CN116286988A - 一种稳定表达冠状病毒3cl蛋白酶的腺相关病毒体系、动物模型及构建方法和应用 - Google Patents
一种稳定表达冠状病毒3cl蛋白酶的腺相关病毒体系、动物模型及构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒体系、动物模型及构建方法和应用,属于生物技术领域。以混合体病毒载体为骨架,将冠状病毒3CL蛋白酶基因片段克隆至混合体病毒骨架载体中,构建重组腺相关病毒表达质粒;其中,重组质粒还包括有调控元件、标签蛋白基因和药物筛选基因。使用包含该重组腺相关病毒表达质粒的腺相关病毒体系感染实验动物,得到安全性高、可长期稳定表达且在低生物安全防护等级实验室即可测定冠状病毒3CL蛋白酶抑制或降解活性的动物模型。通过目标蛋白的信号值及定量检测即可反映动物体内药物效果,操作简便,无需繁琐步骤,可大幅提升科研效率,为加快抗冠状病毒感染药物研发进程及疫苗的研制提供有力工具。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒体系、动物模型及构建方法和应用。
背景技术
SARS-CoV-2属于β属冠状病毒,针对冠状病毒的致病机制和关键靶标,开发有效的抗冠状病毒药物,对于预防和治疗冠状病毒感染具有重要意义。SARS-CoV-2感染宿主细胞后,其遗传物质RNA的ORF1a/b首先翻译表达出两条多聚蛋白前体,多聚蛋白前体在3CL蛋白酶(3CLpro,也称为主蛋白酶Mpro)和木瓜样蛋白酶的作用下发生分子内的切割产生多个非结构蛋白。由于3CL蛋白酶在病毒的生命周期中起到了至关重要的作用且在冠状病毒中保守性高,在人体内没有同源蛋白,将其作为治疗靶点开发出的药物具有广谱抗冠状病毒能力,所以3CL蛋白酶是一个抗病毒药物研发的理想靶点。
但是,新冠感染动物模型的构建是药物从实验室走向临床应用的技术瓶颈之一。普通的实验室动物不能感染SARS-CoV-2,且使用SARS-CoV-2的研究必须在生物安全防护三级实验室(P3)由经过技术安全培训的人员操作,使得抗新冠感染药物和疫苗的研发困难重重。虽然有慢病毒被用于感染筛选单克隆并建立基因稳定的细胞系的报道,但是在动物体内,慢病毒转染效果存在明显劣势,且具有潜在致瘤性。因而需要一种安全性更好、选择性更高、感染能力更强的工具来助力冠状病毒3CL蛋白酶靶向药物的研发。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒体系、动物模型及构建方法和应用,提供一种安全性更好、选择性更高、感染能力更强的工具来助力冠状病毒3CL蛋白酶靶向药物的研发。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明公开了一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系,包括含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组腺相关病毒载体和辅助包装质粒;所述含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组腺相关病毒载体包括混合体病毒载体骨架、冠状病毒3CL蛋白酶基因片段、调控元件、标签蛋白基因和药物筛选基因;所述的冠状病毒3CL蛋白酶基因片段包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV及其变异株的3CL蛋白酶基因。
优选地,所述冠状病毒3CL蛋白酶基因序列如SEQ.ID.5所示。
优选地,所述的混合体病毒载体骨架是利用AAV2型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体。
进一步优选地,所述混合体病毒载体骨架为GV411载体。
优选地,所述辅助包装质粒为调控外源基因表达的腺相关病毒蛋白表达质粒、实现组织或细胞特异性表达的腺相关病毒蛋白表达质粒、提供病毒包装所需包膜蛋白的质粒或提供病毒包装所需包装蛋白的质粒。
优选地,所述的标签蛋白包括His、GST、HA、c-Myc、Flag标签和任何组合的双标签蛋白;所述的药物筛选基因包括Puromycin、Neomycin、G418和Hygromycin。
进一步优选地,衣壳蛋白的血清型选自:AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9。
进一步优选地,衣壳蛋白的血清型为AAV5或AAV9。
