CN116322724A - 预防认知功能障碍的益生菌 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的副干酪乳杆菌物种的细菌。本发明还涉及用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的副干酪乳杆菌物种的细菌，这些认知损害是由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的。

Description

预防认知功能障碍的益生菌
技术领域
本发明涉及用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei，先前称为Lactobacillus paracasei)物种的细菌。本发明还涉及用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的副干酪乳杆菌物种的细菌，这些认知损害是由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的。本发明进一步涉及包含副干酪乳杆菌物种的细菌的组合物(包括食物产品、膳食补充剂和药学上可接受的配制品)、副干酪乳杆菌物种的细菌或包含副干酪乳杆菌物种的细菌的组合物的方法和用途。
背景技术
在现代24小时(h)社会中，睡眠不足是贯穿整个生命周期的普遍且突出的公共卫生问题，并与许多不良的身体和心理功能障碍有关。美国国家睡眠基金会建议成年人(18-64岁)需要7-9小时睡眠/天来维持总体健康和安宁，以及认知、情绪和身体健康(Hirshkowitz等人2015)。事实上，在大多数工业化国家，大约三分之一的成年人报告睡眠持续时间减少(即少于7小时睡眠/天)(Owen和Veasey2020)，并且在美国，持续的睡眠剥夺(SD)与15种主要死亡原因中的7种有关，涉及感染、心血管并发症和代谢功能障碍等(Chattu等人2019)。此外，反复的睡眠减少会对工作效率、公共安全和总体安宁造成严重后果(Magnavita和Garbarino 2017；Simon和Walker2018)，并且已知会影响睡眠障碍(包括失眠)、精神疾病(如情绪、抑郁和焦虑)以及成瘾障碍(Geoffroy等人2020)。
许多睡眠剥夺研究揭示了睡眠结构的各个方面(Toth和Bhargava2013)，并确定了睡眠减少对认知表现(包括注意力和工作记忆以及其他功能，如长期记忆和决策)的神经行为后果(Krause等人2017)。据报道，在人和动物模型中，认知增强干预(如咖啡因和***)逆转睡眠剥夺诱导的认知损害(Colavito等人2013)，然而这样的干预与许多副作用(如定向障碍、习惯和日间疲劳)相关。因此，对研究副作用小且疗效高的药理学干预和膳食补充剂以抵消睡眠剥夺引起的认知缺陷存在未满足的需求。
微生物群-肠道-脑轴(肠道微生物群与中枢神经***之间的双向对话)为开发与增强认知功能和/或缓解认知功能障碍相关的新颖疗法提供了有吸引力的靶标。在此上下文中，已证明不同的乳杆菌属(Lactobacillus)菌株(无论是单独还是组合)在各种啮齿动物模型中改善认知功能，例如(Stenman等人2020；Liang等人2015)。在另一项研究中，特定双歧杆菌属(Bifidobacterium)菌株对健康小鼠的干预选择性地改善了物体再认记忆，减少了空间记忆测试中的错误数量，并在恐惧条件中诱导了更好的长期学习(SaVignac等人2014)。短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)A1在预防认知损害方面的安全性和有效性已在阿尔茨海默病小鼠模型和轻度认知损害参与者中报道(Kobayashi等人2019；Kobayashi等人2017)。先前也已经报道了在小鼠中睡眠剥夺后认知功能的缺陷，并且已证明益生细菌菌株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)MTCC 9510能有效缓解这样的认知破坏(Dhaliwal等人2018)。有趣的是，已证明，在健康的老年人中，更好的睡眠质量与认知任务表现的改善和某些肠道微生物门的更高比例相关，这表明睡眠质量、肠道微生物群和认知灵活性之间可能存在关系(Anderson等人2017)。
发明目的
考虑到微生物群-肠道-脑轴、睡眠生理学和认知之间的重要联系，通过益生菌补充直接调节肠道微生物群组成或影响粘膜生理学可能改善睡眠剥夺诱导的认知功能缺陷。为了检验此假设，在小鼠中建立了三种认知行为测试中重复部分睡眠剥夺的范式，以研究益生菌菌株(植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)Lp-115(先前称为Lactobacillus plantarum)(Lp-115)、副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)Lpc-37(先前称为Lactobacillus paracasei)(Lpc-37)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis ssp.lactis)420(B420))及其组合是否可以预防或治疗由于例如睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的认知损害。
发明内容
本发明基于本文所述的研究，这些研究令人惊讶地证明了副干酪乳杆菌物种、植物乳杆菌物种、动物双歧杆菌乳酸亚种物种及其组合的菌株可以预防或治疗例如由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的认知损害。
因此，在一方面，本发明提供了用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物。
在又一方面，本发明提供了用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的组合物，该组合物包含副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物。
在另一方面，本发明提供了预防或治疗有需要的受试者的认知损害的方法，所述方法包括向所述受试者施用细菌菌株或包含细菌菌株的组合物，其中所述细菌菌株是副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物。
附图说明
图1.新物体识别测试(再认记忆)。益生菌干预对由睡眠剥夺(SD)引起的再认记忆障碍的影响。在施用1×109个菌落形成单位的细菌菌株(Lp-115或Lpc-37或B420)、1.5×109个菌落形成单位的细菌组合(Lp-115+Lpc-37+B420)或媒介物30天(行为测试范式之前)和9天(行为测试范式期间)后，新物体识别测试中的认知功能。(A和B)分别为在训练日(第2天)同一物体阶段期间的物体交互频率(％)和物体交互时间(％)。(C和D)分别为在测试日(第3天)新物体阶段期间的物体交互频率(％)和物体交互时间(％)。(E和F)分别为在测试日(第3天)新物体阶段期间的辨别指数(交互频率)和辨别指数(交互时间)。
图2.Y迷宫自发交替测试(Y-maze spontaneous altemation test)(空间工作记忆)。益生菌干预对由睡眠剥夺(SD)引起的空间工作记忆障碍的影响。在施用1×109个菌落形成单位的细菌菌株(Lp-115或Lpc-37或B420)、1.5×109个菌落形成单位的细菌组合(Lp-115+Lpc-37+B420)或媒介物30天(行为测试范式之前)和9天(行为测试范式期间)后，Y迷宫自发交替测试中的认知功能。(A和B)分别为训练日(第5天)的交替行为(％)和运动(臂进入)。(C和D)分别为测试日(第6天)的交替行为(％)和运动(臂进入)。
