CN116348101A - 嵌合腺病毒载体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了包含编码冠状病毒病2019(COVID‑19)蛋白的核酸和佐剂的嵌合腺病毒载体，以及使用所述载体来引发针对SARS‑CoV‑2蛋白的免疫应答以便治疗COVID‑19的方法。

Description

嵌合腺病毒载体
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年2月1日递交的美国临时申请第63/144,339号、2020年9月4日递交的美国临时申请第63/074,954号；2020年6月29日递交的美国临时申请第63/045,710号；和2020年6月5日递交的美国临时申请第63/035,490号的优先权权益；其中每一项均通过引用并入本文中，用于所有目的。
本公开的背景
冠状病毒病2019(COVID-19)是由严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的传染病。该疾病的一些症状包括，例如，发烧、咳嗽、呼吸短促、肌肉疼痛、产生痰液、腹泻、咽喉痛、嗅觉丧失和腹痛。虽然大多数病例症状轻微，但一些进展为病毒性肺炎和多器官衰竭。该疾病目前没有治愈方法，并已在多个洲迅速传播，在世界各地都有社区暴发。
本公开概述
在一方面，本公开提供了嵌合腺病毒表达载体，其包含包括以下元件的表达盒：(a)第一启动子，其与编码第一严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)蛋白的核酸可操作地连接；和(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接。
在一些实施方案中，所述编码TLR-3激动剂的核酸包含编码dsRNA的核酸。在一些实施方案中，所述编码TLR-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：SEQ ID NO:13-20。在特定实施方案中，所述编码TLR-3激动剂的核酸包含SEQ ID NO:13的序列。
此外，所述嵌合腺病毒表达载体可以包含另外的元件(c)：第三启动子，其与编码第二SARS-CoV-2蛋白的核酸可操作地连接。在一些实施方案中，元件(c)被置于所述表达盒中的元件(a)和元件(b)之间。在某些实施方案中，(a)中的所述第一SARS-CoV-2蛋白和(c)中的所述第二SARS-CoV-2蛋白不同。在其他实施方案中，(a)中的所述SARS-CoV-2蛋白和(c)中的所述SARS-CoV-2蛋白相同。
在该方面的一些实施方案中，编码元件(a)中的所述第一SARS-CoV-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的所述第二SARS-CoV-2蛋白的核酸包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述第一SARS-CoV-2蛋白和/或所述第二SARS-CoV-2蛋白包含SARS-CoV-2 S蛋白，其具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，编码元件(a)中的所述第一SARS-CoV-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的所述第二SARS-CoV-2蛋白的核酸包含与SEQ ID NO:23的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。
在一些实施方案中，编码元件(a)中的所述第一SARS-CoV-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的所述第二SARS-CoV-2蛋白的核酸包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述第一SARS-CoV-2蛋白和/或所述第二SARS-CoV-2蛋白包含SARS-CoV-2 N蛋白，其具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。
在该方面的一些实施方案中，编码元件(a)中的所述第一SARS-CoV-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的所述第二SARS-CoV-2蛋白的核酸包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述第一SARS-CoV-2蛋白和/或所述第二SARS-CoV-2蛋白包含包括SARS-CoV-2 S蛋白的S1区、弗林蛋白酶位点和SARS-CoV-2 N蛋白的融合蛋白，并且其中所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:12的序列具有至少85％同一性的序列。
此外，所述嵌合腺病毒载体中的所述第一启动子和所述第二启动子可以相同或不同。例如，所述第一启动子和所述第二启动子各自可以是CMV启动子。
在该方面的一些实施方案中，当所有三个元件(a)-(c)都存在时，所述第一启动子可以是CMV启动子，所述第二启动子可以是CMV启动子，并且所述第三启动子可以是β-肌动蛋白启动子(例如，人β-肌动蛋白启动子)。
在另一方面，本公开的特征在于嵌合腺病毒表达载体，其包含包括以下元件的表达盒：(a)第一启动子，其与编码SARS-CoV-2 S蛋白的核酸可操作地连接；和(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接。
在该方面的一些实施方案中，所述编码SARS-CoV-2 S蛋白的核酸包含SEQ ID NO:3的序列。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的序列。
在一些实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子各自是CMV启动子。
在该方面的一些实施方案中，元件(a)和元件(b)一起由SEQ ID NO:6的序列编码。此外，该方面的所述嵌合腺病毒表达载体由SEQ ID NO:9的序列编码。
在另一方面，本公开的特征在于嵌合腺病毒表达载体，其包含包括以下元件的表达盒：(a)第一启动子，其与编码SARS-CoV-2 S蛋白的核酸可操作地连接；(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接；和(c)第三启动子，其与编码SARS-CoV-2 N蛋白的核酸可操作地连接，任选地其中所述表达盒中的元件从N末端到C末端的顺序为：元件(a)、元件(c)和元件(b)。
在该方面的一些实施方案中，所述编码SARS-CoV-2 S蛋白的核酸包含SEQ ID NO:3的序列。在该方面的一些实施方案中，所述编码SARS-CoV-2 S蛋白的核酸包含SEQ ID NO:23的序列。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2 S蛋白包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的序列。
在该方面的一些实施方案中，所述编码SARS-CoV-2 N蛋白的核酸包含SEQ ID NO:4的序列。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2 N蛋白包含SEQ ID NO:2的序列。
此外，在该方面的一些实施方案中，元件(a)中的所述第一启动子是CMV启动子，元件(b)中的所述第二启动子是CMV启动子，并且元件(c)中的所述第三启动子是β-肌动蛋白启动子(例如，人β-肌动蛋白启动子)。
在一些实施方案中，元件(a)、元件(b)和元件(c)一起由SEQ ID NO:7的序列编码。此外，该方面的嵌合腺病毒表达载体由SEQ ID NO:10的序列编码。
在另一方面，本公开的特征在于嵌合腺病毒表达载体，其包含包括以下元件的表达盒：(a)第一启动子，其与编码SARS-CoV-2融合蛋白的核酸可操作地连接，其中所述SARS-CoV-2融合蛋白包含SARS-CoV-2 S蛋白的S1区、弗林蛋白酶位点和SARS-CoV-2 N蛋白；和(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接。
在该方面的一些实施方案中，所述编码SARS-CoV-2融合蛋白的核酸包含SEQ IDNO:5的序列。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2融合蛋白包含SEQ ID NO:12的序列。
在该方面的一些实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子各自是CMV启动子。
在该方面的一些实施方案中，元件(a)和元件(b)一起由SEQ ID NO:8的序列编码。此外，该方面的所述嵌合腺病毒表达载体由SEQ ID NO:11的序列编码。
在另一方面，本公开的特征在于免疫原性组合物，其包含本文所述的嵌合腺病毒表达载体和药学上可接受的载体。
在另一方面，本公开另外的特征在于嵌合腺病毒表达载体，其包含包括以下元件的表达盒：(a)第一启动子，其与编码第一严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)蛋白的核酸可操作地连接；(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接；和(c)第三启动子，其与编码SARS-CoV-2 N蛋白的核酸可操作地连接。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2 N蛋白包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，元件(c)位于表达盒中的元件(a)和元件(b)之间。在一些实施方案中，所述第一SARS-CoV-2蛋白包含SARS-CoV-2 S蛋白，其具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，所述编码TLR-3激动剂的核酸包含编码dsRNA的核酸。在一些实施方案中，所述编码TLR-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：SEQ ID NO:13-20。在一些实施方案中，编码元件(a)中的所述第一SARS-CoV-2蛋白的核酸包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，编码所述SARS-CoV-2 N蛋白的核酸包含与SEQ IDNO:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％的同一性的序列。在一些实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子相同。在一些实施方案中，所述第一启动子和所述第二启动子各自是CMV启动子。在一些实施方案中，所述第一启动子是CMV启动子，所述第二启动子是CMV启动子，并且所述第三启动子是β-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，元件(c)位于元件(a)和元件(b)之间，并且元件(a)、元件(c)和元件(b)一起由与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列编码，或者由SEQ ID NO:7的序列编码。在一些实施方案中，所述嵌合腺病毒表达载体包含与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的序列，或者包含SEQ IDNO:10的序列。
在另一方面，本公开提供了在对象中引发针对SARS-CoV-2蛋白(例如，具有SEQ IDNO:1、2或12的序列的SARS-CoV-2蛋白，或如本文所述的其变体(例如，与SEQ ID NO:1、2或12具有至少90％或至少95％的同一性)的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫原性有效量的本文所述的嵌合腺病毒表达载体或本文所述的免疫原性组合物。在一些实施方案中，施用途径为口服、鼻内或粘膜(例如，口服)施用。在某些实施方案中，施用途径为通过吞服药片口服递送。
在该方法的一些实施方案中，所述免疫应答在所述对象的肺泡细胞、吸收性肠上皮细胞、纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和/或气道基底细胞中引发。在某些实施方案中，所述对象是人类。
还提供了嵌合多核苷酸(其可以被用于诱导对象中的免疫应答，包括但不限于CD8T细胞应答)，其包含包括以下元件的表达盒：(a)第一启动子，其与编码第一严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)蛋白的核酸可操作地连接；和(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接；和(c)第三启动子，其与可编码SARS-CoV-2蛋白或非SARS-CoV-2抗原蛋白的核酸操作地连接。
在一些实施方案中，所述嵌合多核苷酸是嵌合腺病毒表达载体。在一些实施方案中，所述编码TLR-3激动剂的核酸包含编码dsRNA的核酸。在一些实施方案中，所述编码TLR-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：SEQ ID NO:13-20。在一些实施方案中，元件(c)被置于所述表达盒中的元件(a)和元件(b)之间。
在另一方面，本公开提供了嵌合多核苷酸，其包含包括以下元件的表达盒：(a)第一启动子，其与编码抗原蛋白的核酸可操作地连接；(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接；和(c)第三启动子，其与编码SARS-CoV-2 N蛋白的核酸可操作地连接。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2 N蛋白与SEQ ID NO:2具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。在一些实施方案中，所述嵌合多核苷酸是嵌合腺病毒表达载体。在一些实施方案中，所述编码TLR-3激动剂的核酸包括编码dsRNA的核酸。在一些实施方案中，所述编码TLR-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：SEQ ID NO:13-20。在一些实施方案中，元件(c)被置于所述表达盒中的元件(a)和元件(b)之间。在一些实施方案中，所述抗原蛋白来自细菌、真菌、病毒或寄生虫。在一些实施方案中，所述抗原蛋白是癌症抗原。
在另一方面，本公开提供了在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用先前段落中所述的嵌合多核苷酸。
附图简述
图1显示了感染后人类细胞中抗原的表达。
图2显示了在第0天和第14天免疫小鼠后针对S1的IgG抗体滴度。滴度通过标准ELISA测量。
图3A和图3B显示了在第0天和第14天免疫小鼠后针对S1和S2的IgG抗体滴度。MSD被用于测量两种抗原在多个时间点的结合信号。在早期时间点，信号没有显著差异，但在后期时间点，高剂量组检测到更多的抗体应答。
图4A-图4D。开发转基因***物以测试疫苗特异性应答。使用这些***物制造重组腺病毒a.rAd-S，b.rAd-S-N，c.rAd-S1-N，d.rAd-S(固定的)-N。
图5A-图5D.用候选rAd疫苗免疫诱导血清IgG和肺IgA应答。用表达全长S(rAd-S)、共表达全长S和N(rAd-S-N)或共表达包含S1结构域和N的融合蛋白(rAd-S1-N)的1×108IUrAd在第0天和第14天免疫Balb/c小鼠后针对S的抗体滴度。(图5A)通过标准ELISA测量S1的IgG血清IgG终点滴度(每个疫苗接种组n＝6，PBS施用组n＝3)。符号表示平均滴度，并且棒表示标准误差)(图5B)。使用替代VNT(sVNT)和基于细胞的VNT(cVNT)两种不同方法比较rAd-S-N和rAd-S1-N的中和抗体应答。(图5C)免疫小鼠中针对S1和S2的IgA肺抗体滴度。通过标准ELISA测量终点滴度(每组n＝10)。线表示中值和四分位数之间的范围。根据Mann-Whitney t检验定义的**p<0.01，***p<0.001。图5D，免疫后在肺中测量的中和抗体。
图6A-图6B。用rAd共表达全长S和N疫苗免疫以剂量依赖性方式诱导IgG应答。图6A和图6B，在第0天和第14天，经IN用共表达全长S和N(rAd-S-N)的1×107IU、1×108IU或7.2×108IU的rAd免疫Balb/c小鼠。使用中尺度结合测定评估稀释1/4000的血清中S1(图6A)和S2特异性IgG的量。点表示平均值，并且线表示标准偏差。
图7A-图7C。用共表达全长S和N疫苗的rAd免疫以剂量依赖性方式诱导多功能T细胞应答。(图7A)在第0天和第14天，经IN用1×108IU(Ad-S-N高)、1×107IU(Ad-S-N低)的rAd-S-N免疫Balb/c小鼠。如通过ICS-FACS测定的，在用1μg/ml(CD4+)或5μg/ml(CD8+)的S肽库刺激脾细胞后仅产生IFN-γ、TNF-α、IL-2或IL-4的CD4+(上图)或CD8+ T细胞(下图)的频率。(B)在用1μg/ml(CD4+)或5μg/ml(CD8+)S肽库刺激脾细胞后产生多于一种细胞因子的多功能性CD4+(上图)或CD8+ T细胞(下图)的频率。棒表示平均值，并且线表示平均值的标准误。(C)通过ELISPOT测量在第0周和第4周用1×106IU、1×107IU、1×108IU剂量的rAd-S-N免疫后4周针对S蛋白的IFN-γT细胞应答。棒表示平均值，并且线表示标准偏差。*p<0.05；具有多重比较的单因素非参数方差分析。
图8A-图8B：当S蛋白以野生型构型中表达时，与固定型相比，针对S的抗体更优越。在第0周和第4周，以每只小鼠1e8 IU(n＝6)免疫Balb/c小鼠，并测量抗体滴度。(图8A)随时间的IgG抗体滴度。(图8B)在第6周测量中和抗体应答。注意1:1000是进行的最大稀释。
图9A-图9F：(图9A)(左)如通过流式细胞术所测量的接种前(第1天)和接种后(第8天)外周血中CD27++CD38++成浆细胞的频率。棒表示中值，而误差棒对应于95％置信区间。使用Wilcoxon检验比较接种前和接种后的频率；(右)代表性流式细胞术图，其显示了一名疫苗接种者接种前和接种后第8天的CD27++CD38++成浆细胞；(图9B)成浆细胞频率的倍数变化(第8天/第1天)。共有24/35名对象(69％)显示出2倍或更高的增长(总体上中值变化增加3.3倍)；(图9C)低剂量和高剂量疫苗队列中表达IgA和B7的成浆细胞的倍数变化(第8天/第1天)。Mann-Whitney检验被用于比较两个不同剂量组之间的频率；(图9D)针对Sars-CoV-2刺突抗原的S1结构域反应的IgA阳性抗体分泌细胞(ASC)的数量的倍数变化(第8天/第1天)；(图9E)如通过MSD平台测量的血清中S、N或RBD特异性IgA抗体的倍数变化(第29天/第1天)。红色虚线表示中值。Mann-Whitney检验被用于比较两个不同剂量组之间的频率；(图9F)如通过MSD平台所测量的鼻和唾液样品中S、N或RBD特异性IgA抗体的倍数变化(第29天/第1天)。
图10A-图10F：(图10A)用SARS-CoV-2肽重新刺激免疫前和免疫后的PBMC，对CD4、CD8和脱粒标志物CD107a进行表面染色，并对细胞因子进行细胞内染色。免疫后，在对SARS-CoV-2刺突蛋白的应答中，CD8 T细胞的IFNγ、TNFα和CD107a百分比相比于背景增加；(图10B)免疫后，在对应SARS-CoV-2刺突蛋白的应答中，CD4 T细胞的IFNγ、TNFα和CD107a百分比相比于增加；(图10C)免疫后第8天相对于第1天产生IFNγ的CD8 T细胞的增加；(图10D)通过VXA-CoV2-1免疫的对象中针对Th1应答相对于Th2应答的极化。显示了相比基线的倍数变化；(图10E)免疫后，在对SARS-CoV-2核蛋白的应答中，CD8 T细胞的IFNγ、TNFα和CD107a百分比相比于背景增加；(图10F)免疫后，在对SARS-CoV-2核蛋白的应答中，CD4 T细胞的IFNγ、TNFα和CD107a百分比相比于背景增加。
图11：免疫后，在对来自4种地方性冠状病毒的S&N肽的应答中，CD8 T细胞的IFNγ、TNFα和CD107a百分比相比于增加。
图12A-图12D。口服VXA-CoV-2引发的抗病毒CD8 T细胞数量高于肌肉内mRNA疫苗。将免疫前和免疫后的PBMC用SARS-CoV-2肽重新刺激，对CD4、CD8和脱粒标志物CD107a进行表面染色，并对细胞因子进行细胞内染色。同时评估所有3种疫苗的PBMC。(图12A)图显示免疫后，在对SARS-CoV-2刺突蛋白的应答中，CD8 T细胞的IFNγ、TNFα和CD107a百分比相比于背景增加，将来自(图12A)的(图12B)IFNγ数据与vaxart队列和康复者一起绘制。由于未获得感染前样品，康复对象未减去第1天。(图12C)比较三种疫苗的代表性facs图。图12(D)Pfizer和Moderna疫苗的时间过程
本公开详述
I.引言
冠状病毒病2019(COVID-19)是由严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)引起的一种传染病。SARS-CoV-2是一种粘膜病毒病原体，其感染肺部甚至可能肠道的上皮细胞(9)。该疾病的一些症状包括，例如，发烧、咳嗽、呼吸短促、肌肉疼痛、产生痰液、腹泻、咽喉痛、嗅觉丧失和腹痛。虽然大多数病例症状轻微，但一些进展为病毒性肺炎和多器官衰竭。
该病毒主要通过密切接触和经由人们咳嗽或打喷嚏时产生的呼吸道飞沫传播。人们也可能通过触摸受污染的表面然后接触其面部而感染COVID-19。当人们出现症状时，这种感染最具传染性，尽管在症状出现之前可能会传播。目前，还没有针对COVID-19的疫苗或特异性抗病毒治疗。管理疾病涉及症状治疗、支持性护理、隔离和一些实验措施。
SARS-CoV-2病毒的基因组编码四种主要结构蛋白，其包括刺突(S)、核衣壳(N)、膜(M)和包膜(E)，它们是制造完整病毒颗粒所必需的。病毒进入后，由两个大的前体蛋白形成16种非结构蛋白。这些病毒具有相对较大的正义RNA链(26-32kb)，并且在没有错误编辑的情况下，RNA可以突变、进化，并与其他家族成员进行同源重组，以产生新的病毒物种(6)。据信，S蛋白是冠状病毒疫苗的主要抗体靶点，因为该蛋白负责受体结合、膜融合和组织嗜性。当比较SARS-CoV-2Wu-1(GenBank登录号QHD4346.1)和SARS-CoV(GenBank登录号AY525636.1)时，发现S蛋白在1273个位置中具有76.2％的同一性、87.2％的相似性和2％的间隙(7)。据信，SARS-CoV和SARS-CoV-2使用相同的受体进入细胞：血管紧张素转换酶2受体(ACE2)，其在一些人类细胞类型上表达(8)。正如Xu等人在文章中所讨论的，ACE2的高表达水平存在于肺的II型肺泡细胞、回肠和结肠的吸收性肠上皮细胞中，且甚至可能存在于口腔组织(如舌头)中(9)。
本文提供了用于治疗COVID-19的疫苗、免疫原性组合物和方法，其涉及使用包含编码一种或多种SARS-CoV-2蛋白的一种或多种核酸和编码TLR-3激动剂的核酸的嵌合腺病毒载体。
II.定义
如本文参考例如核酸、蛋白质或载体使用的术语“嵌合”或“重组”，表示通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质，对核酸、蛋白质和载体进行了修饰。因此，例如，嵌合和重组载体包括在载体的天然(非嵌合或非重组)形式中未发现的核酸序列。嵌合腺病毒表达载体是指包含编码异源多肽(如SARS-CoV-2蛋白)的核酸序列的腺病毒表达载体。
术语“表达载体”是指用一系列特定核酸元件重组或合成产生的核酸构建体，这些核酸元件允许特定核酸在宿主细胞中转录。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常，表达载体包括与启动子可操作地连接的待转录的核酸。
术语“启动子”是指指导核酸转录的核酸控制序列的阵列。如本文所用的，启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列，如在聚合酶II型启动子的情况下，TATA元件。启动子还任选地包括远端增强子元件或阻遏元件，其可以位于距转录起始位点多达几千个碱基对的位置。启动子包括组成型启动子和诱导型启动子。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下都具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调控下具有活性的启动子。术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能连接，其中表达控制序列指导与第二序列相对应的核酸的转录。