本发明还公开了上述一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系的制备方法,将携带有调控元件、标签蛋白基因和药物筛选基因的重组腺相关病毒载体骨架经酶切后获得线性化载体;将以SEQ.ID.1和SEQ.ID.2所示的序列为扩增引物得到的目的基因片段***线性化载体的酶切位点之间,得到新冠病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒表达质粒;再将含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒和病毒辅助包装质粒以质量比为1:2进行包装、转染、扩增,得到稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒***。
优选地,所述酶切位点为BamHI/NheI。
优选地,扩增引物的序列如SEQ.ID.1和SEQ.ID.2所示。
优选地,包装、转染、扩增所需的细胞选自大肠杆菌、HEK-293细胞、HEK-293T细胞、HEK-293A细胞、HEK-293S细胞、HEK-293FT细胞、HEK-293H细胞、HeLa细胞和Vero细胞中的一种或几种。
优选地,包装、转染、扩增的具体步骤为:细胞株扩增获取含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组腺相关病毒质粒和辅助包装质粒,通过质粒提取获得高浓度、高纯度、无内毒素的质粒;将质粒滴加至细胞培养液中,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养6~10h后换入新鲜培养基,继续培养48~72h,裂解细胞收集腺相关病毒体系原液,得到用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的动物模型的腺相关病毒体系。
本发明还公开了上述一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系在制备稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型、动物模型、抗冠状病毒感染化学药物、生物制剂及基因疗法研发中的应用。
本发明还公开了一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型,将上述一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系通过尾静脉注射、腹腔注射、滴鼻注射、气管内注射或气管插管注射的方式感染动物,得到稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型。
本发明还公开了上述一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型在新药研发、药物筛选、生物制剂制备及基因治疗方案研究中的应用。
方法下面:
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明提供的一种构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的动物模型的重组腺相关病毒体系,首先,该体系安全性好,腺相关病毒的衣壳极小且免疫原性低,不表现出致病性或细胞毒性,对人体无致病性;其次,该体系选择性高,腺相关病毒的衣壳蛋白结构可决定其血清型,从而特异性感染实验动物的目的组织或脏器,具有更高的选择性。最后,该体系感染能力强,重组腺相关病毒特异性强,基于不同的血清型对不同的活体脏器有较高的识别和感染能力;重组腺相关病毒免疫原性低,局部大剂量注射活体组织时,很少有感染细胞被免疫***清除,有利于动物模型的构建;而且,重组腺相关病毒感染谱广且表达时间长,各种器官及所有处于***期和静止期的细胞都可以使用重组腺相关病毒来感染,且在细胞***不旺盛的组织中可持续表达数月以上,能够长时间地表达外源基因。因而能够作为低生物安全防护等级实验室(P2)中冠状病毒3CL蛋白酶靶向药物的筛选工具。在动物模型中,通过滴鼻感染或支气管灌注,腺相关病毒能够高效地穿透动物细胞表面和细胞间基质内的糖胺聚糖层,更容易感染动物细胞。应用动物组织内目标蛋白的表达信号强度反映动物体内药物效果,操作简便,无需繁琐步骤,检测成本低,可大幅提升科研效率;可依据实验目的,在特定组织或器官表达3CL蛋白酶,为靶向药物的研究提供理想工具,加快新冠感染有效药物和疫苗的研发进程,为新冠感染治疗药物的开发奠定基础,此外,动物模型的建立方法可以推广到其他领域,助力药物研发。
附图说明
图1为本发明的构建重组冠状病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒的载体骨架GV411图谱;
图2为本发明的GV411载体酶切产物凝胶电泳图谱;其中,1:Marker;2:GV411载体酶切产物;3:未经酶切GV411载体;
图3为本发明的新冠病毒3CL蛋白酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图谱;其中,1:Marker;2:PCR产物;