图3.穿梭被动回避任务(Step-through passive avoidance task)(情境长期记忆)。益生菌干预对由睡眠剥夺(SD)引起的情境长期记忆的影响。在施用1×109个菌落形成单位的细菌菌株(Lp-115或Lpc-37或B420)、1.5×109个菌落形成单位的细菌组合(Lp-115+Lpc-37+B420)或媒介物30天(行为测试范式之前)和9天(行为测试范式期间)后，穿梭被动回避任务(step-through passive avoidance task)中的认知功能。(A)训练日(第8天)的进入潜伏期(latency ofentrance)(s)。(B)测试日(第9天)的穿梭潜伏期(step-throughlatency)(s)。(C)测试日(第9天)的逃逸潜伏期(escape latency)(s)。
图4.实验设计和益生菌干预中的程序时间安排。在经受睡眠剥夺(SD)的小鼠中测试了三种单独的益生菌菌株以及这三种菌株的组合，并将其与未睡眠剥夺(无SD/Veh)和睡眠剥夺的媒介物(SD/Veh)组进行比较。每日向小鼠口服管饲施用1×109个菌落形成单位的细菌单一菌株、1.5×109个菌落形成单位的细菌组合或媒介物三十天(行为测试范式之前)和九天(行为测试范式期间)。在5h的SD期后，应用行为测试来评估学习和记忆表现。使用的行为测试包括新物体识别测试(NOR；第一至第三天)、Y迷宫自发交替测试(Y迷宫；第五天和第六天)和穿梭被动回避任务(STPA；第八天和第九天)，并且第四天和第七天休息两天。
具体实施方式
以下陈述了本发明的详细方面。在单独的部分中部分地讨论了一些详细方面。这是为了便于参考，并且绝对不是限制性的。下面描述的所有实施例同样适用于本发明的所有方面，除非上下文另有特别规定。
细菌
用于本发明各方面的细菌是副干酪乳杆菌物种的细菌。在一方面，副干酪乳杆菌是菌株Lpc-37，也称为Lbc81。该菌株可商购自杜邦营养生物科学公司(DuPont NutritionBiosciences ApS)。这种副干酪乳杆菌的菌株也已经由杜邦营养生物科学公司(丹麦哥本哈根K区Langebrogade街1号，邮编DK-1411(Langebrogade 1，DK-1411Copenhagen K，Denmark))，根据布达佩斯条约于2017年10月5日在莱布尼茨学院(Leibniz-Institut)德国微生物及细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)(DSMZ)(德国不伦瑞克38124，Inhoffenstrasse 7B(Inhoffenstrasse7B，38124Braunschweig，Germany))，保藏在参考号DGCC4981下，其中它以登录号DSM 32661记录。
用于本发明各方面的其他细菌是动物双歧杆菌乳酸亚种物种的细菌。在特别优选的实施例中，本发明中使用的细菌是动物双歧杆菌乳酸亚种菌株420(B420)。该菌株可商购自杜邦营养生物科学公司。这种动物双歧杆菌乳酸亚种的菌株也已经由杜邦营养生物科学公司(丹麦哥本哈根K区Langebrogade街1号，邮编DK-1411)，根据布达佩斯条约于2015年6月30日在莱布尼茨学院德国微生物及细胞培养物保藏中心(DSMZ)(德国不伦瑞克38124，Inhoffenstrasse 7B)，保藏在参考号DGCC420下，其中它以登录号DSM32073记录。
用于本发明各方面的其他细菌是植物乳杆菌物种的细菌。在一方面，植物乳杆菌是菌株Lp-115。该菌株可商购自杜邦营养生物科学公司。
优选地，在本发明中使用的细菌菌株是通常被认为是安全的(GRAS)并且优选地被GRAS批准的细菌菌株。GRAS是美国食品和药物管理局(FDA)的标志数据：专家认为添加到食物中的化学物质或物质是安全的，并且因此免除了通常的联邦食品，药品和化妆品法案(FFDCA)食品添加剂耐受性要求。
在第一方面，本发明提供了用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物。
认知损害通常被定义为一个人在记忆、学***的损害可能会导致失去理解某事的意义或重要性的能力以及说话或写作的能力，从而导致无法独立生活。认知损害通常是由于心理疲劳。心理疲劳包括注意力缺陷(attention deficiencies)、缺乏专注(lack of focusing)、健忘(forgetfulness)、缺乏生产力(lack ofproductivity)、注意力不集中(lack of concentration)、思维清晰度降低(reducedmental clarity)、注意力问题(problempayingattention)、注意力持续时间短(shortattention span)和学习困难等症状。
在另一个方面，本发明提供了用于在预防或治疗认知损害中使用的细菌菌株，其中这些认知损害是由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的。睡眠剥夺和/或睡眠不足可能是由于睡眠障碍。睡眠障碍是或者可以是睡眠呼吸暂停、发作性睡病、失眠和/或睡眠异态。
在一方面，认知损害是学习和记忆障碍。
在另一个方面，认知损害是再认记忆、空间工作记忆和/或情境长期记忆障碍。
认知损害导致神经精神病症、心理疾病和/或神经***变性疾病。神经精神病症和/或心理疾病是情感障碍、抑郁、焦虑、神经症性障碍和成瘾障碍。神经***变性疾病是痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆、亨廷顿病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病、韦尼克-科尔萨科夫综合征。
根据本发明，副干酪乳杆菌可与一种或多种其他细菌物种组合使用，这些其他细菌物种具有对其施用的宿主发挥积极健康益处的能力。
副干酪乳杆菌可以任何形式(例如活的、休眠的、灭活的或死的细菌)使用，只要细菌保持发挥本文所述的作用的能力。优选地，用于本发明各方面的副干酪乳杆菌是活的。
优选地，副干酪乳杆菌和当用于本发明的各方面时的其他细菌物种适合于人类和/或动物食用。技术人员将容易了解副干酪乳杆菌的特定菌株和用于食物和/或农业并且一般地被认为适合人类和/或动物食用的其他细菌菌株。
任选地，副干酪乳杆菌和当用于本发明的各方面时的其他细菌菌株是益生细菌。术语“益生细菌”被定义为包括任何非致病细菌，其当以活菌向宿主施用足够数量时，细菌赋予宿主健康益处。若要分类为“益生菌”，细菌必须存活地通过宿主消化道的上部。它们是非致病性的、无毒的，并且一方面经由与消化道中的常居菌群的生态相互作用以及另一方面通过它们以积极的方式影响宿主生理和免疫***的能力发挥其对健康的有益作用。当施用于宿主足够数量的益生细菌时，益生细菌具有前进通过肠道的能力，从而保持生存力并在宿主胃肠道的管腔和/或壁中发挥其主要作用。然后，它们短暂地形成常居菌群的一部分，并且这种定殖(或短暂定殖)允许益生细菌发挥有益的作用，如抑制存在于菌群中的潜在致病性微生物以及与包括免疫***的肠内宿主相互作用。
因此，在本发明的特定方面，根据本发明使用的细菌菌株是益生菌菌株。特别地，副干酪乳杆菌物种的菌株是于2017年10月5日在DSMZ以保藏号DSM32661登记的菌株Lpc-37。
组合物
术语“组合物”在广义上用于意指某物的组成方式，即其一般组成。在本发明的方面，组合物可基本上由副干酪乳杆菌物种细菌的单一菌株组成。