术语“SARS-CoV-2”或“严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型”是指来自冠状病毒科病毒家族β冠状病毒的一个大属内的冠状病毒。Genbank登录号MN908947.3是SARS-CoV-2的公开DNA序列。该病毒主要通过密切接触和经由人们咳嗽或打喷嚏时产生的呼吸道飞沫传播。
术语“SARS-CoV-2蛋白”是指由SARS-CoV-2的核酸(例如，Genbank登录号MN908947.3)编码的蛋白或该蛋白的片段。在一些实施方案中，SARS-CoV-2蛋白的片段包含来自由Genbank登录号MN908947.3的序列编码的全长蛋白的至少10、20或更多个连续氨基酸。例如，SARS-CoV-2蛋白可以是SARS-CoV-2病毒的核酸编码的全长蛋白的结构蛋白，如SARS-CoV-2 S蛋白(表面糖蛋白；例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22，或其变体，例如，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22至少90％、95％、97％、98％或99％相同的那些)或SARS-CoV-2 N蛋白(核衣壳磷蛋白；SEQ ID NO:2)。SARS-CoV-2蛋白还可以是包含由SARS-CoV-2病毒的核酸编码的全长蛋白的不同部分的融合蛋白。例如，SARS-CoV-2融合蛋白可以包含SARS-CoV-2 S蛋白的S1区、弗林蛋白酶位点和SARS-CoV-2 N蛋白(例如，SEQ ID NO:12)。
术语“COVID-19”或“冠状病毒病2019”是指由SARS-CoV-2病毒引起的传染病。
如本文中所用的术语“TLR激动剂”或“Toll样受体激动剂”是指结合和刺激Toll样受体(包括例如TLR-2、TLR-3、TLR-6、TLR-7或TLR-8)的化合物。TLR激动剂在MacKichan,IAVI Report.9:1-5(2005)和Abreu等人，J Immunol,174(8),4453-4460(2005)中进行了综述。激动剂在与其受体结合后诱导信号转导。
如本文中使用的术语“TLR-3激动剂”或“Toll样受体3激动剂”是指结合和刺激TLR-3的化合物。TLR-3激动剂已被鉴定为包括双链RNA、病毒衍生的dsRNA、双链RNA的几种化学合成的类似物(包括聚肌苷-聚胞苷酸(多聚I:C)-聚腺苷酸-聚尿苷酸(多聚A:U)和多聚I:多聚C)，和针对导致IFN-β产生的TLR-3的抗体(或抗体的交联)(Matsumoto,M等人，Biochem Biophys Res Commun 24:1364(2002),de Bouteiller等人，J Biol Chem 18:38133-45(2005))。在一些实施方案中，TLR-3激动剂包含SEQ ID NO:13-20中任一个的序列。在一些实施方案中，TLR-3激动剂是dsRNA(例如，由包含SEQ ID NO:13中所示序列的核酸编码的dsRNA)。
术语“异源”在参考核酸的部分使用时，表示该核酸包含在性质上彼此不具有相同关系的两个或更多个子序列。例如，所述核酸通常是重组产生的，具有来自不相关基因的两个或更多个序列，所述序列被布置为产生新的功能性核酸，例如，来自一种来源的启动子和来自另一来源的编码区。类似地，异源蛋白表示该蛋白包含在性质上彼此不具有相同关系的两个或更多个子序列(例如，融合蛋白)。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换地用于指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及它们的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，其是合成的、天然存在的和非天然存在的，其具有与参考核酸相似的结合性质，并且以与参考核苷酸相似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另有说明，否则特定核酸序列还包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
术语“抗原”是指可以被T细胞受体和/或抗体识别的蛋白质或多肽链的一部分。通常，抗原来源于细菌、病毒或真菌蛋白。
术语本公开组合物的“免疫原性有效剂量或量”是引发或调节特异性针对SARS-CoV-2蛋白的免疫应答的量。免疫应答包括体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。免疫原性组合物可治疗或预防性地用于任何阶段的疾病的治疗或预防。体液免疫应答通常由血液的无细胞成分(即血浆或血清)介导；血清或血浆从一个个体转移到另一个体会转移免疫。细胞介导的免疫应答通常由抗原特异性淋巴细胞介导；抗原特异性淋巴细胞从一个个体转移到另一个体会转移免疫。
术语“治疗剂量”或“治疗有效量”或“有效量”的嵌合腺病毒载体或包含嵌合腺病毒载体的组合物是指载体或包含载体的组合物的量，其可以预防、减轻、减弱或减少与SARS-CoV-2蛋白(例如，SARS-CoV-2病毒)的来源相关的疾病或病症的症状的严重程度。
术语“佐剂”是指非特异性免疫应答增强剂。合适的佐剂包括例如霍乱毒素、单磷酰脂质A(MPL)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、Quil A和Al(OH)。佐剂也可以是通过如Toll样受体的次级信号传导分子引起抗原呈递细胞激活和增强T细胞呈递的那些物质。Toll样受体的实例包括识别双链RNA、细菌鞭毛、LPS、CpG DNA和细菌脂肽的受体(最近的综述见Abreu等人，J Immunol,174(8),4453-4460(2005))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸(例如羟脯氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但其功能方式类似于天然存在的氨基酸的化合物。
氨基酸在本文中可通过它们通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的一个字母符号来表示。同样，核苷酸也可以通过它们普遍接受的单字母代码来表示。
如本文所用的，在核酸或多肽的上下文中使用的术语“百分比同一性”或“百分比相同”是指与参考序列具有至少50％序列同一性的序列。可替代地，百分比同一性可以是从50％到100％的任何整数。在一些实施方案中，如使用本文所述的方法确定的，如果序列与参考序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，则该序列与参考序列基本相同；如下文所述的，优选使用标准参数的BLAST。百分比同一性也可以通过手动比对来确定。
对于序列比较，通常将一个序列作为参考序列，与测试序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
比较窗包括对多个连续位置中的任意一个的区段(例如，至少10个残基的区段)的引用。在一些实施方案中，比较窗具有10至600个残基，例如，约10至约30个残基、约10至约20个残基、约50至约200个残基，或者约100至约150个残基，其中在两个序列最佳对齐之后，可以将序列与具有相同数量连续位置的参考序列进行比较。
适合于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法是BLAST算法和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中。用于执行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站可公开获得。该算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字节来鉴定高得分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字节对齐时，短字节匹配或满足某个正值阈值得分T。T被称为邻近字节得分阈值(Altschul等人，上文)。这些最初的邻近字节命中作为启动搜索的种子，以找到包含它们的较长HSP。然后，字节命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到累积比对得分可以增加为止。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的惩罚得分；总是<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。在以下情况下，字节命中在每个方向上的延伸将停止：累计比对得分从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或者到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用28的字节大小(W)、10的期望值(E)、M＝1、N＝-2以及两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用3的字节大小(W)、10的期望值(E)和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见，例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小和概率(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间发生偶然匹配的概率的指示。例如，如果测试氨基酸序列与参考氨基酸序列的比较中的最小和概率小于约0.01，更优选小于约10-5，且最优选小于约10-20，则认为氨基酸序列类似于参考序列。
III.本公开的组合物和方法
本公开提供了包含嵌合腺病毒载体的组合物。嵌合腺病毒载体可以包括编码一种或多种SARS-CoV-2蛋白质的一个或多个核酸。嵌合腺病毒载体还可以包括编码toll样受体(TLR)激动剂(例如，TLR-3激动剂)的核酸，其在连同病毒载体一起施用时可以用作有效佐剂。
在一些实施方案中，本公开的嵌合腺病毒载体包含包括以下元件的表达盒：(a)第一启动子，其与编码第一SARS-CoV-2蛋白的核酸可操作地连接；和(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接。第一SARS-CoV-2蛋白可以是由SARS-CoV-2的核酸(例如，Genbank登录号MN908947.3)编码的全长蛋白(或其基本上相同的蛋白)或该蛋白的片段。例如，第一SARS-CoV-2蛋白可以是由SARS-CoV-2病毒的核酸编码的全长蛋白的结构蛋白，如SARS-CoV-2 S蛋白(表面糖蛋白；例如，SEQ ID NO:1或其基本上相同的蛋白，例如，SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22，或其变体，例如与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22至少90％或至少95％、96％、97％、98％或99％相同的那些)；或SARS-CoV-2N蛋白(核衣壳磷蛋白；SEQ ID NO:2或其基本上相同的蛋白，例如，其变体，例如，与SEQ IDNO:2具有至少90％或至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的那些)。在其他实施方案中，第一SARS-CoV-2蛋白可以是由SARS-CoV-2病毒的核酸的其他部分编码的蛋白，如由ORF1ab基因编码的蛋白、由ORF3a基因编码的蛋白、由E基因(编码包膜蛋白)编码的蛋白、由M基因(编码膜糖蛋白)编码的蛋白、由ORF6基因编码的蛋白、由ORF7a基因编码的蛋白、由ORF8基因编码的蛋白，或由ORF10基因编码的蛋白。
在其他实施方案中，第一SARS-CoV-2蛋白可以是包含由SARS-CoV-2病毒的核酸编码的全长蛋白的不同部分的融合蛋白。例如，SARS-CoV-2融合蛋白可以包含SARS-CoV-2 S蛋白的S1区、弗林蛋白酶位点和SARS-CoV-2 N蛋白(例如，SEQ ID NO:12)。
编码元件(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白的核酸可以包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的序列，其编码SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)。在一些实施方案中，元件(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白可以包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性且编码SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的SARS-CoV-2 S蛋白的序列。在一些实施方案中，元件(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白可以包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％)同一性且编码与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22至少90％、95％、97％、98％或99％相同的SARS-CoV-2 S蛋白变体的序列。在其他实施方案中，编码元件(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白的核酸可以包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的序列，其编码SARS-CoV-2 N蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，元件(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白可以包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％或99％)的同一性且编码与SEQ ID NO:2至少90％同一性，或至少95％、96％、97％、98％或99％相同的SARS-CoV-2 N蛋白。在其他实施方案中，编码元件(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白的核酸可以包含与SEQ ID NO:5的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的序列，其编码含有SARS-CoV-2 S蛋白的S1区、弗林蛋白酶位点和SARS-CoV-2 N蛋白的SARS-CoV-2融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:12)。
除了第一SARS-CoV-2蛋白外，本公开的嵌合腺病毒载体还可以包括元件(c)第三启动子，其与编码第二SARS-CoV-2蛋白的核酸可操作地连接。在特定实施方案中，表达盒中的元件从N末端到C末端的顺序为：元件(a)、元件(c)和元件(b)。在一些实施方案中，由表达盒中的元件(a)和元件(c)中其各自的核酸编码的第一SARS-CoV-2蛋白和第二SARS-CoV-2蛋白是相同的。在一些实施方案中，由表达盒中的元件(a)和元件(c)中的其各自的核酸编码的第一SARS-CoV-2蛋白和第二SARS-CoV-2蛋白是不同的。
例如，第一SARS-CoV-2蛋白可以是SARS-CoV-2 S蛋白(例如，SEQ ID NO:1或SEQID NO:21或SEQ ID NO:22，或其变体，例如与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22至少90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的那些，其由与SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)，并且第二SARS-CoV-2蛋白可以是SARS-CoV-2 N蛋白(例如，SEQ ID NO:2，其由与SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、99％,或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％,或100％)同一性的核酸序列编码)。在另一实例中，第一SARS-CoV-2蛋白可以是SARS-CoV-2 N蛋白(例如，SEQ ID NO:2，其由与SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％,或100％)同一性的核酸序列编码)，并且第二SARS-CoV-2蛋白可以是SARS-CoV-2 S蛋白(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22，或其变体，例如与SEQ ID NO:1或或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22至少90％、95％、97％、98％或99％相同的那些，其由与SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)。
在另一实例中，第一SARS-CoV-2蛋白可以是SARS-CoV-2 N蛋白(例如，SEQ ID NO:2；或其变体，例如，与SEQ ID NO:2具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性)或SARS-CoV-2 S蛋白(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22，或其变体，例如与SEQID NO:1或或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22至少90％、95％、97％、98％,或99％相同的那些)，并且第二SARS-CoV-2蛋白可以是SARS-CoV-2融合蛋白(例如，SEQ ID NO:12，其由与SEQ ID NO:5的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)。
在另一实例中，第一SARS-CoV-2蛋白可以是SARS-CoV-2融合蛋白(例如，SEQ IDNO:12，其由与SEQ ID NO:5的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的核酸序列编码)，并且第二SARS-CoV-2蛋白可以是SARS-CoV-2 N蛋白(例如，SEQ ID NO:2；或与SEQ ID NO:2至少95％、96％、97％、98％或99％相同的变体)或SARS-CoV-2 S蛋白(例如，SEQ ID NO:1或SEQID NO:21或SEQ ID NO:22，或其变体，例如，与SEQ ID NO:1或或SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22至少90％、95％、97％、98％,或99％相同的那些)。
技术人员理解SARS-CoV-2蛋白的变体(例如SARS-CoV-2 S蛋白的变体)迅速出现。两种变体S蛋白序列UK B.1.1.1.7变体和南非B.1.351 501Y.V2变体的实例分别在SEQ IDNOS:21和22中提供。已知其他S蛋白变体，其包括巴西变体P.1(L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I)；以及印度变体B.1.617(L452R、E484Q、D614G)等。因此，在一些实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白序列是在患者群体中鉴定的变体序列。
除了上述触发针对SARS-CoV-2蛋白的免疫应答的载体之外，鉴于实施例6中所示的数据，本文提供了这样的实施方案，其中SARS-CoV-2 N蛋白与可以来自非SARS-CoV-2抗原来源的任何第二抗原的共引入可以用于刺激针对第二抗原的CD8 T细胞免疫应答。
因此，本公开还提供了编码SARS-CoV-2 N蛋白(例如，与SEQ ID NO:2或其片段具有至少90％同一性或至少95％同一性的SEQ ID NO:2或其变体)，并编码来自任何来源的第二抗原蛋白的多核苷酸。例如，第二抗原蛋白可以来自非SARS-CoV-2病毒、细菌、其他病原体或癌症。例如，在一些实施方案中，第二抗原是来自以下病毒的蛋白质或其片段：1型单纯疱疹；2型单纯疱疹；脑炎病毒、***瘤病毒、水痘带状疱疹病毒；Epstein-barr病毒；人巨细胞病毒；8型人类疱疹病毒；人***瘤病毒；BK病毒；JC病毒；天花；脊髓灰质炎病毒；乙型肝炎病毒；人博卡病毒；细小病毒B19；人类星形病毒；诺瓦克病毒；柯萨奇病毒；甲型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；严重急性呼吸***综合征病毒；丙型肝炎病毒；黄热病病毒；登革热病毒；西尼罗河病毒；风疹病毒；戊型肝炎病毒；人类免疫缺陷病毒(HIV)；流感病毒；瓜纳里多病毒；胡宁病毒；拉沙病毒；马秋博病毒；萨比亚病毒；克里米亚-刚果出血热病毒；埃博拉病毒；马尔堡病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；呼吸道合胞病毒；人偏肺病毒；亨德拉病毒；尼帕病毒；狂犬病病毒；丁型肝炎；轮状病毒；环状病毒；Colti病毒；版纳病毒；人肠道病毒；汉坦病毒；西尼罗河病毒；中东呼吸综合征冠状病毒；日本脑炎病毒；水疱性疱疹病毒(Vesicular exanthernavirus)；或东方马脑炎。关于可使用的抗原列表，还参见美国专利第8,222,224号。
如本文所述的可与SARS-CoV-2 N蛋白结合使用的第二抗原的具体实例包括但不限于来源于以下的那些：诺如病毒(例如VP1)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(例如HA、NA、M1、NP)、人类免疫缺陷病毒(HIV，例如gag、pol、env等)、人类***状瘤病毒(HPV，例如，衣壳蛋白如L1)、委内瑞拉马脑脊髓炎(VEE)病毒、Epstein Barr病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、人类疱疹病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒、肠道病毒、甲型、乙型、丙型、戊型和庚型肝炎(HAV、HBV、HCV、HEV、HGV，例如表面抗原)、腮腺炎病毒、风疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、天花病毒、狂犬病病毒和水痘带状疱疹病毒。
可用作本文所述的第二抗原的合适的病毒抗原还包括病毒非结构蛋白，例如，与制造衣壳或病毒周围蛋白的那些相比，由不编码结构多肽的病毒核酸编码的蛋白。非结构蛋白包括促进病毒核酸复制、病毒基因表达或翻译后加工的那些蛋白，诸如例如来自委内瑞拉马脑炎(VEE)、东方马脑炎(EEE)或塞姆利基森林的非结构蛋白1、2、3和4(分别为NS1、NS2、NS3和NS4)。
可用作本文所述第二抗原的细菌抗原可来源于例如：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、霍乱弧菌(Vibrio chloerae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、***(Treponemapallidum)、支原体(Mycoplasm sp.)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、伤寒立克次体(Rickettsia typhi)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)(例如霍乱毒素B亚基、霍乱毒素共调节菌毛(TCP))；幽门螺杆菌(Helicobacter pylorii)(例如，VacA、CagA、NAP、Hsp、过氧化氢酶、尿素酶)；大肠杆菌(E.coli)(例如不耐热肠毒素、菌毛抗原)。
