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为包含约10-约25个碳原子的脂质。
17.权利要求1-16中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为胆甾醇基。
18.权利要求1-11中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个选自：
Figure FDA0004172056540000042
Figure FDA0004172056540000051
Figure FDA0004172056540000061
其中
Figure FDA0004172056540000062
表示与L1或L2的连接点。
19.权利要求1-11中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000063
Figure FDA0004172056540000071
Figure FDA0004172056540000081
其中
Figure FDA0004172056540000083
表示与L1或L2的连接点。
20.权利要求1的化合物或药学上可接受的盐，其中LA选自：
Figure FDA0004172056540000082
Figure FDA0004172056540000091
其中，m、n、o和a中的每一个独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和每个
Figure FDA0004172056540000105
表示与Z或RZ的连接点。
21.权利要求20的化合物或药学上可接受的盐，其中，
每个m独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、8、9、10、20、21、22、23、24或25；
每个n独立地为2、3、4或5；
每个a独立地为2、3或4；和
每个o独立地为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13。
22.权利要求9的化合物或药学上可接受的盐，其中L1和L2独立地选自
Figure FDA0004172056540000101
Figure FDA0004172056540000102
其中每个p独立地为20、21、22、23、24或25；每个q独立地为20、21、22、23、24或25；和每个/>
Figure FDA0004172056540000106
表示与式(Ia)的X、Y或CH的连接点。
23.权利要求22的化合物或药学上可接受的盐，其中LA为
Figure FDA0004172056540000103
和每个/>
Figure FDA0004172056540000107
表示与RZ或式(Ia)的CH的连接点。
24.权利要求22或权利要求23的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中的每一个为
Figure FDA0004172056540000104
和/>
Figure FDA0004172056540000108
表示与L1或L2的连接点。
25.一种选自以下的化合物或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000111
/>
Figure FDA0004172056540000121
/>
Figure FDA0004172056540000131
/>
Figure FDA0004172056540000141
/>
Figure FDA0004172056540000151
/>
Figure FDA0004172056540000161
/>
Figure FDA0004172056540000171
/>
Figure FDA0004172056540000181
/>
Figure FDA0004172056540000191
其中每个R为LA-RZ；
LA为连接RZ与化合物其余部分的键或二价部分；和
RZ为基于寡核苷酸的药剂。
26.一种选自以下的化合物或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000201
/>
Figure FDA0004172056540000211
/>
Figure FDA0004172056540000221
/>
Figure FDA0004172056540000231
/>
Figure FDA0004172056540000241
/>
Figure FDA0004172056540000251
/>
Figure FDA0004172056540000261
/>
Figure FDA0004172056540000271
/>
Figure FDA0004172056540000281
/>
Figure FDA0004172056540000291
/>
Figure FDA0004172056540000301
其中每个RZ包含基于寡核苷酸的药剂。
27.权利要求1-26中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中所述基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
28.一种式(II)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000302
其中
R为LA2-RZ；
LA2为连接RZ与-C(O)-的键或二价部分；
RZ包含基于寡核苷酸的药剂；
R1、R2和R3各自独立地为氢或C1-6烷基；
L12和L22各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和
X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
29.权利要求28的化合物或药学上可接受的盐，其中L12和L22各自独立地包含约15-约100个PEG单元。
30.权利要求28或权利要求29的化合物或药学上可接受的盐，其中L12和L22各自独立地包含约20-约60个PEG单元。
31.权利要求28-30中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中L12和L22各自独立地包含约20-约30个PEG单元。
32.权利要求28-30中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中L12和L22各自包含约40-约60个PEG单元。
33.权利要求28的化合物或药学上可接受的盐，其中L12和L22中的一个包含约20-约30个PEG单元和另一个包含约40-约60个PEG单元。
34.权利要求28的化合物或药学上可接受的盐，其中L12和L22中的每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000311
其中
p和q各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和
每个
Figure FDA0004172056540000312
表示与X、Y、-NR2-或-NR3-的连接点，条件是
(i)在接头1-2中，p+q≥5，和
(ii)在接头2-2中，p≥5。
35.权利要求34的化合物或药学上可接受的盐，其中
每个p独立地为20、21、22、23、24或25；和
每个q为20、21、22、23、24或25。
36.权利要求28-35中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中其中X和Y中至少一个为不饱和脂质。
37.权利要求28-36中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为饱和脂质。
38.权利要求28-37中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为分支脂质。
39.权利要求28-38中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为直链脂质。
40.权利要求28-39中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为包含约10-约25个碳原子的脂质。
41.权利要求28-40中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为胆甾醇基。
42.权利要求28-35中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个选自：
Figure FDA0004172056540000321
/>
Figure FDA0004172056540000331
/>
Figure FDA0004172056540000341
其中