可替代地，组合物可以包含副干酪乳杆菌菌株以及其他组分，如其他细菌菌株、生物和化学组分、活性成分、代谢物、营养素、纤维、益生元等。在本发明的特定方面，存在于组合物中的其他细菌菌株是菌株Lp-11 5和/或菌株B420(菌株B420于2015年6月30日在DSMZ以保藏号DSM32073登记)。
在一方面，本发明提供了包含副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物的组合物，该组合物用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用。
根据本发明，认知损害是或可能是由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的。在本发明的特定方面，认知损害是学习和记忆障碍。在本发明的另一个特定方面，认知损害是再认记忆、空间工作记忆和/或情境长期记忆障碍。
在特定方面，睡眠剥夺和/或睡眠不足可能是由于睡眠障碍。在本发明的另一个方面，睡眠障碍是或者可以是睡眠呼吸暂停、发作性睡病、失眠和/或睡眠异态。
在本发明的另一个方面，认知损害导致神经精神病症、心理疾病和/或神经***变性疾病。神经精神病症和/或心理疾病是或可能是情感障碍、抑郁、焦虑、神经症性障碍和成瘾障碍。
在本发明的另外和特定方面，神经***变性疾病是痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆、亨延顿病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病、韦尼克-科尔萨科夫综合征。
在本发明的又另一方面，认知损害是由于心理疲劳。在特定方面，心理疲劳包括注意力缺陷、缺乏专注、健忘、缺乏生产力、注意力不集中、思维清晰度降低、注意力问题、注意力持续时间短和学习困难等症状。
特别地，根据本发明的组合物的细菌菌株是益生菌菌株。
在根据本发明的另一特定情况中，组合物的菌株是于2017年10月5日在DSMZ以保藏号DSM32661登记的菌株Lpc-37。
根据本发明的一方面，组合物是喷雾干燥或冷冻干燥的组合物。
根据本发明的另一方面，组合物包含冷冻保护剂。
在本发明的又另一方面，副干酪乳杆菌物种的细菌菌株以106至1012，例如108至1012个菌落形成单位(CFU)/剂量，任选地1010CFU/剂量的量存在于组合物中。
虽然不要求组合物包含任何支持物、稀释剂或赋形剂，但可以以本领域技术人员熟悉的方式添加和使用这样的支持物、稀释剂或赋形剂。合适的赋形剂的实例包括但不限于微晶纤维素、水稻麦芽糊精、二氧化硅和硬脂酸镁。本发明的组合物还可包含冷冻保护剂组分(例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、抗坏血酸钠和/或其他合适的冷冻保护剂)。
术语“组合物”和“配制品”可互换使用。
用于本发明各方面的组合物可以采取固体、液体、溶液或悬浮液制剂的形式。固体制剂的实例包括但不限于：可以是可湿性的、喷雾干燥的或冷冻干燥/冻干的片剂、丸剂、胶囊、颗粒剂和粉末。组合物可以含有调味剂或着色剂。组合物可以配制用于立即释放、延迟释放、修饰释放、持续释放、脉冲释放或控制释放应用。
举例来说，如果本发明的组合物以片剂形式使用，片剂也可含有以下中的一种或多种：赋形剂，如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂，如淀粉(优选玉米、土豆或木薯淀粉)、乙醇酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；制粒粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和***树胶；润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
用于制备组合物的其他可接受载剂的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
对于水性悬浮液和/或酏剂，可将本发明的组合物与各种甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(例如水、丙二醇和甘油及其组合)进行组合。
为了说明的目的，下文列出了可用于本发明各方面的组合物的特定非限制性实例。这些包括但不限于食物产品、食物成分、功能性食物、膳食补充剂、药物组合物和药物。
食物产品
本发明的组合物可以采取食物产品的形式。此处，术语“食物”在广义上使用，并且包括人类的食物和饮物，也包括动物的食物和饮物(即，饲料)。优选地，食物产品适用于并且设计用于人类食用。
根据用途和/或应用方式和/或施用方式，食物可以呈液体、固体或悬浮液的形式。
当呈食物产品的形式时，组合物可以包含以下中的一种或多种或与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载剂、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。
举例来说，本发明的组合物可以采取下列之一的形式：
果汁；含有乳清蛋白的饮料：保健茶或草药茶、可可饮料、乳饮料、乳酸菌饮料、酸奶和/或饮料酸奶、奶酪、冰淇淋、水冰、甜点、糖果、饼干、蛋糕、蛋糕混合物或蛋糕馅料、休闲食品、水果馅料、蛋糕或甜甜圈糖霜、即食烘焙馅料奶油、饼干馅料、即用烘焙馅料、卡路里降低的馅料、成人营养饮料、酸化大豆/果汁饮料、营养或保健棒、饮料粉末、钙强化豆奶或钙强化咖啡饮料。
任选地，在产品是食物产品的情况下，细菌副干酪乳杆菌应该通过正常的“最迟销售”日期或“截止”日期(在该日期期间食物产品由零售商出售)自始至终保持有效。优选地，有效时间应超过此类日期，直到食物腐败变质变得明显时的正常新鲜期结束。期望的时间长度和正常保质期将随食料而变化，并且本领域普通技术人员将认识到，保质期时间取决于食料的种类、食料的大小、储存温度、加工条件、包装材料和包装设备而变化。
食物成分
本发明的组合物可采取食物成分和/或饲料成分的形式。
如本文所用，术语“食物成分”或“饲料成分”包括作为或可以添加到功能性食物或食料中作为用于人类和动物的营养和/或健康补充剂的组合物。
根据用途和/或应用方式和/或施用方式，食物成分可以呈液体、悬浮液或固体的形式。
功能性食物
本发明的组合物可以采取功能性食物的形式。
如本文所用，术语“功能性食物”意指不仅能够提供营养作用，还能够向消费者递送另外的有益作用的食物。
因此，功能性食物是具有掺入其中的组分或成分(例如本文所述的那些)的普通食物，其赋予食物特定的功能-例如医学或生理学益处-而不是纯粹的营养作用。
虽然对于功能性食物没有法律定义，大多数关注此领域的各方都同意它们是作为具有超过基本营养作用的特定健康作用而面市的食物。
一些功能性食物是保健营养品。此处，术语“保健营养品”意指不仅能够提供营养作用和/或味道满足，还能够向消费者递送治疗(或其他有益)作用的食物。保健营养品跨越了在食物和药之间的传统分界线。
膳食补充剂
本发明的组合物可以采取膳食补充剂的形式，或者本身可以与膳食补充剂组合使用，这些膳食补充剂在本文中也称为食物补充剂。
如本文所用，术语“膳食补充剂”是指用于摄入的含有旨在增加膳食的营养价值或健康益处(以补充膳食)的“膳食成分”的产品。“膳食成分”可包括(但不限于)以下物质中的一种或任何组合：细菌、益生菌(例如，益生细菌)、维生素、矿物质、药草或其他植物制品、氨基酸、供人们用来通过增加总膳食摄取来补充饮食的膳食物质、浓缩物、代谢物、成分或提取物。
膳食补充剂可以许多形式存在，如片剂、胶囊、软胶囊(soft gels)、凝胶胶囊(gelcaps)、液体或粉末。一些膳食补充剂可以帮助确保从膳食中摄取足够的必需营养素；另一些可能有助于降低疾病风险。
药物组合物