可用作本文所述第二抗原的寄生虫抗原可来源于例如：蓝氏贾第虫(Giardialamblia)、利什曼原虫(Leishmania sp.)、锥虫(Trypanosoma sp.)、毛滴虫(Trichomonassp.)、疟原虫(Plasmodium sp.)(例如恶性疟原虫(P.falciparum)表面蛋白抗原，如pfs25、pfs28、pfs45、pfs84、pfs 48/45、pfs 230、Pvs25和Pvs28)；血吸虫(Schistosoma sp.)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(例如Ag85、MPT64、ESAT-6、CFP10、R8307、MTB-32MTB-39、CSP、LSA-1、LSA-3、EXP1、SSP-2、SALSA、STARP、GLURP、MSP-1、MSP-2、MSP-3、MSP-4、MSP-5、MSP-8、MSP-9、AMA-1、1型完整膜蛋白、RESA、EBA-175和DBA)。
可用作本文所述的第二抗原的真菌抗原可来源于例如，足癣(Tinea pedis)、体癣(Tinea corporus)、股癣(Tinea cruris)、甲癣(Tinea unguium)、卡氏枝孢(Cladosporiumcarionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、假丝酵母(Candida sp.)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)和卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)。
可用作本文所述的第二抗原的癌症抗原包括例如在结肠癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、***癌、乳腺癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、白血病或淋巴瘤中表达或过度表达的抗原。示例性癌症抗原包括例如HPV L1、HPV L2、HPV E1、HPV E2、胎盘碱性磷酸酶、AFP、BRCA1、Her2/neu、CA 15-3、CA 19-9、CA-125、CEA、Hcg、尿激酶型纤溶酶原激活剂(Upa)、纤溶酶原激活剂抑制剂、CD53、CD30、CD25、C5、CD11a、CD33、CD20、ErbB2、CTLA-4。关于另外的癌症靶标，参见Sliwkowski&Mellman(2013)Science 341:6151。
虽然减毒腺病毒可以被用于表达SARS-CoV-2 N蛋白和第二抗原蛋白(例如，以产生CD8 T细胞应答)，但也可使用其他多核苷酸或载体。表达载体可以包括例如病毒来源的载体，例如重组腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、改良型安卡拉痘苗病毒(MVA)载体和慢病毒(例如HSV-1来源的)载体(参见，例如Brouard等人(2009)BritishJ.Pharm.157:153)。在其他实施方案中，SARS-CoV-2 N蛋白(例如，SEQ ID NO:2)和第二抗原蛋白可以由多核苷酸编码，例如，裸的或包装的DNA或RNA，例如，mRNA(关于基于RNA的疫苗的各个方面的详细信息，参见例如，美国专利出版物第2020/0254086号)。
在一些实施方案中，包含编码SAR-CoV-2 N蛋白的区域和编码第二抗原蛋白的区域的载体还包含编码TLR激动剂(例如TLR-3激动剂)的核酸，当与载体(如病毒载体)联合施用时，所述TLR激动剂可作为有效佐剂。
在一些实施方案中，载体(例如，病毒载体)编码SARS-Co-V2N蛋白(例如，SEQ IDNO:2的N蛋白序列或其变体，例如，与SEQ ID NO:2具有至少90％相同或至少95％相同)和第二抗原蛋白，其中N蛋白和第二抗原蛋白的表达由不同的启动子驱动。在其他实施方案中，载体包含位于编码N蛋白的核酸区域和编码第二抗原蛋白的区域之间的核糖体跳跃元件。在一些实施方案中，载体包含位于N蛋白和第二抗原蛋白之间的IRES，以产生双顺反子转录物。在一些实施方案中，核糖体跳跃元件是编码以下肽的序列：病毒2A肽(T2A)、猪捷申病毒-1 2A肽(P2A)、口蹄病病毒2A蛋白(F2A)、马甲型鼻炎病毒2A肽(E2A)、胞质多角体病毒2A肽(BmCPV 2A)或家蚕(B.mori)2A肽的软化病病毒(BmIFV 2A)；其位于N蛋白和第二抗原蛋白之间。在一些实施方案中，构建体还编码TLR激动剂。
在一些实施方案中，载体包含与编码SARS-CoV-2 N蛋白的多核苷酸序列可操作地连接的第一启动子和与第二抗原蛋白可操作地连接的第二启动子。在一些实施方案中，载体(例如，病毒载体)还可以包含与TLR激动剂(例如，TLR-3激动剂)可操作地连接的第三启动子。
在特定实施方案中，表达盒中元件从N末端到C末端的顺序为：编码抗原蛋白的序列、编码SARS-Co-V2 N蛋白的序列和编码TLR激动剂(例如，TLR 3激动剂)的序列。
在其他实施方案中，可以将抗原蛋白融合至N蛋白序列。例如，融合蛋白可以含有抗原蛋白、弗林蛋白酶位点和SARS-CoV-2 N蛋白或其变体(例如，与SEQ ID NO:2至少90％相同，或至少95％相同)。
在一些实施方案中，由载体编码的SARS-CoV-2 N蛋白与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性。在一些实施方案中，由载体编码的N蛋白与SEQ ID NO:2具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施方案中，载体包含如本文所述的表达盒，其中第二抗原蛋白替换本文所提供的编码N蛋白和SARS-CoV-2 S蛋白的构建体中的SARS-CoV-2 S蛋白。因此，例如，在一些实施方案中，载体包含如下序列(5’-3)：CMV-第二抗原蛋白-BGH-β肌动蛋白-N蛋白-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA，其中“CMV”是CMV启动子；“第二抗原蛋白”是编码第二抗原蛋白(例如，来自如本文所述的传染病试剂或癌症抗原)的核酸序列，“BGH”是牛生长激素聚腺苷酸化信号序列”；“β肌动蛋白”是β-肌动蛋白启动子(例如，人β-肌动蛋白启动子)；“N蛋白”是编码如本文所述的SARS-CoV2 N蛋白(例如，SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性或至少95％同一性的蛋白)的核酸序列，“SPA”是合成的多聚A序列，并且“dsRNA”是编码TLR激动剂(例如，TLR-3激动剂)的核酸序列。
在一些实施方案中，来自可替代冠状病毒的N蛋白被用于代替包含N蛋白和抗原蛋白(如传染病抗原或癌症抗原)的构建体中的SARS-CoV-2 N蛋白。因此，例如，在一些实施方案中，此类构建体可以包含SARS-CoV或MERS N蛋白。
在一些实施方案中，载体是腺病毒载体，例如，如下文所述的腺病毒5(Ad5)载体。
合适的腺病毒载体
在一些实施方案中，如本文所述的腺病毒载体是腺病毒5(Ad5)，其可以包括例如缺失E1/E3区的Ad5和缺失E4区的Ad5。其他合适的腺病毒载体包括毒株2、口服测试的毒株4和7、肠道腺病毒40和41，以及足以递送抗原并引发对转基因抗原的适应性免疫应答的其他毒株(例如Ad34)(Lubeck等人，Proc Natl Acad Sci U S A,86(17),6763-6767(1989)；Shen等人，J Virol,75(9),4297-4307(2001)；Bailey等人，Virology,202(2),695-706(1994))。在一些实施方案中，腺病毒载体是活的、无复制能力的腺病毒载体(如E1和E3缺失的rAd5)、活的和减毒的腺病毒载体(如E1B55K缺失病毒)或具有野生型复制的活腺病毒载体。
用于体内转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列可由病毒来源提供。例如，常用的启动子和增强子来源于β-肌动蛋白、腺病毒、猴病毒(SV40)和人巨细胞病毒(CMV)。例如，允许在以下启动子的指导下表达蛋白质的载体是合适的：CMV启动子、β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、Rous肉瘤病毒启动子、转导物启动子或其他显示在哺乳动物细胞中有效表达的启动子。可以使用其他病毒基因组启动子、控制序列和/或信号序列，前提是此类控制序列与所选择的宿主细胞相容。
各种启动子可以被用于本文所述的嵌合腺病毒载体中。用于元件(a)、元件(b)和/或元件(c)的启动子可以相同或不同。例如，在一些实施方案中，用于元件(a)的第一启动子和用于元件(b)的第二启动子都可以是CMV启动子。在其他实施方案中，当包括元件(c)时，第三启动子可以与第一启动子和/或第二启动子相同或不同。例如，第一启动子和第二启动子都可以是CMV启动子，并且第三启动子可以是β-肌动蛋白启动子(例如，人β-肌动蛋白启动子)。
TLR激动剂
本文所述的嵌合腺病毒载体还可以包括编码toll样受体(TLR)激动剂的核酸，当与病毒载体联合施用时，所述激动剂可作为有效佐剂。TLR激动剂可以被用于增强对SARS-CoV-2蛋白的免疫应答。在一些实施方案中，使用TLR-3激动剂。在一些实施方案中，本文所述的TLR激动剂可以与编码目标抗原(例如SARS-CoV-2蛋白)的表达载体同时递送。在其他实施方案中，TLR激动剂可以与编码目标抗原(例如SARS-CoV-2蛋白)的表达载体分开(即，时间上或空间上)递送。例如，表达载体可以经由非肠外途径(例如，口服、鼻内或粘膜)施用，而TLR激动剂可以通过肠胃外途径(例如，肌肉内、腹腔内或皮下)递送。
在特定实施方案中，TLR-3激动剂可以被用于刺激目标抗原的免疫识别。TLR-3激动剂包括，例如，短发夹RNA、病毒来源的RNA、可形成双链或短发夹RNA的RNA短区段以及短干扰RNA(siRNA)。在本公开的一实施方案中，TLR-3激动剂是病毒来源的dsRNA，诸如例如来源于辛德毕斯病毒的dsRNA或dsRNA病毒中间体(Alexopoulou等人，Nature 413:732-8(2001))。在一些实施方案中，TLR-3激动剂是短发夹RNA。短发夹RNA序列通常包括两个由接头序列连接的互补序列。特定的接头序列不是本公开的关键方面。可以使用任何合适的接头序列，只要它不干扰两个互补序列的结合以形成dsRNA。
在一些实施方案中，TLR-3激动剂可以包含与SEQ ID NO:13-20中列出的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％(例如，85％、87％、89％、91％、93％、95％、97％、99％或100％)同一性的序列。在特定实施方案中，TLR-3激动剂包含SEQ ID NO:13的序列。在某些实施方案中，作为TLR-3激动剂的dsRNA不编码特定多肽，但在体外或体内与应答细胞(例如树突状细胞、外周血单个核细胞或巨噬细胞)接触时产生促炎性细胞因子(例如IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α、IFN-β)。
在特定实施方案中，本文所述的TLR激动剂(例如TLR-3激动剂)可以在编码SARS-CoV-2蛋白的同一表达载体内同时递送。在其他实施方案中，TLR激动剂(例如TLR-3激动剂)可以与编码SARS-CoV-2蛋白的表达载体分开(即，时间上或空间上)递送。在一些情况下，当TLR-3激动剂与表达载体分开递送时，编码TLR-3激动剂的核酸(例如，表达的dsRNA)和包含编码SARS-CoV-2蛋白的核酸的嵌合腺病毒载体可以在同一制剂中施用。在其他情况下，编码TLR-3激动剂的核酸和包含编码SARS-CoV-2蛋白的核酸的嵌合腺病毒载体可以在不同的制剂中施用。当编码TLR-3激动剂的核酸和包含编码SARS-CoV-2蛋白的核酸的腺病毒载体在不同的制剂中施用时，它们的施用可以是同时的或依序的。例如，可首先施用编码TLR-3激动剂的核酸，然后施用嵌合腺病毒载体(例如，1、2、4、8、12、16、20或24小时，2、3、6、8或10天后)。可替代地，可以首先施用腺病毒载体，然后施用编码TLR-3激动剂的核酸(例如，1、2、4、8、12、16、20或24小时、2、4、6、8或10天后)。在一些实施方案中，编码TLR-3激动剂的核酸和编码SARS-CoV-2蛋白的核酸在同一启动子的控制下。在其他实施方案中，编码TLR-3激动剂的核酸和编码SARS-CoV-2蛋白的核酸在不同启动子的控制下。
IV.药物组合物和施用途径
免疫原性药物组合物可以包含本文所述的嵌合腺病毒载体和药学上可接受的载体。合适的载体包括例如水、盐水、酒精、脂肪、蜡、缓冲剂、固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁，或可生物降解的微球(例如，聚乳酸聚乙醇酯(polylactate polyglycolate))。合适的生物可降解微球体公开于例如例如美国专利第4,897,268号；第5,075,109号；第5,928,647号；第5,811,128号；第5,820,883号中。免疫原性多肽和/或载体表达载体可以包封在可生物降解的微球内或与微球的表面缔合。
免疫原性药物组合物中的成分与以下因素密切相关，诸如但不限于免疫原性药物组合物的施用途径、药物释放的时间线和/或持续时间以及靶向递送位点。在一些实施方案中，制剂的延迟释放包衣或另外的包衣可以包含由于技术原因或药物释放的计时控制而对腔条件不敏感的其他成膜聚合物。用于此目的的材料包括但不限于：糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等，其单独或在混合物中使用。
添加剂(如分散剂、着色剂、颜料、另外的聚合物例如，聚(丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯)、抗粘剂和抗起泡剂)可以包括在包衣层中。可添加其它化合物以增加膜厚度并减少酸性胃液向芯材料中的扩散。包衣层还可以包含药学上可接受的增塑剂以获得所需的机械性能。此类增塑剂例如但不限于三乙酸甘油酯、柠檬酸酯、邻苯二甲酸酯、癸二酸二丁酯、十六醇、聚乙二醇、甘油单酯、聚山梨醇酯或其他增塑剂及以上的混合物。可针对每种配方，并且相对于所选聚合物、所选增塑剂和所述聚合物的施用量优化增塑剂的量。
此类免疫原性药物组合物还可以包含非免疫原性缓冲剂(例如，中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如，氢氧化铝)、混悬剂、增稠剂和/或防腐剂。可替代地，本公开的组合物可以被配制成冻干物。还可以使用公知的技术将化合物包封在脂质体内。
此外，可以制备药物组合物以防止胃降解，使得所施用的免疫原性生物试剂到达所期望的位置。用于DNA微囊化的方法和用于口服递送的药物描述于例如US2004043952中。对于口服环境，有几种方法可用，包括Eudragit和TimeClock释放***以及专为腺病毒设计的其他方法(Lubeck等人，Proc Natl Acad Sci U S A,86(17),6763-6767(1989)；Chourasia和Jain,J Pharm Pharm Sci,6(1),33-66(2003))。在一些实施方案中，Eudragit***可以被用于将嵌合腺病毒载体递送至下小肠。
在特定实施方案中，免疫原性组合物为片剂或胶囊的形式，例如，为肠溶包衣覆盖的压缩片剂的形式。在一些实施方案中，免疫原性组合物被封装在包含明胶、羟丙基甲基纤维素、淀粉或普鲁兰的聚合物胶囊中。在一些实施方案中，免疫原性组合物是直径小于2mm的微粒的形式，例如，如本文所述，每个微粒覆盖有肠溶包衣。在特定实施方案中，片剂、胶囊或微粒形式的免疫原性组合物可以口服施用。在一些实施方案中，可以经由在外部产生的信号下释放的片剂或胶囊来实现位点特异性的递送。关于高频(HF)信号释放的早期模型，如公开于Digenis等人(1998)Pharm.Sci.Tech.Today 1:160中。最初的HF胶囊概念由此已被更新，并且其结果作为
Figure BDA0004113471590000271
上市。更新后的胶囊是射频激活的非崩解递送***。胶囊的放射性标记允许经由伽马闪烁照相法确定胶囊在胃肠道特定区域内的位置。当胶囊到达胃肠道中所期望的位置时，外部激活会打开一系列通向胶囊药物储器的窗口。
在一些实施方案中，免疫原性组合物可以被封装在无线电控制的胶囊中，从而一旦胶囊到达递送部位，就对其进行跟踪并发出信号。在一些实施方案中，胶囊在施用后的给定时间被发信号，该给定时间对应于胶囊预期到达递送部位的时间，进行或不进行检测。
本文所述的组合物可作为缓释制剂(即，在施用后实现化合物缓慢释放的制剂(如胶囊或海绵))的一部分施用。此类制剂通常可使用公知技术制备(参见例如，Coombes等人(1996)Vaccine 14:1429-1438)。缓释制剂可包含分散在载体基质中和/或包含在由速率控制膜包围的储器内的多肽、多核苷酸或抗体。
用于此类制剂中的载体是生物相容的，并且也可以是生物可降解的；优选该制剂提供相对恒定水平的活性成分释放。此类载体包括聚(丙交酯-乙交酯共聚物)的微粒，以及聚丙烯酸酯、乳胶、淀粉、纤维素和葡聚糖。其他延迟释放载体包括超分子生物载体，其包含非液体亲水核(例如，交联的多糖或寡糖)和任选地包含两亲性化合物的外层(参见例如，WO94/20078；WO 94/23701；和WO 96/06638)。缓释制剂中所含活性化合物的量取决于植入部位、释放速率和预期持续时间以及待治疗或预防的病况的性质。
在一些实施方案中，免疫原性组合物在单位剂量或多剂量容器中提供(如密封安瓿或小瓶)。此类容器优选是密封的，以在使用前保持制剂的无菌性。通常，制剂可作为混悬液、溶液或乳液储存在油性或水性媒介物中。可替代地，免疫原性组合物可以在冷冻干燥条件下储存，仅需要在即将使用前添加无菌液体载体。
用于靶向递送的组合物
在靶向递送的一些实施方案中，肠溶包衣被用于保护物质不受胃的低pH环境的影响，并延迟封闭物质的释放，直到其稍后在消化道中到达所期望的靶标。肠溶包衣是已知的，并且可商购获得。实例包括pH敏感聚合物、生物降解聚合物、水凝胶、时间释放***和渗透递送***(参见，例如，Chourasia&Jain(2003)J.Pharm.Pharmaceutical Sci.6:33)。
在一些实施方案中，靶向递送部位是回肠。胃肠道(GIT)的pH值从胃中的非常酸性(pH～2)发展到回肠中的更中性(pH～5.8-7.0)。pH敏感包衣可用于溶解在回肠中或在回肠之前不久。实例包括
Figure BDA0004113471590000281
L和S聚合物(阈值pH值范围为5.5-7.0)；聚醋酸乙烯酯邻苯二甲酸酯(pH 5.0)、羟丙基甲基纤维素邻苯二酸酯50和55(pH分别为5.2和5.4)，以及乙酸纤维素邻苯二甲酸酯(pH5.0)。Thakral等人(2013)Expert Opin.Drug Deliv.10:131综述了用于回肠递送的/>
Figure BDA0004113471590000294
制剂，特别是确保在pH≤7.0下递送的L和S的组合。Crotts等人(2001)Eur.J Pharm.Biol.51:71描述了具有适当崩解性能的/>
Figure BDA0004113471590000295
制剂。Vijay等人(2010)J.Mater.Sci.Mater.Med.21:2583综述了用于在pH 6.8下回肠递送的基于丙烯酸(AA)-甲基丙烯酸甲酯(MMA)的共聚物。
对于回肠递送，聚合物包衣通常在约pH 6.8下溶解，并允许在约40min内完全释放(参见，例如，Huyghebaert等人(2005)Int.J.Pharm.298:26)。为了实现这一点，治疗物质可以覆盖在不同包衣的层中，例如，使得最外层在低pH条件下保护该物质，并在片剂离开胃时溶解，以及至少一个内层在片剂进入增加的pH时溶解。用于递送至远端回肠的分层包衣的实例描述于例如，WO 2015/127278、WO 2016/200951和WO 2013/148258中。
可生物降解的聚合物(例如果胶、偶氮聚合物)通常依赖于GIT中生活的微生物群的酶促活性。回肠含有比早期阶段更多数量的细菌，其包括乳杆菌和肠杆菌。
渗透控制释放口服经口***(
Figure BDA0004113471590000291
Alza)是在水性条件下随时间降解的渗透***的实例。此类材料可以用其他包衣或以不同的厚度操纵，以专门递送至回肠(参见，例如，Conley等人(2006)Curr.Med.Res.Opin.22:1879)。
WO2000062820中报道了用于递送至回肠的组合聚合物。实例包括具有柠檬酸三乙酯(2.4mg/胶囊)的
Figure BDA0004113471590000292
L100-55(25mg/胶囊)，以及聚维酮K-25(20mg/片)，然后是
Figure BDA0004113471590000293
FS30D(30mg/片)。pH敏感性聚合物可以被应用于实现向回肠的递送，如上文所述，并且例如甲基丙烯酸共聚物(例如聚(甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物)1:1)、乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸聚乙酸乙烯酯、乙酸偏苯三甲酸纤维素、羧甲基乙基纤维素、虫胶或其他合适的聚合物。包衣层也可以由对pH以外的其他腔成分敏感的成膜聚合物组成，如细菌降解或当其与另一成膜聚合物混合时具有此类敏感性的成分。提供延迟释放到回肠的此类组分的实例是包含偶氮键、多糖(如果胶及其盐、半乳甘露聚糖、直链淀粉和软骨素)、二硫化物聚合物和糖苷的聚合物。
具有不同pH、水和酶促敏感性的组分可以组合使用，以将治疗组合物靶向回肠。包衣的厚度也可用于控制释放。所述组分还可用于形成基质，将治疗组合物嵌入其中。一般参见药物设计与发现的前沿领域(Frontiers in Drug Design&Discovery，Bentham SciencePub.2009)第4卷。
佐剂
在本公开的一些实施方案中，除了在嵌合腺病毒载体中编码的TLR激动剂(例如TLR-3激动剂)之外，组合物还可以包含另外的佐剂。合适的佐剂包括例如脂质和非脂质化合物、霍乱毒素(CT)、CT亚基B、CT衍生物CTK63、大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)、LT衍生物LTK63、Al(OH)3和多离子有机酸，如例如描述于WO 04/020592；Anderson和Crowle,Infect.Immun.31(1):413-418(1981)；Roterman等人，J.Physiol.Pharmacol.,44(3):213-32(1993)；Arora和Crowle,J.Reticuloendothel.24(3):271-86(1978)以及Crowle和May,Infect.Immun.38(3):932-7(1982))中。合适的多离子有机酸包括例如，6,6’-[3,3’-二甲基[1,1’-联苯]-4,4’-二基]双(偶氮)双[4-氨基-5-羟基-1,3-萘-二磺酸](Evans Blue)和3,3’-[1,1’联苯]-4,4’-二基双(偶氮)双[4-氨基-1-萘磺酸](刚果红)。本领域技术人员将认识到，多离子有机酸可与任何类型的施用一起用于任何遗传疫苗接种方法。
其他合适的佐剂包括局部免疫调节剂，如咪唑并喹啉家族成员，诸如例如咪喹莫特和雷西莫特(参见，例如，Hengge等人，Lancet Infect.Dis.1(3):189-98(2001)。
另外的合适的佐剂可作为以下物质商购获得，例如另外的基于明矾的佐剂(例如，Alhydrogel、Rehydragel、磷酸铝、Algammulin)商购；基于油的佐剂(弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50或Seppic MONTANIDE ISA 720)；基于非离子嵌段共聚物的佐剂、细胞因子(例如，GM-CSF或Flat3配体)；Merck佐剂65(Merck and Company,Inc.,Rahway,N.J.)；AS-2(SmithKlineBeecham,Philadelphia,Pa.)；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性混悬液；酰化糖；阳离子或阴离子来源的多糖；聚磷腈；生物可降解微球；单磷酰脂质A和Quil A。细胞因子(如GM-CSF或白介素-2、白介素-7或白介素-12)也是合适的佐剂。血蓝蛋白(例如钥孔傶血蓝蛋白)和血红蛋白也可以用于本公开。多糖佐剂(如例如甲壳素、壳聚糖和脱乙酰化甲壳素)也适合作为佐剂。其他合适的佐剂包括胞壁酰二肽(MDP，N乙酰胞壁酰L丙氨酰D异谷氨酰胺)细菌肽聚糖及其衍生物(例如，苏氨酰-MDP和MTPPE)。BCG和BCG细胞壁骨架(CWS)也可以用作本公开中的佐剂，其具有或不具有海藻糖二霉菌酸酯。海藻糖二霉菌酸酯可以单独使用(参见例如美国专利第4,579,945号)。脱毒内毒素也可单独用作佐剂或与其他佐剂结合使用(参见例如美国专利第4,866,034号；第4,435,386号；第4,505,899号；第4,436,727号；第4,436,728号；第4,505,900号；和第4,520,019)。皂苷QS21、QS17、QS7也可用作佐剂(参见例如，美国专利第5,057,540号；EP 0362279；WO 96/33739；和WO 96/11711)。其他合适的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic,法国)、SAF(Chiron,Calif.,美国)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列的佐剂(例如，SBAS-2、SBAS-4或SBAS-6或以上的变体，其可从SmithKline Beecham,Rixensart,Belgium获得)、Detox(Corixa,Hamilton,Mont.)和RC-529(Corixa,Hamilton,Mont.)。
