CN116287277A

CN116287277A - 胞苷脱氨酶活性的生物标记物及其应用

Info

Publication number: CN116287277A
Application number: CN202310448538.8A
Authority: CN
Inventors: 张弛; 赵鑫; 王美; 牛延革
Original assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Current assignee: SHANGHAI INSTITUTE OF BIOLOGICAL PRODUCTS CO LTD
Priority date: 2023-04-24
Filing date: 2023-04-24
Publication date: 2023-06-23

Abstract

本发明公开了胞苷脱氨酶活性的生物标记物及其应用。将长非编码RNA(lncRNA)NEAT1和MALAT1在的表达水平以及在这两个lncRNA序列中个别APOBEC3B特异的RNA位点的编辑程度的测定实现对细胞和组织样本中APOBEC3B酶活性的评估。

Description

胞苷脱氨酶活性的生物标记物及其应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体地，本发明涉及胞苷脱氨酶活性的生物标记物及其应用。

背景技术

高度的异质性是肿瘤与其他恶性疾病的最大区别，也是其难以治愈的源头。大量的肿瘤基因组学研究显示，肿瘤能利用达尔文式的进化在细胞层面上完成选择、竞争和适应，从而实现肿瘤发生、微环境适应、浸润、转移以及耐药性的产生。

研究结果表明，由酶介导的核酸遗传物质突变是造成肿瘤基因组异质性的主要途径之一，而DNA/RNA脱氨酶APOBEC家族(Apolipoprotein B mRNA editing catalyticpolypeptide-like)则是这一过程的作用酶。

APOBEC家族酶能作用于单链DNA中的脱氧胞苷，通过脱氨基反应将其转化为脱氧尿苷从而在DNA层面上产生包含C>T突变在内的多种突变。在肿瘤细胞中,异常激活的APOBEC家族酶推动了异质性的积累，并通过促进分支进化产生难以治愈的耐药性克隆。在临床研究中通过大规模全基因组测序证实APOBEC家族呈异常激活，并通过驱动肿瘤异质性与耐药克隆进化导致差的预后。

一些研究与临床实践结果表明，APOBEC家族中的其他具有酶活性的成员，尤其是APOBEC3A，对APOBEC3B的基于生化手段的活性测定方法产生干扰影响。此外，虽然通过全基因组测序手段进行突变检测并且抽提单核苷酸突变谱的方法能有效预示APOBEC的活性，但是这些手段在价格昂贵的同时也不能区分APOBEC3A和APOBEC3B的活性。这也成为APOBEC3B相关的肿瘤诊断和新型靶向疗法开发所面临的一大难题。

综上，目前尚缺少能在肿瘤细胞或组织样本中直接评估APOBEC3B特异活性的方法。因此，本领域迫切需要开发在肿瘤细胞或组织样本中对APOBEC3B酶活性进行特异性检测的生物标记物。

发明内容

本发明的目的就是提供可在肿瘤细胞或组织样本中对APOBEC3B酶活性进行特异性检测的生物标记物及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于检测胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性；

其中，所述胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物选自下组：lncRNA NEAT1、lncRNAMALAT1、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测试剂用于检测lncRNA NEAT1上的选自下组的RNA编辑位点(以GRCh38参考基因组坐标)是否发生C→U变化：chr11:65425652，chr11:65444937，chr11:65428056，chr11:65441080，chr11:65431271，chr11:65436573，chr11:65436866，chr11:65442018，chr11:65443866，或其组合；

和/或，所述的检测试剂用于检测lncRNA MALAT1的选自下组的编辑位点(以GRCh38参考基因组坐标)是否发生C→U变化：chr11:65498061，chr11:65498321，chr11:65498990，chr11:65499884，chr11:65500618，chr11:65500772，chr11:65501742，chr11:65504613，或其组合。

在另一优选例中，所述诊断试剂或试剂盒还用于评估一对象为胞苷脱氨酶APOBEC3B阳性的对象，或者评估所述对象是否适合施用抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的药物。

在另一优选例中，所述的对象为肿瘤患者。

在另一优选例中，使用荧光定量PCR检测lncRNA NEAT1、lncRNA MALAT1、或其组合的表达水平，以检测胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性。

在另一优选例中，使用所述荧光定量PCR检测时，至少使用一对特异性扩增lncRNANEAT1和lncRNA MALAT1的引物，所述引物选自下组：

NEAT1_1-F(SEQ ID NO：1)：

5'-GGCACAAGTTTCACAGGCCTACATGGG-3'；

NEAT1_1-R(SEQ ID NO：2)：

5'-GCCAGAGCTGTCCGCCCAGCGAAG-3'；

NEAT1_2-F(SEQ ID NO：3)：

5'-GGAGCCAACCTGCCCTGAAT-3'；

NEAT1_2-R(SEQ ID NO：4)：

5'-CCACAGGCTACCCTCTGCTC-3'；

MALAT1-F(SEQ ID NO：5)：

5'-CTTCCCTAGGGGATTTCAGG-3'；

MALAT1-R(SEQ ID NO：6)：

5'-GCCCACAGGAACAAGTCCTA-3'。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i)胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物的RNA或其检测试剂；

其中，所述胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物选自下组：lncRNA NEAT1、lncRNAMALAT1、或其组合；和

任选的(ii)胞苷脱氨酶APOBEC3B酶、其促进剂、其抑制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的lncRNA NEAT1上的编辑位点选自下组(以GRCh38参考基因组坐标)：chr11:65425652，chr11:65444937，chr11:65428056，chr11:65441080，chr11:65431271，chr11:65436573，chr11:65436866，chr11:65442018，chr11:65443866；

其中，所述的lncRNA MALAT1上的编辑位点选自下组(以GRCh38参考基因组坐标)：chr11:65498061，chr11:65498321，chr11:65498990，chr11:65499884，chr11:65500618，chr11:65500772，chr11:65501742，chr11:65504613。

在另一优选例中，所述的抑制剂为抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶的药物。

在另一优选例中，所述的抑制剂为抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶的抗体或小分子化合物。

在另一优选例中，所述标志物来自人。

在另一优选例中，所述标志物来自非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述检测针对肿瘤患者、或肿瘤易感对象。

在另一优选例中，所述检测针对非肿瘤患者。

在另一优选例中，所述检测是针对离体样本的检测。

在另一优选例中，所述的离体样本选自下组：组织样本、细胞样本、血液样本、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测试剂偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述诊断试剂选自下组：引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)、或其组合。

在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的特异性寡核苷酸探针，所述的特异性寡核苷酸探针包括与任一所述标志物的多核苷酸(mRNA或cDNA)特异性结合的探针。

在另一优选例中，所述的试剂盒含有所述标志物的基因、RNA、和/或cDNA作为对照品或质控品。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于判断所述的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性。

在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、gRNA或其组合，更佳地为用于PCR、qPCR、RT-PCR的引物对或探针。

在另一优选例中，所述标志物的检测可通过如下的方法进行检测：测序、PCR、或其组合。

在另一优选例中，所述标志物的检测包括定量检测或定性检测。

在本发明的第三方面，提供了一种检测方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供一检测样本，所述检测样本中含有胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物，其中，所述胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物选自下组：lncRNA NEAT1、lncRNA MALAT1、或其组合；

(b)检测所述检测样本中所述标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)，记为C1；和

(c)将所述标志物中编辑位点发生C→U变化的水平C1与对照参比值C0进行比较；

其中，如果检测样本中的所述标志物检测结果满足以下条件时：C1>C0，则提示所述检测样本中的所述胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性高。

在另一优选例中，所述变化的水平(或程度)为所述检测样本中所述标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值(记为C1)。

在另一优选例中，所述变化的水平(或程度)为所述检测样本中所述标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与检测样本中相应lncRNA(lncRNA NEAT1和/或lncRNA MALAT1)的数量(如摩尔数)的比值(记为C1)。

