CN116322974A - 填充剂及其制造方法以及尺寸排阻色谱用柱 - Google Patents

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Abstract

提供耐碱性高、抑制非特异吸附的尺寸排阻色谱所使用的填充剂及其制造方法。一种填充剂，其特征在于，在多孔质有机高分子载体上通过来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基而结合有亚烷基的一个末端，上述多孔质有机高分子载体含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元60～95mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元5～40mol％，上述亚烷基是选自碳原子数4～9的、直链亚烷基、环亚烷基、直链烷基环亚烷基中的至少1种亚烷基，上述亚烷基的另一个末端经由醚键而与多元醇的任1个末端结合。

Description

填充剂及其制造方法以及尺寸排阻色谱用柱
技术领域
本发明涉及蛋白质精制用的尺寸排阻色谱的填充剂。进一步详细而言，涉及耐碱性高的填充剂。
背景技术
按照分子大小的顺序分离的尺寸排阻色谱在将多糖类、肽、蛋白质、DNA、RNA那样的水溶性高分子分离时被广泛利用。尺寸排阻色谱由于特别是在蛋白质等生物体高分子的分离、分取中，可以将生物体高分子在温和的条件下处理，因此具有可以在生物体高分子的变性少的状态下分离、分取这样的优点。被分离、分取的生物体高分子在向生物化学反应的应用、食品、制药、化学等工业用途中被使用，近年来市场显著扩大成长。
为了应对该需求，期望按照工业规模的能够大量处理的分离、分取用的填充剂。特别是，在预计今后市场扩大的基因治疗药领域中，为了以病毒载体、病毒样粒子等的精制工艺的生产性的大幅改善作为目标，进一步期望填充剂的功能改善。期望特别是能够用于分子尺寸大的病毒载体、病毒样粒子的精密分离精制，经过从培养液到精制的一系列工序而精密尺寸分离简便。
因此对于填充剂，期望作为与分析柱不同的课题/要件的、可以回收被分离出来的物质的分取效率良好，例如在包含来源于发酵生产物的生物药品所包含的杂质、不明成分等多种多样的成分的情况下，也可以抑制它们的非特异吸附，进一步能够用高强度的碱进行洗涤再生。
然而，这样的具有耐碱性的填充剂尚未提出。
另外，本申请人在国际公开第2018/155241号公报(专利文献1)中，提出使用了甲基丙烯酸酯系单体的尺寸排阻色谱用填充剂。在专利文献1中，虽然公开了经过下述工序的填充剂，所述工序为将具有缩水甘油基的单体和交联剂在聚合引发剂的存在下聚合，将由所得的共聚物形成的多孔质粒子用糖醇进行亲水化，然后将残留缩水甘油基通过无机酸进行开环的工序，但是关于耐碱性，要求更高的耐碱性。
此外，在日本专利第5315691号公报(专利文献2)中，公开了将使用了对碱性水溶液的耐性提高了的甲基丙烯酸系单体之中的具有特殊结构的单体的交联聚合物粒子的表面进行了亲水化处理的填充剂。在专利文献2中使用的单体由于不是通用的单体，因此难以容易地简单获得，具有成本变高这样的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/155241号公报
专利文献2：日本专利第5315691号公报
发明内容
发明所要解决的课题
虽然像这样有各种报导，但依然期望耐碱性高、适于分取的填充剂。
本发明以解决上述发现的问题作为课题。如果进一步特定，则本发明的课题是提供耐碱性高的尺寸排阻色谱用的填充剂及其制造方法。
用于解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而反复进行了深入研究，结果发现，具有使亚烷基结合于包含具有缩水甘油基的单体与交联剂的交联共聚物的多孔质粒子、多元醇与亚烷基的另一个末端结合而成的结构的填充剂的耐碱性高，从而完成了本发明。即，本发明涉及以下事项。
[1]一种填充剂，其特征在于，在多孔质有机高分子载体上通过来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基而结合有亚烷基的一个末端，上述多孔质有机高分子载体含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元60～95mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元5～40mol％，上述亚烷基是选自碳原子数4～9的、直链亚烷基、环亚烷基、和直链烷基环亚烷基中的至少1种亚烷基，
上述亚烷基的另一个末端经由醚键而与多元醇的任1个末端结合。
[2]根据[1]所述的填充剂，上述多官能性单体为含有2个以上(甲基)丙烯酰基的(甲基)丙烯酰基系单体。
[3]根据[1]或[2]所述的填充剂，上述多官能性单体至少包含乙二醇二甲基丙烯酸酯、和甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯中的任一者。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的填充剂，上述亚烷基包含亚丁基、环己烷-1,4-二亚甲基中的任一者。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的填充剂，上述多元醇经由来源于通过多元醇而开环了的缩水甘油基的醚键而结合。
[6]根据[1]～[4]中任一项所述的填充剂，上述多元醇包含乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇中的任一者。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的填充剂，其用于尺寸排阻色谱。
[8][1]～[7]中任一项所述的填充剂的制造方法，其具有下述工序(A)～工序(D)，
工序(A)：将包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体的原料单体在稀释剂和聚合引发剂的存在下聚合，获得作为多孔质有机高分子载体的载体α；
工序(B)：使上述载体α的来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基与结构包含亚烷基的二醇化合物的一个羟基反应，获得结合了上述结构包含亚烷基的二醇化合物的末端的载体β，所述亚烷基为碳原子数4～9的直链、或包含脂肪族环的亚烷基；
工序(C)：使结合于上述载体β的上述结构包含亚烷基的二醇化合物的另一个羟基与表氯醇反应而获得向上述载体β导入了缩水甘油基的载体γ；以及