在本文所提供的药物组合物中，佐剂组合物可以被设计成诱导例如主要为Th1或Th2型的免疫应答。高水平的Th1型细胞因子(例如，IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-12)倾向于有利于诱导细胞介导的对施用抗原的免疫应答。相比之下，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于促进体液免疫应答的诱导。在口服递送包含本文所提供的免疫原性多肽的组合物之后，通常会引发包括Th1型和Th2型应答的免疫应答。
施用途径
可通过任何非肠胃外途径(例如，经由***、肺、唾液腺、鼻腔、小肠、结肠、直肠、扁桃体或派伊尔结的口服、鼻内或粘膜)施用包含嵌合腺病毒载体的组合物。该组合物可单独或与上述佐剂一起施用。在特定实施方案中，免疫原性组合物以片剂或胶囊的形式口服施用。在其他实施方案中，免疫原性组合物以片剂或胶囊的形式口服施用，以用于回肠中的靶向递送。
V.治疗用途
本公开的一方面涉及使用本文所述的免疫原性组合物在对象中引发针对SARS-CoV-2蛋白(例如，具有SEQ ID NOS:1、2或12的序列的SARS-CoV-2蛋白)的抗原特异性免疫应答。在一些实施方案中，在对象的肺泡细胞、吸收性肠上皮细胞、纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和/或气道基底细胞中引发免疫应答。如本文所用，“对象”指任何温血动物，诸如例如啮齿动物、猫科动物、犬科动物或灵长类动物，优选人类。在对象发展COVID-19之前，可以使用免疫原组合物来预防疾病。可以使用本领域普遍接受的标准来诊断该疾病。例如，可以通过测量来自对象的生物样品(例如，鼻孔拭子或粘膜样品)中的病毒滴度来诊断病毒感染。
如实例中所示，本文所述的疫苗可在触发CD8+ T细胞免疫应答方面特别有效。在一些实施方案中，这种显著的CD8应答可由存在的SARS-CoV-2 N蛋白(例如，SEQ ID NO:2或其基本相同的变体)触发，其用于刺激针对第二抗原蛋白(其在本实例中为SARS-CoV-2 S蛋白，但其可以是不同的SARS-CoV-2蛋白，或如下文更详细所讨论的，非SARS-CoV-2蛋白)的CD8+ T细胞应答。因此，在一些实施方案中，如本文所述的导致SARS-CoV-2 N蛋白以及第二抗原蛋白表达的疫苗可以被用于在对象(例如人类对象)中触发免疫应答，其包括CD8+ T细胞应答。在一些实施方案中，人类对象是具有较少能力产生基于抗体的免疫应答或以其他方式受益于CD8+ T细胞免疫应答的对象。示例性对象可以包括但不限于：老年人(例如至少50岁、至少60岁或至少70岁)，或患有抗体缺乏症的那些(关于其描述参见例如，AngelA.Justiz Vaillant；Kamleshun Ramphul,ANTIBODY DEFICIENCY DISORER(TreasureIsland(FL):StatPearls Publishing；2020))，其可以包括但不限于患有X连锁无丙种球蛋白血症(Bruton病)、新生儿短暂性低丙种球球蛋白血症、选择性Ig免疫缺乏症(例如IgA选择性缺乏症)、超IgM综合征和常见的可变免疫缺陷病症的对象。
免疫疗法通常是主动免疫疗法，其中治疗依赖于内源性宿主免疫***的体内刺激，以针对例如病毒感染的细胞反应，其中施用包含本文所述嵌合腺病毒载体的免疫原性组合物。
本文所述免疫原性组合物的施用频率以及剂量将因个体而异，并且可以使用标准技术容易地确定。在一些实施方案中，可以在52周期间施用1至10(例如，2至10、3至10、4至10、5至10、6至10、7至10、8至10、9至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2)的剂量。在一些实施方案中，以1个月的间隔施用2或3剂；或者例如每2-3个月施用2-3剂。对于某些疗法，间隔可能是每年一次。此后可定期接种加强疫苗。
合适的剂量是例如当按如上所述施用时能够促进抗病毒免疫应答并且比基础(即，未处理的)水平高至少10％-50％的化合物的量。此类应答可以通过测量患者中的抗病毒抗体或通过疫苗依赖性产生能够在体外杀伤例如患者的病毒感染细胞的溶细胞T细胞来监测。免疫原性应答也可以通过检测免疫原性多肽和体液中对免疫原性多肽具有特异性的抗体之间形成的免疫复合物来测量。可以分析在治疗开始之前和之后从个体中采集的体液样品的免疫复合物。简而言之，可以比较两种样品中检测到的免疫复合物的数量。相对于第一样品(治疗前)，第二样品(治疗后开始)中的免疫复合物数量的显著变化反映了成功的治疗。与未接种疫苗的患者相比，此类疫苗还应能够引起免疫应答，从而在接种疫苗的患者中预防COVID-19疾病。
可以以感染单位(I.U.)测量示例性剂量。复制缺陷型重组Ad5载体可以用I.U.单位计量和定量。这是通过在粘附的人类胚胎肾(HEK)293细胞系中进行IU测定来实现的，该细胞系允许复制缺陷型Ad5的生长。将HEK293细胞接种于24孔无菌组织培养板中，并使其粘附。将病毒物质依次以10倍稀释进行稀释，并以适当数量的重复感染到HEK293细胞平板的单个孔中，通常为一式两份或一式三份。允许感染在37C、5％CO2下进行孵育～40-42小时。然后用甲醇固定细胞以允许渗透，洗涤，并用含有牛血清白蛋白(BSA)的缓冲溶液封闭。然后将细胞用兔源性抗Ad5六邻体表面蛋白的第一抗体孵育，洗涤，并再次用HRP缀合的抗兔第二抗体探测。然后经由用3,3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)和过氧化氢孵育对感染的细胞进行染色。使用相差显微镜观察感染的细胞，并选择表现出个别个体感染事件的稀释–这些可见为深染色的细胞，其相对于未感染细胞的半透明单层高度可见。对适当稀释的至少十个视野中的每个视野的总感染细胞计数。可以使用这些计数的平均数结合使用的物镜/目镜放大率的视野总数，以及乘以计数中使用的稀释因子来计算病毒滴度。
在一些实施方案中，所施用的疫苗具有的剂量可以为107-1011，例如，108-1011、109-1011、5×109-5×1010I.U。合适的剂量大小将随着患者的尺寸而变化，但对于注射的疫苗，范围通常为约0.01ml至约10ml，更通常为约0.025至约7.5ml，最典型地为约0.05至约5ml。对于片剂或胶囊最终产品，大小将在10mg至1000mg之间，最典型地在100-400mg之间。本领域技术人员将理解，剂量大小可根据特定患者或正在治疗的特定疾病或病症进行调整。
实施例
以下实施例旨在说明但不限制本公开。
实施例1.重组腺病毒构建体的产生
使用先前临床评估的相同载体平台(14,15)，开发了几种不同的重组腺病毒(rAd)构建体，以防止SARS-CoV-2感染，不同的是使用了不同的抗原。几种rAd SARS-CoV-2疫苗是通过标准方法产生的(例如，如He等人(17)所述)。
基于公布的可作为Genbank登录号MN908947.3公开获得的SARS-CoV-2的DNA序列创建了三种疫苗构建体。具体而言，将公布的SARS-CoV-2 S蛋白(或表面糖蛋白；下面的SEQ1)和SARS-CoV-2 N蛋白(或核衣壳磷蛋白；下面的SEQ2)的氨基酸序列用于合成密码子优化的核酸序列，以在智人(Homo sapiens)细胞中表达。SARS-CoV-2 S基因和SARS-CoV-2 N基因的密码子优化的核酸序列分别显示在SEQ ID NO:3和4中。这些序列被用于创建含有克隆到5型腺病毒E1区中的转基因的重组质粒(pAd)。
使用来自SARS-CoV-2的序列构建了两种重组pAd质粒：
1.ED81.4.1：pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-CMV-dsRNA-SPA。含有在CMV启动子控制下的SEQ ID NO:3的重组Ad5载体。从起始CMV启动子到dsRNA佐剂之后的SPA的整个转基因盒的序列包括为SEQ ID NO:6。包含该转基因构建体的整个重组腺病毒基因组的序列包括为SEQ ID NO:9。
2.ED84A6.4.1：pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-b肌动蛋白-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA。重组Ad5载体，其包含在CMV启动子控制下的SEQ ID NO:3和在β-肌动蛋白启动子控制之下的SEQ ID NO:4。从起始CMV启动子到dsRNA佐剂之后的SPA的整个转基因盒的序列包括为SEQ ID NO:7。包含该转基因构建体的整个重组腺病毒基因组的序列包括为SEQ ID NO:10。
另外，使用融合序列(SEQ ID NO:5)构建第三pAd质粒，该融合序列将SARS-CoV-2S基因的S1区(包括S1和S2之间的天然弗林蛋白酶位点)与全长SARS-CoV-2 N基因组合：
3.ST05.1.3.3：pAd-CMV-SARS-CoV-2-S1-弗林蛋白酶-N-BGH-CMV-dsRNA-SPA。含有在CMV启动子控制下的SEQ ID NO:5的重组Ad5载体。从起始CMV启动子到dsRNA佐剂之后的SPA的整个转基因盒的序列包括为SEQ ID NO:8。包含该转基因构建体的整个重组腺病毒基因组的序列包括为SEQ ID NO:11。
使用限制位点(例如Sthl和Sgfl)将序列克隆到穿梭质粒中。穿梭质粒被用于将转基因锁定在含有E1基因缺失的5型腺病毒全序列(pAd)的质粒(pAd)上。将pAd质粒转染到人细胞中，以提供反式E1基因产物，以允许复制和纯化重组腺病毒用作疫苗中的API。
实施例2.抗原蛋白的表达
通过细胞内染色/流式细胞术评估三种不同的候选物的表达。将HEK293细胞以3e5个细胞/孔放置在24孔板中的组织培养物中。4小时后，用MOI为1的各种构建体感染细胞。40小时后收获细胞，并使用识别S1或N蛋白的人单克隆抗体(Genscript)对单独的孔进行染色。使用抗人IgG PE第二抗体来观察固定细胞上的表达。表达全长SARS-CoV-2 S蛋白但不表达N蛋白的候选物(rAd-S；上述的质粒pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-CMV-dsRNA-SPA)清楚地显示了此类表达模式。表达S1-N融合蛋白的候选物(rAd-S1-N；如上所述的质粒pAd-CMV-SARS-CoV-2-S1-弗林蛋白酶-N-BGH-CMV-dsRNA-SPA)表达S和N蛋白，在单独启动子下表达S和N的候选物(rAd-S-N；如上所述的质粒pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-b肌动蛋白-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA)也是如此(图1)。
实施例3.小鼠中的免疫原性
最初小鼠免疫原性研究的主要目的是确定哪些rAd载体诱导了显著的抗体应答。结果用于确定将选择哪种候选疫苗用于GMP生产。通过i.n.(N＝6)免疫动物，并随时间测量抗体滴度。在单独启动子下表达S和N的rAd载体(如上所述的质粒pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-b肌动蛋白-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA)产生与来自SARS-CoV-2的S蛋白的S1组分相等的滴度。rAd-S-N载体具有比表达rAd-S1-N的融合蛋白略高的S1抗体应答(图2)。
然后进行所选疫苗rAd-S-N的剂量应答以测试免疫原性。测试了三种不同的剂量水平，并使用中尺度装置测量了对S1和S2的抗体应答。在早期时间点，在所有三个剂量水平上都观察到类似的应答，但较高剂量组在稍后时间点具有改善的抗体应答(图3A和图3B)。
实施例4.人类中的免疫原性
rAd-S-N质粒(如上所述的pAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-b肌动蛋白-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA)将在GMP设施中制造、干燥并放入片剂中。一项人体试验将评估rAd-S-N在不同剂量水平下引发人体免疫应答的能力。
实施例5.重组腺病毒粘膜疫苗防止SARS-COV-2感染的临床前研究前言
2019年，一种作为COVID-19病的病原体的新的新型冠状病毒(严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2))的出现导致了一场全球大流行，并导致了一个世纪以来未见的严重发病率、死亡率和社会经济破坏。冠状病毒病2019(COVID-19)是一种严重程度不等的呼吸***疾病；范围从无症状感染到轻度感染，伴有发热和咳嗽，再到严重肺炎和急性呼吸困难1。目前的报告表明，无症状传播是大量的(2)，并且SARS-CoV-2感染在大多数个体中诱导短暂的抗体应答(3)。因此，开发成功的干预措施是保护全球人口免受这种病毒感染和传播及其相关临床和社会后果的迫切要求。使用有效疫苗的群体免疫已经非常成功地防止了许多其他传染病的传播，并且也可以通过诱导群体免疫来预防弱势群体的疾病。正在投入大量努力和资源，紧急确定有效的SARS-CoV-2疫苗。许多不同的疫苗平台已经证明了临床前免疫原性和对肺炎的有效性(4,5)。几种疫苗已经证明了I期或II期安全性和免疫原性(6-8)。然而，目前尚无疫苗在该领域显示出效力。
最先进的SARS-CoV-2候选疫苗均通过肌肉内(IM)途径施用，其中一些需要-80℃储存。这是大流行期间疫苗传播和部署的主要障碍，在大流行期间，人们被要求保持社交距离并避免聚集。任何疫苗活动的最终目标都是通过提供足够的群体免疫以抑制病毒传播来预防疾病，而不是生产一定数量的疫苗。注射的溶液需要很长的时间来管理和分配，并且需要昂贵的物流，这意味着剂量可用性不会立即转化为免疫力。此外，全身免疫可诱导外周和下呼吸道的免疫。然而，这些疫苗不能诱导上呼吸道中的粘膜免疫，正如来自Doremalen等人的4种粘膜IgA(具有聚合结构和分泌成分的添加)报道的粘膜IgA不佳所证明的，产生更有效的病毒中和(9)可以阻断病毒传播(10,11)，并且鉴于这是针对呼吸***病原体的第一道防线，通常更可能产生杀菌免疫。
粘膜疫苗可以在湿润的表面诱导粘膜免疫应答、抗体和T细胞。我们正在开发针对多种适应症的口服疫苗，包括流感和诺如病毒，以片剂形式分配给人们。我们的疫苗平台是一种复制缺陷型5型腺病毒载体疫苗，它表达抗原和一种作为佐剂的新的toll样受体3激动剂。这些疫苗具有良好的耐受性，并且能够对表达的抗原产生强大的体液和细胞免疫应答(12-14)。如表征良好的实验性流感感染模型中所示的，在接种疫苗后90天或更长时间内，在人类中证明了对呼吸***病毒的保护效力(15)。此外，该疫苗还具有室温稳定性和无针、易于施用的优点，在疫苗部署和获取方面提供了优于注射疫苗方法的几个优点。
在此，我们描述了基于Vaxart口服腺病毒平台的SARS-CoV-2疫苗的临床前开发。关键的方法是平行开发几种候选疫苗，以便在初始免疫原性实验进行时创造出预生产种子。鉴于疫苗是在大流行期间生产的，因此需要迅速做出决定，以防止生产和监管时间线下滑。我们评估了基于刺突(S)和核衣壳(N)SARS-CoV-2蛋白表达抗原的四种候选疫苗的相对免疫原性。这些蛋白已被很好地表征为相关冠状病毒的抗原，如SARS-CoV和MERS(在Yong等人(16)中综述)，并且越来越多地被表征为SARS-CoV-2刺突的抗原。我们疫苗的目的是在三个层面上诱导免疫原性；首先，诱导针对S的有效血清中和抗体，其次，诱导粘膜免疫应答，和第三，诱导对两种疫苗抗原的T细胞应答。这种三重方法旨在诱导强大和广泛的免疫力，其能够保护个人免受病毒感染和疾病，在大流行期间促进疫苗的快速传播，并通过群体免疫保护人群免受病毒传播。
在此，我们报告了在表达一种或多种SARS-CoV-2抗原的rAd载体免疫后，在小鼠中诱导中和抗体(Nab)、IgG和IgA抗体应答以及T细胞应答。
结果
载体构建
最初，构建了三种不同的rAd载体来表达不同的SARS-CoV-2抗原。这些是表达全长S蛋白(rAd-S)的载体、表达S蛋白和N蛋白的载体(rAd-S-N)，以及表达S1结构域与N蛋白的融合蛋白的载体(rAd-S1-N)。rAd-S-N的N蛋白在人β肌动蛋白启动子的控制下表达，该启动子在人细胞中比小鼠细胞中更有效。在稍后的日期构建其中表达的S蛋白以预融合构象固定的另外的构建体(rAd-S(固定的)-N)，作为探索中和抗体应答的对照。这些在图4中描述。在293细胞感染后，使用流式细胞术和针对S或N蛋白的单克隆抗体确认了各种转基因的表达。
表达S和N抗原的rAd载体的免疫原性
最初的小鼠免疫原性研究的主要目的是确定哪些rAd载体诱导了对S的显著抗体应答，并快速获得那些结果，以及时为生产提供GMP种子。我们和其他人(17)已经观察到，通过口服施用于小鼠的疫苗载体在其肠道环境中可以抑制转基因表达，因此在鼻内(i.n.)免疫后评估了免疫原性。对动物进行i.n.免疫，并通过IgG ELISA测量抗体滴度随时间的变化。所有三种rAd载体在第2周和第4周诱导了几乎相等的抗S1 IgG滴度，并且所有动物中的IgG滴度通过第二次免疫显著加强(p<0.05，Mann Whitney t检验)(图5A)。然而，与仅表达S1的载体相比，表达全长S的载体(rAd-S-N)诱导了更高的中和滴度(图5B)。这通过两种不同的中和测定进行测量，一种基于SARS-CoV-2感染Vero细胞(cVNT)，且一种基于替代中和测定(sVNT)。此外，与最终免疫后两周的rAd-S1-N相比，rAd-S-N诱导了对S1的更高的肺部IgA应答，并且毫不意外地诱导了对S2的更高IgA应答(图5C)。值得注意的是，与含S1的疫苗(rAd-S1-N)相比，当使用rAd-S-N时，肺中的中和滴度也显著更高(图5D)。这表明，与仅含有S1结构域的疫苗相比，rAd-S-N候选物诱导了更大的功能应答(NAb和IgA)。由于N蛋白比S蛋白保守得多，并且是感染诱导的长期T细胞应答的靶标(18)，因此选择了载体rAd-S-N用于GMP生产。
然后测试三个剂量水平的rAd-S-N，以了解该疫苗的剂量反应性。测量了对S1(图6A)和S2(图6B)的抗体应答。在所有时间点，在所有三个剂量水平下都看到了类似的应答。与更早的时间相比，第6周，所有组对S1和S2的应答都显著增加。
然后评估不同剂量下rAd-S-N对S特异性T细胞的诱导。在2次免疫后两周观察到产生效应细胞因子(如IFN-γ、TNF-α和IL-2)的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞的诱导(图7A)。值得注意的是，通过该疫苗且仅在CD4+ T细胞中诱导了很少的IL-4；提供了疫苗依赖性疾病增强风险非常低的保证水平。此外，rAd-S-N免疫诱导了双阳性和三阳性的多功能IFN-γ、TNF-α和IL-2CD4+ T细胞(图7B)。在最终免疫后4周(研究的第8周)，进行第二次剂量应答实验以关注T细胞对S蛋白的应答。用分成两个单独的肽库的S蛋白肽库刺激脾细胞过夜。对两个库中的T细胞应答求和并绘图(图7C)。与未处理的动物相比，施用1e7 IU和1e8 IU剂量水平的动物具有显著更高的T细胞应答，但产生了与彼此类似数量的IFN-γ分泌细胞，证明了1e7 IU剂量下的剂量平台。值得注意的是，该T细胞分析在第二次免疫后4周进行，可能在T细胞应答峰值之后进行。
rAd表达的野生型S相比稳定的/预融合S诱导更优的中和应答。
进行了另一项研究，以将rAd-S-N与S蛋白稳定且跨膜区被去除的候选疫苗(rAd-S(固定的)-N)进行比较。S蛋白的稳定形式已被提出作为改善中和抗体应答和产生较少非中和抗体的方法。如Amanat等人,(19)所述，通过修饰使S蛋白稳定。rAd-S-N在测试的两个时间点都诱导了更高的针对S1的血清IgG滴度(图8A)，尽管通过Mann-Whitney在第6周时这些没有统计学意义(p＝0.067)。然而，相比稳定形式，rAd-S-N诱导了显著更高的中和抗体应答(图8B)(p＝0.0152)。这些结果表明，S蛋白的野生型形式在小鼠中优于基于rAd的疫苗。
讨论
COVID-19大流行的最后阶段需要确定和制造安全有效的疫苗，并随后开展全球免疫活动。许多候选疫苗已加速进行至第三阶段全球效力测试，并且如果在这些试验中充分成功，可能会形成第一代免疫活动。然而，所有这些先进的候选物都是注射的基于S的疫苗。如猕猴挑战研究所证明的，此类方法不太可能防止病毒传播，但应防止肺炎和病毒在下呼吸道和周围的生长和损害(4,5)。
全球COVID-19免疫活动的一个关键制约因素是冷链配送物流，以及需要经过适当培训的卫生保健工作者(HCW)注射疫苗的瓶颈。当前的物流成本，包括冷链和培训，可能使中低收入国家(LMIC)的个人完全免疫的成本翻倍(20)。实施大规模免疫活动，需要经过培训的HCW来进行基于注射的疫苗，这将对所有国家的医疗资源产生重大影响。对冷链、生物危害性尖锐废物处理和培训的需求将导致成本增加、疫苗获取不公平、疫苗接种延迟和这一流行病的延长。如果疫苗无法提供长期保护(对其他β-冠状病毒的自然免疫是短暂的(21))，并且需要每年进行基于注射的活动，这些成本将被放大。Vaxart的口服片剂疫苗平台为这些免疫学以及物流、经济、获取和可接受性问题提供了解决方案。在本研究中，我们在动物临床前模型中证明了使用Vaxart疫苗平台的SARS-CoV-2疫苗的免疫原性；即血清和粘膜中和抗体和多功能T细胞的诱导。
小鼠研究旨在在2020年春季快速测试候选疫苗的免疫原性，然后进行对应对大流行至关重要的生产和临床研究。Vaxart的口服片剂疫苗平台此前已被证明能够在人类中产生针对几种不同病原体的可靠粘膜(呼吸***和肠道)、T细胞和抗体应答(12,14,22,23)。我们从我们先前的人类流感病毒挑战性研究中得知，口服免疫能够在免疫后90天诱导保护效力；与商用四价灭活疫苗相当(15)。这些特征提供了信心，即COVID-19平台的采用可以转化为对这种致病性冠状病毒的疗效，并可以提供针对病毒感染的持久保护。最后，片剂疫苗活动要容易得多，因为不需要合格的医疗支持来对其施用。这种易于施用将导致增加疫苗的获得，并可能提高可接受性，如易于施用的口服脊髓灰质炎在消除脊髓灰质炎病毒中的成功所证明的(24)。与其他疫苗相比，这些特征在SARS-CoV-2免疫接种活动中可能甚至更为重要，因为鉴于全球范围内对COVID-19的否认、不信任和疫苗犹豫的加剧水平(25,26)，可能需要多得多的资源来确保这种疫苗的使用。片剂疫苗不需要冰箱或冰柜，不需要针或小瓶，并且可以经由标准邮件或通过无人机运送。这些性质大大加强了部署和分配物流，甚至允许进入技术资源较少的孤立地区。最后，从免疫学的角度来看，这种腺病毒的口服施用不会因预先存在的对腺病毒的免疫而受到损害，或产生实质性的抗载体免疫(12,13)，这些问题已被证明会导致基于rAd5的SARS-CoV2疫苗的疫苗效力显著降低(27)，并且当通过IM途径重新施用相同的腺病毒平台时，可能防止持续增加的免疫(28)。
在新的大流行期间，抗原的选择可能很困难，在这个时期，需要迅速做出关键决定。据信，S蛋白是冠状病毒疫苗的主要中和抗体靶标，因为该蛋白负责受体结合、膜融合和组织嗜性。当将SARS-CoV-2Wu-1与SARS-CoV进行比较时，发现S蛋白具有76.2％的同一性(29)。据信，SARS-CoV和SARS-CoV-2使用相同的受体进入细胞：血管紧张素转换酶2受体(ACE2)，它在一些人类细胞类型上表达30。因此，迄今为止，SARS–CoV-2 S蛋白被用作疫苗开发中的主要靶抗原，并且鉴于其作为病毒与靶细胞结合的关键机制，是一种理想的靶标。然而，疫苗对S蛋白和IgG血清应答的总体依赖最终可能导致病毒逃逸。对于流感，血凝素结合蛋白的微小变化(包括单个糖基化位点)会极大地影响注射疫苗的保护能力(31)。SARS-CoV-2似乎比大多数RNA病毒更稳定，但已经观察到在没有广泛分布的疫苗的选择性压力的情况下的S蛋白突变。一旦疫苗压力开始，逃逸突变可能会出现。我们采取了两种方法来解决这个问题；首先在疫苗中包括更保守的N蛋白，其次诱导更广泛的免疫应答，即通过粘膜IgA。