本发明的组合物可用作药品或用于制备药品。此处，术语“药品”以广义使用并且涵盖用于人类的药品以及用于动物的药品(即，兽医应用)。在优选的方面，药品是用于人类使用。
药品可以用于治疗目的-其本质上可以是治疗的、姑息的或预防的。
药品可以呈压缩片剂、片剂、胶囊、软膏、栓剂或可饮用溶液的形式。
当用作药品或用于制备药品时，本发明的组合物可与以下中的一种或多种结合使用：药学上可接受的载剂、药学上可接受的稀释剂、药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的辅剂、药物活性成分。
根据用途和/或应用方式和/或施用方式，药品可以呈液体的形式或作为固体。
用于本发明的副干酪乳杆菌本身可以构成药物活性成分。在一个实施例中，副干酪乳杆菌构成唯一的活性组分。可替代地，副干酪乳杆菌可以是多种(即两种或更多种)药学活性组分中的至少一种。
药物
本发明的组合物可以采取药物的形式。
如本文所用，术语“药物”涵盖在人类和兽医学中供人类和动物两者使用的药物。此外，如本文所用，术语“药物”意指提供治疗、预防和/或有益作用的任何物质。如本文所用，术语“药物”不一定限于需要上市许可证(marketing approval)的物质，而是可以包括可以用于化妆品、保健营养品、食物(包括例如饲料和饮料)、益生菌培养物和天然补救剂的物质。此外，如本文所用，术语“药物”涵盖设计用于掺入动物饲料(例如牲畜饲料和/或宠物食物)中的产品。
医疗食物
本发明的组合物可采取医疗食物的形式。
所谓“医疗食物”，意指如下食物，该食物被配制成在有或没有医生监督的情况下食用或施用并且旨在用于特定的膳食管理或状况，针对该膳食管理或状况，基于公认的科学原理，通过医学评估建立独特的营养需求。
剂量
本发明的组合物每剂量或每克组合物可包含106至1012个菌落形成单位(CFU)的一种或多种细菌菌株，并且更特别地，每剂量或每克组合物可包含108至1012CFU的一种或多种细菌菌株。任选地，组合物每剂量或每克组合物包含约1010CFU的一种或多种细菌菌株。
一种或多种细菌菌株(例如副干酪乳杆菌(如菌株Lpc-37)、和/或菌株Lp-115和/或菌株B420)可以约106至约1012CFU的细菌菌株/剂量，优选地约108至约1012CFU的细菌菌株/剂量的剂量施用。术语“每剂量”意指每天或每次摄入(优选每天)向受试者提供这种数量的细菌。例如，如果将细菌施用在食物产品中，例如在酸奶中，则酸奶可含有约106至1012CFU的细菌菌株。然而，可替代地，这种数量的细菌可以分成多次施用，每次施用由较小量的微生物负荷组成-只要受试者在任何特定时间(例如每24h期间)接受的细菌菌株的总量是约106至约1012CFU的细菌，任选地108至约1012CFU的细菌。
根据本发明，至少一种细菌菌株的有效量可以是至少106CFU的细菌/剂量，任选地约108至约1012CFU的细菌/剂量，例如约1010CFU的细菌/剂量。
在一个实施例中，副干酪乳杆菌(例如菌株Lpc-37/DSM 32661)可以约106至约1012CFU的细菌/天，任选地约108至约1012CFU的细菌/天的剂量施用。因此，此实施例中的有效量可以是约106至约1012CFU的细菌/天，任选地约108至约1012CFU的细菌/天。
在特定的实施例中，施用1×109CFU的单一细菌菌株或1.5×109CFU的细菌多菌株(bacterial multi-strain)(例如Lpc-37为5×108CFU，Lp-115为5×108CFU并且B420为5×108CFU)的量。
作用/受试者/医学适应症
在一个实施例中，如本文所用，术语“受试者”意指哺乳动物，包括例如家畜(例如，牛、马、猪和绵羊)和人。在一个实施例中，受试者是人。在一个实施例中，受试者是女性。在一个实施例中，受试者是男性。在另一个实施例中，受试者是狗(如犬属(Canis)的成员)或猫(如猫属(Felis)或豹属(Panthera)的成员)。在另一个实施例中，受试者是家禽，例如鸡、火鸡、鸭和鹅。在优选的实施例中，细菌菌株和组合物用于人类。
本发明的细菌菌株和/或组合物可用于预防或治疗有需要的受试者的认知损害。
根据美国疾病控制和预防中心(Centers for Disease Control andPrevention)(CDC)，“认知损害”是一个人在记忆、学***的损害可能会导致失去理解某事的意义或重要性的能力以及说话或写作的能力，从而导致无法独立生活。
例如，认知损害可能是睡眠剥夺和/或睡眠不足的结果。睡眠剥夺和/或睡眠不足可能是睡眠障碍(如呼吸暂停、发作性睡病、失眠和/或睡眠异态)的结果。
例如，与认知损害有关的障碍是学习和记忆障碍、再认记忆、空间工作记忆、情境长期记忆障碍、情感障碍、抑郁、焦虑、神经症性障碍、成瘾障碍、痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆、亨廷顿病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病、韦尼克-科尔萨科夫综合征、注意力缺陷、缺乏专注、健忘、缺乏生产力、注意力不集中、思维清晰度降低、注意力问题、注意力持续时间短和学习困难。
益生元
在一个实施例中，本发明的细菌菌株和组合物可进一步组合或包含一种或多种纤维和/或益生元。
益生元被定义为被宿主微生物选择性利用从而赋予健康益处的底物。这些通常是通过选择性刺激一种或有限数量的细菌的生长和/或活性而有益地影响宿主的健康、从而改善宿主健康的成分。益生元可以应用于口服途径，但是它也可以应用于其他微生物定殖部位。典型地，益生元是碳水化合物(如寡糖)，但是该定义不排除非碳水化合物(如多酚)或多不饱和脂肪酸或可以被有限数量的细菌选择性利用以赋予健康益处的其他成分。最普遍的益生元形式在营养上被归类为可溶性纤维。在某种程度上，许多形式的膳食纤维表现出一定水平的益生元作用。
在一个实施例中，益生元是选择性发酵的成分，它允许在胃肠道或皮肤微生物群落的组成和/或活性方面发生特定变化，从而赋予宿主安宁和健康益处。
合适地，益生元可根据本发明以0.01至100g/天、优选0.1至50g/天、更优选0.5至20g/天的量使用。在一个实施例中，益生元可根据本发明以1至10g/天、优选2至9g/天、更优选3至8g/天的量使用。在另一个实施例中，益生元可根据本发明以5至50g/天、优选5至25g/天的量使用。
益生元的膳食来源的实例包括大豆、菊粉来源(如菊芋(Jerusalem artichoke)、豆薯和菊苣根)、生燕麦、未精制小麦、未精制大麦和雪莲果。
合适的益生元的实例包括藻酸盐、黄原胶、果胶、槐豆胶(LBG)、菊粉、瓜尔胶，半乳寡糖(GOS)、果寡糖(FOS)、聚右旋糖1O(即，
Figure BDA0004166454720000161
)、乳糖醇、L-***糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、肌醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果糖、角叉菜胶、藻酸盐、微晶纤维素(MCC)、甜菜碱、低聚乳果糖、大豆寡糖、异麦芽酮糖(Palatinose TM)、异麦芽寡糖、葡萄糖寡糖、木寡糖、甘露寡糖、β-葡聚糖、纤维二糖、棉子糖、龙胆二糖、蜜二糖、木二糖、环糊精、异麦芽糖、海藻糖、水苏糖、潘糖、出芽短梗霉聚糖、毛蕊花糖、半乳甘露聚糖、(人类)乳寡糖和所有形式的抗性淀粉。
根据本发明的一种或多种细菌菌株和根据本发明的一种或多种纤维和/或益生元的组合在某些应用中表现出协同作用(即，大于单独使用时细菌的累加作用的作用)。
在一个实施例中，根据本发明的细菌菌株或其混合物与一种或多种纤维和/或益生元组合使用。