工序(D)：使上述载体γ的缩水甘油基与多元醇的羟基在水存在下反应，获得多元醇的任1个末端作为醚键结合而成的载体δ。
[9]一种尺寸排阻色谱用柱，是[1]～[7]中任一项所述的填充剂被填充于液相色谱用壳体而成的。
发明的效果
根据本发明，可获得耐碱性高、适于分取的填充剂。由此能够进行分离处理的高速化。进一步，该填充剂能够通过便宜的原料、简便的工序来制造，在使用大量的填充剂的工业用规模中应用也容易。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明的实施方式，但在以下说明中例示的材料、尺寸等为一例，本实施方式不受它们限定，能够在不变更其主旨的范围内适当变更而实施。
另外，所谓填充剂，也包含其单独能够作为填充剂使用、并且也能够将表面根据目的进行改性而使用的物质。
此外，在本说明书中，“(甲基)丙烯酸”，是指丙烯酸和甲基丙烯酸，“(甲基)丙烯酰基”也同样。
[填充剂]
本实施方式的填充剂具有以下所示的、特定的骨架与多孔质有机高分子载体结合而得的结构。
(多孔质有机高分子载体)
多孔质有机高分子载体(以下，简写为载体α)含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元60～95mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元5～40mol％。优选以由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元为65～95mol％、且由多官能性单体衍生的重复单元为5～35mol％的比率含有，进一步优选以由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元75～92mol％、且由多官能性单体衍生的重复单元为8～25mol％的比率含有。在由多官能性单体衍生的重复单元的比率低的情况下，最终的填充剂有时背压变高而不适于使用，在由多官能性单体衍生的重复单元的比率高的情况下，有时发生非特异吸附，不能进行目标的分取。另外，使用丙烯酸缩水甘油酯也能够获得本实施方式的载体α。
多官能性单体为分子内具有2个以上烯属双键的化合物。作为多官能性单体，优选为分子内具有2个以上(甲基)丙烯酰基的物质。具体而言，可举出烷二醇二(甲基)丙烯酸酯(烷烃的碳原子数为1～12)、三羟甲基丙烷三(甲基)丙烯酸酯、双三羟甲基丙烷四(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇四(甲基)丙烯酸酯、季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇五(甲基)丙烯酸酯、二季戊四醇六(甲基)丙烯酸酯等，除此以外，也可举出多官能氨基甲酸酯(甲基)丙烯酸酯等。这些化合物可以仅使用1种也可以并用2种以上。
优选至少包含乙二醇二甲基丙烯酸酯、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯中的任1种。只要相对于多官能性单体的总量，50mol％以上为乙二醇二甲基丙烯酸酯、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯即可，优选为80mol％以上，从细孔形成等观点考虑，进一步优选全部量为乙二醇二甲基丙烯酸酯和/或甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯。
上述共聚物如果包含合计95mol％以上的上述甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体作为单体单元，则可以在不使多孔质粒子的性质大幅变化的范围内包含其它单体单元。作为其它单体，除了作为具有缩水甘油基的单体的3,4-环氧环己基甲基甲基丙烯酸酯、4-羟基丁基丙烯酸酯缩水甘油基醚等以外，也可以使用(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯等。
共聚物的交联度为5mol％～40mol％，优选为5mol％～35mol％，更优选为8～25mol％。
上述交联度由下式表示。
(多官能性单体的合计摩尔数/全部单体的合计摩尔数)×100
＝交联度(mol％)
在交联度低的情况下，最终的填充剂有时尺寸排阻色谱用柱的背压变高而不适于使用，如果交联度高，则有时发生非特异吸附，不能进行目标的分取。
(表面结构)
在本实施方式中，选自碳原子数4～9的、直链亚烷基、环亚烷基、直链烷基环亚烷基、环烷基二亚烷基中的至少1种亚烷基的一个末端与上述载体α结合。上述亚烷基的一个末端经由来源于载体α所包含的甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基进行开环反应而生成的醚键而与载体α结合。此外，上述亚烷基的另一个末端经由醚键而直接或间接地与多元醇结合。关于醚键，来源于多元醇的醚键、和来源于在导入例如表氯醇等多元醇时使用了的环氧化合物的醚键都被包含。即，是在载体表面具有形成来源于亚烷基的疏水层的疏水骨架，进一步在疏水层表面具有形成来源于多元醇的亲水层的亲水性骨架的结构。这样的结构优选相对于载体的干燥质量，以500μmol/g～2000μmol/g、优选以700μmol/g～1800μmol/g的密度被导入。导入密度能够由缩水甘油基的量、多元醇的量、进一步在后述制造方法中在中途被导入的缩水甘油基的量等来测定，通过调整它们，从而也能够调整导入密度。
亚烷基为从碳原子数4～9的、直链烷基或环烷基、或直链烷基环烷基(烷基环烷基、环二烷基)等烷基中，从分子链最长的链的两末端的烃、在环烷基的情况下从环状结构的最远的位置的烃、分别1个1个地除去了氢的2价基。此外，可以在直链、脂肪族环具有烷基作为侧链。
作为亚烷基，具体而言，可举出亚丁基、亚己基、亚庚基、1,4-环亚己基、1-亚甲基-4-环己基、环己烷-1,4-二亚甲基等。如果碳原子数少，则有时耐碱性变得不充分，如果过多，则有时发生非特异吸附，有时不能进行目标的分取。上述亚烷基包含亚丁基、环己烷-1,4-二亚甲基中的至少任一者由于耐碱性和非特异吸附抑制等均衡地优异，目标的分取效率良好，因此是优选的。
作为多元醇，优选为含有2个以上羟基，对碱稳定，具有充分的亲水性的物质，例如，聚醚多元醇、聚内酯多元醇等。该多元醇经由醚键而直接或间接地与构成上述疏水骨架的亚烷基结合。在与亚烷基结合了的多元醇中残留有至少1个羟基。在使用了二醇化合物作为构成疏水骨架的亚烷基的导入原料的情况下，二醇化合物的2个羟基两者都通过反应而向醚键氧变化，与来源于残留有至少1个羟基的多元醇的构成部区分开。