ACE2的高表达水平存在于肺的II型肺泡细胞、回肠和结肠的吸收性肠上皮细胞，且甚至可能存在于口腔组织(如舌头)中(32)。据信，病毒的传播主要通过密切接触的未保护个体之间的呼吸道飞沫和媒介物传播(33)，尽管由一些经由口粪途径传播的证据(如SARS-CoV和MERS-CoV病毒所见的)，其中可能在来自感染人的粪便样品中分泌冠状病毒(34)。也有证据表明，存在有胃肠道症状而非呼吸***症状的个体子集，更可能更长时间地传播病毒(35)。驱动呼吸***和肠道处对S的免疫粘膜免疫应答可能能够提供更广泛的免疫力和更大的阻断传播的能力，而不是仅仅简单地靶向一个粘膜部位。阻断传播，而不仅仅是疾病，对于降低感染率并最终根除SARS-CoV-2至关重要。我们之前已经证明，口服的基于rAd的片剂疫苗可以诱导针对流感病毒挑战后呼吸***感染和脱落的保护(15)，以及对人类中诺如病毒抗原的肠道免疫(12)。此外，粘膜IgA比单体IgG应答更可能能够解决循环病毒中S蛋白的任何异质性。还发现mIgA对其他呼吸道病原体的交叉反应性比IgG更强(36)。在COVID-19中，IgA也可能是比IgG更具中和性的同种型，且事实上，中和性IgA主导早期免疫应答(37)。值得注意的是，在我们的小鼠研究中，我们也发现我们的肺中中和抗体和非中和抗体相对于血清抗体结果之间的更高比率，这支持了IgA可能比IgG更有效力的概念。聚合IgA通过与抗原和Fc受体的多重结合相互作用，可以将微弱的单一相互作用转换为更高的总亲和力结合和激活信号，从而对异源病毒产生更多的交叉保护(38)。
我们缓解这种潜在的疫苗驱动逃逸问题的第二个策略是在疫苗构建体中包括N蛋白。N蛋白在β-冠状病毒中高度保守(90％以上相同)，含有几种免疫显性T细胞表位，并且在SARS-CoV康复对象以及已知未暴露于SARS-CoV或SARS-CoV-2的人群中可以发现对N的长期记忆(18,39)。在感染环境中，T细胞对N蛋白的应答似乎与中和抗体应答的增加相关(40)。所有这些原因导致我们在我们的疫苗方法中加入N。该蛋白在293A细胞中表达。然而，由于人类β肌动蛋白启动子在人类细胞中比在小鼠中更活跃，我们没有探索Balb/c小鼠的免疫应答，但将在未来的NHP和人类研究中更仔细地检查它们。
SARS-CoV-2疫苗中包括的S蛋白的最佳序列和结构是一个争论的话题。几个实验室已经表明，将S蛋白减少到受体结合域(RBD)内的关键中和结构域将促进更高的中和抗体应答，并且非中和抗体更少(41,42)。我们制作了一种由包括RBD的S1结构域组成的候选疫苗，试图提升这种方法。尽管基于S1的疫苗产生了与S1相似的IgG结合滴度，但中和抗体应答相比全长S抗原显著降低。其他基于基因的疫苗也表明，对S的还原论方法效果不佳，表明表达全长S蛋白的DNA疫苗产生的中和抗体高于较短的S片段(5)。与这些猕猴研究一致，我们观察到Ad编码抗原的序列对抗体功能有显著影响，这里是关于中和作用。虽然减少暴露非中和抗体表位的可能性在理论上似乎是合理的，但这可能会减少T细胞的帮助，后者允许产生更多的中和抗体。实际上，在占SARS-CoV-2应答54％的刺突蛋白T细胞应答中，只有11％映射到受体结合结构域(43)。稳定S蛋白可能对蛋白质疫苗很重要，但对基于基因的疫苗来说不一定如此。前者是在体外生产的，且其生产目的是保持均匀、明确的结构，以备注射。相比之下，后者在体内与自然感染一样，基本上以预融合形式表达于细胞表面上，并且B细胞可能不需要额外的稳定性来产生针对关键中和表位的抗体。如本实施例中所述，我们在编码S蛋白和N蛋白的构建体中直接比较了S的稳定形式和野生型形式。野生型形式在诱导中和抗体应答方面明显更好。令人感兴趣的是，在NHP的DNA疫苗研究中也观察到了这一点，其中与野生型S5相比，稳定形式似乎诱导了较低的中和抗体(NAb)滴度。Mercado等人在NHP中对rAd26载体的研究中观察到了稍有不同的结果，其中表达稳定形式的S蛋白似乎可以改善NAb，但降低T细胞应答(44)。总之，稳定并不能普遍改善基于基因的疫苗或基于载体的疫苗的免疫应答。
多种候选疫苗正在或即将开始临床测试。由于已知对诸如埃博拉病毒等流行病原体的安全性和免疫原性，两种主要候选疫苗基于重组腺病毒载体；牛津大学的ChAdOx1-nCov和Janssen Pharmaceutical的AdVac平台(45-48)。与Balb/c小鼠中的ChAdOx1-nCov相比(4)，我们在我们的研究中发现了更强的血清IgG和NAb滴度。然而，这可能反映了测定成分的差异。Hassan等人进行了rAd36疫苗研究，其中1e10 VP的剂量通过鼻内递送给予(49)。从阻断小鼠SARS-CoV-2挑战模型中的肺部感染的角度来看，结果是显著的。他们报告的血清抗体滴度为1e4的滴度，高于背景滴度，与我们的结果相似，尽管使用的剂量比我们的研究高2-log至3-log倍。实际上，在我们的研究中，通过鼻内途径使用1e7 IU和1e8 IU观察到相当强的T细胞和抗体应答。使用这些剂量，我们观察到高百分比的分泌IFN-γ和TNF-α的CD8+ T细胞应答(高达14％)以及肽再刺激后的强CD4+ T细胞。尽管我们没有评估这些抗原特异性T细胞的运输特性，但我们知道，在人类中口服施用这种基于Ad的疫苗会诱导高水平的粘膜归巢淋巴细胞(12,15)。在这项小鼠研究中，一定比例的抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞是多功能的。疫苗诱导的具有多种功能的T细胞可在感染后更有效地消除病毒，并因此可参与疾病预防，然而，目前尚不确定保护疾病所需的最佳T细胞表型是什么。
总之，这些在小鼠中进行的研究是我们创造疫苗候选物的第一步，证明了即使在低疫苗剂量下构建体的免疫原性，并阐明了全长刺突蛋白作为诱导T细胞应答的主要候选抗原以及优越的全身和粘膜中和抗体。未来的工作将集中于人类中的免疫应答。
方法
疫苗构建体
对于这项研究，基于公布的作为Genbank登录号MN908947.3可公开获取的SARS-CoV-2的DNA序列创建了四种重组腺病毒疫苗构建体。具体而言，SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)和SARS-CoV-2核衣壳蛋白(N蛋白)的已公布氨基酸序列用于合成密码子优化的核酸序列，以在智人细胞中表达(Blue Heron Biotechnology,Bothell,WA)。如He等人(50)所述的，这些序列被用于创建含有克隆到5型腺病毒(rAd5)的E1区中的转基因的重组质粒，使用先前口服rAd片剂临床试验中使用的相同载体主链(12,15)。如图4所示，创建了以下四种构建体：
a.rAd-S：含有在CMV启动子控制下的全长SARS-CoV-2 S基因的rAd5载体。
b.rAd-S-N：含有在CMV启动子控制下的全长SARS-CoV-2 S基因和在人β-肌动蛋白启动子控制下的全长SARS-CoV-2 N基因的rAd5载体。
c.rAd-S1-N：使用将SARS-CoV-2 S基因的S1区(包括S1和S2之间的天然弗林蛋白酶位点)与全长SARS-CoV-2 N基因组合的融合序列的rAd5载体。
d.rAd-S(固定的)-N：含有在CMV启动子的控制下的去除了跨膜区的稳定的S基因和在人β-肌动蛋白启动子的控制下的全长SARS-CoV-2 N基因的rAd5载体。通过以下修饰稳定S基因：
a)删除第682、683、685位aa处的精氨酸残基，以去除天然弗林蛋白酶切割位点
b)引入了两个稳定突变：K986P和V987P
c)去除P1213之后的跨膜区，并用噬菌体T4 fibritin三聚折叠结构域序列(51)(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL)替换
所有疫苗在Expi293F悬浮细胞系(Thermo Fisher Scientific)中培养，通过CsCl密度离心纯化，并以液体形式提供用于动物实验。
动物实验
动物护理和使用委员会(the Animal Care and Use Committees，IACUC)批准了研究的伦理。所有的程序都是按照地方、州和联邦的指导方针和条例进行的。6-8周大的雌性Balb/c小鼠购自Jackson实验室(Bar Harbor,ME)。由于小鼠不吞服药片，所以将液体制剂以每个鼻孔10μl经鼻内滴入，每只小鼠20μl，以测试各种构建体的免疫原性。在不同时间点通过脸颊穿刺获取血清。
抗体评估
ELISA
对蛋白质的特异性抗体滴度的测量类似于先前描述的方法(52)。简而言之，在1个具有1.0ug/ml S1蛋白(GenScript)的碳酸盐缓冲液(0.1M，pH 9.6)中包被微量滴定板(MaxiSorp:Nunc)。将板在4℃的加湿室中孵育过夜，然后在PBS加0.05％ Tween 20(PBST)加1％ BSA溶液中封闭1h，然后洗涤。将血浆样品在PBST中连续稀释。孵育2h后，用PBST洗涤板至少5次。然后将抗体作为抗小鼠IgG1-辣根过氧化物酶(HRP)和抗小鼠IgG2a-HRP(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX)的混合物加入。每种第二抗体以1:5,000稀释度使用。孵育1h后，将板洗涤至少5次。用3,3＝,5,5＝-四甲基-联苯胺(TMB)底物(Rockland,Gilbertsville,PA)检测抗原特异性小鼠抗体，并使用H2SO4作为终止溶液。在Spectra MaxM2微孔板读数仪上在450nm下读取板。除非另有说明，否则平均抗体滴度报告为倒数稀释，其中吸光度值大于平均背景加2个标准差。
抗体结合抗体
为了同时测量对S1和S2的应答，用SARS CoV-2抗原包被
Figure BDA0004113471590000461
96孔、2-Spot板(Mesoscale Devices；MSD)。从在哺乳动物细胞(293细胞)中产生蛋白质的来源(Native Antigen Company)商购获取蛋白质。这些被生物素化，并通过其各自的U-PLEX连接子粘附到其各自的斑点上。为了测量IgG抗体，在摇动下将板用MSD阻断剂B阻断1小时，然后在加入样品之前洗涤三次，稀释1:4000。摇动孵育2小时后，将板洗涤三次。然后将平板用1μg/mL的检测抗体(MSD SULFO-TAGTM抗小鼠IgG)孵育1小时。洗涤3次后，加入读取缓冲液，并在Meso QuickPlex SQ 120上读取板。
SARS-CoV-2中和测定
基于SARS-CoV-2替代病毒中和测试(sVNT)试剂盒(GenScript)，常规检测中和抗体。该基于ELISA的试剂盒检测阻碍SARS-CoV-2刺突糖蛋白的受体结合结构域(RBD)与宿主细胞上ACE2受体之间相互作用的抗体，并与Vero细胞SARS-CoV-2感染的常规病毒中和滴度高度相关(53)。这种方法的优点是可以在BSL-2实验室中进行测定。使用提供的样品稀释缓冲液以1:20、1:100、1:300、1:500、1:750和1:1000稀释来自用候选疫苗免疫的小鼠的血清。将来自未免疫小鼠的血清稀释1:20。肺样品稀释1:5、1:20和1:100。按照提供的方案以1:9的体积比制备阳性和阴性对照。稀释后，将血清或肺样品单独以1:1的比例用HRP-RBD溶液在37℃下孵育30分钟。孵育后，将100μl的每种HRP-RBD和样品或对照混合物加入到hACE2预涂覆的捕获板中的相应孔中，并在37℃下再一次孵育15分钟。随后，彻底清洗孔，并将100μl所提供的TMB(3,3＝,5,5＝-四甲基-联苯胺)溶液加入到每个孔中，并在室温(20-25℃)下保持孵育15分钟。最后，向每个孔中加入50μl终止溶液，并在Spectra Max M2微孔板读数仪上在450nm下读取板。给定样品的吸光度与给定样品中抗SARS-CoV-2 RBD中和抗体的滴度成反相关。根据测试试剂盒方案，当将样品的OD相对于阴性对照的OD进行比较时，20％抑制的截止点被确定为对存在中和抗体的阳性。将在最低稀释度下为阴性的样品设置为等于测试的最低稀释度的1/2，血清样品为10，或者肺样品为2.5。
在一些研究中，使用BSL3条件下Visimederi处的cVNT测定测量了另外的中和抗体应答。cVNT测定具有细胞病变效应(CPE)读数，以检测动物或人类样品中针对活SARS-COV-2的特异性中和抗体。cVNT/CPE测定允许病毒进行多次感染循环并从细胞中释放；其在几天(通常为孵育72小时)内呈指数增长，导致部分或完全的细胞单层从支撑物表面脱离，可清楚地识别为CPE。将血清样品在56°下热灭活30min；从1:10开始进行两倍稀释，然后与等体积的含有100TCID50的SARS-CoV-2的病毒溶液混合。将血清-病毒混合物在具有5％ CO2的37°的湿润气氛中孵育1小时。孵育后，将每种稀释下的100μL混合物以一式两份添加到含有半汇聚Vero E6单层的细胞板中。孵育72小时后，通过倒置光学显微镜检查平板。将保护50％以上细胞免受CPE影响的最高血清稀释度作为中和滴度。
肺IgA ELISA
最终免疫后两周(研究的第28天)，处死小鼠并经由心脏穿刺放血。取出肺并在-80℃下快速冷冻。解冻后，对肺进行称重。使用颗粒杵(Sigma Z359947)，将肺在150μl DPBS中匀浆。将匀浆以1300rpm离心3分钟，并冷冻上清液。在评估IgA含量之前，使用Bradford测定评估肺匀浆中的总蛋白质含量，以确保所有样品中的组织量相等。使用小鼠IgAELISA试剂盒(Mabtech)和pNPP底物(Mabtech)检测肺中的抗原特异性IgA滴度。简而言之，用PBS中的S1或S2(The Native Antigen Company；50ng/孔)涂覆MaxiSorp板(Nunc)，以在4℃下吸附过夜，然后在PBS加0.05％ Tween 20(PBST)加0.1％ BSA(PBS/T/B)溶液中封闭1h，然后洗涤。将肺匀浆在PBS/T/B中连续稀释，以1:30稀释开始。孵育和洗涤2小时后，根据制造商的方案，使用MT39A-ALP缀合抗体(1:1000)检测结合的IgA。在415nm下读取板。终点滴度作为稀释曲线的x轴截距，其吸光度值为原始小鼠血清吸光度的3×标准差大。无应答的动物的滴度设置为15或测试的最低稀释值的1/2。
T细胞应答
在用5ml注射器推过无菌过滤器之前，将脾脏取出并置于5ml Hanks平衡盐溶液(具有1M HEPES加5％ FBS)中。RBC溶解(Ebiosolutions)、再悬浮和计数后，细胞准备好进行分析。将细胞以5e5个细胞/孔与1μg/ml的代表全长S蛋白的两个肽库(Genscript)一起培养过夜，以刺激细胞。培养基由具有0.01M HEPES、1×l-谷氨酰胺、1×MEM碱性氨基酸、1×青链霉素、10％ FBS和5.5e-5摩尔/lβ-巯基乙醇RPMI培养基(Lonza)组成。使用Mabtech试剂盒测量抗原特异性IFN-γELISPOT。用适当的抗体染色后，使用Attune流式细胞仪和FlowJo 10.7.1版进行流式细胞术分析。对于流式细胞术，将每孔2e6个脾细胞在37℃下用肽库孵育18小时，肽库代表1或5ug/ml的全长S，在孵育的最后4小时加入布雷菲德菌素A(ThermoFisher)。使用的抗体是APC-H7缀合的CD4、FITC缀合的CD8、BV650缀合的CD3、PerCP-Cy5.5缀合的IFN-y、BV421缀合的IL-2、PE-Cy7缀合的TNFa、APC缀合的IL-4、AlexaFluor缀合的CD44和PE缀合的CD62L(BD biosciences)。
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实施例6
研究VXA-COV2-101是一项1期开放标记、剂量范围试验，以评估SARS-CoV-2口服片剂疫苗(rAd-S-N,SEQ ID NO:10)的安全性和免疫原性，该疫苗在实施例6和7中被称为VXA-CoV2-1，施用于18-55岁年龄的健康成年对象。
本研究的目的是评估通过肠溶片递送的VXA-CoV2-1口服疫苗的安全性和免疫原性。
对象在南加州的一个单阶段1单元进行了登记。在完成筛选评估和资格确认后，35名对象被纳入本试验；队列1的哨兵对象(n＝5)在第1天接种疫苗，并在第29天重复接种。队列2和3的对象在第1天接受了单次疫苗接种。研究设计如下表所示。
VXA-COV2-101研究设计
Figure BDA0004113471590000551
队列1哨兵对象在第29天接受与第一次相同剂量水平的第二次剂量(加强)
B细胞/抗体分析
使用基于流式细胞术的测量和通过ELISPOT的抗体分泌细胞(ASC)测定来评估VXA-CoV2-1促进具有高抗体生成潜力的B细胞的能力。先前已经很好地证实，对疫苗接种有应答的B细胞在施用部位和局部引流***中被激活，其中它们在生发中心应答后分化为成浆细胞。在免疫后6至8天之间，相当比例的成浆细胞离开生发中心并短暂出现在外周循环中，其中可以发现它们高度富集了疫苗抗原特异性抗体分泌细胞(ASC)。因此，VXA-COV2-01研究中接种前和接种后收集的固定的全血样品的流式细胞术分析揭示，接种后8天，总体CD27++CD38++成浆细胞群体显著扩增，约70％(24/35)的疫苗接种者显示出与基线水平相比，成浆细胞频率增加2倍或更高(图9A-9B)。进一步的研究表明，疫苗接种后循环成浆细胞表面上的IgA和粘膜归巢受体α4β7都上调，特别是在接受较高剂量水平VXA-CoV2-1的队列中(图9C)，因此表明疫苗诱导了这种产生IgA的B细胞群向粘膜组织的迁移(Mora和vonAndrian,2008)。总体而言，这些结果与该公司在人类甲型流感第2阶段挑战性研究中发表的先前数据一致，其中发现口服流感疫苗后产生具有相似粘膜特征的IgA成浆细胞是疫苗诱导保护的强指标(Liebowitz等人，2020)。
另外，ELISpot测定用于测量VXA-CoV2-1诱导循环抗体分泌B细胞的能力，该B细胞能够识别并结合SARS-CoV-2刺突(S)抗原的S1结构域。该分析表明，在第一次免疫后第8天，疫苗诱导的S1应答性、IgA分泌型ASC的显著产生(p＝0.0002，Wilcoxon检验)，总体中值比基线水平增加了4倍(图9D)。更具体地说，如通过相对于接种前水平，接种后第8天每百万个细胞分泌IgA的ASC数量增加了2倍或更高的中值(中值增加2.67倍；95％ CI：1.0-13.32)所示的，在第1天和第8天ASC测量都可用的低剂量疫苗组中，8/12(67％)的对象被分类为“应答者”。在较高疫苗剂量队列中，记录到应答者的比例略高(11/15名对象，73％)(中值增加4倍；95％CI：1.3-13.32)。
使用中Meso Scale Discovery(MSD)平台在免疫前和免疫后测量血清、唾液和鼻样品中对不同SARS-CoV-2抗原特异性的IgA抗体水平。与经由流式细胞术和ELISPOT观察到的B细胞应答的粘膜特征一致，可以在血清和粘膜隔室中发现靶向SARS-CoV-2刺突(S)、核蛋白(N)和刺突受体结合域(RBD)的IgA抗体。总体而言，23％(8/35)的疫苗接种者到第29天时血清中的疫苗特异性IgA增加了50％或更高，其中6/8的对象产生了靶向所有三种分析的SARS-CoV-2抗原的IgA。与IgA+B7+成浆细胞测量结果一致，高剂量队列中的对象显示出较高的血清中S特异性的IgA抗体应答(图9)。正如我们所预期的，鉴于VXA-CoV2-1口服候选疫苗的独特特性，相对于血清，更高百分比的疫苗接种者在粘膜隔室中获得SARS-COV-2特异性IgA抗体应答，其中54％的疫苗接种者(19/35)在唾液或鼻样品中的粘膜IgA达到2倍或更高的增加(图9F)。更具体地，10/35(29％)的疫苗接种者在其唾液中的IgA抗体增加2倍或更多，而12/35(35％)到接种后第29天在其鼻隔室中达到相同的阈值。在两个剂量组之间的唾液或鼻样品中没有观察到疫苗特异性IgA应答的显著差异(图9F)。由于粘膜样品的限制，很难测量IgA的中和能力，但初步发现表明，特异性鼻IgA增加两倍的对象也有能力在替代中和测定中中和，该测定测量ACE2与刺突蛋白的结合(图9F)。如Sterlin等人报道的，分泌型IgA对SARS-CoV-2的中和能力高于IgG(Sterlin等人，2021)。
这些发现是有希望的，因为一些报告强调了粘膜免疫和生成IgA抗体在帮助防护COVID-19方面的潜力(Ejemel等人，2020；Russell等人，2020；Sterlin等人，2021)。值得注意的是，尽管可注射疫苗的设计不能有效诱导呼吸道粘膜中的IgA抗体，但口服疫苗接种策略可能会提供这一优势(Jeyanathan等人，2020)。在关键粘膜表面处诱导SARS-CoV-2特异性IgA应答也可能引发杀菌免疫，并具有更大的阻断病毒传播的能力，这是非常理想的特征，特别是在新的SARS-CoV-2变体可能在未检测到的疫苗接种对象中复制的情况下。
疫苗接种后血清中IgG抗体的分析表明，SARS-CoV-2特异性抗体应答没有增加。类似地，在血清中没有观察到显著的SARS-CoV-2抗体介导的中和。虽然目前尚未确定血清中缺乏疫苗特异性IgG和抗体中和的潜在原因，但本研究中使用的剂量水平的单次口服剂量的VXA-CoV2-1可能不足以引发强烈的疫苗特异性抗体中和应答。另外，不能排除VXA-CoV2-1构建体中编码N的基因的存在可能使该疫苗候选物的免疫原性特征偏离了血清中和抗体，偏向于T细胞介导的免疫。
T细胞分析
除了B细胞和抗体外，T细胞在产生针对许多微生物感染的保护性免疫应答中也发挥着关键作用。在COVID-19的背景下，T细胞已被证明在恢复期对象中靶向多种SARS-CoV-2蛋白，而与抗体相比，它们似乎对SARS-CoV-2变体的易感性更低(Grifoni等人，2020；Ledford,2021；Tarke等人，2021)。
使用来自疫苗接种前和接种后第8天采集的26对样品的外周血单核细胞(PBMC)，使用再刺激测定，测量接种VXA-CoV2-1后SARS-CoV-2特异性T细胞的诱导和Th1/Th2极化，用来自S或N的SARS-CoV-2肽培养，并评估Th1/Th2细胞因子应答。将PBMC解冻、静止过夜，并在布雷菲德菌素A(Invitrogen)和莫能菌素(Biolegend)的存在下，在37摄氏度下，在Immunocult培养基(Stemcell Technologies)中以1x107个细胞/ml的浓度在96孔圆形底板中，用S或N肽库(Miltenyi)培养5小时。收获细胞，用CD4-BV605、CD8-BV785和zombie近IR活性染料(Biolegend)进行表面染色。在用4％ PFA(biotium)固定并用Cytoperm(BDBiosciences)渗透后，将针对细胞因子IFNγ-BV510(Biolegend)、TNFα-e450(Thermofisher)、IL-2-APC(Thermofisher)、IL-4-PerCP(biolegend)、IL-5-PE(Biolegend)、IL-13(Biolegend)和CD107a-Alexa488(Thermofisher)的抗体用于评估细胞内细胞因子应答，并使用Attune(Thermofisher)流式细胞仪分析以进行评估。
与疫苗接种前水平相比，在任何接种后样品中，在对S或N的应答中，未观察到Th2应答的显著增加，定义为CD4+ T细胞的IL5/IL4/IL13细胞因子的细胞内生成。这一点很重要，因为该领域中的早期报告假设了Th2极化后与抗体依赖性增强(ADE)相关的潜在不良事件(Lee等人，2020)。
值得注意的是，本研究中的大多数疫苗接种者在疫苗接种后第8天的Th1应答显著增加，定义为应答于用S肽再刺激，IFNγ/TNFα细胞因子的细胞内生成和脱颗粒标记物CD107a，特别是来自CD8+ T细胞(图10A、C)以及CD4+ T细胞(图10B)。特别地，13/26(50％)的对象应答于S，Th1细胞因子增加了2倍或更高，其中19/26(73％)的对象总体表现出高于基线水平的可测量的产生细胞因子的CD8+ T细胞应答(图10D)。在用SARS-COV-2 N肽重新刺激后，也发现了疫苗接种后Th1细胞因子的产生增加(图10E-F)，特别是对于CD8+ T细胞，尽管与S特异性应答相比，其幅度较低。更具体地说，与基线水平相比，9/26(35％)的对象在第8天N再刺激后，Th1细胞因子的CD8+ T细胞产生达到2倍或更高的增加。总体而言，在用VXA-CoV2-1口服免疫后诱导的显示出应答于SARS-CoV-2肽的抗病毒功能性的标记物的T细胞，特别是产生IFNγ的CD8+ T细胞的百分比是显著的。目前使用的针对COVID-19的mRNA疫苗尚未报告应答CD8 T细胞的这种百分比。这可能是一个关键的优势，因为具有细胞毒性能力的CD8+ T细胞具有独特的位置，可以清除病毒感染的细胞，并且也可以通过减少感染患者中的病毒载量来帮助减少传播(Ledford,2021)。后续分析将侧重于更直接地比较美国接受EUA的VXA-CoV2-1和SARS-CoV-2mRNA疫苗之间疫苗诱导的T细胞免疫。
总之，VXA-CoV2-1通过在关键粘膜部位处诱导SARS-CoV-2特异性IgA抗体以及疫苗特异性T细胞，特别是产生IFNγ的针对SARS-CoV-2疫苗抗原S和N的CD8+ T细胞。
冠状病毒疫苗的另一个通用目标不仅是防护现有毒株，还提供对其他人类冠状病毒循环毒株的保护，从而创造出一种泛冠状病毒疫苗。为了研究这一点，我们评估了VXA-CoV2-1是否诱导了对四种地方性人类冠状病毒(229E、HKU1、OC43和NL63)特异性的T细胞。我们发现，相比所有四种地方性人类冠状病毒的疫苗接种前水平都有所增加(图11)，表明诱导的T细胞与循环人类冠状病毒交叉应答。
实施例7
为了比较VXA-COV2-1与目前领先的肌肉内covid疫苗诱导的应答，我们招募了应接种mRNA疫苗的对象捐献PBMC。在疫苗接种前和接种后7天，在与疫苗接种者相同的时间点采集PBMC，并在相同的体外测定中与了来自VXA-COV1-101试验的PBMC一起测量T细胞活性。来自所有3种疫苗的样品在相同的测定中运行，并进行相同的分析以控制测定可变性。