图4为本发明的阳性转化子PCR鉴定凝胶电泳图;其中,1:空白对照;2:阴性对照;3:阳性对照;4:DNA Ladder;5~12:1~8号转化子;
图5为本发明的腺相关病毒体系包装辅助质粒pAAV-RC载体图谱;
图6为本发明的腺相关病毒体系包装辅助质粒pHelper载体图谱;
图7为本发明的进行重组腺相关病毒滴度检测时的PCR扩增曲线图;
图8为本发明的重组腺相关病毒滴度检测标准曲线图;
图9为本发明的感染重组腺相关病毒的小鼠模型的取样时间点示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
本发明提供的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的动物模型的腺相关病毒体系,包括含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组腺相关病毒载体质粒和辅助包装质粒;用于构建重组腺相关病毒载体质粒的混合体病毒载体骨架的衣壳蛋白的血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9;含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组腺相关病毒载体质粒,包含冠状病毒3CL蛋白酶基因片段、调控元件、标签蛋白基因和药物筛选基因;辅助包装质粒为可调控外源基因表达的腺相关病毒蛋白表达质粒、可实现组织或细胞特异性表达的腺相关病毒蛋白表达质粒、提供病毒包装所需包膜蛋白的质粒和提供病毒包装所需包装蛋白的质粒;
其中,所述标签蛋白包括但不限于His、GST、HA、c-Myc、Flag标签或任何组合的双标签蛋白;所述药物筛选基因包括但不限于Puromycin、Neomycin、G418或Hygromycin;所述冠状病毒3CL蛋白酶基因为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV或变异株的3CL蛋白酶基因。
下面以含有新冠病毒3CL蛋白酶基因、骨架载体质粒元件序列为CMV-betaGlobin-MCS-3Flag-SV40 PolyA的重组腺相关病毒载体、病毒包装辅助质粒pAAV-RC载体和pHelper载体包装得到的腺相关病毒体系进行详述。
1.构建新冠病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒表达质粒
利用限制性内切酶消化获得线性化载体,PCR扩增制备新冠病毒3CL蛋白酶基因片段,以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系,进行重组反应,实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物进行转化,挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定,对阳性克隆进行测序及结果分析。具体步骤如下:
1)酶切体系的构建
商业化的GV411载体(质粒图谱见图1,购自上海吉凯基因化学技术有限公司),该载体元件顺序:CMV-betaGlobin-MCS-3Flag-SV40 PolyA,克隆位点:BamHI/NheI。如表1所示构建酶切体系,用移液器轻轻吹打混匀,短暂离心,置于37℃反应3h。对GV411载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带(图2)。
表1酶切反应体系
试剂 | 体积(μL) |
ddH2O | 42 |
10×CutSmart Buffer2 | 5 |
纯化的GV411载体质粒DNA(1μg/μL) | 2 |
AgeI(10U/μL) | 1 |
Total | 50 |
2)目的基因片段的获取
设计引物,扩增引物序列如表2所示:
表2扩增引物序列
ID | 序列 | 序号 |
3CLpro-p1 | ggaggtagtggaatggatcccgccaccatgagtggttttagaaaaatg | SEQ.ID.1 |
3CLpro-p2 | tcatccttgtagtcgctagcttggaaagtaacacctgagcattg | SEQ.ID.2 |
扩增引物说明:包括交换配对碱基、酶切位点,并含有3CL蛋白酶基因5’端部分序列用于PCR获得目的基因。
根据表3所示配置PCR反应体系,吹打混匀后离心,置于PCR仪中进行反应。根据表4反应条件进行目的基因PCR扩增,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带(图3)。
表3 PCR反应体系
表4 PCR反应条件
3)PCR产物与载体进行交换
于冰水浴中配制如表5所示反应体系并离心,避免产生气泡。后于37℃反应30min,再置于冰水浴中冷却5min后立即转化。在该体系中,加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的最适摩尔比为1:2。