作为多元醇的具体例，可举出乙二醇、二甘醇、三甘醇等饱和和不饱和的各种公知的低分子二醇类、聚乙烯多元醇、聚乙二醇等聚亚烷基二醇等。进一步也能够使用甘油那样的三醇类；赤藓醇、苏糖醇那样的丁糖醇类；***糖醇、木糖醇那样的戊糖醇类；山梨糖醇、甘露糖醇那样的己糖醇类；庚七醇、甘露庚糖醇那样的庚糖醇类等糖醇。这些多元醇类在经由醚键而结合时，与上述碳原子数4～9的亚烷基，在链长、具有羟基的结构等方面区分开。
多元醇的平均分子量没有特别限制，只要为5000以下就没有特别限制。在多元醇的平均分子量为5000以上的情况下，有时载体α的细孔内被闭塞，不能进行目标的分取。
期望在本发明中使用的、多元醇类为辛醇水分配系数(logP)为-1.2以下的多元醇。辛醇水分配系数(logP)例如为乙二醇(-1.36)、三甘醇(-1.98)、聚乙二醇(低于-1.98)、山梨糖醇(-2.20)、甘油(-1.76)、异丙二醇(-1.07)、1,4-丁二醇(-0.88)。
此外，关于多元醇类，不具有酯、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、硅氧烷等诱发基于碱的水解的结构的物质在对碱稳定这方面是期望的。
多元醇类的重均分子量虽然没有特别限制，但是在亲水性这方面，只要为50以上即可，在导入的容易性等方面，只要为200以下即可。
上述多元醇中，特别优选为导入容易的乙二醇、聚乙二醇、赤藓醇、山梨糖醇、庚七醇，更优选为能够便宜地获得的乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇。
上述多元醇只要经由醚键而与上述亚烷基结合即可，也能够直接结合，但也可以如后述那样经由在导入缩水甘油基时使用的表氯醇得到的结构而间接地与上述亚烷基结合。
在使多元醇的一例为聚乙二醇时，本发明的填充剂示意性地由以下化学式表示，但本发明不特别限定于这一例。
Figure BDA0004136356260000081
(填充剂的制造方法)
本实施方式的填充剂可以通过以下工序(A)～(D)来制造。
具有下述工序：
工序(A)：将包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体的原料单体在稀释剂和聚合引发剂的存在下聚合，获得作为多孔质有机高分子载体的载体α；
工序(B)：使上述载体α的来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基与结构包含亚烷基的二醇化合物的一个羟基反应，获得结合了上述结构包含亚烷基的二醇化合物的末端的载体β，所述亚烷基为碳原子数4～9的直链、或包含脂肪族环的亚烷基；
工序(C)：使结合于上述载体β的结构包含上述亚烷基的二醇化合物的另一个羟基与表氯醇反应而获得向上述载体β导入了缩水甘油基的载体γ；以及
工序(D)：使上述载体γ的缩水甘油基与多元醇的羟基在水存在下反应，获得多元醇的一个末端作为醚键结合了的载体δ。
[工序(A)]
调制包含以甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体作为单体单元的共聚物的载体α。载体α通过将这些单体在稀释剂和聚合引发剂的存在下共聚而获得。这些多孔质粒子可以以日本特开2007/170907、WO2006/132333等记载的方法作为参考来制造。
期望上述原料单体中的甲基丙烯酸缩水甘油酯浓度为60～95mol％，优选为70～95mol％。期望上述原料单体中的上述多官能性单体浓度为5mol％～40mol％，优选为5mol％～30mol％。
此外，如上述那样，可以包含其它单体成分。
为了向载体α导入细孔，在单体混合物中添加稀释剂进行聚合。所谓稀释剂，是溶解于单体混合物但在聚合反应中为非活性，进一步不溶解生成了的共聚物的性质的有机溶剂。在聚合结束后，将稀释剂通过洗涤等除去，从而稀释剂部分变为空洞而在载体α粒子中形成多孔性细孔。
作为稀释剂，可以使用例如甲苯、二甲苯、二乙基苯、十二烷基苯、氯苯那样的芳香族系烃类；己烷、庚烷、戊烷、辛烷、壬烷、癸烷那样的饱和烃类；异戊醇、己醇、庚醇、辛醇、壬醇那样的醇类；二氯甲烷、二氯乙烷、三氯乙烷那样的脂肪族卤代烃类；乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯、琥珀酸二乙酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸丙酯那样的脂肪族或芳香族酯等。这些稀释剂可以单独使用或混合使用2种以上。
该稀释剂的添加量对填充剂的排阻极限分子量、细孔容积的体积％(表示细孔容积相对于填充剂粒子的全部体积的比例)产生影响。因此，适当调节其量而加入。这些稀释剂的添加量以加入时温度下的原料单体的合计体积的0.8倍～4.0倍、优选为1.0～3.0倍的体积使用。
在聚合时使用的聚合引发剂只要是产生自由基的公知的自由基聚合引发剂，就没有特别限定。可以举出例如，2,2’-偶氮二异丁腈、2,2’-偶氮二(异丁酸甲酯)、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)那样的偶氮系引发剂。其中，从化学结构的亲和性考虑，期望使用2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)。对聚合引发剂的浓度没有特别限定，但相对于单体的总量100质量份优选为0.1～5质量份。
通过单体混合物、稀释剂、聚合引发剂，准备包含单体的油相。使油相在包含适当的分散稳定剂的水性介质中搅拌悬浮，成为油滴的状态。通过在该状态下聚合(悬浮聚合)，从而共聚物作为具有适当的粒径的多孔质粒子而生成。在油滴的制作方法中，除了采用上述搅拌的方法以外，还可以应用使包含稀释剂的单体溶剂通过多孔质膜、或形成于石英基板的微流路而滴加在水性介质中的方法。
作为水性介质所包含的分散稳定剂，可以使用公知物质。通常，使用明胶、聚丙烯酸钠、聚乙烯醇等水溶性高分子化合物。一般而言，使用聚乙烯醇。分散稳定剂的浓度相对于水性介质优选为0.1～5质量％。
水性介质除了水以外，还可以包含盐类这样的其他水溶性成分。作为盐类，可举出氯化钠、氯化钙等一般使用的物质。由于根据所使用的盐类而溶解度有不同，因此浓度不能笼统地规定，例如对于氯化钠，也可以溶解0.1～15质量％而使用，对于氯化钙也可以溶解1～40质量％而使用。盐类被添加而用于盐析。
悬浮聚合反应在氮气置换后，通常，在搅拌下加热到40～100℃，在大气压下进行5～16小时反应。此时各个油滴所包含的单体在包含稀释剂的状态下聚合，聚合物网状地生长，因此之后将稀释剂除去从而可获得多孔质粒子。在反应后，多孔质粒子可以通过过滤等而从水性介质容易地分离。进一步，用丙酮、甲醇那样的溶剂洗涤，进行稀释剂的除去。在干燥后，所得的具有缩水甘油基的多孔质粒子通过筛子、风力分级装置而被分级。