令人惊讶的是，我们发现服用VXA-COV2-1片剂的对象的T细胞应答通常比使用紧急使用授权(Emergency Use Authorization)批准的Pfizer或Moderna疫苗肌内接种的对象高一个数量级。
IFNγ和TNFα从CD8 T细胞的释放显著增加(图12A)，其中CD107a脱粒显示出比接种前基线更小的增加。对于Pfizer/Moderna/Vaxart疫苗接种者，超过来自疫苗接种者的CD8 T细胞的第1天IFNγ的平均增加百分比分别为0.4/0.09/2.3。相对于肌内疫苗，对于服用VXA-CoV-2片剂的那些，这上升至>5倍的增加。
由于只有七名对象中的一小部分在与其他疫苗相同的测定中进行了测试，以说明对象选择中的潜在偏差，因此将之前测量的整个队列绘制在一起以进行比较，其中在将整个队列与对照实验进行比较时仍然可以看到显著性(图12B)。关于在1.5％处测量的包括无应答者在内的整个队列的平均值，与肌内疫苗相比，仍可见>3.5倍的增长。4名恢复期对象的平均IFNγ应答为0.8。图12C中示出了代表性的facs图，显示了接种后第7天VXA-CoV2-1对象中的增加。报告的来自肌内疫苗的T细胞测量值是在第二剂疫苗后7天的时间点采集的。为了说明这一点，在相同的测定中，在第二次剂量后7天也测量了PBMC，并发现在两个时间点都具有相同大小的应答，除了一名对象具有在两个时刻都增加的特别好的T细胞应答(图12D)。这与Pfizer报告的数据类似(Sahin等人，Nature 2021)。
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序列表
SEQ ID NO:1:SARS-CoV-2 S蛋白(表面糖蛋白)的氨基酸序列
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID NO:2:SARS-CoV-2 N蛋白(核衣壳磷蛋白)的氨基酸序列
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA*
SEQ ID NO:3:SARS-CoV-2 S蛋白(表面糖蛋白)的核酸序列
ggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGTCCCTGGGAGCTGAGAATTCAGTCGCGTATTCAAACAATTCCATTGCTATTCCTACTAATTTCACTATCTCCGTCACGACCGAGATCCTGCCAGTTTCCATGACTAAGACTTCTGTTGACTGCACCATGTATATCTGTGGCGATAGCACCGAGTGCAGTAATCTGCTTCTGCAGTACGGCTCCTTCTGCACACAACTCAATCGAGCACTGACCGGTATTGCAGTTGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTCTTTGCACAGGTCAAACAAATTTACAAAACCCCCCCCATAAAAGACTTTGGTGGGTTCAACTTCAGCCAAATCCTCCCAGATCCCAGCAAGCCCTCCAAAAGATCCTTCATCGAAGACCTTTTGTTCAATAAGGTAACCCTGGCCGACGCAGGCTTCATCAAACAATATGGCGATTGCCTTGGAGACATTGCTGCGCGCGATTTGATCTGTGCTCAGAAATTTAACGGTTTGACCGTGCTGCCCCCACTTCTGACTGATGAGATGATAGCACAGTATACTTCTGCTCTTCTGGCAGGAACAATCACTTCCGGGTGGACCTTTGGCGCTGGTGCAGCACTGCAAATCCCCTTCGCAATGCAAATGGCCTACCGATTCAATGGTATTGGTGTTACCCAGAACGTGCTCTATGAGAATCAGAAACTCATCGCCAATCAGTTCAATAGCGCTATTGGCAAGATTCAGGATTCCCTCAGCTCTACCGCCAGCGCTCTGGGGAAGCTCCAGGACGTGGTGAACCAAAATGCTCAAGCGCTCAATACCCTTGTGAAACAGCTCAGCTCCAATTTTGGCGCAATTAGCAGCGTTCTGAATGATATTCTGTCCCGGCTGGACAAGGTAGAAGCAGAAGTCCAGATCGACAGGCTGATCACCGGGCGGTTGCAGAGTCTCCAGACCTATGTCACACAACAGCTGATCCGCGCCGCCGAGATCAGGGCTTCCGCTAACCTGGCCGCCACTAAGATGTCCGAATGCGTGTTGGGGCAGAGTAAGCGGGTCGACTTTTGCGGGAAGGGATACCATCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCACCCCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACATATGTGCCCGCTCAGGAAAAGAATTTCACAACCGCACCTGCTATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTTCCTAGAGAAGGAGTTTTCGTATCTAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTTTACGAGCCTCAGATTATAACTACGGACAACACTTTCGTGTCAGGCAACTGTGACGTGGTGATTGGGATCGTGAACAACACAGTCTACGACCCATTGCAGCCCGAGTTGGACTCCTTCAAAGAGGAGCTTGATAAGTATTTCAAGAACCATACCTCTCCCGACGTGGACCTGGGGGACATTAGCGGCATCAATGCATCCGTTGTGAATATCCAGAAAGAAATCGATAGGCTGAATGAGGTCGCAAAAAATCTTAATGAGTCACTGATTGATCTGCAGGAACTCGGCAAATATGAGCAGTATATTAAGTGGCCGTGGTACATATGGCTCGGCTTTATCGCCGGTCTGATTGCCATCGTGATGGTGACCATTATGCTGTGTTGTATGACAAGCTGCTGTTCATGTCTCAAAGGATGCTGCTCCTGCGGTAGCTGCTGTAAGTTCGATGAAGACGACAGTGAGCCCGTGCTCAAAGGAGTGAAACTCCACTACACATAAcgatcg
SEQ ID NO:4:SARS-CoV-2 N蛋白(核衣壳磷蛋白)的核酸序列
ggtaccgccaccATGTCCGATAACGGCCCCCAGAATCAGAGAAACGCTCCCCGCATCACGTTCGGCGGACCAAGTGACAGCACAGGCAGTAACCAGAACGGAGAACGCTCCGGTGCTCGCTCCAAGCAGCGACGGCCGCAAGGGCTTCCCAACAATACCGCCAGCTGGTTTACGGCTCTGACCCAACACGGGAAAGAAGATCTTAAATTCCCCAGGGGCCAGGGCGTCCCTATCAATACTAACTCCAGCCCGGATGATCAGATAGGCTACTATAGACGCGCTACCCGACGGATACGAGGGGGGGACGGCAAAATGAAGGACCTTTCCCCCCGGTGGTATTTCTATTACTTGGGCACCGGACCAGAAGCCGGACTGCCTTACGGCGCTAACAAAGACGGAATAATCTGGGTTGCGACGGAGGGCGCCCTGAATACACCTAAAGACCATATCGGCACAAGAAATCCTGCTAACAATGCCGCGATTGTGCTCCAGCTGCCTCAGGGAACCACGCTGCCTAAAGGGTTTTACGCTGAGGGGTCAAGGGGGGGGAGTCAAGCGTCTAGTAGGTCATCCTCTCGCTCTCGCAATAGTTCCCGGAACTCAACCCCAGGCAGCAGCAGAGGAACCTCTCCCGCACGGATGGCTGGCAATGGGGGAGATGCTGCCCTTGCTCTCCTTCTGCTGGATCGCCTTAACCAGCTCGAATCAAAGATGTCTGGAAAAGGTCAGCAGCAGCAAGGCCAGACCGTGACAAAGAAGAGTGCAGCTGAAGCTAGTAAAAAGCCACGCCAAAAACGGACCGCAACTAAGGCATATAACGTAACACAGGCCTTCGGCAGAAGAGGTCCAGAACAAACACAGGGAAACTTTGGCGATCAAGAGCTGATTAGACAGGGCACAGATTACAAACACTGGCCACAGATCGCGCAGTTTGCACCAAGCGCCTCTGCATTCTTCGGGATGAGTCGGATTGGGATGGAAGTCACTCCATCCGGGACCTGGCTTACCTACACAGGGGCAATAAAACTCGACGACAAAGACCCAAACTTTAAAGATCAGGTCATCCTGCTGAATAAACACATCGATGCCTACAAAACTTTCCCCCCAACCGAACCAAAGAAAGACAAGAAAAAAAAGGCAGACGAAACGCAAGCGCTCCCTCAGCGCCAGAAGAAGCAGCAGACCGTTACACTGTTGCCAGCAGCAGATCTGGATGATTTTTCCAAGCAGCTTCAACAGAGTATGTCAAGCGCTGACAGCACTCAGGCTTGAcgatcg
SEQ ID NO:5:SARS-CoV-2融合物:S1-弗林蛋白酶-N的核酸序列
ggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGATGTCCGATAACGGCCCCCAGAATCAGAGAAACGCTCCCCGCATCACGTTCGGCGGACCAAGTGACAGCACAGGCAGTAACCAGAACGGAGAACGCTCCGGTGCTCGCTCCAAGCAGCGACGGCCGCAAGGGCTTCCCAACAATACCGCCAGCTGGTTTACGGCTCTGACCCAACACGGGAAAGAAGATCTTAAATTCCCCAGGGGCCAGGGCGTCCCTATCAATACTAACTCCAGCCCGGATGATCAGATAGGCTACTATAGACGCGCTACCCGACGGATACGAGGGGGGGACGGCAAAATGAAGGACCTTTCCCCCCGGTGGTATTTCTATTACTTGGGCACCGGACCAGAAGCCGGACTGCCTTACGGCGCTAACAAAGACGGAATAATCTGGGTTGCGACGGAGGGCGCCCTGAATACACCTAAAGACCATATCGGCACAAGAAATCCTGCTAACAATGCCGCGATTGTGCTCCAGCTGCCTCAGGGAACCACGCTGCCTAAAGGGTTTTACGCTGAGGGGTCAAGGGGGGGGAGTCAAGCGTCTAGTAGGTCATCCTCTCGCTCTCGCAATAGTTCCCGGAACTCAACCCCAGGCAGCAGCAGAGGAACCTCTCCCGCACGGATGGCTGGCAATGGGGGAGATGCTGCCCTTGCTCTCCTTCTGCTGGATCGCCTTAACCAGCTCGAATCAAAGATGTCTGGAAAAGGTCAGCAGCAGCAAGGCCAGACCGTGACAAAGAAGAGTGCAGCTGAAGCTAGTAAAAAGCCACGCCAAAAACGGACCGCAACTAAGGCATATAACGTAACACAGGCCTTCGGCAGAAGAGGTCCAGAACAAACACAGGGAAACTTTGGCGATCAAGAGCTGATTAGACAGGGCACAGATTACAAACACTGGCCACAGATCGCGCAGTTTGCACCAAGCGCCTCTGCATTCTTCGGGATGAGTCGGATTGGGATGGAAGTCACTCCATCCGGGACCTGGCTTACCTACACAGGGGCAATAAAACTCGACGACAAAGACCCAAACTTTAAAGATCAGGTCATCCTGCTGAATAAACACATCGATGCCTACAAAACTTTCCCCCCAACCGAACCAAAGAAAGACAAGAAAAAAAAGGCAGACGAAACGCAAGCGCTCCCTCAGCGCCAGAAGAAGCAGCAGACCGTTACACTGTTGCCAGCAGCAGATCTGGATGATTTTTCCAAGCAGCTTCAACAGAGTATGTCAAGCGCTGACAGCACTCAGGCTTGAcgatcg
SEQ ID NO:6:CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-CMV-dsRNA-SPA
TAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgggaccgatccagcctgactctagCctAGCTCtgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGAGGTCGACGGTATCGATGggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGTCCCTGGGAGCTGAGAATTCAGTCGCGTATTCAAACAATTCCATTGCTATTCCTACTAATTTCACTATCTCCGTCACGACCGAGATCCTGCCAGTTTCCATGACTAAGACTTCTGTTGACTGCACCATGTATATCTGTGGCGATAGCACCGAGTGCAGTAATCTGCTTCTGCAGTACGGCTCCTTCTGCACACAACTCAATCGAGCACTGACCGGTATTGCAGTTGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTCTTTGCACAGGTCAAACAAATTTACAAAACCCCCCCCATAAAAGACTTTGGTGGGTTCAACTTCAGCCAAATCCTCCCAGATCCCAGCAAGCCCTCCAAAAGATCCTTCATCGAAGACCTTTTGTTCAATAAGGTAACCCTGGCCGACGCAGGCTTCATCAAACAATATGGCGATTGCCTTGGAGACATTGCTGCGCGCGATTTGATCTGTGCTCAGAAATTTAACGGTTTGACCGTGCTGCCCCCACTTCTGACTGATGAGATGATAGCACAGTATACTTCTGCTCTTCTGGCAGGAACAATCACTTCCGGGTGGACCTTTGGCGCTGGTGCAGCACTGCAAATCCCCTTCGCAATGCAAATGGCCTACCGATTCAATGGTATTGGTGTTACCCAGAACGTGCTCTATGAGAATCAGAAACTCATCGCCAATCAGTTCAATAGCGCTATTGGCAAGATTCAGGATTCCCTCAGCTCTACCGCCAGCGCTCTGGGGAAGCTCCAGGACGTGGTGAACCAAAATGCTCAAGCGCTCAATACCCTTGTGAAACAGCTCAGCTCCAATTTTGGCGCAATTAGCAGCGTTCTGAATGATATTCTGTCCCGGCTGGACAAGGTAGAAGCAGAAGTCCAGATCGACAGGCTGATCACCGGGCGGTTGCAGAGTCTCCAGACCTATGTCACACAACAGCTGATCCGCGCCGCCGAGATCAGGGCTTCCGCTAACCTGGCCGCCACTAAGATGTCCGAATGCGTGTTGGGGCAGAGTAAGCGGGTCGACTTTTGCGGGAAGGGATACCATCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCACCCCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACATATGTGCCCGCTCAGGAAAAGAATTTCACAACCGCACCTGCTATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTTCCTAGAGAAGGAGTTTTCGTATCTAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTTTACGAGCCTCAGATTATAACTACGGACAACACTTTCGTGTCAGGCAACTGTGACGTGGTGATTGGGATCGTGAACAACACAGTCTACGACCCATTGCAGCCCGAGTTGGACTCCTTCAAAGAGGAGCTTGATAAGTATTTCAAGAACCATACCTCTCCCGACGTGGACCTGGGGGACATTAGCGGCATCAATGCATCCGTTGTGAATATCCAGAAAGAAATCGATAGGCTGAATGAGGTCGCAAAAAATCTTAATGAGTCACTGATTGATCTGCAGGAACTCGGCAAATATGAGCAGTATATTAAGTGGCCGTGGTACATATGGCTCGGCTTTATCGCCGGTCTGATTGCCATCGTGATGGTGACCATTATGCTGTGTTGTATGACAAGCTGCTGTTCATGTCTCAAAGGATGCTGCTCCTGCGGTAGCTGCTGTAAGTTCGATGAAGACGACAGTGAGCCCGTGCTCAAAGGAGTGAAACTCCACTACACATAAcgatcgGATATCGCTAGCGTACCGGCGGCCGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTAT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SEQ ID NO:7:CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-b肌动蛋白-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA
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SEQ ID NO:8:CMV-SARS-CoV-2-S1-弗林蛋白酶-N-BGH-CMV-dsRNA-SPA
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SEQ ID NO:9:rAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-CMV-dsRNA-SPA
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SEQ ID NO:10:rAd-CMV-SARS-CoV-2-S-BGH-b肌动蛋白-SARS-CoV-2-N-SPA-BGH-CMV-dsRNA-SPA
TAAGGATCCCATCATCAATAATATACCTTATTTTGGATTGAAGCCAATATGATAATGAGGGGGTGGAGTTTGTGACGTGGCGCGGGGCGTGGGAACGGGGCGGGTGACGTAGTAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGCAAGTGTGGCGGAACACATGTAAGCGACGGATGTGGCAAAAGTGACGTTTTTGGTGTGCGCCGGTGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATACTGCTAGAGATCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACTGGCCACAGGAGCTTGGCCCATTGCATACGTTGTATCCATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAACATTACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTGACTCTAGCCTAGCTCTGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttaggctgctggtctgagcctagGAGATCTCTCGAGGTCGACGGTATCGATGggtaccgccaccATGTTTGTTTTTCTCGTACTCCTGCCCCTGGTTTCCTCCCAATGTGTCAATCTGACTACCCGGACCCAACTTCCTCCCGCCTACACCAATTCCTTTACCCGAGGTGTTTACTACCCAGACAAAGTGTTCAGGTCATCCGTCCTCCATAGTACCCAAGACCTCTTCCTCCCTTTTTTTTCTAACGTTACCTGGTTTCACGCTATTCACGTTAGCGGCACCAACGGCACCAAAAGATTCGATAACCCCGTACTGCCGTTCAACGACGGGGTATATTTTGCCTCTACTGAAAAATCAAACATCATACGCGGATGGATCTTTGGGACTACCCTGGACTCAAAAACTCAGTCCCTGCTGATTGTGAATAACGCTACCAACGTGGTGATCAAAGTCTGTGAATTCCAGTTTTGCAACGATCCTTTTCTCGGCGTTTATTATCACAAAAATAACAAATCCTGGATGGAGAGCGAGTTCCGGGTGTACTCCTCCGCGAATAATTGCACCTTCGAATATGTGTCTCAGCCATTCCTCATGGACCTCGAGGGGAAGCAGGGCAATTTTAAGAATCTGCGAGAATTCGTGTTCAAGAATATAGACGGTTACTTCAAGATTTACTCCAAACACACCCCGATTAACCTGGTTAGGGACTTGCCTCAGGGCTTTTCTGCATTGGAGCCCCTCGTGGACCTCCCAATCGGCATAAACATTACAAGATTTCAGACTTTGCTTGCATTGCACAGGAGCTATTTGACACCCGGCGATTCTTCTTCCGGATGGACCGCTGGAGCAGCTGCTTATTACGTGGGCTATCTGCAGCCTCGAACCTTTCTTTTGAAGTACAACGAAAATGGAACTATCACCGATGCAGTTGACTGCGCCCTGGACCCCCTGTCCGAAACTAAGTGCACGCTCAAAAGTTTCACAGTAGAGAAGGGGATATACCAGACTAGCAATTTCCGCGTTCAGCCAACCGAAAGTATAGTGCGCTTTCCTAATATAACTAACCTGTGTCCTTTCGGGGAAGTGTTTAACGCCACTAGATTCGCTTCCGTCTACGCCTGGAATAGAAAGAGGATCTCAAATTGCGTTGCTGACTATAGTGTTTTGTACAATTCCGCCTCTTTCTCAACCTTCAAATGTTACGGGGTGAGCCCTACCAAACTGAACGACCTGTGCTTTACAAACGTATACGCCGACAGCTTTGTTATCAGAGGAGACGAGGTTCGCCAGATTGCTCCGGGTCAGACAGGCAAGATTGCTGATTATAATTACAAACTGCCCGACGACTTTACAGGATGTGTGATCGCGTGGAACAGTAACAATCTTGACTCAAAGGTTGGGGGTAATTATAATTATCTTTACCGGCTGTTCAGAAAAAGCAATTTGAAACCCTTCGAAAGGGACATATCCACCGAGATCTATCAGGCCGGGTCCACTCCATGCAATGGTGTGGAAGGTTTTAATTGCTACTTCCCATTGCAGTCTTATGGATTCCAACCAACCAATGGCGTAGGCTACCAGCCGTATCGCGTTGTCGTGCTCAGCTTCGAGCTGCTCCACGCCCCCGCGACCGTATGCGGTCCTAAGAAGTCCACCAATCTTGTTAAGAACAAGTGTGTAAACTTTAACTTTAACGGGCTGACCGGGACCGGCGTTCTGACTGAATCTAACAAAAAATTCCTGCCTTTCCAGCAGTTCGGCCGCGATATTGCTGACACCACTGACGCTGTAAGAGACCCTCAGACCCTTGAAATTCTCGATATCACACCTTGCAGCTTTGGGGGCGTGTCCGTCATCACTCCAGGAACTAACACAAGCAACCAGGTGGCAGTGTTGTACCAGGATGTTAATTGTACCGAGGTGCCAGTGGCCATCCACGCCGATCAATTGACACCTACCTGGAGGGTTTACAGCACAGGGTCCAATGTTTTTCAGACAAGAGCCGGATGTCTGATCGGTGCCGAGCATGTCAACAATTCCTACGAGTGTGATATCCCCATTGGTGCGGGAATTTGTGCATCATATCAGACCCAGACTAATAGCCCAAGAAGAGCTAGATCCGTCGCTAGTCAATCCATCATTGCATATACAATGTCCCTGGGAGCTGAGAATTCAGTCGCGTATTCAAACAATTCCATTGCTATTCCTACTAATTTCACTATCTCCGTCACGACCGAGATCCTGCCAGTTTCCATGACTAAGACTTCTGTTGACTGCACCATGTATATCTGTGGCGATAGCACCGAGTGCAGTAATCTGCTTCTGCAGTACGGCTCCTTCTGCACACAACTCAATCGAGCACTGACCGGTATTGCAGTTGAGCAGGACAAGAACACACAGGAGGTCTTTGCACAGGTCAAACAAATTTACAAAACCCCCCCCATAAAAGACTTTGGTGGGTTCAACTTCAGCCAAATCCTCCCAGATCCCAGCAAGCCCTCCAAAAGATCCTTCATCGAAGACCTTTTGTTCAATAAGGTAACCCTGGCCGACGCAGGCTTCATCAAACAATATGGCGATTGCCTTGGAGACATTGCTGCGCGCGATTTGATCTGTGCTCAGAAATTTAACGGTTTGACCGTGCTGCCCCCACTTCTGACTGATGAGATGATAGCACAGTATACTTCTGCTCTTCTGGCAGGAACAATCACTTCCGGGTGGACCTTTGGCGCTGGTGCAGCACTGCAAATCCCCTTCGCAATGCAAATGGCCTACCGATTCAATGGTATTGGTGTTACCCAGAACGTGCTCTATGAGAATCAGAAACTCATCGCCAATCAGTTCAATAGCGCTATTGGCAAGATTCAGGATTCCCTCAGCTCTACCGCCAGCGCTCTGGGGAAGCTCCAGGACGTGGTGAACCAAAATGCTCAAGCGCTCAATACCCTTGTGAAACAGCTCAGCTCCAATTTTGGCGCAATTAGCAGCGTTCTGAATGATATTCTGTCCCGGCTGGACAAGGTAGAAGCAGAAGTCCAGATCGACAGGCTGATCACCGGGCGGTTGCAGAGTCTCCAGACCTATGTCACACAACAGCTGATCCGCGCCGCCGAGATCAGGGCTTCCGCTAACCTGGCCGCCACTAAGATGTCCGAATGCGTGTTGGGGCAGAGTAAGCGGGTCGACTTTTGCGGGAAGGGATACCATCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCACCCCACGGAGTAGTGTTCCTCCACGTCACATATGTGCCCGCTCAGGAAAAGAATTTCACAACCGCACCTGCTATCTGTCACGACGGCAAGGCCCACTTTCCTAGAGAAGGAGTTTTCGTATCTAACGGCACCCACTGGTTCGTGACACAGCGGAACTTTTACGAGCCTCAGATTATAACTACGGACAACACTTTCGTGTCAGGCAACTGTGACGTGGTGATTGGGATCGTGAACAACACAGTCTACGACCCATTGCAGCCCGAGTTGGACTCCTTCAAAGAGGAGCTTGATAAGTATTTCAAGAACCATACCTCTCCCGACGTGGACCTGGGGGACATTAGCGGCATCAATGCA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SEQ ID NO:11:rAd-CMV-SARS-CoV-2-S1-弗林蛋白酶-N-BGH-CMV-dsRNA-SPA
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GGTGAGCTCCTCGCTTGGTCTCCGTCCGGACGGGACATTTCAGATCGGCGGCGCCGGCCGCTCTTCATTCACGCCTCGTCAGGCAATCCTAACTCTGCAGACCTCGTCCTCTGAGCCGCGCTCTGGAGGCATTGGAACTCTGCAATTTATTGAGGAGTTTGTGCCATCGGTCTACTTTAACCCCTTCTCGGGACCTCCCGGCCACTATCCGGATCAATTTATTCCTAACTTTGACGCGGTAAAGGACTCGGCGGACGGCTACGACTGAATGTTAAGTGGAGAGGCAGAGCAACTGCGCCTGAAACACCTGGTCCACTGTCGCCGCCACAAGTGCTTTGCCCGCGACTCCGGTGAGTTTTGCTACTTTGAATTGCCCGAGGATCATATCGAGGGCCCGGCGCACGGCGTCCGGCTTACCGCCCAGGGAGAGCTTGCCCGTAGCCTGATTCGGGAGTTTACCCAGCGCCCCCTGCTAGTTGAGCGGGACAGGGGACCCTGTGTTCTCACTGTGATTTGCAACTGTCCTAACCCTGGATTACATCAAGATCCTCTAGTTAATGTCAGGTCGCCTAAGTCGATTAACTAGAGTACCCGGGGATCTTATTCCCTTTAACTAATAAAAAAAAATAATAAAGCATCACTTACTTAAAATCAGTTAGCAAATTTCTGTCCAGTTTATTCAGCAGCACCTCCTTGCCCTCCTCCCAGCTCTGGTATTGCAGCTTCCTCCTGGCTGCAAACTTTCTCCACAATCTAAATGGAATGTCAGTTTCCTCCTGTTCCTGTCCATCCGCACCCACTATCTTCATGTTGTTGCAGATGAAGCGCGCAAGACCGTCTGAAGATACCTTCAACCCCGTGTATCCATATGACACGGAAACCGGTCCTCCAACTGTGCCTTTTCTTACTCCTCCCTTTGTATCCCCCAATGGGTTTCAAGAGAGTCCCCCTGGGGTACTCTCTTTGCGCCTATCCGAACCTCTAGTTACCTCCAATGGCATGCTTGCGCTCAAAATGGGCAACGGCCTCTCTCTGGACGAGGCCGGCAACCTTACCTCCCAAAATGTAACCACTGTGAGCCCACCTCTCAAAAAAACCAAGTCAAACATAAACCTGGAAATATCTGCACCCCTCACAGTTACCTCAGAAGCCCTAACTGTGGCTGCCGCCGCACCTCTAATGGTCGCGGGCAACACACTCACCATGCAATCACAGGCCCCGCTAACCGTGCACGACTCCAAACTTAGCATTGCCACCCAAGGACCCCTCACAGTGTCAGAAGGAAAGCTAGCCCTGCAAACATCAGGCCCCCTCACCACCACCGATAGCAGTACCCTTACTATCACTGCCTCACCCCCTCTAACTACTGCCACTGGTAGCTTGGGCATTGACTTGAAAGAGCCCATTTATACACAAAATGGAAAACTAGGACTAAAGTACGGGGCTCCTTTGCATGTAACAGACGACCTAAACACTTTGACCGTAGCAACTGGTCCAGGTGTGACTATTAATAATACTTCCTTGCAAACTAAAGTTACTGGAGCCTTGGGTTTTGATTCACAAGGCAATATGCAACTTAATGTAGCAGGAGGACTAAGGATTGATTCTCAAAACAGACGCCTTATACTTGATGTTAGTTATCCGTTTGATGCTCAAAACCAACTAAATCTAAGACTAGGACAGGGCCCTCTTTTTATAAACTCAGCCCACAACTTGGATATTAACTACAACAAAGGCCTTTACTTGTTTACAGCTTCAAACAATTCCAAAAAGCTTGAGGTTAACCTAAGCACTGCCAAGGGGTTGATGTTTGACGCTACAGCCATAGCCATTAATGCAGGAGATGGGCTTGAATTTGGTTCACCTAATGCACCAAACACAAATCCCCTCAAAACAAAAATTGGCCATGGCCTAGAATTTGATTCAAACAAGGCTATGGTTCCTAAACTAGGAACTGGCCTTAGTTTTGACAGCACAGGTGCCATTACAGTAGGAAACAAAAATAATGATAAGCTAACTTTGTGGACCACACCAGCTCCATCTCCTAACTGTAGACTAAATGCAGAGAAAGATGCTAAACTCACTTTGGTCTTAACAAAATGTGGCAGTCAAATACTTGCTACAGTTTCAGTTTTGGCTGTTAAAGGCAGTTTGGCTCCAATATCTGGAACAGTTCAAAGTGCTCATCTTATTATAAGATTTGACGAAAATGGAGTGCTACTAAACAATTCCTTCCTGGACCCAGAATATTGGAACTTTAGAAATGGAGATCTTACTGAAGGCACAGCCTATACAAACGCTGTTGGATTTATGCCTAACCTATCAGCTTATCCAAAATCTCACGGTAAAACTGCCAAAAGTAACATTGTCAGTCAAGTTTACTTAAACGGAGACAAAACTAAACCTGTAACACTAACCATTACACTAAACGGTACACAGGAAACAGGAGACACAACTCCAAGTGCATACTCTATGTCATTTTCATGGGACTGGTCTGGCCACAACTACATTAATGAAATATTTGCCACATCCTCTTACACTTTTTCATACATTGCCCAAGAATAAAGAATCGTTTGTGTTATGTTTCAACGTGTTTATTTTTCAATTGCAGAAAATTTCAAGTCATTTTTCATTCAGTAGTATAGCCCCACCACCACATAGCTTATACAGATCACCGTACCTTAATCAAACTCACAGAACCCTAGTATTCAACCTGCCACCTCCCTCCCAACACACAGAGTACACAGTCCTTTCTCCCCGGCTGGCCTTAAAAAGCATCATATCATGGGTAACAGACATATTCTTAGGTGTTATATTCCACACGGTTTCCTGTCGAGCCAAACGCTCATCAGTGATATTAATAAACTCCCCGGGCAGCTCACTTAAGTTCATGTCGCTGTCCAGCTGCTGAGCCACAGGCTGCTGTCCAACTTGCGGTTGCTTAACGGGCGGCGAAGGAGAAGTCCACGCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCGTGCATCAGGATAGGGCGGTGGTGCTGCAGCAGCGCGCGAATAAACTGCTGCCGCCGCCGCTCCGTCCTGCAGGAATACAACATGGCAGTGGTCTCCTCAGCGATGATTCGCACCGCCCGCAGCATAAGGCGCCTTGTCCTCCGGGCACAGCAGCGCACCCTGATCTCACTTAAATCAGCACAGTAACTGCAGCACAGCACCACAATATTGTTCAAAATCCCACAGTGCAAGGCGCTGTATCCAAAGCTCATGGCGGGGACCACAGAACCCACGTGGCCATCATACCACAAGCGCAGGTAGATTAAGTGGCGACCCCTCATAAACACGCTGGACATAAACATTACCTCTTTTGGCATGTTGTAATTCACCACCTCCCGGTACCATATAAACCTCTGATTAAACATGGCGCCATCCACCACCATCCTAAACCAGCTGGCCAAAACCTGCCCGCCGGCTATACACTGCAGGGAACCGGGACTGGAACAATGACAGTGGAGAGCCCAGGACTCGTAACCATGGATCATCATGCTCGTCATGATATCAATGTTGGCACAACACAGGCACACGTGCATACACTTCCTCAGGATTACAAGCTCCTCCCGCGTTAGAACCATATCCCAGGGAACAACCCATTCCTGAATCAGCGTAAATCCCACACTGCAGGGAAGACCTCGCACGTAACTCACGTTGTGCATTGTCAAAGTGTTACATTCGGGCAGCAGCGGATGATCCTCCAGTATGGTAGCGCGGGTTTCTGTCTCAAAAGGAGGTAGACGATCCCTACTGTACGGAGTGCGCCGAGACAACCGAGATCGTGTTGGTCGTAGTGTCATGCCAAATGGAACGCCGGACGTAGTCATATTTCCTGAAGCAAAACCAGGTGCGGGCGTGACAAACAGATCTGCGTCTCCGGTCTCGCCGCTTAGATCGCTCTGTGTAGTAGTTGTAGTATATCCACTCTCTCAAAGCATCCAGGCGCCCCCTGGCTTCGGGTTCTATGTAAACTCCTTCATGCGCCGCTGCCCTGATAACATCCACCACCGCAGAATAAGCCACACCCAGCCAACCTACACATTCGTTCTGCGAGTCACACACGGGAGGAGCGGGAAGAGCTGGAAGAACCATGTTTTTTTTTTTATTCCAAAAGATTATCCAAAACCTCAAAATGAAGATCTATTAAGTGAACGCGCTCCCCTCCGGTGGCGTGGTCAAACTCTACAGCCAAAGAACAGATAATGGCATTTGTAAGATGTTGCACAATGGCTTCCAAAAGGCAAACGGCCCTCACGTCCAAGTGGACGTAAAGGCTAAACCCTTCAGGGTGAATCTCCTCTATAAACATTCCAGCACCTTCAACCATGCCCAAATAATTCTCATCTCGCCACCTTCTCAATATATCTCTAAGCAAATCCCGAATATTAAGTCCGGCCATTGTAAAAATCTGCTCCAGAGCGCCCTCCACCTTCAGCCTCAAGCAGCGAATCATGATTGCAAAAATTCAGGTTCCTCACAGACCTGTATAAGATTCAAAAGCGGAACATTAACAAAAATACCGCGATCCCGTAGGTCCCTTCGCAGGGCCAGCTGAACATAATCGTGCAGGTCTGCACGGACCAGCGCGGCCACTTCCCCGCCAGGAACCATGACAAAAGAACCCACACTGATTATGACACGCATACTCGGAGCTATGCTAACCAGCGTAGCCCCGATGTAAGCTTGTTGCATGGGCGGCGATATAAAATGCAAGGTGCTGCTCAAAAAATCAGGCAAAGCCTCGCGCAAAAAAGAAAGCACATCGTAGTCATGCTCATGCAGATAAAGGCAGGTAAGCTCCGGAACCACCACAGAAAAAGACACCATTTTTCTCTCAAACATGTCTGCGGGTTTCTGCATAAACACAAAATAAAATAACAAAAAAACATTTAAACATTAGAAGCCTGTCTTACAACAGGAAAAACAACCCTTATAAGCATAAGACGGACTACGGCCATGCCGGCGTGACCGTAAAAAAACTGGTCACCGTGATTAAAAAGCACCACCGACAGCTCCTCGGTCATGTCCGGAGTCATAATGTAAGACTCGGTAAACACATCAGGTTGATTCACATCGGTCAGTGCTAAAAAGCGACCGAAATAGCCCGGGGGAATACATACCCGCAGGCGTAGAGACAACATTACAGCCCCCATAGGAGGTATAACAAAATTAATAGGAGAGAAAAACACATAAACACCTGAAAAACCCTCCTGCCTAGGCAAAATAGCACCCTCCCGCTCCAGAACAACATACAGCGCTTCCACAGCGGCAGCCATAACAGTCAGCCTTACCAGTAAAAAAGAAAACCTATTAAAAAAACACCACTCGACACGGCACCAGCTCAATCAGTCACAGTGTAAAAAAGGGCCAAGTGCAGAGCGAGTATATATAGGACTAAAAAATGACGTAACGGTTAAAGTCCACAAAAAACACCCAGAAAACCGCACGCGAACCTACGCCCAGAAACGAAAGCCAAAAAACCCACAACTTCCTCAAATCGTCACTTCCGTTTTCCCACGTTACGTCACTTCCCATTTTAAGAAAACTACAATTCCCAACACATACAAGTTACTCCGCCCTAAAACCTACGTCACCCGCCCCGTTCCCACGCCCCGCGCCACGTCACAAACTCCACCCCCTCATTATCATATTGGCTTCAATCCAAAATAAGGTATATT
SEQ ID NO:12:S1-N的氨基酸序列
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMMSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA
SEQ ID NO:13:TLR-3激动剂的序列
GAAACGATATGGGCTGAATACTTAAGTATTCAGCCCATATCGTTTC
SEQ ID NO:14:TLR-3激动剂的序列
CGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCGCCCTTAGATATCGTCGACGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACATCGATGATATCTAAAGGGCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTCAGCTGCGGATCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTTCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTATCGAATTCAAGCTTGTCGACTCGAAGATCCTAGACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGCCCTTTAGATATCATCGATGTCTCGGCGGTGGTGGCGCGTCGCGCCGCTGGGTTTTATAGGGCGCCGCCGCGGCCGCTCGAGCCATAAAAGGCAACTTTCGGAACGGCGCACGCTGATTGGCCCCGCGCCGCTCACTCACCGGCTTCGCCGCACAGTGCAGCATTTTTTTACCCCCTCTCCCCTCCTTTTGCGAAAAAAAAAAAGAGCGAGAGCGAGATTGAGGAAGAGGAGGAGGGAGAGTTTTGGCGTTGGCCGCCTTGGGGTGCTGGGCGTCGACGATATCTAAGGGCGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCG
SEQ ID NO:15:TLR-3激动剂的序列
CGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCGCCCTTAGATATCGTCGACGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACATCGATGATATCTAAAGGGCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTCAGCTGCGGATCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTTCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTATCGAATTCAAGCTTGTCGACTCGAAGATCGTACACAGGAAGTGACAATTTTCGCGCGGTTTTAGGCGGATGTTGTAGTAAATTTGGGCGTAACCGAGTAAGATTTGGCCATTTTCGCGGGAAAACTGAATAAGAGGAAGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGCGCGTAATACTGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCGCCCTTAGATATCGTCGACGCCCAGCACCCCAAGGCGGCCAACGCCAAAACTCTCCCTCCTCCTCTTCCTCAATCTCGCTCTCGCTCTTTTTTTTTTTCGCAAAAGGAGGGGAGAGGGGGTAAAAAAATGCTGCACTGTGCGGCGAAGCCGGTGAGTGAGCGGCGCGGGGCCAATCAGCGTGCGCCGTTCCGAAAGTTGCCTTTTATGGCTCGAGCGGCCGCGGCGGCGCCCTATAAAACCCAGCGGCGCGACGCGCCACCACCGCCGAGACATCGATGATATCTAAAGGGCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGATCCGCAGCTGAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGCATGCATCTAGAAATAAAATATCTTTATTTTCATTACATCTGTGTGTTGGTTTTTTGTGTGGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTA
SEQ ID NO:16:TLR-3激动剂的序列
GATGGTGCTTCAAGCTAGTACTTAAGTACTAGCTTGAAGCACCATC
SEQ ID NO:17:TLR-3激动剂的序列
GATGGTGCTTCAAGCTAGTACGGATCCGTACTAGCTTGAAGCACCATC
SEQ ID NO:18:TLR-3激动剂的序列
GAAACGATATGGGCTGAATACGGATCCGTATTCAGCCCATATCGTTTC
SEQ ID NO:19:TLR-3激动剂的序列
CCTAATAATTATCAAAATGTGGATCCACATTTTGATAATTATTAGG
SEQ ID NO:20:TLR-3激动剂的序列
CCTAATAATTATCAAAATGTAATTACATTTTGATAATTATTAGG
SEQ ID NO:21
UK B.1.1.7S蛋白变体
GISAID登陆#EPI_ISL_601443
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAISGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIDDTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSHRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPINFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILARLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTHNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID NO:22
南非B.1.351 501Y.V2 S蛋白变体
GISAID登陆#EPI_ISL_678597
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFANPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRGLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGNIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQGVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGVENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT*
SEQ ID NO:23
UK B.1.1.7S蛋白变体GISAID登陆#epi_isl_601443，人类密码子优化的核酸序列：