合适地，所使用的益生元是聚右旋糖、乳糖醇、肌醇、L-***糖、D-木糖、L-鼠李糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、果糖、角叉菜胶、藻酸盐、5微晶纤维素(MCC)、乳寡糖或甜菜碱。
在另一个方面，本发明涉及包含根据本发明的细菌菌株或其混合物和一种或多种纤维和/或益生元的组合物、食物产品、食物成分、膳食补充剂或药学上可接受的组合物。
本发明的方法、用途和其他实施例
在一方面，本发明提供了预防或治疗有需要的受试者的认知损害的方法，所述方法包括向所述受试者施用细菌菌株或包含细菌菌株的组合物，其中所述细菌菌株是副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物。
为避免疑问，本发明所述的细菌菌株和任何组合物都可用于本发明的方法和用途方面中。例如，另外的实施例包括但不限于以下所述的那些实施例：
实施例1.一种用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物。
实施例2.根据实施例1所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害是由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的。
实施例3.根据实施例1所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害是学习和记忆障碍。
实施例4.根据实施例1所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害是再认记忆、空间工作记忆和/或情境长期记忆障碍。
实施例5.根据实施例1所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害导致神经精神病症、心理疾病和/或神经***变性疾病。
实施例6.根据实施例5所述使用的细菌菌株，其中所述神经精神病症和/或心理疾病是情感障碍、抑郁、焦虑、神经症性障碍和成瘾障碍。
实施例7.根据实施例5所述使用的细菌菌株，其中所述神经***变性疾病是痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆、亨廷顿病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病、韦尼克-科尔萨科夫综合征。
实施例8.根据实施例2所述使用的细菌菌株，其中所述睡眠剥夺和/或睡眠不足是由于睡眠障碍。
实施例9.根据实施例8所述使用的细菌菌株，其中所述睡眠障碍是睡眠呼吸暂停、发作性睡病、失眠和/或睡眠异态。
实施例10.根据实施例1-9中任一项所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害是由于心理疲劳。
实施例11.根据实施例10所述的细菌菌株，其中心理疲劳包括注意力缺陷、缺乏专注、健忘、缺乏生产力、注意力不集中、思维清晰度降低、注意力问题、注意力持续时间短和学习困难等症状。
实施例12.根据前述实施例中任一项所述使用的细菌菌株，其中所述副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物是益生菌菌株。
实施例13.根据实施例1-12中任一项所述使用的细菌菌株，其中所述副干酪乳杆菌物种的菌株是于2017年10月5日在DSMZ以保藏号DSM32661登记的菌株Lpc-37。
实施例14.一种用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的组合物，该组合物包含副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物。
实施例15.根据实施例14所述使用的组合物，其中所述认知损害是由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的。
实施例16.根据实施例14所述使用的组合物，其中所述认知损害是学习和记忆障碍。
实施例17.根据实施例14所述使用的组合物，其中所述认知损害是再认记忆、空间工作记忆和/或情境长期记忆障碍。
实施例18.根据实施例14所述使用的组合物，其中所述认知损害导致神经精神病症、心理疾病和/或神经***变性疾病。
实施例19.根据实施例18所述使用的组合物，其中所述神经精神病症和/或心理疾病是情感障碍、抑郁、焦虑、神经症性障碍和成瘾障碍。
实施例20.根据实施例19所述使用的组合物，其中所述神经***变性疾病是痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆、亨廷顿病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病、韦尼克-科尔萨科夫综合征。
实施例21.根据实施例15所述使用的组合物，其中所述睡眠剥夺和/或睡眠不足是由于睡眠障碍。
实施例22.根据实施例21所述使用的组合物，其中所述睡眠障碍是睡眠呼吸暂停、发作性睡病、失眠和/或睡眠异态。
实施例23.根据实施例14-22所述使用的组合物，其中所述认知损害是由于心理疲劳。
实施例24.根据实施例23所述使用的组合物，其中心理疲劳包括注意力缺陷、缺乏专注、健忘、缺乏生产力、注意力不集中、思维清晰度降低、注意力问题、注意力持续时间短和学习困难等症状。
实施例25.根据实施例14-24中任一项所述使用的组合物，其中所述副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物是益生菌菌株。
实施例26.根据实施例14-25中任一项所述使用的组合物，其中所述副干酪乳杆菌物种的菌株是于2017年10月5日在DSMZ以保藏号DSM32661登记的菌株Lpc-37。
实施例27.根据实施例14-26中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物包含另外的细菌。
实施例28.根据实施例27所述使用的组合物，其中所述另外的细菌是于2015年6月30日在DSMZ以保藏号DSM32073登记的菌株Lp-115和/或菌株B420。
实施例29.根据实施例14-28中任一项所述的组合物，其中所述组合物是食物产品、食物成分、膳食补充剂或药物组合物。
实施例30.一种预防或治疗有需要的受试者的认知损害的方法，所述方法包括向所述受试者施用细菌菌株或包含细菌菌株的组合物，其中所述细菌菌株是副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物。
实施例31.根据实施例30所述的方法，其中所述认知损害是由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的。
实施例32.根据实施例30所述的方法，其中所述认知损害是学习和记忆障碍。
实施例33.根据实施例30所述的方法，其中所述认知损害是再认记忆、空间工作记忆和/或情境长期记忆障碍。
实施例34.根据实施例30所述的方法，其中所述认知损害导致神经精神病症、心理疾病和/或神经***变性疾病。
实施例35.根据实施例34所述的方法，其中所述神经精神病症和/或心理疾病是情感障碍、抑郁、焦虑、神经症性障碍和成瘾障碍。
实施例36.根据实施例35所述的方法，其中所述神经***变性疾病是痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆、亨廷顿病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病、韦尼克-科尔萨科夫综合征。
实施例37.根据实施例31所述的方法，其中所述睡眠剥夺和/或睡眠不足是由于睡眠障碍。