这样操作而在工序(A)中获得的载体α为具有来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基的多孔质粒子，具有上述那样的平均粒径和细孔。
[工序(B)]
接着，使载体α的来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基与结构包含碳原子数4～9的直链、或包含脂肪族环的亚烷基的二醇化合物反应而获得包含多孔质有机高分子的载体β。存在于多孔质粒子的表面的缩水甘油基开环，与二醇化合物的末端羟基反应，经由来源于末端羟基的醚键，二醇化合物与多孔质粒子结合。该二醇化合物的亚烷基部分最终构成填充剂的疏水部。
具体而言，在包含催化剂的溶液的存在下，使二醇化合物与载体α反应。作为二醇化合物，可举出1,4-丁二醇、1,5-戊二醇、1,6-己二醇、1,7-庚二醇、1,4-环己二醇、4-(羟基甲基)环己醇、1,4-环己烷二甲醇等。如果碳原子数在上述范围内，则耐碱性高，而且疏水性也不会变得过强，因此可以抑制非特异吸附的诱导。
作为二醇化合物的使用量，相对于载体α100质量份，优选为100质量份～2000质量份。
此外，作为二醇化合物的使用量，相对于载体α所包含的甲基丙烯酸缩水甘油酯，优选为100mol％～2000mol％。
如果二醇化合物都在上述范围内，则耐碱性和非特异吸附抑制等均衡地优异，目标的分取效率良好，因此可以获得填充剂。
优选以载体α所包含的甲基丙烯酸缩水甘油酯的80mol％以上、优选为90mol％以上与二醇化合物反应的方式，调整二醇化合物的使用量、反应条件。
作为催化剂，可以使用三氟化硼二乙基醚配位化合物、硼氟化锌、三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸、硫酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸、二氯乙酸等。催化剂相对于载体α100质量份优选为0.1质量份～100质量份，更优选为0.5质量份～20质量份。如果在该范围内，则能够进行二醇化合物的导入，可以防止多孔质粒子的酯基等发生反应。
所得的载体β通过用二甲亚砜等洗涤，从而除去多余的二醇化合物、催化剂等。
[工序(C)]
接下来，使用表氯醇向上述载体β导入缩水甘油基，获得载体γ。即，被导入到载体β的二醇化合物的未反应的一方的羟基的氢原子与表氯醇的氯原子进行消去反应，向载体β经由来源于表氯醇的结构的-OCH2CH(OH)CH2-而导入缩水甘油基。
另外，除了表氯醇以外，只要是含有缩水甘油基的化合物就可以利用，具体而言，可举出1,4-丁二醇二缩水甘油基醚、乙二醇二缩水甘油基醚、甘油二缩水甘油基醚。其中，基于导入容易这样的理由，优选使用表氯醇。
表氯醇等含有缩水甘油基的化合物的导入通过在无溶剂或二甲亚砜等溶剂中在催化剂存在下，将相对于上述载体β的质量为100质量份～300质量份的含有缩水甘油基的化合物与载体β一起添加而均匀地搅拌的反应来进行。由此，向与载体β结合的二醇化合物的未与载体β结合的末端导入缩水甘油基。
关于表氯醇等含有缩水甘油基的化合物，只要相对于被导入到载体β的二醇化合物的未反应的一方的羟基的量为过剩即可，假定向来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基导入亚烷基100％，则相对于亚烷基末端羟基(mol)，优选在100mol％～1000mol％的范围内。
作为催化剂，使用碱金属氢氧化物，可以例示例如，氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属氢氧化物。作为其使用量，相对于载体β100质量份优选为1质量份～100质量份，进一步更优选为5质量份～50质量份。
[工序(D)]
使导入了缩水甘油基的载体γ与多元醇在水存在下反应，将多元醇的任1个末端固定化而获得载体δ。此时根据需要，可以使用催化剂，可以使用上述碱金属氢氧化物。
多元醇化合物的任1个末端羟基与缩水甘油基反应，经由醚结构，多元醇化合物的末端被导入到载体γ表面。多元醇化合物由于具有多个羟基，因此残留至少一个羟基。在工序(D)中也可以在溶剂中使载体γ与多元醇化合物共存时，添加碱金属氢氧化物，进行加热搅拌从而进行反应。水只要相对于干燥载体γ质量为1倍～3倍质量即可。
作为多元醇化合物的使用量，相对于载体γ100质量份优选为10质量份～1500质量份。如果多元醇化合物的量少，则有导入量少、亲水性变得不充分的倾向，此外如果过多，则有时溶解所需要的溶剂量增加。
相对于被导入到上述载体γ的缩水甘油基(mol)，多元醇化合物的使用量优选在100mol％～20,000mol％的范围。如果多元醇化合物的量少，则有导入量少、亲水性变得不充分的倾向，此外如果过多，则有时溶解所需要的溶剂量增加。
所得的载体δ，即本实施方式的填充剂通过用水洗涤而除去多余的多元醇化合物、碱金属氢氧化物。
此外，在所得的填充剂中有时残存有未反应的缩水甘油基。如果残存缩水甘油基，则填充剂的疏水性上升，例如可能将蛋白质那样的疏水性高的水溶性化合物疏水性吸附。因此，为了更提高亲水性，期望将残存的缩水甘油基用无机酸开环。
作为无机酸，可以例示硫酸、硝酸、盐酸等。其中，特别优选为硫酸。所使用的无机酸的浓度只要为0.01M～1.0M左右即可，特别优选为0.1～0.5M左右。如果无机酸为0.01M以上，则开环充分进行，此外，如果无机酸为1.0M以下，则也没有载体中的酯基等被水解而生成离子性的官能团的情况。所得的粒子通过用水洗涤，从而容易地除去多余的无机酸。
(填充剂的特性)
填充剂的平均粒径只要为10μm以上，就没有特别限制，但从柱填充性等观点考虑，优选在15～100μm的范围。这里，平均粒径由体积换算平均粒径表示。所谓体积换算平均粒径，是通过图像解析式粒度分布测定装置而获得的值。在粒子的体积换算平均粒径使用图像解析式粒度分布测定装置的情况下，由将2000个以上交联聚合物粒子用图像解析式粒度分布测定装置摄像而获得的二维的粒子图像(优选为静止图像)获得各粒子的等效圆直径(具有与粒子图像的投影面积相同的面积的圆的直径)，由该等效圆直径算出各粒子的体积，以体积作为基准进行了平均化的粒径。此时，各粒子视为与上述等效圆直径具有相同直径的球体。作为图像解析式粒度分布测定装置，可以使用例如，流式粒子图像分析装置(商品名：FPIA-3000、シスメックス(株)制)。另外，填充剂的平均粒径能够根据制造载体时的聚合条件来调整。
填充剂具有细孔。细孔的大小根据目的来适当选择。
本实施方式的填充剂具有适合的亲水性和排阻极限分子量。亲水性、排阻极限分子量能够通过稀释剂的种类、量、或甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体的比率来调整。填充剂的平均粒径、细孔径不根据表面结构而变化。