在另一优选例中，在步骤(b)和(c)包括：

(b)检测所述检测样本中所述标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值，记为C1；和

(c)将所述标志物中编辑位点发生C→U变化数量相对于未发生变化数量的比值C1与对照样本中同样位点的C→U变化数量相对于未发生变化数量C0进行比较；

在另一优选例中，所述的C1>C0指统计学上显著大于。

在另一优选例中，对照参比值C0是在预定或已知的酶活性的胞苷脱氨酶APOBEC3B存在下，所测定的同一标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值。

在另一优选例中，对照参比值C0是在预定或已知的酶活性的胞苷脱氨酶APOBEC3B存在下，所测定的同一标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)。

在另一优选例中，对照参比值C0是在无酶活性的胞苷脱氨酶APOBEC3B存在下，所测定的同一标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值。

在另一优选例中，对照参比值C0是在无酶活性的胞苷脱氨酶APOBEC3B存在下，所测定的同一标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)。

在另一优选例中，如果检测样本中的所述标志物检测结果满足以下条件时：C0/C1≤2/3或C0/C1≤1/2，较佳地C0/C1≤1/5，更佳地C0/C1≤1/10，则提示所述检测样本中的所述胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性高于参比值C0所对应的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性。

在另一优选例中，所述的lncRNA NEAT1上的编辑位点选自下组(以GRCh38参考基因组坐标)：chr11:65425652，chr11:65444937，chr11:65428056，chr11:65441080，chr11:65431271，chr11:65436573，chr11:65436866，chr11:65442018，chr11:65443866、或其组合；

其中，所述的lncRNA MALAT1上的编辑位点选自下组(以GRCh38参考基因组坐标)：chr11:65498061，chr11:65498321，chr11:65498990，chr11:65499884，chr11:65500618，chr11:65500772，chr11:65501742，chr11:65504613、或其组合。

在另一优选例中，所述的检测方法是非诊断、非治疗的。

在本发明的第四方面，提供了一种评估胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的设备，所述设备包括：

(a)输入模块，所述输入模块用于输入来自某一对象待检测样本的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物数据，所述数据包括所述标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)；

其中，所述胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物选自下组：lncRNA NEAT1、lncRNAMALAT1、或其组合；

其中，所述的lncRNA NEAT1上的编辑位点选自下组(以GRCh38参考基因组坐标)：chr11:65425652，chr11:65444937，chr11:65428056，chr11:65441080，chr11:65431271，chr11:65436573，chr11:65436866，chr11:65442018，chr11:65443866、或其组合；

其中，所述的lncRNA MALAT1上的编辑位点选自下组(以GRCh38参考基因组坐标)：chr11:65498061，chr11:65498321，chr11:65498990，chr11:65499884，chr11:65500618，chr11:65500772，chr11:65501742，chr11:65504613、或其组合；

(b)处理模块，所述处理模块对于输入的所述标志物数据进行处理，从而获得所述胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的评估结果；和

(c)输出模块，所述输出模块用于输出所述胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的评估结果。

在另一优选例中，所述处理模块的处理包括处理器，其可通过程序实现自动计算。

在另一优选例中，所述变化的水平(或程度)为所述检测样本中所述标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值。

在另一优选例中，所述变化的水平(或程度)为所述检测样本中所述标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与检测样本中相应lncRNA(lncRNA NEAT1和/或lncRNA MALAT1)的数量(如摩尔数)的比值。

在另一优选例中，在步骤(a)包括：

(a)输入模块，所述输入模块用于输入来自某一对象待检测样本的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物数据，所述数据包括所述标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值。

在本发明的第五方面，提供了一种筛选潜在化合物的方法，其特征在于，所述化合物为潜在的促进或抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的化合物，所述方法包括步骤：

(a)提供待筛选的化合物；

(b)在测试组中，在所述化合物存在下，培养细胞；并且在空白对照组中，在所述化合物不存在且其他条件相同的情况下，培养所述细胞，和

(c)检测测试组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)，记为C1；以及检测空白对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)，记为参考值C0；

如果所述标志物水平C1显著大于参考值C0，则判定所述化合物为促进胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的潜在化合物；

如果所述标志物水平C1显著小于参考值C0，则判定所述化合物为抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的潜在化合物。

在另一优选例中，所述测试组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)为所述测试组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值(记为C1)。

在另一优选例中，所述测试组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)为所述测试组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与所述测试组的样本中相应lncRNA(lncRNANEAT1和/或lncRNA MALAT1)的数量(如摩尔数)的比值(记为C1)。

在另一优选例中，所述空白对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)为所述空白对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值(记为C0)。

在另一优选例中，所述空白对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)为所述空白对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与所述空白对照组中的样本中相应lncRNA(lncRNA NEAT1和/或lncRNA MALAT1)的数量(如摩尔数)的比值(记为C0)。

在另一优选例中，在步骤(c)包括：

(c)检测测试组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的变化的数量与未发生变化数量的比值，记为C1；以及检测空白对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的变化的数量与未发生变化数量的比值，记为参考值C0；

在另一优选例中，如果检测样本中的所述标志物检测结果满足以下条件时：C0/C1≤2/3或C0/C1≤1/2，较佳地C0/C1≤1/5，更佳地C0/C1≤1/10，则提示所述化合物为潜在的促进或抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的化合物。

在另一优选例中，所述的筛选方法是体外筛选方法。

在另一优选例中，所述的方法在步骤(b)中，还包括：促进剂阳性对照组，其中，在促进剂阳性对照组中，在促进胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的化合物存在且其他条件相同的情况下，培养所述细胞；

并且在步骤(c)，检测促进剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)，记为参考值Y0；

其中，如果所述标志物水平C1显著大于参考值Y0，则判定所述化合物为促进胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的化合物。

在另一优选例中，所述促进剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)为所述促进剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值(记为Y0)。

在另一优选例中，所述促进剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)为所述促进剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与所述测试组的样本中相应lncRNA(lncRNA NEAT1和/或lncRNA MALAT1)的数量(如摩尔数)的比值(记为Y0)。

在另一优选例中，在步骤(c)包括：

(c)检测促进剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的变化的数量与未发生变化数量的比值，记为Y0。

在另一优选例中，对照参比值Y0是在预定或已知的阳性对照促进剂、和预定或已知的酶活性的胞苷脱氨酶APOBEC3B存在下，所测定的同一标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值。

在另一优选例中，对照参比值Y0是在预定或已知的阳性对照促进剂、和预定或已知的酶活性的胞苷脱氨酶APOBEC3B存在下，所测定的同一标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)。

在另一优选例中，如果检测样本中的所述标志物检测结果满足以下条件时：Y0/C1≤2/3或Y0/C1≤1，较佳地Y0/C1≤1/2，更佳地Y0/C1≤1/3，最佳地Y0/C1≤1/5，则提示所述化合物为潜在的促进胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的化合物。

在另一优选例中，所述的方法在步骤(b)中，还包括：抑制剂阳性对照组，其中，在抑制剂阳性对照组中，在抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的化合物存在且其他条件相同的情况下，培养所述细胞；

并且在步骤(c)，检测抑制剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)，记为参考值Z0；

其中，如果所述标志物水平C1显著小于参考值Z0，则判定所述化合物为抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的化合物。

在另一优选例中，所述抑制剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)为所述抑制剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值(记为Z0)。

在另一优选例中，所述抑制剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)为所述抑制剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与所述测试组的样本中相应lncRNA(lncRNA NEAT1和/或lncRNA MALAT1)的数量(如摩尔数)的比值(记为Z0)。

在另一优选例中，在步骤(c)包括：

(c)检测抑制剂阳性对照组中所述细胞的胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物中编辑位点发生C→U变化的变化的数量与未发生变化数量的比值，记为Z0。

在另一优选例中，对照参比值Z0是在预定或已知的阳性对照抑制剂、和预定或已知的酶活性的胞苷脱氨酶APOBEC3B存在下，所测定的同一标志物中编辑位点发生C→U变化的数量与未发生变化数量的比值。

在另一优选例中，对照参比值Z0是在预定或已知的阳性对照抑制剂、和预定或已知的酶活性的胞苷脱氨酶APOBEC3B存在下，所测定的同一标志物中编辑位点发生C→U变化的水平(或程度)。