Figure FDA0004172056540000343
表示与L12或L22的连接点。
43.权利要求28-35中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000342
/>
Figure FDA0004172056540000351
其中
Figure FDA0004172056540000363
表示与L12或L22的连接点。
44.权利要求43的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000361
其中
Figure FDA0004172056540000364
表示与L12或L22的连接点。
45.权利要求28-44中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中LA2选自：
Figure FDA0004172056540000362
/>
Figure FDA0004172056540000371
其中m、n和o中的每一个独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和每个
Figure FDA0004172056540000373
表示与RZ或-C(O)-的连接点。
46.权利要求45的化合物或药学上可接受的盐，其中
m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、21、22、23或25；
n为2、3、4或5；和
o为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13。
47.权利要求28-46中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中R1、R2和R3中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。
48.权利要求28-47中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中R1、R2和R3中的每一个为氢。
49.权利要求28的化合物或药学上可接受的盐，其中式(II)化合物选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000372
/>
Figure FDA0004172056540000381
/>
Figure FDA0004172056540000391
/>
Figure FDA0004172056540000401
50.权利要求28的化合物或药学上可接受的盐，其中式(II)化合物选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000402
/>
Figure FDA0004172056540000411
/>
Figure FDA0004172056540000421
/>
Figure FDA0004172056540000431
/>
Figure FDA0004172056540000441
/>
Figure FDA0004172056540000451
51.权利要求28-50中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中所述基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
52.一种式(III)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000452
其中
R为LA3-RZ；
LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；
RZ包含基于寡核苷酸的药剂；
W1为-C(O)NR1-或-OCH2CH2NR1C(O)-，其中R1为氢或C1-6烷基；
W2为-C(O)NR2-或-OCH2CH2NR2C(O)-，其中R2为氢或C1-6烷基；
L13和L23各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和
X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
53.权利要求52的化合物或药学上可接受的盐，其中L13和L23各自独立地包含约15-约100个PEG单元。
54.权利要求52或权利要求53的化合物或药学上可接受的盐，其中L13和L23各自独立地包含约20-约60个PEG单元。
55.权利要求52-54中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中L13和L23各自独立地包含约20-约30个PEG单元。
56.权利要求52-54中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中L13和L23各自包含约40-约60个PEG单元。
57.权利要求52的化合物或药学上可接受的盐，其中L13和L23中的一个包含约20-约30个PEG单元和另一个包含约40-约60个PEG单元。
58.权利要求52的化合物或药学上可接受的盐，其中L13和L23中的每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000461
其中
p和q各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和
每个
Figure FDA0004172056540000462
表示与X、Y、W1或W2的连接点；条件是：
(i)在接头1-3和接头3-3中，p+q≥5；和
(ii)在接头2-3中，p≥5。
59.权利要求58的化合物或药学上可接受的盐，其中
每个p独立地为20、21、22、23、24或25；和
每个q为20、21、22、23、24或25。
60.权利要求52-59中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中其中X和Y中至少一个为不饱和脂质。
61.权利要求52-60中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为饱和脂质。
62.权利要求52-61中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为分支脂质。
63.权利要求52-62中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为直链脂质。
64.权利要求52-63中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为包含约10-约25个碳原子的脂质。
65.权利要求52-64中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为胆甾醇基。
66.权利要求52-59中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个选自：
Figure FDA0004172056540000471
/>
Figure FDA0004172056540000481
/>
Figure FDA0004172056540000491
其中
Figure FDA0004172056540000493
表示与L13或L23的连接点。
67.权利要求52-59中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000492
/>
Figure FDA0004172056540000501
其中
Figure FDA0004172056540000513
表示与L13或L23的连接点。
68.权利要求67的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000511
其中
Figure FDA0004172056540000514
表示与L13或L23的连接点。
69.权利要求52-68中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中LA3选自：
Figure FDA0004172056540000512
其中，m和a中的每一个独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和
每个
Figure FDA0004172056540000522
表示与RZ或式(III)的苯环的连接点。
70.权利要求69的化合物或药学上可接受的盐，其中
m为1、2、3、4或5；和
a为2、3、4或5。
71.权利要求52-70中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中R1和R2中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。