适合于蛋白质的精制的排阻极限分子量为1,000,000～100,000,000，更优选为50,000,000～20,000,000。如果在该范围内，则能够有效率地进行蛋白质的分离。
排阻极限分子量可以将填充了填充剂的柱与高效液相色谱连接，以离子交换水作为流动相以1.0mL每分钟的流速，将各种分子量的标准物质注入到柱中，使用其溶出容量，通过一般已知的方法而求出。在本实施方式中，检测使用差示折射率检测器(商品名：RI-201H，昭和电工社制)，标准物质使用普鲁兰多糖标准品(商品名：Shodex(注册商标)STANDARD P-82，昭和电工社制)。
另外，为了将巨大的蛋白质用尺寸排阻色谱分离，排阻极限分子量根据蛋白质的分子量来适当选择。例如在将分子量约90万的IgM和分子量约15万的IgG这样的巨大的蛋白质分离时，如果排阻极限小于100万，则IgM落入到排阻极限区域而不能分离。
因此，通过将该填充剂填充于液相色谱用壳体，从而可以获得高性能的尺寸排阻色谱用柱，进一步可以获得具备该尺寸排阻色谱用柱的色谱装置。此外，可以提供通过使用该尺寸排阻色谱用柱，从而可以用水系洗脱液将生物体高分子精度良好地分离，进一步分取的生物体高分子的分离方法和分取方法。
此外，由于耐碱性高，因此能够洗涤再利用，能够长期连续使用。
实施例
以下，通过实施例使本发明的效果更明确。另外，本发明不限定于以下实施例，可以在不变更其主旨的范围内适当变更而实施。
[实施例1]
＜工序(A)：具有缩水甘油基的多孔质粒子的合成＞
在作为稀释剂的琥珀酸二乙酯58.7g中，溶解甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)27.8g、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル701，新中村化学工业(株))11.3g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g，鼓泡30分钟氮气，准备了油相。
接下来，与油相另行地，准备了使作为分散稳定剂的PVA-224((株)クラレ制，皂化度87.0％-89.0％的聚乙烯醇)10.0g、和作为盐析剂的氯化钠10.0g溶解于离子交换水480g中的水相。
将水相和油相转移到可拆式烧瓶中，用安装了半月型搅拌叶片的搅拌棒以430rpm的旋转速度使其分散20分钟，然后将反应器内用氮气置换，在60℃下反应16小时。然后，将所得的聚合物转移到玻璃过滤器上，以50～80℃左右的温水、改性醇、水的顺序充分地洗涤，获得了多孔质粒子(载体α1)100.4g。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为79.8mol％，甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为20.2mol％。
＜工序(B)：亚烷基的导入反应＞
将上述载体α1在玻璃过滤器上量取98g，用二甘醇二甲基醚充分地洗涤。在洗涤后，将载体α1转移到可拆式烧瓶中，将二甘醇二甲基醚150g、1,4-丁二醇150g(相对于甲基丙烯酸缩水甘油酯为920mol％)转移到1L可拆式烧瓶中进行了搅拌分散。然后，加入三氟化硼二乙基醚配位化合物1.5ml，一边以200rpm搅拌一边向80℃升温而进行了4小时反应。在冷却后，将结合了结构包含亚烷基的二醇化合物的多孔质粒子(载体β1)过滤分离后，用离子交换水1L洗涤，获得了152g载体β1。反应的进行通过以下步骤而确认了。将导入了亚烷基的干燥多孔质粒子的一部分与溴化钾混合，施加压力而制粒后用FT-IR(商品名：Nicolet(注册商标)iS10，サーモサイエンティフィック(株)制)测定，确认了红外吸收光谱中的由缩水甘油基引起的908cm-1的吸光度的峰高度。其结果，未观测到由FT-IR得到的908cm-1的吸光度峰。
＜工序(C)：缩水甘油基的导入反应＞
将载体β1在玻璃过滤器上量取150g，用二甲亚砜充分地洗涤。洗涤后，将载体β1转移到可拆式烧瓶中，加入二甲亚砜262.5g和表氯醇150g，在室温下搅拌，进一步加入30％氢氧化钠水溶液(关东化学(株)制)37.5ml，加热到30℃，搅拌了6小时。在反应结束后，将多孔质粒子转移到玻璃过滤器上，以水、丙酮、水的顺序充分地洗涤，获得了导入了缩水甘油基的多孔质粒子(载体γ1)172g。
通过以下步骤测定了所得的载体γ1的缩水甘油基的导入密度。
取载体γ1 5.0g，求出干燥质量，结果为1.47g。接下来，将相同量的载体γ1量取到可拆式烧瓶中，使其分散于水40g，在室温下一边搅拌一边加入二乙基胺16mL，然后加热到50℃，搅拌4小时。在反应结束后，将反应物转移到玻璃过滤器上，用水充分地洗涤，获得了导入了二乙基胺的多孔质粒子A。
将所得的多孔质粒子A转移到烧杯中，使其分散于0.5mol/L氯化钾水溶液150mL，以pH变为4.0的时刻作为中和点用0.1mol/L盐酸进行了滴定。由此，算出导入了二乙基胺的多孔质粒子1所导入的二乙基胺的量，通过以下所示的式子，算出载体γ1的缩水甘油基的密度。其结果，缩水甘油基的密度为880μmol/g。
缩水甘油基的密度(μmol/g)＝{0.1×中和点的盐酸体积(μL)/导入了缩水甘油基的多孔质粒子的干燥质量(g)}
＜工序(D)：多元醇的导入反应＞
将载体γ1 150g、水600mL、D-山梨糖醇(logP＝-2.20，关东化学(株)制)1000g(相对于缩水甘油基为13000mol％)转移到3L可拆式烧瓶中进行了搅拌分散。然后，加入氢氧化钾10g，一边以200rpm搅拌一边向60℃升温而进行了15小时反应。在冷却后，将反应物过滤分离后，用水充分地洗涤，获得了导入了多元醇的多孔质粒子(载体δ1)152g。将所得的载体δ1利用筛子而分级为16～37μm，获得了140.5g的填充剂1。
＜耐碱性评价＞
耐碱性的评价通过利用以下步骤而算出基于氢氧化钠的水解的羧基生成量来进行。
首先，使填充剂4g分散在0.5mol/L氯化钾水溶液150mL中，以pH变为7.0的时刻作为中和点而用0.1mol/L氢氧化钠水溶液滴定。因此，通过以下式子，算出填充剂所包含的水解前的羧基的量。
羧基的量(μmol/mL)＝0.1×中和时刻的氢氧化钠水溶液体积(μL)/填充剂的表观体积(mL)
这里，填充剂的表观体积是使填充剂4g分散于水而调制浆料液，将浆料液转移到量筒中后，静置充分的时间后测定的填充剂相的体积。
接着，将填充剂4g量取到可拆式烧瓶中，加入5mol/L氢氧化钠水溶液20mL，一边以200rpm搅拌一边在50℃下处理了20小时。在冷却后，将填充剂过滤分离后，按照0.1mol/LHCl水溶液、水的顺序洗涤，通过与先前同样的手法而算出所得的填充剂所包含的羧基量。由与5mol/L氢氧化钠水溶液反应前后的羧基的量之差，算出由与5mol/L氢氧化钠水溶液的反应得到的羧基生成量。其结果，羧基生成量为21μmol/mL。