在另一优选例中，如果检测样本中的所述标志物检测结果满足以下条件时：Z0/C1≥1或Z0/C1≥3/2，较佳地Z0/C1≥2/1，更佳地Z0/C1≥3/1，最佳地Z0/C1≥10，则提示所述化合物为潜在的抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的化合物。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(d)对于步骤(c)中确定的潜在化合物，进一步测定其对肿瘤细胞的抑制作用。

在另一优选例中，所述步骤(d)为体外的细胞测试。

在另一优选例中，所述细胞为人细胞。

在另一优选例中，所述细胞为非人哺乳动物细胞。

在另一优选例中，所述方法是体外方法。

在另一优选例中，所述方法是非诊断性的和非治疗性的。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

附图说明

图1显示在诱导表达APOBEC3B野生型的T47D细胞中检测的RNA差异化编辑位点的洛伦兹曲线。

图2显示在诱导表达APOBEC3B野生型的T47D细胞中检测的所有C>U RNA差异化编辑位点在编辑比值变化和平均测序深度空间中的分布，其中NEAT1和MALAT1上的差异化编辑位点以黑色圆形边框显示。

图3显示使用微滴式PCR方法在T47D诱导表达细胞株中检测五个C>U编辑位点的编辑情况结果。

图4显示使用RNA染色质免疫共沉淀(RIP)方法检测T47D细胞中过表达的APOBEC3A和APOBEC3B与NEAT1和MALAT1相互作用的结果。

图5显示使用反义寡聚核苷酸(ASO)敲低NEAT1和MALAT1，并使用荧光定量PCR进行验证的结果。

图6显示使用基于Cas9-APOBEC家族重组蛋白CRISPR编辑技术的荧光报告基因技术检测NEAT1和MALAT1敲低对APOBEC3A和APOBEC3B重组蛋白活性的影响结果。

图7显示使用shRNA在五种乳腺癌细胞系敲低NEAT1和MALAT1，并使用荧光定量PCR对NEAT1和MALAT1表达含量进行验证的结果。

图8显示使用shRNA在五种乳腺癌细胞系敲低NEAT1和MALAT1，并使用荧光定量PCR对APOBEC3A和APOBEC3B表达含量进行验证的结果。

图9显示使用shRNA在五种乳腺癌细胞系敲低NEAT1和MALAT1，并检测敲低对APOBEC3A和APOBEC3B总酶活性的影响。

图10显示使用shRNA在五种乳腺癌细胞系敲低NEAT1和MALAT1，并检测敲低对APOBEC3A酶活性的影响，其中APOBEC3A酶活性以DDOST 558C>U编辑检测(微滴式数字PCR)为评估工具。

图11显示在二十种乳腺癌细胞系中分别检测NEAT1上APOBEC3B介导的两个差异化编辑位点(chr11:65441080和chr11:65425652)的编辑程度和APOBEC3B的酶活性，并做进行对比与相关性分析的结果。

图12显示在二十种乳腺癌细胞系中分别检测MALAT1上APOBEC3B介导的两个差异化编辑位点(chr11:65498990和chr11:65498321)的编辑程度和APOBEC3B的酶活性，并做进行对比与相关性分析的结果。

图13显示APOBEC3A、APOBEC3B、NEAT1和MALAT1在五种肿瘤病人群体样本中的表达含量的Pearson相关度热力图。其中，样本来源为TCGA数据库，所涉及癌肿为膀胱癌(BLCA)，乳腺癌(BRCA),食管腺癌(ESAD)，头颈鳞癌(HNSC)和肺腺癌(LUAD)；转录本表达为RNA测序测定，数值使用RPKM方法进行标准化。

图14显示根据APOBEC3A、APOBEC3B、NEAT1和MALAT1的表达情况对五种肿瘤病人群体进行划分，并观察APOBEC3A驱动的基因组突变谱(SBS2，SBS13)的影响。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种胞苷脱氨酶APOBEC3B活性的生物标记物及其应用。具体地，经过大量筛选，实验结果表明，APOBEC3B在人类转录组中的主要编辑位点是NEAT1和MALAT1这两个lncRNA上的部分序列，并且证明NEAT1和MALAT1能被APOBEC3B选择性编辑；本发明通过检测NEAT1和MALAT1中编辑位点的RNA C>U编辑程度，从而预测APOBEC3B活性。在此基础上，完成了本发明。

术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。

如本文所用，术语“含有”或“包括”可以是开放式的或封闭式的，即包括了“由……构成”和“含有......”。

本领域技术人员将容易理解本文所述的所有参数，尺寸，材料和构造的含义。实际参数，尺寸，材料和/或配置取决于使用本发明说明的特定应用。本领域技术人员能够理解，实施例或权利要求仅是通过示例的方式给出的，并且在等效物或权利要求的范围内，本发明的实施例可涵盖的范围不限于具体描述和要求的范围。

本文的定义和使用的所有定义应被理解为超过词典定义或通过引用并入的文档中的定义。

本文所发明的所有参考文献，专利和专利申请都相对于其所引用的主题通过引用并入，在某些情况下可能包含整个文档。

应当理解，对于本文所述的包括一个以上步骤的任何方法，步骤的顺序不一定限于这些实施例中描述的顺序。

胞苷脱氨酶APOBEC3B

胞苷脱氨酶APOBEC3B是一种在肿瘤细胞中异常表达，并且能通过介导C>U核苷酸突变推动肿瘤进化的关键酶之一。在肿瘤细胞中检测APOBEC3B的活性，对患者预后、预测耐药性产生以及靶向APOBEC3B疗法的适用性至关重要。然而，包括检测APOBEC3B的转录本水平或蛋白水平在内的简单手段并不能很好的预测组织样本中APOBEC3B的活性，这主要是由于与APOBEC3B高度同源，并且具有一定共表达规律的APOBEC3A对APOBEC3B活性存在巨大的干扰。因此，临床条件下存在选择性的检测APOBEC3B活性的未满足需求。本发明通过对转录本中APOBEC3B介导的差异化RNA编辑位点的分析，发现非编码RNA NEAT1和MALAT1上存在APOBEC3B选择性C>U编辑位点，并且这两种非编码RNA能通过直接与APOBEC3B选择性结合并抑制其活性。进而能基于通过检测NEAT1和MALAT1的转录本水平或这两种非编码RNA上特定的C>U编辑位点设计预测肿瘤组织中APOBEC3B活性的方法，从而提供一类能选择性预测APOBEC3B活性的生物标记物。

lncRNA

长链非编码RNA(long ncRNAs，lncRNA)是RNA的一种，一般定义为长度超过200个核苷酸的未翻译成蛋白质的转录物。这种界定将lncRNA与小非编码RNA区分开来，例如microRNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、snoRNA、和其他短RNA。长***/基因间非编码RNA(lincRNA)是不与蛋白质编码基因重叠的lncRNA序列。

长链非编码RNA包括基因间lincRNA、内含子ncRNA以及有义和反义lncRNA，每种类型都显示出与基因和外显子相关的不同基因组位置。

NEAT1和lncRNA MALAT1

NEAT1(英語：Nuclear Enriched Abundant Transcript 1的缩写，也称为VINC，Virus Inducible NonCoding RNA)是一个长链非编码RNA基因，在多发性内分泌肿瘤中表达。

lncRNA NEAT1为NEAT1基因转录而成的RNA序列。

MALAT1和lncRNA MALAT1

MALAT-1(英語：metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1的缩写，也称为NEAT2，noncoding nuclear-enriched abundant transcript 2)是一个长链非编码RNA基因，表达于细胞核，在哺乳动物中高度保守。MALAT-1参与调控细胞核的组织、mRNA的选择性剪接、DNA的表观遗传修饰等细胞中的多种反应，可控制参与肿瘤远端转移的基因表现。此RNA表现异常与糖尿病与癌症等多种疾病有关，其高表现和多种癌症较差的存活率呈正相关。

lncRNA MALAT1为MALAT1基因转录而成的RNA序列。

APOBEC3B酶活性的评估标志物和方法

本发明通过对长非编码RNA(lncRNA)NEAT1和MALAT1的表达水平以及在这两个lncRNA序列中个别APOBEC3B特异的RNA位点的编辑程度的测定实现对APOBEC3B酶活性的评估。