72.权利要求52-71中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中R1和R2中的每一个为氢。
73.权利要求52的化合物或药学上可接受的盐，其中式(III)化合物选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000521
Figure FDA0004172056540000531
74.权利要求52的化合物或药学上可接受的盐，其中式(III)化合物选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000532
/>
Figure FDA0004172056540000541
75.权利要求52的化合物或药学上可接受的盐，其中式(III)化合物为式(IIIa)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000542
其中
R为LA3-RZ；
LA3为连接RZ与苯环的键或二价部分；
RZ包含基于寡核苷酸的药剂；
R1和R2各自独立地为氢或C1-6烷基；
L13和L23各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和
X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
76.权利要求75的化合物或药学上可接受的盐，其中L13和L23中的每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000551
其中
p和q各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和
每个
Figure FDA0004172056540000554
表示与X、Y、-NR1-或-NR2-的连接点，条件是
(i)在接头1-3中，p+q≥5，和
(ii)在接头2-3中，p≥5。
77.权利要求75或权利要求76的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000552
其中
Figure FDA0004172056540000555
表示与L13或L23的连接点。
78.权利要求75-77中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中LA3选自：
Figure FDA0004172056540000553
Figure FDA0004172056540000561
/>
其中m和a中的每一个独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和
每个
Figure FDA0004172056540000563
表示与RZ或式(IIIa)的苯环的连接点。
79.权利要求75-78中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中R1和R2中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。
80.权利要求75-79中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中R1和R2中的每一个为氢。
81.权利要求75的化合物或药学上可接受的盐，其中式(IIIa)化合物选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000562
Figure FDA0004172056540000571
82.权利要求75的化合物或药学上可接受的盐，或其药学上可接受的盐，选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000572
Figure FDA0004172056540000581
83.权利要求52的化合物或药学上可接受的盐，其中式(III)化合物为式(IIIb)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000582
其中
R为LA3-RZ；
LA3为连接RZ与式(IIIb)的苯基的键或二价部分；
RZ包含基于寡核苷酸的药剂；
R1和R2各自独立地为氢或C1-6烷基；
L13和L23各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和
X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
84.权利要求83的化合物或药学上可接受的盐，其中L13和L23中的每一个为：
Figure FDA0004172056540000583
Figure FDA0004172056540000591
其中
p和q各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；和
每个
Figure FDA0004172056540000594
表示与X、Y或-C(O)-的连接点，条件是在接头3-3中，p+q≥5。
85.权利要求83或84的化合物，其中X和Y中每一个独立地为：
Figure FDA0004172056540000592
其中
Figure FDA0004172056540000595
表示与L13或L23的连接点。
86.权利要求83-85中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中LA3选自：
Figure FDA0004172056540000593
其中每个
Figure FDA0004172056540000596
表示与RZ或式(IIIb)的苯环的连接点。
87.权利要求83-86中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中R1和R2中的每一个独立地为氢或C1-3烷基。
88.权利要求83-87中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中R1和R2中的每一个为氢。
89.权利要求83的化合物或药学上可接受的盐，其中式(IIIb)化合物选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000601
90.权利要求83的化合物或药学上可接受的盐，其中式(IIIb)化合物选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000602
91.权利要求52-90中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中所述基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
92.一种式(IV)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000603
其中
R为LA4-RZ；
LA4为连接RZ与-C(O)-的键或二价部分；
RZ包含基于寡核苷酸的药剂；
L14和L24各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和
X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
93.权利要求92的化合物或药学上可接受的盐，其中L14和L24各自包含约15-约100个PEG单元。
94.权利要求92或权利要求93的化合物或药学上可接受的盐，其中L14和L24各自独立地包含约20-约60个PEG单元。
95.权利要求92-94中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中L14和L24各自独立地包含约20-约30个PEG单元。
96.权利要求92-94中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中L14和L24各自独立地包含约40-约60个PEG单元。
97.权利要求92的化合物或药学上可接受的盐，其中L14和L24中的一个包含约20-约30个PEG单元和另一个包含约40-约60个PEG单元。
98.权利要求92的化合物或药学上可接受的盐，其中L14和L24中的每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000611
/>
Figure FDA0004172056540000621
其中
每个p独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；
每个q独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30；
每个r独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；和
每个
Figure FDA0004172056540000622