表5 PCR产物与载体的反应体系
反应体系 | 阳性对照(μL) | 阴性对照(μL) | 实验组(μL) |
ddH2O | 2.5 | 4.5 | 3.5 |
5×CE II Buffer | 2 | 2 | 2 |
酶切后的GV411载体DNA | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
纯化后的PCR产物片段 | 2 | 0 | 1 |
ExnaseTMII | 1 | 1 | 1 |
Total | 10 | 10 | 10 |
4)转化
将10μL上述交换反应产物加入到100μL感受态细胞中,轻弹管壁混匀后,冰上放置30min。42℃热激90s,冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基,置于37℃摇床振荡培养1h。取菌液均匀涂布在含有Puromycin(Clontech Laboratories,Inc)的平板上,在恒温培养箱中倒置培养14h。
5)菌落PCR鉴定
根据表6进行PCR反应,震荡混匀,短暂离心。在超净工作台中,用无菌的枪头挑取单个菌落至20μL鉴定体系中,吹打混匀,置于PCR仪中进行反应。
表6 PCR鉴定引物序列、反应体系及反应条件
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带,观察鉴定结果(图4)。其中:空白对照以ddH2O为模板,结果显示鉴定体系不存在污染;阴性对照以未***目的基因的空载体为模板,结果显示扩增过程中无假阳性现象;阳性对照以含有GAPDH基因的DNA为模板,结果显示工作体系正常。阳性转化子PCR产物大小为1105bp。
6)测序
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含Puromycin的LB液体培养基中,37℃培养16h,取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析。比对结果说明,测序结果与目标序列完全一致,重组质粒载体构建完成。具体比对结果如下:
表7测序结果
2.稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒体系的包装
使用质粒抽提试剂盒(Qiagen)将重组新冠病毒3CL蛋白酶腺相关病毒表达质粒及商品化的病毒包装辅助质粒pAAV-RC载体(图5,上海吉凯基因化学技术有限公司)和pHelper载体(图6,上海吉凯基因化学技术有限公司)进行质粒提取,获得高浓度高纯度无内毒素的质粒。包装过程中用到的腺相关病毒包装细胞为HEK-293细胞,经培养生长增殖形成单层细胞;用于扩增腺相关病毒载体和辅助包装质粒的菌株为大肠杆菌菌株DH5α。具体包装步骤如下:
转染前将HEK-293细胞进行复苏和传代培养,用胰酶-EDTA溶液消化对数生长期细胞,重新接种在含有新鲜生长培养基的组织培养瓶中,37℃,5%CO2培养,每天查看细胞密度,当细胞培养至50%汇合率时进行传代。37℃水浴中预热DMEM完全培养基和胰酶-EDTA溶液,移去生长培养基。PBS溶液清洗细胞,用5mL胰酶-EDTA溶液消化细胞2分钟,后用5mL培养基稀释细胞以使胰酶失活。将细胞悬浮液重新接种在含有新鲜生长培养基的组织培养瓶中,37℃,5% CO2培养,每天查看细胞密度,细胞汇合率维持在50%以下。
转染前48h,在细胞培养盘中加入10mL DMEM生长培养基,然后加入3×106个HEK-293细胞,待汇合率达到70%~80%即可用于转染。转染开始前,将DNA溶液(重组腺相关病毒表达载体质粒10μg、pAAV-RC载体质粒10μg、pHelper载体质粒10μg)加入离心管中,然后加入1mL的0.3M CaCl2混合。吸取1mL的2×HBS溶液到另一锥底管中,向其中滴加1.03mL的上述DNA/CaCl2混合液,反复吹打混匀。将混合后的DNA/CaCl2/HBS溶液滴加到细胞培养盘上,轻晃使其混匀,将细胞培养盘放回到37℃培养箱放置6h。转染结束后,将盘中的培养基替换为10mL新鲜培养基,将细胞培养盘送回到孵箱中再次培养并观察腺相关病毒体系的包装进程,72h后收毒。
准备干冰乙醇浴(将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒中)及37℃水浴。离心3分钟分离细胞和培养基,弃去上清,细胞用1mL PBS溶液重悬;将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反复转移,冻融四次,通过10000×g离心去除细胞碎片,将离心上清转移到离心管中,即得稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒体系原液。