本发明首次发现了APOBEC3B在人类转录组中的主要编辑位点是NEAT1和MALAT1这两个lncRNA上的部分序列，并且证明NEAT1和MALAT1能被APOBEC3B选择性编辑。本发明首次发现了NEAT1或MALAT1能与APOBEC3B蛋白直接结合，而不结合APOBEC3A。进一步发现NEAT1或MALAT1与APOBEC3B的结合能选择性抑制APOBEC3B的酶活性，并且其在肿瘤细胞中的表达量与APOBEC3B酶活性呈负相关。

本发明进一步证明NEAT1和MALAT1中编辑位点的RNA C>U编辑程度与APOBEC3B活性呈正相关，而与APOBEC3A关联度不高。因此，这些位点的编辑程度能预测肿瘤细胞或组织样本中APOBEC3B的活性，从而进一步的推断该样本肿瘤异质性程度以及APOBEC3B相关靶向治疗策略的适用性。

为了实现通过测量NEAT1和MALAT1表达量或在NEAT1和MALAT1编辑位点的C>U编辑程度来预测APOBEC3B酶活性的目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供通过检测NEAT1和MALAT1表达量作为预测细胞或组织样本中APOBEC3B酶活性的生物标记物的应用，本发明还提供NEAT1和MALAT1编辑位点的C>U编辑作为预测APOBEC3B酶活性的生物标记物的应用。这些方法能作为APOBEC3B酶活性功能相关的预测工具，运用于肿瘤诊断、治疗策略的制定、以及预后评估。

本发明中，所述通过检测NEAT1和MALAT1表达水平预测样本中APOBEC3B酶活性的评估工具包括：荧光定量PCR、高通量RNA测序。

优选地，所述通过检测NEAT1和MALAT1表达水平预测样本中APOBEC3B酶活性评估工具包括试剂和试剂盒。

优选地，所述通过荧光定量PCR检测NEAT1和MALAT1表达水平预测样本中APOBEC3B酶活性的方法至少包含一对特异性扩增NEAT1和MALAT1的引物，所述引物包括，

NEAT1_1-F(SEQ ID NO：1)：

5'-GGCACAAGTTTCACAGGCCTACATGGG-3'；

NEAT1_1-R(SEQ ID NO：2)：

5'-GCCAGAGCTGTCCGCCCAGCGAAG-3'；

NEAT1_2-F(SEQ ID NO：3)：

5'-GGAGCCAACCTGCCCTGAAT-3'；

NEAT1_2-R(SEQ ID NO：4)：

5'-CCACAGGCTACCCTCTGCTC-3'；

MALAT1-F(SEQ ID NO：5)：

5'-CTTCCCTAGGGGATTTCAGG-3'；

MALAT1-R(SEQ ID NO：6)：

5'-GCCCACAGGAACAAGTCCTA-3'。

本发明中，所述通过荧光定量PCR法检测NEAT1和MALAT1表达水平预测样本中APOBEC3B酶活性评估工具除了包含引物以外，还包括从肿瘤组织中提取RNA并进行逆转录以及荧光定量PCR的所有试剂，包括从肿瘤样本中抽提RNA所用试剂(如Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇和无核酸酶活性水)；以RNA为模板的逆转录反应试剂(如逆转录酶，随机引物、三磷酸基脱氧核糖核苷酸及RNA酶抑制剂)；以及荧光定量PCR反应所需试剂(如内参基因及待检基因特异性引物、荧光标记的DNA染料、DNA聚合酶以及相应缓冲液等)。

优选地，上述荧光定量PCR法

优选地，用于检测NEAT1和MALAT1表达含量预测样本中APOBEC3B酶的高通量RNA测序方法具有以下特征：(1).使用核糖体去除方法处理总RNA样本；(2).文库构建方法为任意一种cDNA链特异性文库构建方法；(3).测序有效片段数量不少于三千万条。

本发明中，测量NEAT1和MALAT1中编辑位点的RNA C>U编辑程度的工具包括：高通量RNA测序、微滴式数字PCR。

优选地，所述测量NEAT1和MALAT1中编辑位点的RNA C>U编辑程度的工具包括试剂和试剂盒。

优选地，所测量NEAT1上的编辑位点选自下组(以GRCh38参考基因组坐标)：chr11:65498321，chr11:65498990，chr11:65499884，chr11:65500618，chr11:65500772，chr11:65504613，chr11:65498962，chr11:65499488，chr11:65500899。

优选地，所测量MALAT1上的编辑位点选自下组(以GRCh38参考基因组坐标)：chr11:65498061，chr11:65498321，chr11:65498990，chr11:65499884，chr11:65500618，chr11:65500772，chr11:65501742，chr11:65504613。

上述这些位点的参考基因组碱基类型均为C，经APOBEC3B编辑后的碱基类型为U，所检测的突变碱基类型为U或T。

优选地，所述高通量RNA测序方法检测NEAT1和MALAT1中编辑位点的RNA C>U编辑程度的方法包括以下特征：(1)使用核糖体去除方法处理总RNA样本；(2)文库构建方法为任意一种cDNA链特异性文库构建方法；(3)测序有效片段数量不少于三千万条。(4)使用专利申报书202211574812.8所述的方法开展NEAT1和MALAT1中编辑位点的差异化编辑分析。

优选地，所述微滴式数字PCR检测NEAT1和MALAT1中编辑位点的RNA C>U编辑程度的方法包括以下特征：(1)使用微滴式数字PCR仪制造厂商配套的设计程序开展引物和探针设计；(2)设计程序的类别为突变检测，分别使用两种不同的荧光素标记NEAT1和MALAT1中编辑位点的参考碱基类型和经APOBEC3B编辑后的碱基类型；(3)设计程序的输入序列包含待检测位点坐标在人类基因组的上游和下游的序列；(4)检测的参考碱基类型为C，突变碱基类型为U或T。

本发明使用真实世界肿瘤样本数据，证实NEAT1和MALAT1转录本水平能预测APOBEC3A/APOBEC3B高表达病人样本中的C>T突变情况。结果表明，NEAT1和MALAT1高表达的病人样本中由于APOBEC3B活性被这些lncRNA选择性抑制，进一步导致APOBEC3A被激活，从而间接致使这些病人样本中展现了较强的基因组层面的由APOBEC3A驱动的突变谱。

因此，本发明所提供的技术手段首次提供了一类预测在APOBEC3A和APOBEC3B均高表达病人样本中预测APOBEC3B酶活性的方法。这个方法将为围绕APOBEC3B为治疗靶点设计的新型疗法提供诊断、伴随治疗和预后工具。

检测试剂盒

基于胞苷脱氨酶APOBEC3B活性标志物NEAT1和MALAT1与胞苷脱氨酶APOBEC3B活性的相关性，因胞苷脱氨酶APOBEC3B活性标志物可以作为胞苷脱氨酶APOBEC3B活性的判断标志物。

本发明还提供了一种判断胞苷脱氨酶APOBEC3B活性的试剂盒，所述的试剂盒含有一检测试剂，所述检测试剂用于检测胞苷脱氨酶APOBEC3B活性标志物的基因、mRNA、cDNA、蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书。