另外，如果羧基生成量为40μmol/mL以下，则评价为耐碱性高。
＜非特异吸附评价＞
将所得的填充剂通过平衡浆料法填充于8mm内径、300mm长度的不锈钢柱((株)杉山商事制)。使用所得的柱，通过以下所示的方法，进行了非特异吸附试验。
将填充了上述填充剂的柱与岛津制作所HPLC***(送液泵(商品名：LC-10AT，(株)岛津制作所制)、自动进样器(商品名：SIL-10AF，(株)岛津制作所制)、光电二极管阵列检测器(商品名：SPD-M10A，(株)岛津制作所制))连接，以50mmol/L磷酸钠缓冲水溶液作为流动相而以0.6mL/分钟的流速通水。作为溶剂，使用与流动相相同的磷酸钠水溶液，制作0.7mg/mL的甲状腺球蛋白(Mw6.7×105)、0.6mg/mL的γ-球蛋白(Mw1.6×105)、0.96mg/mL的BSA(Mw6.65×104)、0.7mg/mL的核糖核酸酶(Mw1.3×104)、0.4mg/mL的抑肽酶(Mw6.5×103)、0.02mg/mL的尿苷(Mw 244)(以上，メルク·シグマアルドリッチ制)的各样品溶液，分别从自动进样器注入10μL。将使用波长280nm的光电二极管阵列检测器而观测到的各自的溶出时间进行比较，确认到溶出容量的顺序与分子量的大小的顺序没有矛盾。
其结果，各个样品从填充了填充剂1的柱的溶出容量为8.713mL、9.691mL、9.743mL、10.396mL、11.053mL、11.645mL，确认了样品的分子量与溶出容量的顺序没有矛盾，未诱导非特异吸附。另外，在样品的分子量与溶出容量的顺序没有矛盾的情况下，没有非特异吸附，在表1中，表述为〇，在有矛盾的情况下，由于诱导非特异吸附，因此表述为×。
[实施例2]
与实施例1同样地操作而获得了多孔质粒子(载体α1)后，如以下那样操作而获得了填充剂2。
将上述载体α1在玻璃过滤器上量取98g，用二甘醇二甲基醚充分地洗涤了。在洗涤后，将多孔质粒子1转移到可拆式烧瓶中，将二甘醇二甲基醚150g、1,4-环己烷二甲醇150g(相对于缩水甘油基为580mol％)转移到1L可拆式烧瓶中进行了搅拌分散。然后，加入三氟化硼二乙基醚配位化合物1.5ml，一边以200rpm搅拌一边向80℃升温而进行了4小时反应。冷却后，将所得的结合了结构包含亚烷基的二醇化合物的多孔质粒子(载体β2)过滤分离后，用离子交换水1L洗涤，获得了165g载体β2。反应的进行通过以下步骤而确认了。将导入了亚烷基的干燥多孔质粒子的一部分与溴化钾混合，施加压力而制粒后用FT-IR(商品名：Nicolet(注册商标)iS10，サーモサイエンティフィック(株)制)测定，确认了红外吸收光谱中的缩水甘油基引起的908cm-1的吸光度的峰高度。其结果，未观测到由FT-IR得到的908cm-1的吸光度峰。
＜工序(C)：缩水甘油基的导入反应＞
将载体β2在玻璃过滤器上量取150g，用二甲亚砜充分地洗涤了。洗涤后，将载体β2转移到可拆式烧瓶中，加入二甲亚砜262.5g和表氯醇150g，在室温下搅拌，进一步加入30％氢氧化钠水溶液(关东化学(株)制)37.5ml，加热到30℃，搅拌6小时。在反应结束后，将多孔质粒子转移到玻璃过滤器上，按照水、丙酮、水的顺序充分地洗涤，获得了导入了缩水甘油基的多孔质粒子(载体γ2)180g。
与实施例1同样地测定了所得的载体γ2的缩水甘油基的导入密度。其结果，缩水甘油基的密度为900μmol/g。
＜工序(D)：多元醇的导入反应＞
将载体γ2在玻璃过滤器上量取150g，用二甘醇二甲基醚充分地洗涤了。洗涤后，将多孔质粒子转移到可拆式烧瓶中，将二甘醇二甲基醚150g、乙二醇(logP＝-1.36)150g(相对于缩水甘油基为5760mol％)转移到1L可拆式烧瓶中进行了搅拌分散。然后，加入三氟化硼二乙基醚配位化合物1.5mL，一边以200rpm搅拌一边向80℃升温而进行了4小时反应。冷却后，将反应物过滤分离后，用水充分地洗涤，获得了导入了多元醇的多孔质粒子(载体δ2)152g。将载体δ2利用筛子而分级为16～37μm，获得了140.5g的填充剂2。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂2的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为15.2μmol/mL，确认了填充剂2具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂2的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为8.814mL、***mL、9.778mL、10.37mL、10.898mL、12.347mL，确认了样品的分子量与溶出容量的顺序没有矛盾，未诱导非特异吸附。
[实施例3]
与实施例2同样地操作而获得了载体γ2。将所得的载体γ2在玻璃过滤器上量取150g，用二甘醇二甲基醚充分地洗涤了。洗涤后，将多孔质粒子转移到可拆式烧瓶中，将二甘醇二甲基醚150g、聚乙二醇#200(关东化学(株)制，平均分子量190～210，logP不明确，但作为接近的化合物的四甘醇(Mw 194)的logP为-2.02)(相对于缩水甘油基为1790mol％)150g转移到1L可拆式烧瓶中进行了搅拌分散。然后，加入三氟化硼二乙基醚配位化合物1.5mL，一边以200rpm搅拌一边向80℃升温而进行了4小时反应。冷却后，将反应物过滤分离后，用水充分地洗涤，获得了导入了多元醇的多孔质粒子(载体δ3)152g。将载体δ3利用筛子而分级为16～37μm，获得了140.5g的填充剂3。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂3的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为16.1μmol/mL，确认了填充剂3具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂3的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为8.517mL、9.241mL、9.47mL、10.034mL、10.484mL、11.927mL，确认了样品的分子量与溶出容量的顺序没有矛盾，未诱导非特异吸附。
[实施例4]
使甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)33.2g、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル701，新中村化学工业(株))5.9g、琥珀酸二乙酯58.7g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g为油相，除此以外，与实施例3同样地操作，获得了填充剂4。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为90.0mol％，甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为10.0mol％。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂4的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为11.5μmol/mL，确认了填充剂4具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂4的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为7.52mL、8.214mL、8.451mL、9.062mL、9.511mL、11.915mL，确认了样品的分子量与溶出容量的顺序没有矛盾，未诱导非特异吸附。
[实施例5]
使甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)21.5g、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル701，新中村化学工业(株))17.6g、琥珀酸二乙酯58.7g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g为油相，除此以外，与实施例3同样地操作，获得了填充剂5。
甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为66.2mol％，甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为33.8mol％。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂5的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为18.3μmol/mL，确认了填充剂5具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂5的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为8.692mL、9.434mL、9.625mL、10.236mL、10.759mL、12.457mL，样品的分子量与溶出容量的顺序没有矛盾，确认了未诱导非特异吸附。
[实施例6]
使甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)33.2g、乙二醇二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル1G，新中村化学工业(株))5.9g、乙酸丁酯29.3g、氯苯29.3g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g为油相，除此以外，与实施例3同样地操作，获得了填充剂6。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为88.7mol％，乙二醇二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为11.3mol％。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂6的耐碱性评价。其结果，羧基生成量为12.5μmol/mL，确认了填充剂6具有优异的耐碱性。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂6的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为9.613mL、10.427mL、10.444mL、11.066mL、11.582mL、12.575mL，样品的分子量与溶出容量的顺序没有矛盾，确认了未诱导非特异吸附。
[比较例1]
对与实施例1同样地操作而获得的多孔质粒子(载体α1)，实施了实施例1的工序D。
＜工序(D)：多元醇的导入反应＞
将98g载体α1、水600mL、D-山梨糖醇(关东化学(株)制)1000g(相对于缩水甘油基为3050mol％)转移到3L可拆式烧瓶中进行了搅拌分散。然后，加入氢氧化钾10g，一边以200rpm搅拌一边向60℃升温而进行了15小时反应。冷却后，将反应物过滤分离后，用水充分地洗涤，获得了导入了多元醇的多孔质粒子(载体δ7)130g。将载体δ7利用筛子而分级为16～37μm，获得了115g的填充剂7。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂7的耐碱性评价。其结果，填充剂7的羧基生成量为120.3μmol/mL，成为耐碱性差的结果。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂7的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为8.606mL、9.769mL、9.9567mL、10.703mL、11.470mL、12.112mL，样品的分子量与溶出容量的顺序没有矛盾，确认了未诱导非特异吸附。
[比较例2]
作为亚烷基导入剂，代替1,4-丁二醇而使用了乙二醇150g，除此以外，与实施例1同样地操作而获得了填充剂8。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂8的耐碱性评价。其结果，填充剂8的羧基生成量为108.4μmol/mL，成为耐碱性差的结果。
进一步，与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂8的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为9.708mL、9.8946mL、10.6452mL、11.5374mL、12.1656mL，样品的分子量与溶出容量的顺序没有矛盾，确认了未诱导非特异吸附。
[比较例3]