3.稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒体系的质量检测
采用下述方法对制得的腺相关病毒体系原液进行质量检测方法:
1)物理指标检测
通过肉眼判断,上述腺相关病毒体系呈澄清液体状。用移液器缓慢吸取50μL上清液体,无明显粘稠感或吸液滞后现象。
2)无菌检测
将腺相关病毒体系上清液加入到HEK-293细胞中,培养24h后镜检,发现无细菌及真菌污染情况,细胞间隙无明显颗粒存在,培养基澄清透明。
3)滴度检测
采用定量PCR方法检测稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒体系的基因组拷贝数,从而测定腺相关病毒的病毒颗粒数,具体实验步骤如下:
标准品制备:每一个标准品准备6份90μL水,装在Ep管中。取10μL样品加入到第一份水中,混匀后从中取出10μL加入到第二份水中,依次类推。最后得到6个稀释度的样品,取后5个样品作为模板进入定量PCR;每个目标样品取20μL加入到180μL水中,混匀后准备5份90μL水,装在Ep管中,然后从中取出10μL加入到90μL水中,依次类推。最后得到5个稀释度,取后4个样品进入定量PCR(图7)。
配置反应体系,每个反应体系中含10μL 2X SYBR Green Mix,上下游引物各0.5μL,0.2μL Rox参比染料,加水补充到15μL后加入到96孔反应板中,每个样品加入5μL,设置复孔。PCR反应按照SYBR Green试剂盒(Roche)说明进行;
表8标准曲线拷贝数
标准曲线拷贝数如表8所示,得到定量PCR产物的Ct值(表9)后,以标准品浓度的对数值和Ct平均值为横纵坐标拟合得到标准曲线:Y=-3.256×Log(X)+38.80,R2=0.990(图8)。
表9定量PCR产物Ct值
标准品 | Standard-2 | Standard-3 | Standard-4 | Standard-5 |
Ct值 | 15.37 | 17.43 | 21.56 | 24.22 |
目的样品 | Sample-2 | Sample-3 | Sample-4 | Sample-5 |
Ct值 | 15.92 | 17.77 | 21.25 | 24.07 |
通过将目的样品的Ct值代入公式,得到待测样品滴度,除以稀释度并乘2得到原始样品滴度,将四个组的滴度数值加以平均,得到滴度均值,即为样品的最终滴度数据为5.78E+13(表10)。
表10样品的最终滴度数据
(注:标注删除线部分为实验误差较大的数据,不参与平均滴度的计算。)
4.肺部稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶的小鼠模型的建立
本实施例应用稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶的重组腺相关病毒体系,建立在低生物安全防护等级实验室(P2)应用的肺部稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶的小鼠模型。
将5周龄BALB/cAJcl小鼠放入气体麻醉腔中,通入氧气及2.5%的异氟烷,2~3分钟后小鼠处于完全无意识状态。将麻醉好的小鼠取出,仰卧放置在手术板上,固定四肢及头部。在小鼠鼻孔上方放置连通气体麻醉***的软管,确保小鼠处于稳定麻醉状态。吸取80μL滴度为1E+12v.g/mL的重组腺相关病毒原液,通过气管灌注感染小鼠。待病毒完全滴入后撤掉气管插管,关闭气体麻醉***。将小鼠从手术板上取下,放回饲养笼中,待其苏醒观察48h。
病毒注射完成后,按照如图9所示每间隔两周处死模型小鼠,分离肺脏置于装有50mL 4%多聚甲醛固定液的离心管中于4℃过夜。第2天倒去多聚甲醛固定液,用PBS溶液将肺组织置于冰上洗涤3遍。然后浸于30%的蔗糖溶液于4℃脱水完全。将肺组织取出置于包埋盒中,滤纸吸干组织周围多余溶液,滴加适量的O.C.T包埋剂(Sakura)直至肺组织完全浸没,静置使O.C.T包埋剂与组织充分接触,放于-80℃冰箱中,待O.C.T包埋剂凝固。使用切片机将包埋块修理成小块,后切成合适厚度的薄片,用细毛笔将切片整理平整,铺在明胶包被过的载玻片上。