本发明的主要优点

(1)相对于检测APOBEC3B含量的方法，包括转录本水平或蛋白水平的测定，本方法能更好的体现APOBEC3B在胞内的实际活性。

(2)本方法描述的测定APOBEC3B的选择性底物NEAT1和MALAT1的丰度和编辑位点编辑情况方法，是反映APOBEC3B的胞内酶活性最直接的手段。

(3)本发明相对传统手段，能有效的区分APOBEC3B活性测定中的重要干扰因素，即同家族酶APOBEC3A。

(4)本发明首次、意外地发现了APOBEC3B酶在NEAT1和MALAT1的特异性编辑位点，具有巨大的应用潜力和前景。

(5)本发明的检测方法便于定量检测。

(6)本发明的检测方法是基于核酸检测，具有简便、特异性、和价格便宜的优点。

具体地，本发明通过一种意外发现的APOBEC3B活性调节机制，即非编码RNA NEAT1和MALAT1对APOBEC3B的选择性负向调节，设计了针对APOBEC3B的胞内活性检测手段。相对于检测APOBEC3B含量的方法，包括转录本水平或蛋白水平的测定，本方法能更好的体现APOBEC3B在胞内的实际活性。这是因为APOBEC3B活性在胞内受复杂机制调控，其含量往往与活性不成比例。本方法描述的测定APOBEC3B的选择性底物NEAT1和MALAT1的丰度和编辑位点编辑情况方法，是反映APOBEC3B的胞内酶活性最直接的手段。

除此以外，本发明相对传统手段，能有效的区分APOBEC3B活性测定中的重要干扰因素，即同家族酶APOBEC3A。由于APOBEC3A无法结合并编辑NEAT1和MALAT1，本方法提能有效的区分APOBEC3A与APOBEC3B介导的胞内胞苷脱氨酶活性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

材料与方法

APOBEC3B诱导表达T47D细胞株的构建：使用GeneArt服务(Thermo Fisher)全基因合成APOBEC3B片段(NM_004900.5)，在合成前对编码序列进行人类细胞密码子优化。所以用QuickChange试剂盒(Agilent)对APOBEC3B的E68、E225分别进行突变，得到APOBEC3B(E68Q/E225Q)编码DNA片段。将这两个DNA片段使用AgeI和ClaI(BspDI)分别克隆至pTRIPZ(GEHealthcare)载体中，得到慢病毒诱导表达质粒。使用辅助质粒pMD2.G和psPAX2与上述表达质粒共转染293TN(Clonetech)细胞，24小时后更换一次培养基。并于转染后48和72小时收集两次培养基上清。经过0.44μm微孔过滤后，使用Peg-IT试剂盒(System Biosciences)的标准流程浓缩慢病毒。使用浓缩过的慢病毒转导T47D细胞，于转导后48小时更换培养基，并于24小时后于培养基中加入1μg/ml嘌呤霉素，并保持该选择压力对细胞持续进行培养。使用1μg/ml多西环素对外源APOBEC3B进行诱导表达，使用免疫印迹方法对外源表达的APOBEC3B进行监测，所使用的一抗为Abcam公司的EPR18138单克隆抗体。

高通量测序：使用Roche MagnaPure 96仪器以及配套试剂开展RNA提取；在优选例中，基因组DNA样本的A260/A280值达1.8-2.0之间，RNA样本的RIN值达8以上。对基因组DNA样本，采用标准的全基因组测序文库建立手段，并使用BGISeq-500仪器进行PE100格式的30X测序深度测序。对于RNA样本，使用核糖体去除法降低rRNA在文库中的含量后，使用first strand法构建链特异测序文库，再使用BGI-seq500仪器以PE100模式开展测序工作，每个样本测序数据量为六千万个片段，每个样本集包含一个实验处理条件与四个生物学重复。

差异化RNA编辑位点的检测：使用专利申报书202211574812.8所述的方法进行。

稳定敲降细胞株的构建：使用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)敲降NEAT1和MALAT1的方法如Zhang,P.,Cao,L.,Zhou,R.,Yang,X.and Wu,M.,2019.The lncRNANeat1 promotes activation of inflammasomes in macrophages.Naturecommunications,10(1),p.1495.和Qu,D.,Sun,W.W.,Li,L.,Ma,L.,Sun,L.,Jin,X.,Li,T.,Hou,W.and Wang,J.H.,2019.Long noncoding RNA MALAT1 releases epigeneticsilencing of HIV-1replication by displacing the polycomb repressive complex2from binding to the LTR promoter.Nucleic acids research,47(6),pp.3013-3027.所述。其中，

NEAT1所用shRNA的序列为(SEQ ID NO：7)：

5'-GAGTTACCATCCCGTCCTCTAGGATCCTAGAGGACGGGATGGTAACTC-3'；

MALAT1所用shRNA的序列为(SEQ ID NO：8)：

5'-AAGACCTTGAAATCCATGACGCTCGAGCGTCATGGATTTCAAGGTCTT-3'；

对照所用非靶向shRNA序列为(SEQ ID NO：9)：

5'-TTCTCCGAACGTGTCACGTATCTCGAGATACGTGACACGTTCGAGAA-3'。

上述shRNA均亚克隆至pLKO.1慢病毒shRNA表达载体中。慢病毒采用辅助质粒pMD2.G和psPAX2与编码shRNA的pLKO.1载体进行制备，转导至目标细胞系中。目标细胞采用嘌呤霉素进行筛选。

NEAT1和MALAT1的荧光定量PCR检测：使用含SYBR Green染料的PCR预混液试剂盒Thunderbird SYBR qPCR Mix(TOYOBO公司制)结合ABI 7900HT仪器进行检测。其中用于NEAT1检测的PCR引物和序列为，

NEAT1_1-F(SEQ ID NO：1)：

5'-GGCACAAGTTTCACAGGCCTACATGGG-3'；

NEAT1_1-R(SEQ ID NO：2)：

5'-GCCAGAGCTGTCCGCCCAGCGAAG-3'；

NEAT1_2-F(SEQ ID NO：3)：

5'-GGAGCCAACCTGCCCTGAAT-3'；

NEAT1_2-R(SEQ ID NO：4)：

5'-CCACAGGCTACCCTCTGCTC-3'；

MALAT1-F(SEQ ID NO：5)：

5'-CTTCCCTAGGGGATTTCAGG-3'；

MALAT1-R(SEQ ID NO：6)：

5'-GCCCACAGGAACAAGTCCTA-3'；

GAPDH-F(SEQ ID NO：10)：

5'-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3'；

GAPDH-R(SEQ ID NO：11)：

5'-GTCAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3'。

其中，反应温度程序条件为95℃ 5分钟，紧接95℃ 30秒、55℃ 30秒、72°C 30秒共40个循环。数据分析方面，使用ΔΔCT方法，使用GAPDH作为内参对照，评估NEAT1和MALAT1转录本的相对含量。

微滴式数字PCR:细胞样本使用Trizol试剂提取全RNA后，使用High CapacitycDNA Reverse Transcription反转录试剂盒(Thermo Scientific公司)进行反转录。将40ng所得cDNA与2μL设计的引物和探针进行结合，并与微滴式数字PCR预混液(ddPCRSupermix for Probes No UTP，Bio-Rad公司)混合至终体积为25μL。其中，引物和探针购自Bio-Rad公司，采用配套线上软件进行设计。使用QX200微滴产生器(Bio-Rad公司)产生油包水微滴后，反应体系转移至C1000 Touch微滴式数字PCR仪上(Bio-Rad)公司，并使用以下程序进行扩增：95℃ 5分钟，紧接94℃ 30秒、53℃ 60秒共40个循环，98℃ 10分钟附加温度梯度2℃每秒。产生的微滴使用QX200微滴读取器进行读取，其中FAM荧光标记为野生型转录本，HEX荧光标记为突变型转录本。使用QuantaSoft软件(Bio-Rad)公司对野生型转录本占样本比值进行分析。

免疫共沉淀法测定APOBEC3B酶活性：本方法采用免疫共沉淀方法将细胞内APOBEC3B分离，并且测定其酶活性。该方法能区别APOBEC3B活性与APOBEC3A活性，但方法复杂并且需要新鲜细胞和组织样本，因而限制其临床条件下的运用。具体方法为：将100微克细胞裂解液加入1毫升免疫共沉淀缓冲液中(含20mM Tris pH8.0，250mM NaCl，1mM DTT，1mM EDTA)，并加入1微克APOBEC3B抗体(Abcam公司ab184990)在4℃共孵育过夜，并使用20微升Dynabeads Protein A/G微珠(Thermo Scientific公司)结合此贴将免疫沉淀进行吸附，并使用免疫共沉淀缓冲液对微珠进行洗涤。所得的微珠使用Zhang,Y.H.,Guo,X.C.,Zhong,J.B.,Zhong,D.X.,Huang,X.H.,Fang,Z.Y.,Zhang,C.and Lu,Y.J.,2022.Discoveryof APOBEC Cytidine Deaminases Inhibitors Using a BspH1 Restriction Enzyme-Based Biosensor.ChemistrySelect,7(21),p.e202201456.所述的BspH1生物传感器检测手段，对APOBEC3B的生化活性进行测定。