未进行缩水甘油基的导入、和多元醇的导入，除此以外，与实施例2同样地操作而获得了填充剂9。即，将在实施例2的工序(B)中获得的载体β2作为填充剂9。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂9的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为8.590mL、10.316mL、9.603mL、10.484mL、13.863mL、12.861mL，样品的分子量与溶出容量的顺序产生矛盾，确认了诱导了非特异吸附。因此未进行耐碱性评价。
[比较例4]
作为亚烷基导入剂，代替1,4-丁二醇而使用了1,10-癸二醇150g(相对于甲基丙烯酸缩水甘油酯为480mol％)，除此以外，与实施例1同样地操作而获得了填充剂10。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂10的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为9.991mL、10.15mL、10.063mL、10.691mL、12.172mL、11.531mL，样品的分子量与溶出容量的顺序产生矛盾，确认了诱导了非特异吸附。因此未进行耐碱性评价。
[比较例5]
使甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)13.7g、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル701，新中村化学工业(株))25.4g、琥珀酸二乙酯58.7g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g为油相，除此以外，与实施例3同样地操作，获得了填充剂11。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为46.4mol％，甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为53.6mol％。
与实施例1同样地操作而进行了所得的填充剂11的非特异吸附评价。其结果，各个样品的溶出容量为8.872mL、10.131mL、9.82mL、10.422mL、12.782mL、12.553mL，样品的分子量与溶出容量的顺序产生矛盾，确认了诱导了非特异吸附。因此未进行耐碱性评价。
另外，确认了在实施例1～6和比较例1～5中获得的填充剂的排阻极限分子量都为100万以上。
[比较例6]
使甲基丙烯酸缩水甘油酯(商品名：ブレンマーG(注册商标)日油(株)制)37.1g、甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯(商品名：NKエステル701，新中村化学工业(株))2.0g、琥珀酸二乙酯58.7g、2,2’-偶氮二(2,4-二甲基戊腈)1.9g为油相，除此以外，与实施例3同样地操作，获得了填充剂12。甲基丙烯酸缩水甘油酯的使用量相对于单体总量为96.7mol％，甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯的使用量相对于单体总量为3.3mol％。
使用所得的填充剂12，尝试了向不锈钢柱的填充。然而，背压高，送液变得困难，填充不能进行。因此任一评价都不能进行。
将以上实施例/比较例的结果示于表1中。
根据以上结果，通过采用本发明的构成，从而可获得非特异吸附被抑制了的耐碱性高的填充剂。
另外，在不设置疏水部、或亚烷基链短的情况下，如比较例1和2所示那样，耐碱性变低。此外，亚烷基链过长、或不设置亲水部的情况疏水性变强，如比较例3和4所示那样，表明了诱导非特异吸附。此外，在由多官能性单体衍生的重复单元多的比较例5中，表明诱导非特异吸附，在由多官能性单体衍生的重复单元少的比较例6中，表明了施加于装置的背压变高，难以填充于柱。
表1
Figure BDA0004136356260000241
1)GDMA：甘油-1，3-二甲基丙烯酸酯
2)EDMA：乙二醇二甲基丙烯酸酯
3)EG：乙二醇
4)PEG200：聚乙二醇#200
5)○：无非特异吸附，×：有非特异吸附
。

Claims (9)

1.一种填充剂，其特征在于，在多孔质有机高分子载体上通过来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基而结合有亚烷基的一个末端，所述多孔质有机高分子载体含有由甲基丙烯酸缩水甘油酯衍生的重复单元60～95mol％、和由多官能性单体衍生的重复单元5～40mol％，所述亚烷基是选自碳原子数4～9的、直链亚烷基、环亚烷基、和直链烷基环亚烷基中的至少1种亚烷基，
所述亚烷基的另一个末端经由醚键而与多元醇的任1个末端结合。
2.根据权利要求1所述的填充剂，所述多官能性单体为含有2个以上(甲基)丙烯酰基的(甲基)丙烯酰基系单体。
3.根据权利要求2所述的填充剂，所述多官能性单体包含选自乙二醇二甲基丙烯酸酯、和甘油-1,3-二甲基丙烯酸酯中的至少1种。
4.根据权利要求1所述的填充剂，所述亚烷基包含亚丁基、环己烷-1,4-二亚甲基中的任一者。
5.根据权利要求1所述的填充剂，所述多元醇经由来源于通过多元醇而开环了的缩水甘油基的醚键而结合。
6.根据权利要求1所述的填充剂，所述多元醇包含乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇中的任一者。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的填充剂，其用于尺寸排阻色谱。
8.权利要求1～6中任一项所述的填充剂的制造方法，其具有以下工序(A)～工序(D)，
工序(A)：将包含甲基丙烯酸缩水甘油酯和多官能性单体的原料单体在稀释剂和聚合引发剂的存在下聚合，获得作为多孔质有机高分子载体的载体α；
工序(B)：使所述载体α的来源于甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基与结构包含亚烷基的二醇化合物的一个羟基反应，获得结合了所述结构包含亚烷基的二醇化合物的末端的载体β，所述亚烷基为碳原子数4～9的直链、或包含脂肪族环的亚烷基；
工序(C)：使结合于所述载体β的所述结构包含亚烷基的二醇化合物的另一个羟基与表氯醇反应而获得向所述载体β导入了缩水甘油基的载体γ；以及
工序(D)：使所述载体γ的缩水甘油基与多元醇的羟基在水存在下反应，获得多元醇的任1个末端作为醚键结合而成的载体δ。
9.一种尺寸排阻色谱用柱，是权利要求7所述的填充剂被填充于液相色谱用壳体而成的。
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