表示与式(IV)的X、Y或-N-C(O)-的连接点；条件是
(i)在接头1-4、接头2-4和接头4-4中，p+q+r≥5；和
(ii)在接头3-4中，p+q≥5。
99.权利要求98的化合物或药学上可接受的盐，其中
每个p独立地为20、21、22、23、24或25；
每个q独立地为20、21、22、23、24或25；和
每个r独立地为2、3、4、5或6。
100.权利要求92-99中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为不饱和脂质。
101.权利要求92-100中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为饱和脂质。
102.权利要求92-101中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为分支脂质。
103.权利要求92-102中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为直链脂质。
104.权利要求92-103中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为包含约10-约25个碳原子的脂质。
105.权利要求92-104中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个为胆甾醇基。
106.权利要求92-99中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中至少一个选自：
Figure FDA0004172056540000631
/>
Figure FDA0004172056540000641
其中
Figure FDA0004172056540000643
表示与L14或L24的连接点。
107.权利要求92-99中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000642
/>
Figure FDA0004172056540000651
/>
Figure FDA0004172056540000661
其中
Figure FDA0004172056540000663
表示与L14或L24的连接点。
108.权利要求107的化合物或药学上可接受的盐，其中X和Y中每一个独立地选自：
Figure FDA0004172056540000662
/>
Figure FDA0004172056540000671
/>
Figure FDA0004172056540000681
其中
Figure FDA0004172056540000683
表示与L14或L24的连接点。
109.权利要求92-109中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中LA4选自：
Figure FDA0004172056540000682
其中每个
Figure FDA0004172056540000692
表示与RZ或式(IV)的-C(O)-的连接点。
110.权利要求92的化合物或药学上可接受的盐，其中式(IV)化合物选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000691
/>
Figure FDA0004172056540000701
/>
Figure FDA0004172056540000711
/>
Figure FDA0004172056540000721
111.权利要求92的化合物或药学上可接受的盐，其中式(IV)化合物选自以下或任何这些化合物的药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000731
/>
Figure FDA0004172056540000741
/>
Figure FDA0004172056540000751
/>
Figure FDA0004172056540000761
/>
Figure FDA0004172056540000771
112.权利要求92-111中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中所述基于寡核苷酸的药剂为RNAi剂。
113.一种体内减少靶基因表达的方法，所述方法包括向细胞中引入权利要求1-112中任何一项的化合物或药学上可接受的盐，其中所述化合物包含与所述靶基因至少基本上互补的RNAi剂。
114.权利要求113的方法，其中所述细胞为骨骼肌细胞。
115.权利要求113的方法，其中所述细胞为脂肪细胞。
116.权利要求113-115中任何一项的方法，其中所述细胞处于受试者内。
117.权利要求116中任何一项的方法，其中所述受试者已诊断患有通过减少靶基因表达来治疗、预防或改善的疾病或障碍。
118.权利要求117的方法，其中所述疾病或障碍为肌营养不良。
119.权利要求118的方法，其中所述肌营养不良为选自杜氏肌营养不良、强直性肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良和埃默里-德赖弗斯肌营养不良的肌营养不良。
120.权利要求1-112中任何一项的化合物用于治疗、预防或改善疾病或障碍的用途。
121.权利要求120的用途，其中所述疾病或障碍为肌营养不良。
122.权利要求121的用途，其中所述肌营养不良为选自杜氏肌营养不良、强直性肌营养不良、贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、先天性肌营养不良、眼咽型肌营养不良、远端型肌营养不良和埃默里-德赖弗斯肌营养不良的肌营养不良。
123.一种式(V)化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000781
其中
J为LA5-RX；
LA5为连接RX与Z的键或二价部分；
RX为用于与基于寡核苷酸的药剂缀合的反应性部分；
Z为CH、苯基或N；
L1和L2各自独立地为包含至少约5个PEG单元的接头；和
X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质。
124.权利要求123的化合物或药学上可接受的盐，其中RX选自
Figure FDA0004172056540000782
其中/>
Figure FDA0004172056540000783
表示与LA5的连接点。
125.权利要求123或124的化合物或药学上可接受的盐，其中LA5选自：
Figure FDA0004172056540000784
/>
Figure FDA0004172056540000791
/>
Figure FDA0004172056540000801
其中m、n、o和a中的每一个独立地为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30，和每个
Figure FDA0004172056540000803
表示与Z或Rx的连接点。
126.一种选自以下的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0004172056540000802
/>
Figure FDA0004172056540000811
/>
Figure FDA0004172056540000821
/>
Figure FDA0004172056540000831
/>
Figure FDA0004172056540000841
/>
Figure FDA0004172056540000851
/>
Figure FDA0004172056540000861
/>
Figure FDA0004172056540000871
/>
Figure FDA0004172056540000881
/>
Figure FDA0004172056540000891
/>
Figure FDA0004172056540000901
127.一种制备式(I)化合物或其药学上可接受的盐的方法：
Figure FDA0004172056540000902
Figure FDA0004172056540000911
其中
R为LA-RZ；
LA为连接RZ与Z的键或二价部分；
RZ包含基于寡核苷酸的药剂；
Z为CH、苯基或N；
L1和L2各自独立地为包含至少5个PEG单元的接头；和
X和Y各自独立地为包含约10-约50个碳原子的脂质；
其中所述方法包括将包含第一反应性部分的RNAi剂与包含脂质和第二反应性部分的化合物缀合以形成式(I)化合物。
128.权利要求127的方法，其中所述第一反应性部分选自二硫化物和炔丙基。
129.权利要求127和128中任何一项的方法，其中所述第二反应性部分选自马来酰亚胺、砜、叠氮化物和炔烃。
130.权利要求127-129中任何一项的方法，其中所述包含脂质的化合物选自权利要求126的任何一种化合物。
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