实施例1：APOBEC3B在乳腺癌细胞系中的RNA编辑热点的发现

在慢病毒构建的诱导表达APOBEC3B的T47D细胞中，使用1μg/ml多西环素对外源APOBEC3B蛋白进行诱导表达72小时，标记为诱导表达组；并采用溶剂DMSO作为对照，标记为对照组，使用免疫印迹法对APOBEC3B的诱导表达进行验证。对上述两个不同条件处理的实验组别分别进行四次生物学重复，抽提DNA与RNA样本，并使用上述高通量测序手段，分别进行30X深度的全基因组DNA测序以及60M reads的链特异RNA测序。使用专利申报书202211574812.8所述的方法进行差异化RNA编辑位点分析。所得结果如表1所示。

表1：在APOBEC3B诱导表达T47D细胞株中进行RNA测序和差异化RNA编辑位点分析的所得结果。

取分析所得C>U差异化RNA编辑位点(假阳性率FDR<0.05，位点所在最低深度DP>10)，将APOBEC3B诱导表达组C>U编辑的总read深度定为100％，计算各个C>U编辑位点深度的占比，计为该位点占APOBEC3B总RNA编辑活性的所占比。将C>U编辑位点站APOBEC3B总RNA编辑活性的占比排序作为纵坐标与该编辑位点占的RNA测序深度排序作图绘制洛伦兹曲线。在该曲线中，若APOBEC3B在转录组编辑位点的分布不存在特异性，则曲线应接近y＝x函数；而曲线的曲率越高，则表明APOBEC3B在转录组编辑位点的特异性越高。如图1所示，该结果表明APOBEC3B对全转录组编辑活性分配的基尼系数高达0.54，预示了APOBEC3B对RNA编辑位点具有明显的选择性。

使用GENCODE第38版基因组注释对C>U差异化编辑位点进行所在编辑位点所在基因进行标注。其中，若一个差异化编辑位点对应多个基因，则将所有对应基因分别列出。将所有C>U差异化编辑位点的受APOBEC3B诱导表达影响的编辑比例变化作为纵坐标与该C>U编辑位点在RNA测序中的丰度作气泡图，其中气泡大小显示该位点占APOBEC3B总RNA编辑活性占比。如图2所示，该结果表明非编码RNA NEAT1和MALAT1是APOBEC3B的主要编辑底物。其中NEAT1上所有C>U差异化编辑位点占APOBEC3B的RNA总编辑活性的7.9％,MALAT1上所有C>U差异化编辑位点占APOBEC3B的RNA总编辑活性的1.8％。

使用慢病毒构建的诱导表达APOBEC3B失活突变(E68Q/E225Q)的T47D细胞株重复上述的RNA测序、差异化编辑位点检测以及后期数据分析。结果如表1所示，诱导表达72小时APOBEC3B失活突变仅检测到2个差异化C>U编辑位点，并且均不位于NEAT1和MALAT1基因中。

使用慢病毒构建的诱导表达APOBEC3B失活突变(E68Q/E225Q)的T47D细胞株上，使用数字液滴式PCR方法对9个以RNA测序手段检测出的NEAT1和9个MALAT1上APOBEC3B介导的差异化位点进行验证分析，实验所需引物和探针的设计使用Bio-Rad公司的微滴数字PCR线上设计程序进行，实验类别为突变检测(mutation detection)，输入序列为待检测位点上下游各100bp序列。待检测位点的坐标以GRCh38参考基因组，以表2所列，检测突变类型均为C>T突变。实验的具体开展使用上述“材料与方法”部分进行。结果如表2所示，这些候选差异化编辑位点均展现出了对APOBEC3B诱导表达的依赖性，即仅当高表达APOBEC3B是，C>U编辑程度才会提升。该结果验证了这些在NEAT1和MALAT1上位点的C>U编辑是由APOBEC3B介导的。

表2

由这些结果可见，NEAT1和MALAT1是APOBEC3B在乳腺癌细胞模型中的主要转录组选择性编辑对象。

实施例2.：APOBEC3B诱导表达对NEAT1和MALAT1上特定位点的影响

本实施例采用微滴式数字PCR方法考察APOBEC3B诱导表达对NEAT1和MALAT1上编辑位点的影响。实验所需引物和探针的设计使用Bio-Rad公司的微滴数字PCR线上设计程序进行，实验类别为突变检测(mutation detection)，输入序列为待检测位点上下游各100bp序列。待检测位点的坐标以GRCh38参考基因组为：chr11:65425652(NEAT1)，chr11:65441080(NEAT1)，chr11:65431271(NEAT1)，chr11:65498990(MALAT1)和chr11:65498321(MALAT1)，检测突变类型均为C>T突变。实验的具体开展使用上述“材料与方法”部分进行。

取慢病毒构建的诱导表达APOBEC3B野生型和失活突变(E68Q/E225Q)的T47D细胞株，使用DMSO对照或1μg/ml多西环素诱导细胞72小时，抽提样本总RNA并进行反转录后开展微滴式数字PCR方法检测上述位点突变。结果如图3所示，所有被检测的NEAT1和MALAT1上的差异化C>U编辑位点均展现出对APOBEC3B酶活性的依赖性，因此是APOBEC3B酶的直接编辑底物。

实施例3：NEAT1和MALAT1与APOBEC3B的胞内相互作用。

本实施例采用RNA免疫共沉淀技术检测NEAT1与MALAT1是否形成RNA-蛋白质复合物。首先，在T47D细胞中过表达Flag标记的APOBEC3A和APOBEC3B重组蛋白。重组蛋白编码载体骨架由pCMV6-Entry构成，购自Origene公司，分别编码Myc-DDK(Flag)标记的全长APOBEC3A(NM_145699，RC220995)和APOBEC3B(NM_004900，RC222712)。使用Lipofectamine3000转染试剂将上述两个载体转染至T47D细胞中，总载体DNA量按照六孔板每孔总量1.2μg，并在转染后48小时使用1％中性甲醛固定细胞5分钟。收集细胞，并使用Magna NuclearRIP(cross-linked)试剂盒(默克公司)开展RNA免疫共沉淀实验。除了抗体选用Sigma公司的Flag-M2(F1804)小鼠抗Flag单克隆抗体以外，所有实验参数均遵从厂家说明书进行选取。使用前述的荧光定量PCR检测检测手段分析被Flag-M2单克隆抗体或阴性对照抗体共沉淀的NEAT1和MALAT1含量，并与各自input对照进行标准化处理。结果如图4所示，该结果表明NEAT1和MALAT1均与细胞内表达的Flag标记重组APOBEC3B形成复合物，并被Flag-M2单克隆抗体产生免疫沉淀。而该现象未能在转染了Flag标记重组APOBEC3A的T47D细胞中被观察到。与此对应的，在所有的组别中阴性对照抗体均不能与NEAT1或MALAT1产生共沉淀。由此可见NEAT1和MALAT1能选择性与APOBEC3B形成RNA-蛋白质复合物。

实施例4：瞬时敲降NEAT1和MALAT1对APOEBC3A和APOBEC3B酶活性的影响。

本实施例采用Martin,A.S.,Salamango,D.J.,Serebrenik,A.A.,Shaban,N.M.,Brown,W.L.and Harris,R.S.,2019.A panel of eGFP reporters for single baseediting by APOBEC-Cas9 editosome complexes.Scientific reports,9(1),p.497.报道的基于Cas9-APOBEC家族重组蛋白CRISPR编辑技术的荧光报告基因技术手段。该技术使用包含编码L202S突变的增强绿色荧光蛋白(eGFP)的过表达载体作为Cas9-APOBEC家族重组蛋白的编辑底物。当在细胞内共转染编码Cas9-APOBEC家族重组蛋白载体、对应的L202S-eGFP靶向gRNA以及编码L202S-eGFP的载体后，在gRNA的指引下Cas9-APOBEC家族重组蛋白载体能将eGFP的202号氨基酸残基由丝氨酸选择性突变为赖氨酸，从而激活eGFP产生绿色荧光。