实施例38.根据实施例37所述的方法，其中所述睡眠障碍是睡眠呼吸暂停、发作性睡病、失眠和/或睡眠异态。
实施例39.根据实施例30-38中任一项所述的方法，其中所述认知损害是由于心理疲劳。
实施例40.根据实施例39所述的方法，其中心理疲劳包括注意力缺陷、缺乏专注、健忘、缺乏生产力、注意力不集中、思维清晰度降低、注意力问题、注意力持续时间短和学习困难等症状。
实施例41.根据实施例30-40中任一项所述的方法，其中所述副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物是益生菌菌株。
实施例42.根据实施例30-41中任一项所述的方法，其中所述副干酪乳杆菌物种的菌株是于2017年10月5日在DSMZ以保藏号DSM32661登记的菌株Lpc-37。
实施例43.根据实施例30-41中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含另外的细菌。
实施例44.根据实施例43所述的组合物，其中所述另外的细菌是于2015年6月30日在DSMZ以保藏号DSM32073登记的菌株Lp-115和/或菌株B420。
实例
提供以下实例以证明和进一步说明本发明的特定实施例和方面，而不应被解释为限制本发明的范围。
研究的基本原理
睡眠不足是现代社会严重的公共卫生流行病，导致记忆和其他认知功能损害。益生菌可以通过微生物群-肠道-脑轴提供一种改善认知表现的新颖方法。在此研究中，部分睡眠剥夺用于诱导小鼠的认知损害，以确定益生菌的效果。在部分睡眠剥夺的小鼠中测试了副干酪乳杆菌Lpc-37(Lpc-37)、植物乳杆菌Lp-115(Lp-115)、动物双歧杆菌乳酸亚种420(B420)及其组合，并与未睡眠剥夺和睡眠剥夺的媒介物组(安慰剂组)进行比较。每日向小鼠口服管饲施用1×109个菌落形成单位(CFU)的细菌单一菌株、1.5×109CFU的细菌多菌株或媒介物三十天(在行为测试范式之前)和九天(在行为测试范式期间)。行为测试(包括新物体识别(NOR)、自发交替Y迷宫(Y迷宫)和穿梭被动回避(STPA)任务)用于评估部分睡眠剥夺后的学习和记忆表现。
研究设计
总体研究设计和计划
动物
体重30-35g的五周大的雄性瑞士小鼠购自JANVIER(圣伯特文(SaintBerthevin)，法国)。将小鼠分组圈养在温度和湿度受控的，12h光/暗循环的动物设施中(7pm熄灯)。每个笼圈养六只小鼠，随意获取食物(SAFE A04C，SAFE，圣布里斯路(Route deSaint Bris)，89290AUGY，法国)和水，笼中的所有小鼠接受相同的治疗。根据2010年9月22日欧洲议会和理事会(European Parliament and of the Council)指令2010/63/UE的建议，本研究在Amylgen公司的动物设施(批准号A-34-169-002)中进行。该方案由朗格多克鲁西荣伦理委员会(Languedoc Roussillon Ethic Committee)CE2A-36批准。通常，每天目视监测小鼠的总体健康状况(毛发和眼睛)和活动/状况(自主活动和姿势)。每周记录三次体重测量。
实验设计和益生菌干预
将小鼠随机分配到六个治疗组(n＝12/组)：未睡眠剥夺的媒介物(无SD/Veh)，睡眠剥夺的媒介物(SD/Veh)，和补充有单一菌株Lp-115(SD/Lp-115)、Lpc-37(SD/Lpc-37)、B420(SD/B420)或细菌多菌株(Lpc-37+Lp-115+B420；SD/多菌株)的四个睡眠剥夺组。
参与小鼠治疗和护理的实验者对实验治疗组是不知情的，并且为每种治疗分配一个编号以维持不知情的状态。益生菌治疗组中的小鼠经口管饲1×109个菌落形成单位(CFU)的单一细菌菌株或1.5×109CFU的细菌多菌株(Lp-115为5×108CFU，Lpc-37为5×108CFU，并且B420为5×108CFU)。冷冻干燥的细菌培养物由丹尼斯科培养物公司(DaniscoCultures)(丹尼斯克美国公司(Danisco USA Inc.)(杜邦营养生物科学公司；麦迪逊，威斯康星州)的一个部门)产生，并每天将其新鲜稀释到100μl的生理盐水(双去离子水中的0.9％NaCl)中，以达到正确的剂量。媒介物小鼠仅经口管饲100μl/天的生理盐水溶液。持续进行每天细菌干预三十天(行为测试范式之前)和九天(行为测试范式期间)，直到行为评估的最后一天。在第十天(最后一次行为测试后的第二天)，将所有小鼠(n＝72)用4％异氟烷麻醉，并通过颈脱位处死。图4示意性地显示了程序的时间安排。
行为测试范式
在三十天的益生菌或媒介物干预后，所有小鼠都接受了行为测试范式，以测量睡眠剥夺后的认知功能(学习和记忆)。新物体识别(NOR)测试用于测量短期非空间再认记忆；Y迷宫自发交替(Y迷宫)测试用于测量短期工作的空间工作记忆，并且穿梭被动回避(STPA)任务用于测量情境长期记忆。
连续九天进行行为评估：
-第1天)NOR(习惯化)；
-第2天)NOR(同一物体阶段)；
-第3天)NOR(新物体阶段)；
-第4天)休息；
-第5天)Y迷宫(训练阶段)；
-第6天)Y迷宫(测试阶段)；
-第7天)休息；
-第8天)STPA(训练阶段)以及
-第9天)STPA(测试阶段)。
在第二天、第五天和第八天，在每次行为测试的训练阶段之后，立即在活动期开始前(7pm)对小鼠进行5h的睡眠剥夺。
所有行为测试都在动物设施内专门配备的房间中进行。为了使压力最小化，在测试前通过将饲养笼放置在测试室至少30min来使小鼠适应测试室。在所有行为测试中对相同的小鼠进行评估。在每次行为测试中，对组名称不知情的研究人员仍留在测试室。此外，所有的输出都是由对实验组不知情的实验者测量的。
睡眠剥夺程序
在程序前由熟悉小鼠的训练有素的技术人员使用“温和处理”方法诱导部分睡眠剥夺。“温和处理”方法包括每当观察到睡眠的行为迹象(即嗜睡或试图保持睡眠姿势)时，通过温和的操作使随机分配到睡眠剥夺组的小鼠保持清醒。在第二天、第五天和第八天，在每次行为测试的训练阶段之后，立即在活动期开始之前(7pm)，在小鼠的饲养笼中对小鼠进行5h的睡眠剥夺。
终点测量
新物体识别(NOR)测试
NOR测试利用了老鼠探索新物体的自然趋势，并测量了在新物体相对于熟悉物体上花费的时间。测试包括习惯期(第一天)、训练期(第二天)和测试期(第三天)。
在评估NOR之前，小鼠均适应了测试活动场所，以测量焦虑相关的行为、自主活动和刻板行为(例如后腿直立和理毛)。旷场(OF)场地是白色有机玻璃开放活动场所(50cm×50cm×55cm)，地板上装有发射红外光的二极管。将小鼠放置在柔和照明(100勒克斯)的OF活动场所的中心，并允许在活动场所中自由探索10min，在此期间，使用连接到计算机的红外敏感摄像机记录它们的自主活动和行为。用
Figure BDA0004166454720000241
XT12软件(诺达思公司(Noldus))分析在活动场所中心花费的时间和自主活动、总自主活动和刻板活动。
在第二天，OF测试后24h，使小鼠重新进入同一活动场所，该活动场所含有放置在活动场所对角的两个相同物体，距离每个侧壁大约5cm。允许小鼠在活动场所中自由探索10min时间，并且在此期间，使用连接到计算机的红外敏感摄像机记录行为。
在第三天，训练期后24h，使小鼠重新进入活动场所，这一次该活动场所含有一个熟悉物体和一个新物体(第2天位置二处的物体被一个颜色、形状和质地上与熟悉的物体不同的新物体取代)。允许小鼠自由探索活动场所10min，在此期间，使用连接到计算机的红外敏感摄像机记录行为。使用50％vol/vol乙醇清洁小鼠之间的装置和物体。每天测试后，将小鼠和笼里的同伴一起放回它们的饲养笼里。