ATGTTTGTTTTCTTGGTGCTCCTTCCACTGGTGTCCTCCCAGTGTGTGAACCTCACCACTCGCACGCAACTGCCCCCAGCCTACACGAACTCTTTCACCCGAGGGGTATATTACCCTGATAAAGTCTTCAGGTCCTCTGTTCTCCATAGCACTCAGGATCTTTTCCTGCCTTTCTTTAGCAACGTAACTTGGTTTCACGCAATTTCAGGCACGAACGGCACGAAGAGATTTGATAACCCAGTGCTCCCTTTCAATGACGGCGTTTACTTCGCTTCTACCGAGAAAAGCAACATCATCAGGGGATGGATTTTCGGGACAACATTGGATTCAAAGACCCAGAGCCTTCTCATTGTGAATAATGCCACGAACGTGGTAATCAAGGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCATTCCTTGGAGTTTACCACAAAAACAATAAGAGCTGGATGGAGAGCGAGTTTAGAGTGTATAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTTGAGTACGTTAGCCAACCCTTTCTGATGGACCTGGAGGGCAAACAGGGAAACTTTAAGAACCTCCGCGAATTCGTTTTCAAGAACATTGATGGGTATTTTAAGATATACTCTAAGCATACCCCTATTAACTTGGTGCGAGATCTTCCTCAGGGGTTCAGCGCGCTCGAACCTCTCGTGGACTTGCCTATTGGTATCAACATCACCCGATTCCAGACCCTGCTGGCTCTGCACAGGTCATACTTGACTCCCGGCGATTCATCCAGCGGATGGACTGCGGGTGCCGCCGCATATTATGTGGGCTACTTGCAGCCACGAACCTTTCTTTTGAAATATAACGAGAATGGCACAATCACCGACGCCGTTGATTGCGCCCTGGATCCCCTTTCCGAGACGAAGTGTACGCTGAAGTCTTTCACAGTGGAAAAGGGAATCTACCAGACATCAAACTTCCGCGTCCAACCTACCGAGTCAATAGTGCGCTTCCCAAATATCACCAATCTCTGCCCCTTTGGGGAAGTGTTTAATGCCACCCGGTTCGCTTCTGTCTATGCCTGGAACAGGAAGCGCATTTCAAACTGCGTTGCTGACTATTCCGTGCTGTATAACTCTGCAAGCTTTTCTACCTTTAAGTGCTATGGTGTTAGTCCGACAAAACTGAATGATCTGTGCTTTACCAACGTTTACGCCGACTCATTCGTGATTCGAGGAGATGAGGTCAGACAAATTGCTCCTGGGCAGACCGGCAAAATCGCCGACTACAACTATAAGTTGCCTGATGACTTCACCGGCTGCGTGATTGCCTGGAACTCTAACAACCTTGATTCTAAAGTCGGAGGGAACTATAATTACCTCTATCGCCTCTTTAGAAAGTCTAATCTGAAGCCGTTTGAGAGAGATATCTCTACGGAAATATACCAGGCCGGATCAACTCCTTGTAACGGCGTAGAGGGCTTCAACTGCTATTTTCCACTGCAATCCTACGGGTTCCAACCTACTTACGGAGTGGGCTATCAACCCTACAGGGTTGTGGTGCTGTCATTTGAGCTGCTCCACGCACCTGCTACCGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCAACCAACCTGGTCAAGAACAAGTGCGTGAATTTCAATTTTAACGGTCTGACCGGAACAGGGGTGCTCACAGAGTCAAACAAGAAGTTTCTGCCCTTCCAGCAGTTCGGGCGCGATATTGATGACACTACCGACGCAGTTCGCGACCCTCAGACTCTTGAGATTCTTGATATCACTCCCTGCAGCTTTGGGGGGGTTTCAGTCATCACCCCAGGCACTAACACATCCAATCAAGTGGCCGTGCTGTATCAGGGAGTCAATTGCACCGAGGTCCCAGTGGCAATCCACGCGGATCAACTCACACCAACATGGAGAGTGTACAGCACCGGGTCTAATGTGTTCCAAACTAGAGCCGGTTGTCTCATTGGCGCAGAACACGTGAACAACAGCTACGAGTGCGACATTCCAATTGGAGCCGGAATCTGTGCCTCTTACCAAACACAGACCAACTCCCACAGACGGGCTCGATCTGTGGCCTCCCAAAGCATTATCGCTTACACGATGAGTCTGGGTGCAGAGAATAGCGTTGCCTACAGTAATAATTCTATCGCTATACCTATCAATTTCACCATCTCTGTAACCACTGAGATCCTTCCAGTCAGTATGACGAAGACTTCTGTTGACTGCACAATGTATATATGCGGAGATTCCACAGAGTGCAGTAACCTGCTGCTGCAATATGGCTCCTTTTGCACTCAGCTCAATAGGGCCCTTACAGGAATCGCCGTGGAGCAAGACAAGAATACTCAAGAAGTCTTCGCGCAGGTGAAGCAGATCTACAAAACGCCTCCTATAAAAGACTTTGGCGGGTTCAATTTTTCCCAGATCTTGCCTGATCCCTCAAAACCCTCTAAGAGATCCTTCATCGAGGATCTTCTGTTTAATAAGGTCACCCTGGCAGACGCAGGCTTCATTAAGCAGTACGGAGACTGCCTCGGGGACATCGCTGCAAGAGACCTTATTTGTGCCCAGAAGTTTAATGGACTCACCGTACTTCCACCACTGCTCACAGATGAGATGATTGCACAGTACACCTCTGCCCTGCTTGCCGGCACTATCACCAGCGGCTGGACTTTCGGAGCCGGAGCTGCCCTTCAGATCCCTTTCGCCATGCAGATGGCATATAGATTCAACGGGATCGGAGTCACCCAGAACGTGCTTTACGAAAATCAGAAACTGATCGCGAACCAATTCAACAGTGCCATCGGCAAGATCCAGGATAGCCTCTCATCCACTGCGAGTGCGTTGGGGAAACTGCAAGATGTGGTCAATCAGAATGCGCAGGCCCTCAACACGCTGGTGAAGCAGCTCTCCTCTAATTTCGGGGCTATCAGCTCTGTTCTGAACGATATCTTGGCTAGACTGGATAAGGTGGAGGCTGAAGTTCAGATTGATAGATTGATTACTGGCCGGCTGCAGTCACTCCAGACTTATGTTACGCAGCAGTTGATTCGCGCTGCGGAGATACGGGCCTCAGCTAATCTTGCCGCTACTAAGATGTCCGAGTGTGTGTTGGGGCAATCCAAACGCGTGGATTTCTGCGGCAAAGGTTACCATCTTATGTCATTCCCCCAGAGCGCCCCTCACGGAGTGGTTTTTCTCCATGTGACATATGTCCCAGCCCAGGAAAAAAATTTTACCACAGCCCCAGCTATATGCCACGACGGCAAAGCTCACTTTCCTCGCGAGGGGGTCTTCGTATCCAACGGCACACACTGGTTTGTAACCCAGAGGAATTTCTACGAACCGCAGATCATCACAACTCATAACACGTTTGTTTCCGGTAATTGTGATGTAGTAATCGGCATCGTTAATAATACAGTGTATGATCCTCTTCAACCCGAACTGGATAGCTTCAAGGAGGAACTCGATAAGTACTTCAAGAATCACACTTCTCCTGACGTGGACCTTGGTGATATATCCGGCATAAATGCTAGTGTGGTGAACATCCAAAAAGAGATAGACAGGCTCAATGAGGTTGCTAAGAATTTGAACGAATCTCTTATCGACCTCCAGGAGCTCGGCAAGTACGAGCAGTATATTAAGTGGCCTTGGTACATCTGGCTGGGTTTCATCGCTGGCTTGATAGCAATCGTAATGGTCACCATTATGTTGTGCTGCATGACTTCCTGTTGTAGCTGTCTCAAAGGGTGTTGCAGCTGTGGCTCATGCTGCAAATTTGACGAAGATGACTCTGAACCAGTCCTCAAGGGCGTCAAGCTTCACTACACGTGA
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应当理解，本文所描述的实例和实施方案仅用于说明目的，并且将向本领域技术人员建议根据其进行的各种修改或改变，并且将包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均在此通过引用整体并入本文中，用于所有目的。

Claims (61)

1.嵌合腺病毒表达载体，其包含包括以下元件的表达盒：
(a)第一启动子，其与编码第一严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)蛋白的核酸可操作地连接；
(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接；和
(c)第三启动子，其与编码SARS-CoV-2N蛋白的核酸可操作地连接。
2.如权利要求1所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述SARS-CoV-2N蛋白包含与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的嵌合腺病毒表达载体，其中元件(c)位于所述表达盒中的元件(a)和元件(b)之间。
4.如权利要求1-3中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一SARS-CoV-2蛋白包含SARS-CoV-2S蛋白，其具有与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述编码TLR-3激动剂的核酸包含编码dsRNA的核酸。
6.如权利要求1-4中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述编码TLR-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：SEQ ID NO:13-20。
7.如权利要求1-6中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中元件(a)中的编码所述第一SARS-CoV-2蛋白的核酸包含与SEQ ID NO:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。
8.如权利要求1-7中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述编码SARS-CoV-2N蛋白的核酸包含与SEQ ID NO:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。
9.如权利要求1-25中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
10.如权利要求9所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一启动子和所述第二启动子各自是CMV启动子。
11.如权利要求1-10中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一启动子是CMV启动子，所述第二启动子是CMV启动子，并且所述第三启动子是β-肌动蛋白启动子。
12.如权利要求1所述的嵌合腺病毒表达载体，其中元件(c)位于元件(a)和元件(b)之间，并且元件(a)、元件(c)和元件(b)一起由与SEQ IDNO:7至少85％、至少90％或至少95％相同的序列编码，或者由SEQ IDNO:7的序列编码。
13.如权利要求1所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述嵌合腺病毒表达载体包含与SEQ ID NO:10至少85％、至少90％或至少95％相同的序列，或者包含SEQ ID NO:10的序列。
14.嵌合腺病毒表达载体，其包含包括以下元件的表达盒：
(a)第一启动子，其与编码包含SARS-CoV-2S蛋白的S1区、弗林蛋白酶位点和SARS-CoV-2N蛋白的融合蛋白的核酸可操作地连接；和
(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接。
15.如权利要求14所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:12的序列具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
16.如权利要求14或15所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述编码SARS-CoV-2融合蛋白的核酸与SEQ ID NO:5至少85％、至少90％或至少95％相同，或者包括SEQ ID NO:5。
17.如权利要求14-16中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
18.如权利要求17所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一启动子和所述第二启动子各自是CMV启动子。
19.如权利要求14-18中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中元件(a)和元件(b)一起由SEQ ID NO:8的序列编码，或者由与SEQ IDNO:8至少85％、至少90％或至少95％相同的序列编码。
20.如权利要求14-19中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述嵌合腺病毒表达载体由SEQ ID NO:11的序列编码，或者由与SEQ ID NO:11至少85％、至少90％或至少95％相同的序列编码。
21.嵌合腺病毒表达载体，其包含包括以下元件的表达盒：
(a)第一启动子，其与编码SARS-CoV-2S蛋白的核酸可操作地连接；和
(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接。
22.如权利要求21所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述SARS-CoV-2S蛋白与SEQ IDNO:1、21或22中的任一个具有至少95％、96％、97％、98％或99％。
23.如权利要求21所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述SARS-CoV-2S蛋白包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:21或SEQ IDNO:22的序列。
24.如权利要求21-23中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述编码SARS-CoV-2S蛋白的核酸与SEQ ID NO:3的多核苷酸序列至少85％、90％或95％相同，或者包含SEQ IDNO:3的序列。
25.如权利要求21-24中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一启动子和所述第二启动子是相同的。
26.如权利要求25所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一启动子和所述第二启动子各自是CMV启动子。
27.如权利要求21-26中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中元件(a)和元件(b)一起由SEQ ID NO:6的序列编码，或者由与SEQ IDNO:6具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列编码。
28.如权利要求21-27中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述嵌合腺病毒表达载体由与SEQ ID NO:9具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的序列编码，或者由SEQID NO:9的序列编码。
29.免疫原性组合物，其包含权利要求1-28中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体和药学上可接受的载体。
30.用于在对象中引发针对SARS-CoV-2蛋白的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫原性有效量的权利要求1-28中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，或者向哺乳动物对象施用权利要求29所述的免疫原性组合物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述施用途径为口服、鼻内或粘膜施用。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述施用途径为通过吞服药片口服递送。
33.如权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述免疫应答在所述对象的肺泡细胞、吸收性肠上皮细胞、纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和/或气道基底细胞中引发。
34.如权利要求30-33中任一项所述的方法，其中所述对象是人类。
35.嵌合多核苷酸，其包含包括以下元件的表达盒：
(a)第一启动子，其与编码抗原蛋白的核酸可操作地连接；
(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接；和
(c)第三启动子，其与编码SARS-CoV-2N蛋白的核酸可操作地连接。
36.如权利要求35所述的嵌合多核苷酸，其中所述SARS-CoV-2N蛋白与SEQ ID NO:2具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
37.如权利要求35或36所述的嵌合多核苷酸，其中所述嵌合多核苷酸是嵌合腺病毒表达载体。
38.如权利要求35-37中任一项的权利要求所述的嵌合多核苷酸，其中编码所述TLR-3激动剂的核酸包含编码dsRNA的核酸。
39.如权利要求35-37中任一项的权利要求所述的嵌合多核苷酸，其中所述编码TLR-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：SEQ IDNO:13-20。
40.如权利要求35-37中任一项的权利要求所述的嵌合多核苷酸，其中元件(c)位于所述表达盒中的元件(a)和元件(b)之间。
41.如权利要求35-40中任一项所述的方法，其中所述抗原蛋白来自细菌、真菌、病毒或寄生虫。
42.如权利要求35-40中任一项所述的方法，其中所述抗原蛋白是癌症抗原。
43.在对象中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求35-42中任一项所述的嵌合多核苷酸。
44.嵌合腺病毒表达载体，其包含包括以下元件的表达盒：
(a)第一启动子，其与编码第一严重急性呼吸***综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)蛋白的核酸可操作地连接；和
(b)第二启动子，其与编码toll样受体-3(TLR-3)激动剂的核酸可操作地连接。
45.如权利要求44所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述编码TLR-3激动剂的核酸包含编码dsRNA的核酸。
46.如权利要求44所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述编码TLR-3激动剂的核酸包含选自以下的序列：SEQ ID NO:13-20。
47.如权利要求44-46中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其还包含元件(c)第三启动子，所述第三启动子与编码第二SARS-CoV-2蛋白的核酸可操作地连接。
48.如权利要求47所述的嵌合腺病毒表达载体，其中元件(c)被置于所述表达盒中的元件(a)和元件(b)之间。
49.如权利要求47或48所述的嵌合腺病毒表达载体，其中(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白和(c)中的第二SARS-CoV-2蛋白不同。
50.如权利要求47或48所述的嵌合腺病毒表达载体，其中(a)中的SARS-CoV-2蛋白和(c)中的SARS-CoV-2蛋白相同。
51.如权利要求44-50中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中编码元件(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的第二SARS-CoV-2蛋白的核酸包含与SEQID NO:3的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。
52.如权利要求51所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一SARS-CoV-2蛋白和/或所述第二SARS-CoV-2蛋白包含SARS-CoV-2S蛋白，其具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。
53.如权利要求44-52中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中编码元件(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的第二SARS-CoV-2蛋白的核酸包含与SEQID NO:4的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。
54.如权利要求53所述的嵌合腺病毒表达载体，其中所述第一SARS-CoV-2蛋白和/或所述第二SARS-CoV-2蛋白包含SARS-CoV-2N蛋白，其具有与SEQ ID NO:2的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。
55.如权利要求44-54中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，其中编码元件(a)中的第一SARS-CoV-2蛋白的核酸和/或编码元件(c)中的第二SARS-CoV-2蛋白的核酸包含与SEQID NO:5的序列具有至少85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的序列。
56.免疫原性组合物，其包含权利要求44-55中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体和药学上可接受的载体。
57.用于在对象中引发针对SARS-CoV-2蛋白的免疫应答的方法，其包括向所述对象施用免疫原性有效量的权利要求44-55中任一项所述的嵌合腺病毒表达载体，或者向哺乳动物对象施用权利要求56所述的免疫原性组合物。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述施用途径为口服、鼻内或粘膜施用。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述施用途径为通过吞服药片口服递送。
60.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其中所述免疫应答在所述对象的肺泡细胞、吸收性肠上皮细胞、纤毛细胞、杯状细胞、棒状细胞和/或气道基底细胞中引发。
61.如权利要求57-60中任一项所述的方法，其中所述对象是人类。
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