该实验Cas9-APOBEC家族重组蛋白载体选用A3A-Cas9n-UGI-NLS、A3Bi-Cas9n-UGI和A3Bi-ctd-Cas9n-UGI-NLS，分别编码重组Cas9-APOBEC3A、重组Cas9-APOBEC3B以及重组Cas9-APOBEC3B-CTD(C-terminal domain，C-末端结构域)。sgRNA编码载体选用eGFP-L202-gRNA(eGFP靶向)和Non-specific-sgRNA(非靶向对照)载体；L202S-eGFP报告基因载体选用eGFP-L202-Reporter载体。上述载体全部购自Addgene公司。

为考察NEAT1和MALAT1的敲降对APOBEC家族蛋白酶活性的影响，使用反义核苷酸(Antisense Oligonucleotides，ASO)对NEAT1和MALAT1分别进行敲降。ASO的序列如Adriaens,C.,Standaert,L.,Barra,J.,Latil,M.,Verfaillie,A.,Kalev,P.,Boeckx,B.,Wijnhoven,P.W.,Radaelli,E.,Vermi,W.and Leucci,E.,2016.p53 induces formationof NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stressresponse and chemosensitivity.Nature medicine,22(8),pp.861-868.和Amodio,N.,Stamato,M.A.,Juli,G.,Morelli,E.,Fulciniti,M.,Manzoni,M.,Taiana,E.,Agnelli,L.,Cantafio,M.E.G.,Romeo,E.and Raimondi,L.,2018.Drugging the lncRNA MALAT1 viaLNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggersanti-multiple myeloma activity.Leukemia,32(9),pp.1948-1957.所述。其中，

NEAT1靶向ASO的序列为(SEQ ID NO：12)：

5'-CTCACACGTCCATCT-3'；

MALAT1靶向ASO序列为(SEQ ID NO：13)：

5'-ACATTGCCTCTTCATT-3'。

作为对照所用的非靶向性ASO序列为(SEQ ID NO：14)：

5'-CATACTATATGACAG-3'。

上述ASO均采用GapmeRs公司的锁核苷酸(Locked Nucleic Acid，LNA)技术构建。

本实施例在T47D细胞系中开展。在六孔板的每个孔中，按照Cas9-APOBEC家族重组蛋白载体：sgRNA编码载体：L202S-eGFP比例为3:1:2的比例，以总量1.2μg混匀，并加入终浓度为20nM的ASO。使用Lipofectamine 2000转染试剂构建转染复合物，并加入T47D细胞。在转染后72小时，加入Hoechst33342活细胞核染料，并使用PE Operetta CLx高内涵***计算表达绿色荧光蛋白的细胞占总细胞数的比例。本实验的结果如图5和图6所示，结果表明本实施例选取的APOBEC家族酶靶向的ASO较于非靶向ASO均能有效的敲降NEAT1和MALAT1。在使用阴性对照ASO和非靶向sgRNA载体验证了APOBEC家族重组蛋白对eGFP靶向编辑有效性的前提下，NEAT1和MALAT1的敲降均能提高重组Cas9-APOBEC3B或重组Cas9-APOBEC3B-CTD的活性。而该现象未能使用Cas9-APOBEC3A编码载体转染的细胞中观察到。由此可见，顺时敲降NEAT1和MALAT1对APOBEC3B在细胞中的的酶活性有提升作用，预示了NEAT1和MALAT1在细胞中选择性抑制了APOBEC3B的活性。

实施例5：NEAT1和MALAT1的稳定敲降对APOBEC3A和APOBEC3B活性的影响

本实施例在已知APOBEC3A和APOBEC3B表达情况的五种细胞株中开展。其中HCC2218细胞株只表达APOBE3A，T47D和MCF7只表达APOBEC3B，而BT474和HCC202细胞均为APOBEC3A和APOBEC3B高表达。稳定敲降NEAT1和MALAT1细胞株的构建采用慢病毒介导的shRNA技术，具体开展参考“材料与方法”部分，所有细胞株均在完成稳转构建并传代培养三次后开展实验。使用荧光定量PCR对稳定敲降NEAT1和MALAT1的细胞株进行验证。如图7所示，该结果表明慢病毒介导的NEAT1和MALAT1靶向的shRNA能有效敲降NEAT1和MALAT1的表达。

使用荧光定量PCR在稳定敲降NEAT1和MALAT1的细胞株中检测分别检测APOBEC3A和APOBEC3B基因的表达量。如图8所示，NEAT1和MALAT1的稳定敲降对APOBEC3A和APOBEC3B的表达量不能产生影响。

使用Zhang,Y.H.,Guo,X.C.,Zhong,J.B.,Zhong,D.X.,Huang,X.H.,Fang,Z.Y.,Zhang,C.and Lu,Y.J.,2022.Discovery of APOBEC Cytidine Deaminases InhibitorsUsing a BspH1 Restriction Enzyme-Based Biosensor.ChemistrySelect,7(21),p.e202201456.的方法对上述稳定敲降NEAT1和MALAT1的细胞株进行APOBEC3B总活性测定。如图9所示，该结果表明了稳定敲降NEAT1和MALAT1对仅APOBEC3B表达的细胞系(T47D和MCF7)或APOBEC3A/B共表达细胞系的APOBECB酶活性有提升作用，而对仅表达APOBEC3B的细胞系(HCC2218)不产生影响。预示了NEAT1和MALAT1的敲降能选择性降低细胞内的APOBEC3B活性。

鉴于前人研究的发现，APOBEC3B对APOBEC3A的活性有反向调节功能，因此预示了NEAT1和MALAT1导致的APOBEC3B活性的提升会减弱APOBEC3A的活性。为了验证这个假说，以前人报道的APOBEC3A特异性编辑位点DDOST1 558C>U作为其活性的预测物，并采用微滴式数字PCR方法考察NEAT1和MALAT1的稳定敲降对DDOST1 558C>U编辑的影响。如图10所示，结果表明NEAT1和MALAT1的稳定敲降在APOBEC3A和APOBEC3B共表达的细胞系中(BT474和HCC202)能降低APOBEC3A的活性。而该现象不能在仅表达APOBEC3A的细胞系(HCC2218)中观察到，表明NEAT1和MALAT1敲低介导的APOBEC3B活性提高对APOBEC3A的活性产生了负面的影响。

实施例6:不同细胞株内NEAT1和MALAT1上特定位点编辑程度与APOBEC3B活性的关系。

本实施例采用已鉴定的在NEAT1和MALAT1中由APOBEC3B介导的C>U编辑位点，通过数字液滴式PCR方法考察这些位点的C>U编辑程度与APOBEC3B酶生化活性的相关度。在本实验中，APOBEC3B酶生化活性的实验以APOBEC3B免疫共沉淀结合BspH1生物传感器方法进行，具体方法参考“具体实施方式一栏”。其中APOBEC3B酶生化活性以探针分子中TAMRA和FAM荧光基团的信号比表示，比值越高，APOBEC3B酶活性越强。由于该方法需要新鲜细胞和组织样本，在临床研究中适用范围狭窄。

在二十种乳腺癌细胞系中(SKBR3，HCC2218，MDA-MB-436，MDA-MB-157，MDA-MB-175，MCF-10-A，HCC1806，MCF7，CAL51，BT20，BT549，BT474，MDA-MB-231，EFM1924，MDA-MB-453，MDA-MB-468，T47D，HCC1143，MDA-MB-486，HCC202)，分别测定APOBEC3B介导的两个NEAT1差异化RNA编辑位点(chr11:65441080和chr11:65425652)的突变碱基所占比例和APOBEC3B酶生化活性，并绘制散点图。结果如图11所示。该结果表明，在APOBEC3B依赖的差异化RNA编辑位点的编辑程度，与APOBEC3B酶生化活性相关度较好，Pearson相关系数平方R²均在0.6左右。因此，预示了通过考察这些差异化RNA编辑位点能很好的预测APOBEC3B在肿瘤细胞中的酶活性。