通过测量偏好指数(PI)和辨别指数(DI)来分析认知功能。物体探索被定义为当小鼠的鼻子进入物体的2cm半径范围内并且头部的方向指向物体的时间。PI计算为与位置二处的物体接触的频率或持续时间除以与两个物体(位置一和位置二)接触的总频率或总持续时间。对新物体的DI计算为小鼠在新物体和熟悉物体之间所花费的时间的差除以探索这两个物体的总时间。[辨别指数，DI＝(新物体探索时间-熟悉物体探索时间)/(新物体时间+熟悉物体探索时间)]。在DI中，结果可以在+1(即新物体花费的时间更多)和-1(即熟悉物体花费的时间更多)之间变化，其中0表示在新物体和熟悉物体之间花费的时间相等。将显示在第二天和第三天与物体接触少于十次的小鼠从评估中排除。
自发交替Y迷宫测试
Y迷宫测试是基于小鼠在探索迷宫的不同臂之间交替的先天趋向。测试包括训练期(第五天)和测试期(第六天)。
Y迷宫由灰色聚氯乙烯制成，并且每个臂长40cm，高12cm，底部宽3cm，顶部宽10cm，并汇聚在等边三角形中心区域。在第五天和第六天，将小鼠单独放置在迷宫的一个臂的末端，并允许其在8min阶段期间自由移动通过迷宫。由训练有素的技术人员目视记录一系列臂进入。使用50％vol/vol水/乙醇清洁小鼠之间的装置和物体。每天测试后，将小鼠和笼里的同伴一起放回它们的饲养笼里。在第五天，在训练期之后，立即在活动期开始前(7pm)对小鼠进行5h的睡眠剥夺。
交替被定义为连续完全进入三个臂中的每一个(不包括尾部)。最大交替数为臂进入总数减二，并且交替百分比由以下公式定义：[(交替)/(总进入-2)×100]。将显示超过10个臂进入或两天交替百分比小于20％或大于90％的小鼠从评估中排除。
穿梭被动回避(STPA)任务
STPA任务是用于评估记忆形成的情境长期记忆指数。任务包括训练期(第八天)和测试期(第九天)。
该设备包括一个两室箱(15cm×20cm×15em)，其中一个室具有白色聚氯乙烯墙壁照明的明亮围墙(enclosure)，另一个具有用黑色聚氯乙烯墙壁的黑暗围墙，由可伸缩门连接。第八天，将每只小鼠放在亮室中。5秒钟后，将可伸缩的门抬起。当小鼠进入暗室时，将门关闭，并且使用电击发生器扰频器(拉菲德仪器(Lafayette Instrument)，拉菲德，美国)通过网格地板传递扰频脚部电击(0.3mA，3秒持续时间)。每只单独的小鼠从光室到电网地板的时间被认为是穿梭潜伏期时间的度量，并记录进入的穿梭潜伏期。在第八天，在训练期之后，立即在活动期开始前(7pm)对小鼠进行5h的睡眠剥夺。
在第九天，训练后24h，将小鼠放回亮室，并且学习的衡量标准是再次进入暗室所用的时间。5秒钟后，将门抬高。如果动物没有穿过黑暗围墙，则建立高达300秒截止时间的穿梭潜伏期。还记录了逃逸到亮室的穿梭潜伏期。使用50％vol/vol水/乙醇清洁小鼠之间的装置和物体。每天测试后，将小鼠和笼里的同伴一起放回它们的饲养笼里。
统计分析
除被动回避潜伏期外，所有值均表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。如果数据呈正态分布，则首先使用夏皮罗-威尔克检验(Shapiro-Wilk test)检查所有数据正态性，并且然后使用单因素ANOVA随后Dunnett多重比较检验或双因素ANOVA然后Sidak多重比较检验分析所有数据。非正态分布数据(即被动回避潜伏期)使用非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test)，随后邓恩多重比较检验(Dunn’s test)来分析。使用GraphPad Prism software v.6(GraphPad软件公司(GraphPad Software Inc.)，拉荷亚，加利福尼亚州，美国)分析所有数据。低于0.05的p值被认为具有统计学意义。
结果和说明
新物体识别(NOR)测试(再认记忆；图1)
NOR测试用于评估益生菌对睡眠剥夺的小鼠短期非空间再认记忆能力的影响；结果显示在图1中。
在NOR测试的第二天期间和睡眠剥夺之前，与媒介物组相比，细菌干预对两个相似物体的交互频率(图1A)或物体交互时间(图1B)没有显著影响。
在获得记忆(即熟悉物体)后(NOR测试的第二天)立即进行睡眠剥夺导致在NOR测试的第三天识别熟悉物体的能力被显著破坏。而与50％的理论值相比，无SD/Veh组对新物体具有显著更高的交互频率(p＜0.05；图1C)和交互时间(p＜0.001；图1D)，在SD/Veh组中没有观察到相同的结果。在用Lpc-37干预后，尽管有一段时间的睡眠剥夺，与50％的理论值相比，SD/Lpc-37组的小鼠对新物体具有显著更高的相交互频率(p＜0.05；图1C)和交互时间(p＜0.001；图1D)。类似地，与50％的理论值相比，SD/多菌株治疗的小鼠显示对新物体的交互频率(p＜0.01；图1C)和交互时间(p＜0.001；图1D)增加。与SD/Veh组类似，用Lp-11 5或B420进行干预并不能预防由睡眠剥夺引起的再认记忆障碍(图1C和1D)。
睡眠剥夺似乎对物体交互接触频率的DI没有影响，因为SD/Veh组与无SD/Veh组没有显著差异(图1E)。此外，当将治疗组与SD/Veh进行比较时，细菌干预对该DI测量没有影响(图1E)。在交互时间的DI中，与无SD/Veh组相比，SD/Veh组中观察到统计学差异(p＜0.001；图1F)。与SD/Veh组相比，交互时间的DI中反映，即使在部分睡眠剥夺后，Lpc-37(p＜0.001)和多菌株(p＜0.001)仍具有显著更强的区分新的和熟悉的物体的能力(图1F)。在此指数中，与SD/Veh组类似，用Lp-115或B420进行干预不导致区分新的和熟悉的物体的能力更大(图1F)。Lpc-37和多菌株与无SD/Veh组没有显著差异(图1F)。
统计分析：所有数据均采用单因素ANOVA(F值)和Dunnett多重比较检验进行分析。将物体交互频率(％)和物体交互时间(％)的统计分析与50％的理论值(或对于DI，为“0”)进行比较。除非另有说明，否则所有组的n＝12。数据表示为平均值±SEM。
$p＜0.05，$$p＜0.01(相对于50％的理论值)(C)；$$$相对于50％的理论值，p＜0.001(D)；***相对于无SD/Veh组，p＜0.001(F)；###相对于SD/Veh组，p＜0.001(1F)。
Y迷宫自发交替测试(空间工作记忆；图2)
Y迷宫自发交替测试用于评估益生菌对睡眠剥夺小鼠的空间工作记忆的影响，结果如图2中所示。
在第五天，在自发交替Y迷宫测试的训练阶段期间和睡眠剥夺之前，没有治疗组与媒介物组在自发交替行为方面有显著差异(图2A)。此外，与媒介物组相比，细菌干预对运动或臂进入没有影响(图2B)。在行为测试范式的第六天，在Y迷宫测试中，获得记忆(即空间学习和参考记忆的评估)后立即进行睡眠剥夺导致对空间工作记忆的显著破坏。在测试阶段期间，与无SD/Veh组相比，SD/Veh组的小鼠表现出自发交替的显著减少(p＜0.001；图2C)。睡眠剥夺对运动或臂进入没有影响，并且媒介物组之间没有显著差异(图2D)。用Lpc-37干预后，尽管有一段时间的睡眠剥夺，但与SD/Veh组相比，SD/Lpc-37组的小鼠具有显著增加的自发交替行为(p＜0.001；图2C)。此外，Lpc-37与无SD/Veh组没有显著差异(p＞0.05；图2C)。与SD/Veh组相比，在用细菌多菌株进行干预后，观察到自发交替行为的部分恢复(p＜0.05；图2C)。与SD/Veh组类似，用Lp-115或B420进行干预并没有增加自发交替行为(图2C)。与媒介物组相比，治疗对运动或臂进入没有显著影响(图2D)。
统计分析：所有数据均采用单因素ANOVA(F值)和Dunnett多重比较检验进行分析。除非另有说明，否则所有组的n＝12。数据表示为平均值±SEM。