在冰冻切片后,室温下避光晾片30~45min。待切片与载玻片贴合牢固后,放入通风橱中,每张切片滴加1mL 4%多聚甲醛溶液室温固定10min,然后倒掉多聚甲醛,用PBS溶液洗涤三次,每次10min,用滤纸吸干载玻片上多余的PBS溶液。配制一抗(anti-flag:37kDa,Sigma;anti-β-actin:42kDa,Santa Cruz)工作液,取200μL滴加到切片上后小心覆盖封口膜,4℃避光孵育48h。一抗孵育结束后取出切片,揭去封口膜,倒掉一抗,将切片放入染缸中用PBS溶液洗涤3次,每次10min。配制二抗(anti-rabbit IgG:CST)工作液,取200μL滴加到切片上后小心覆盖封口膜,4℃避光孵育过夜。第二天取出切片,揭去封口膜,倒掉二抗,将切片放入染缸用PBS溶液洗涤3次,每次10min。将切片取出,并于室温避光晾干。晾干后的切片滴加适量的封片剂到载玻片上,盖上盖玻片晾干后,密封四周防止盖玻片滑动。处理好的切片置于荧光显微镜下进行小鼠肺组织免疫荧光检测,发现经重组腺相关病毒体系感染的小鼠模型肺部可稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系,其特征在于,包括含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组腺相关病毒载体和辅助包装质粒;所述含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组腺相关病毒载体包括混合体病毒载体骨架、冠状病毒3CL蛋白酶基因片段、调控元件、标签蛋白基因和药物筛选基因;所述的冠状病毒3CL蛋白酶基因片段包括SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV及其变异株的3CL蛋白酶基因。
2.根据权利要求1所述的一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系,其特征在于,所述的混合体病毒载体骨架是利用AAV2型基因组与不同血清型的衣壳蛋白基因组结合产生的混合体病毒载体。
3.根据权利要求1所述的一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系,其特征在于,所述辅助包装质粒为调控外源基因表达的腺相关病毒蛋白表达质粒、实现组织或细胞特异性表达的腺相关病毒蛋白表达质粒、提供病毒包装所需包膜蛋白的质粒或提供病毒包装所需包装蛋白的质粒。
4.根据权利要求1所述的一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系,其特征在于,所述的标签蛋白包括His、GST、HA、c-Myc、Flag标签和任何组合的双标签蛋白;所述的药物筛选基因包括Puromycin、Neomycin、G418和Hygromycin。
5.根据权利要求2所述的一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系,其特征在于,衣壳蛋白的血清型选自:AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9。
6.根据权利要求5所述的一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系,其特征在于,衣壳蛋白的血清型为AAV5或AAV9。
7.权利要求1~6任一项所述的一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系的制备方法,其特征在于,将携带有调控元件、标签蛋白基因和药物筛选基因的重组腺相关病毒载体骨架经酶切后获得线性化载体;将以SEQ.ID.1和SEQ.ID.2所示的序列为扩增引物得到的目的基因片段***线性化载体的酶切位点之间,得到新冠病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒表达质粒;再将含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒和病毒辅助包装质粒以质量比为1:2进行包装、转染、扩增,得到稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的腺相关病毒***。
8.权利要求1~6任意一项所述的一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系在制备稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型、动物模型、抗冠状病毒感染化学药物、生物制剂及基因疗法研发中的应用。
9.一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型,其特征在于,将权利要求1~6任意一项所述的一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型的腺相关病毒体系通过尾静脉注射、腹腔注射、滴鼻注射、气管内注射或气管插管注射的方式感染动物,得到稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型。
10.权利要求9所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶动物模型在新药研发、药物筛选、生物制剂制备及基因治疗方案研究中的应用。
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