使用同样的实验手段，在二十种乳腺癌细胞系中考察两个MALAT1差异化RNA编辑位点(chr11:65498990和chr11:65498321)与APOBEC3B酶生化活性的相关度，结果如图12所示。与NEAT1上差异化编辑位点类似，MALAT1的APOBEC3B介导的差异化RNA编辑位点能很好的预测肿瘤细胞中APOBEC3B的酶活性。

实施例7：NEAT1和MALAT1的表达含量预测APOBEC3A和APOBEC3B在临床病人肿瘤组织中活性的能力

本实施例使用美国癌症研究院(NCI)的The Cancer Genome Atlas(TCGA)真实世界临床数据对NEAT1和MALAT1预测APOBEC3A驱动的C>T基因组突变程度的能力。根据前人研究，选取APOBEC3A和APOBEC3B异常表达并且包含大量这两种酶介导突变的瘤种，分别是膀胱癌(bladder cancer,BLCA)，乳腺癌(breast cancer,BRCA),食管腺癌(esophagusadenocarcinoma，ESAD)，头颈鳞癌(head and neck squamous cancer,HNSC)，肺腺癌(lungadenocarcinoma，LUAD)。在TCGA数据库中，调用包含全基因组或全外显子组DNA测序数据，并提供配套转录组RNA测序的病人样本，满足该条件的膀胱癌病人409人；乳腺癌病人1007人；食管腺癌182人；头颈鳞癌494人；肺腺癌506人。

调取转录组RNA测序中各病人的转录组RNA测序数据，并抽提APOBEC3A、APOBEC3B、NEAT1和MALAT1的表达数据(RPKM标准化数据)。使用Pearson相关性分析这些基因在病人表达情况的相关度，并绘制热力图。如图13所示，NEAT1/MALAT1与APOBEC3A/APOBEC3B在表达量上不存在明显的相关性。而APOBEC3A和APOBEC3B之间，以及NEAT1和MALAT1之间存在部分的相关性。

调取所有病人的全基因组或全外显子组测序的联合突变检测(joint mutationcalling)结果，以VCF格式文件形式下载。使用前人报道的非负矩阵分解(NMF)聚类方法对每个病人的突变图谱进行分析，其中单碱基替代(single base substitution,SBS)2号(SBS2)和13号(SBS13)为APOBEC3A主导的C>U突变。将所有病人归为两类，其中NEAT1或MALAT1的RNA表达量排名为前25％的定义为高表达者，其余为低表达者。在此基础上，按照APOBEC3A和APOBEC3B表达情况进一步将这些病人进一步归为八类，其中APOEBEC3A和APOBEC3B的RNA表达量排名为前25％的定义为高表达者，并将这八类病人的SBS2和SBS13突变占总突变的八分比作图。如图14所示，在APOBEC3A和APOBEC3B高表达的病人中，NEAT1或MALAT1的高表达者相对于低表达者显示出高水平的SBS2和SBS13突变，具有统计学差异，并且在所有瘤种的病人中获得重复。

由于APOBEC3A和APOBEC3B之间存在者复杂的负调控关系，而且两个基因还存在明显的共表达情况，因此单独使用这两个基因的转录水平预测APOBEC3A驱动的C>U突变存在着明显的不足，需要进一步细化病人的分类。本实施例的结果指示NEAT1和MALAT1是在APOBEC3A/APOBEC3B高表达病人中两个有效预测APOBEC3A驱动的C>U突变的生物标记物。结合前述的实施例，NEAT1和MALAT1很可能是通过直接抑制APOBEC3B而间接激活APOBEC3A，并且在真实世界的临床样本中得以体现。NEAT1和MALAT1作为生物标记物，能运用于未来靶向APOBEC3A或APOBEC3B的新型肿瘤治疗方法中，提供配套的诊断、治疗和预后工具。

讨论

APOBEC3B是APOBEC家族酶中唯一在多种肿瘤中普遍高表达并且异常激活的成员，并且其表达量在约50％的人类肿瘤中与C>T序列突变程度在呈正相关。APOBEC3B在肿瘤中的高表达与药物治疗耐药性产生以及差的临床预后相关联，因此，通过精准手段评估APOBEC3B在肿瘤细胞与组织样本中的活性具有重要的科学与实践意义。

除了作用于单链DNA外，研究表明，APOBEC3B的C末端结构域与已知的RNA编辑酶APOBEC3A高度同源，因此也极可能在RNA层面上通过胞苷脱氨反应进行C>U编辑。APOBEC3B的N末端结构域与RNA能形成高分子量复合物，从而起到调控APOBEC3B对DNA和RNA编辑活性的功能。这种由APOBEC3B介导的RNA编辑能力能改变转录本所对应的氨基酸编码序列，在一定程度上对肿瘤异质性、耐药克隆产生以及肿瘤特异新抗原的产生起到了关键性作用。

通过评估APOBEC3B在肿瘤组织与细胞中的酶活性，可进一步探究APOBEC3B在RNA编辑功能中的具体分子机制与调控方式，从而为新的耐药性产生与肿瘤免疫疗法开发提供思路。

本发明提供了在肿瘤细胞模型或者患者样本中开展APOBEC3B酶活性的监控的有效标志物、评估方法、评估试剂盒和评估设备，从而为APOBEC3B相关的基础研究、肿瘤疾病诊断、治疗策略的选取、预后评估、药物筛选等研究工作提供了用力的工具，具有重要的意义。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断试剂或试剂盒，所述诊断试剂或试剂盒用于检测胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性；

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂用于检测lncRNA NEAT1上的选自下组的RNA编辑位点(以GRCh38参考基因组坐标)是否发生C→U变化：chr11:65425652，chr11:65444937，chr11:65428056，chr11:65441080，chr11:65431271，chr11:65436573，chr11:65436866，chr11:65442018，chr11:65443866，或其组合；

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，使用荧光定量PCR检测lncRNA NEAT1、lncRNAMALAT1、或其组合的表达水平，以检测胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，使用所述荧光定量PCR检测时，至少使用一对特异性扩增lncRNA NEAT1和lncRNA MALAT1的引物，所述引物选自下组：

NEAT1_1-F(SEQ ID NO：1)：

5'-GGCACAAGTTTCACAGGCCTACATGGG-3'；

NEAT1_1-R(SEQ ID NO：2)：

5'-GCCAGAGCTGTCCGCCCAGCGAAG-3'；

NEAT1_2-F(SEQ ID NO：3)：

5'-GGAGCCAACCTGCCCTGAAT-3'；

NEAT1_2-R(SEQ ID NO：4)：

5'-CCACAGGCTACCCTCTGCTC-3'；

MALAT1-F(SEQ ID NO：5)：

5'-CTTCCCTAGGGGATTTCAGG-3'；

MALAT1-R(SEQ ID NO：6)：

5'-GCCCACAGGAACAAGTCCTA-3'。

5.一种用于检测胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i)胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性标志物的RNA或其检测试剂；

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的lncRNA NEAT1上的编辑位点选自下组(以GRCh38参考基因组坐标)：chr11:65425652，chr11:65444937，chr11:65428056，chr11:65441080，chr11:65431271，chr11:65436573，chr11:65436866，chr11:65442018，chr11:65443866；

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述标志物的检测包括定量检测或定性检测。

8.一种检测方法，其特征在于，包括步骤：

9.一种评估胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的设备，所述设备包括：

10.一种筛选潜在化合物的方法，其特征在于，所述化合物为潜在的促进或抑制胞苷脱氨酶APOBEC3B酶活性的化合物，所述方法包括步骤：

(a)提供待筛选的化合物；