***相对于无SD/Veh组，p＜0.001(C)；#p＜0.05，###p＜0.001(相对于SD/Veh组)(2C)。
穿梭被动回避(STPA)任务(情境长期记忆；图3)
STPA任务用于评估益生菌对睡眠剥夺小鼠的情境长期记忆的影响，结果如图3中所示。
在第八天，在STPA任务的训练阶段期间和睡眠剥夺之前，与媒介物组相比，所有治疗组的小鼠在穿梭潜伏期时间方面没有表现出显著差异(图3A)。在行为测试范式的第九天，在STPA任务中，获得记忆(即在暗室内关联脚部电击)后立即进行睡眠剥夺导致对情境长期记忆的显著破坏。在测试阶段期间，无SD/Veh组中的穿梭潜伏期时间与SD/Veh组类似(图3B)，并且与SD/Veh组相比，细菌干预对穿梭潜伏期时间没有显著影响(图3B)。所有小鼠，无论是否经受睡眠剥夺，都拒绝进入暗室，并在被手动移入暗室之前使用300秒的最大允许时间。与无SD/Veh组相比，一旦进入暗室，SD/Veh组具有显著增加的逃逸潜伏期，或离开暗室的速度显著更慢(p＜0.001；图3C)。与SD/Veh组相比，SD/Lpc-37组中的小鼠是逃逸潜伏期时间显著减少的唯一治疗组(p＜0.001；图3C)。此外，SD/Lpc-37组是唯一在逃避潜伏期时间方面与无SD/Veh组没有显著差异的治疗组，这表明用Lpc-37进行干预似乎使睡眠剥夺的影响正常化到无SD/Veh组的。
统计分析：所有数据均使用克鲁斯卡尔-沃利斯非参数ANOVA(H值)和邓恩多重比较检验进行分析。除非另有说明，否则所有组的n＝12。数据表示为平均值±SEM。
*p＜0.05，***p＜0.001(相对于无SD/Ve组)；##相对于SD/Veh组，p＜0.01(C)。
结果的一般结论
从上述结果可以得出以下结论。
·部分睡眠剥夺对睡眠剥夺的媒介物小鼠(无SD/Veh和SD/Veh)的认知功能具有显著影响；
·用Lpc-37进行干预显著改善了睡眠剥夺诱导的再认记忆障碍(NOR中)、空间工作记忆障碍(Y迷宫中)和情境长期记忆损害(STPA中)；
·细菌多菌株(Lp-115+Lpc-37+B420)显著改善了睡眠剥夺诱导的再认记忆障碍(NOR中)和空间工作记忆障碍(Y迷宫中)；
上述说明书中提及的所有出版物通过援引并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的方法和***的各种修改和变化对于本领域的技术人员将是显而易见的。尽管已经结合特定优选的实施例描述了本发明，但应当理解，如要求保护的本发明不应不适当地限制于这样的特定实施例。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所描述的实施例的各种修改旨在落入以下权利要求的范围内。

Claims (29)

1.一种用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的副干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)物种的细菌菌株或其混合物。
2.根据权利要求1所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害是由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的。
3.根据权利要求1所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害是学习和记忆障碍。
4.根据权利要求1所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害是再认记忆、空间工作记忆和/或情境长期记忆障碍。
5.根据权利要求1所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害导致神经精神病症、心理疾病和/或神经***变性疾病。
6.根据权利要求5所述使用的细菌菌株，其中所述神经精神病症和/或心理疾病是情感障碍、抑郁、焦虑、神经症性障碍和成瘾障碍。
7.根据权利要求5所述使用的细菌菌株，其中所述神经***变性疾病是痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆、亨廷顿病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病、韦尼克-科尔萨科夫综合征。
8.根据权利要求2所述使用的细菌菌株，其中所述睡眠剥夺和/或睡眠不足是由于睡眠障碍。
9.根据权利要求8所述使用的细菌菌株，其中所述睡眠障碍是睡眠呼吸暂停、发作性睡病、失眠和/或睡眠异态。
10.根据权利要求1-9中任一项所述使用的细菌菌株，其中所述认知损害是由于心理疲劳。
11.根据权利要求10所述的细菌菌株，其中心理疲劳包括注意力缺陷、缺乏专注、健忘、缺乏生产力、注意力不集中、思维清晰度降低、注意力问题、注意力持续时间短和学习困难等症状。
12.根据前述权利要求中任一项所述使用的细菌菌株，其中所述副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物是益生菌菌株。
13.根据权利要求1-12中任一项所述使用的细菌菌株，其中所述副干酪乳杆菌物种的菌株是于2017年10月5日在DSMZ以保藏号DSM32661登记的菌株Lpc-37。
14.一种用于在预防或治疗有需要的受试者的认知损害中使用的组合物，该组合物包含副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物。
15.根据权利要求14所述使用的组合物，其中所述认知损害是由睡眠剥夺和/或睡眠不足引起的。
16.根据权利要求14所述使用的组合物，其中所述认知损害是学习和记忆障碍。
17.根据权利要求14所述使用的组合物，其中所述认知损害是再认记忆、空间工作记忆和/或情境长期记忆障碍。
18.根据权利要求14所述使用的组合物，其中所述认知损害导致神经精神病症、心理疾病和/或神经***变性疾病。
19.根据权利要求18所述使用的组合物，其中所述神经精神病症和/或心理疾病是情感障碍、抑郁、焦虑、神经症性障碍和成瘾障碍。
20.根据权利要求19所述使用的组合物，其中所述神经***变性疾病是痴呆、帕金森病、阿尔茨海默病、血管性痴呆、路易体痴呆、亨延顿病、进行性核上性麻痹、额颞叶痴呆、克罗伊茨费尔特-雅各布病、韦尼克-科尔萨科夫综合征。
21.根据权利要求15所述使用的组合物，其中所述睡眠剥夺和/或睡眠不足是由于睡眠障碍。
22.根据权利要求21所述使用的组合物，其中所述睡眠障碍是睡眠呼吸暂停、发作性睡病、失眠和/或睡眠异态。
23.根据权利要求14-22所述使用的组合物，其中所述认知损害是由于心理疲劳。
24.根据权利要求23所述使用的组合物，其中心理疲劳包括注意力缺陷、缺乏专注、健忘、缺乏生产力、注意力不集中、思维清晰度降低、注意力问题、注意力持续时间短和学习困难等症状。
25.根据权利要求14-24中任一项所述使用的组合物，其中所述副干酪乳杆菌物种的细菌菌株或其混合物是益生菌菌株。
26.根据权利要求14-25中任一项所述使用的组合物，其中所述副干酪乳杆菌物种的菌株是于2017年10月5日在DSMZ以保藏号DSM32661登记的菌株Lpc-37。
27.根据权利要求14-26中任一项所述使用的组合物，其中所述组合物包含另外的细菌。
28.根据权利要求27所述使用的组合物，其中所述另外的细菌是于2015年6月30日在DSMZ以保藏号DSM32073登记的菌株Lp-115和/或菌株B420。
29.根据权利要求14-28中任一项所述的组合物，其中所述组合物是食物产品、食物成分、膳食补充剂或药物组合物。
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