CN116286955A - 一种可变剪切产物在提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短生长周期中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可变剪切产物在提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短生长周期中的应用，属于植物基因工程技术领域。所述可变剪切产物是SIK1.1基因及其在其他物种中的同源基因，所述SIK1.1的基因序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。本发明实验发现通过改变单个基因的两个剪切产物(即有活性的激酶SIK1.1和无活性的激酶抑制蛋白SIK1.2)的表达水平即可同时达到增产早熟以及抗盐的目的，为作物育种提供了新的参考。

Description

一种可变剪切产物在提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短 生长周期中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，是一种可变剪切产物在提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短生长周期中的应用。

背景技术

粮食是人类生存最基本的生活消费品，一个国家的粮食问题是关系到国计民生的头等大事。我国人口基数大，但可用耕地面积有限，培育高产作物，对于稳定粮食安全和实现经济的可持续增长具有极其重要意义。

土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题。我国盐碱地和土壤盐渍化问题突出，培育抗盐性提高的作物新品种，可以有效利用盐渍化土地，缓解我国土地资源匮乏的问题。

我国是世界上自然灾害较为严重的国家，灾害严重影响了我国粮食安全。突破粮食生产周期瓶颈，是我国粮食生产连年实现丰收的重要因素。在不减产的同时缩短作物的生长周期，可以有效降低自然灾害的影响。

近年来，随着研究人员对植物高产分子机制的深入研究，采用转基因等基因工程手段向植物导入外源基因提高产量已成为培育高产植物品种的新途径之一，对解决我国日益严峻的粮食问题十分重要，并且对于可观的、可持续的社会经济作物育种是一项投资少、效益高的生物技术，对发展种植生产具有重要意义。可通过提高作物产量、增强作物抗性、提高生产效率促进作物的生产。与传统的作物育种方式相比，基因工程育种目的性强、育种周期短，其关键在于功能基因的发掘与利用。转基因作物的争议主要来自于外源基因转入。在深入研究植物自身基因表达水平以及蛋白活性的调控的基础上，通过精细操作植物内源基因的表达水平，培育高产抗逆新品种，不属于转基因的范畴，可以避免外源基因转入导致的争议。

中国专利申请：CN201810582355.4公开了一种棉花基因GhDTX27在植物耐盐、干旱和冷胁迫方面的应用，所述棉花基因GhDTX27的基因ID是Gh_D06G0281。通过转基因技术获得的转GhDTX27基因的拟南芥纯合系对盐、干旱和冷胁迫的耐受性显著提高，通过盐、干旱和冷处理后表型变化、叶绿素含量测定、叶片相对含水量测定、离子电导率测定、离体叶片失水测定、发芽率统计、根长伸长量的比较、幼苗鲜重变化、逆境胁迫响应基因的表达分析、抗氧化酶活性和氧化剂含量测定多种验证。

再如中国专利申请：CN201611248777.5公开了一种拟南芥基因COLD1在植物抗干旱胁迫方面的应用，具体公开了拟南芥基因COLD1(Genbank：AT1G32230)在植物抗干旱胁迫方面的新用途。基于该发现，进一步提供了拟南芥基因COLD1在培育抗干旱胁迫转基因植物方面的应用，具体为：将COLD1基因或其CDS序列，或由COLD1基因或其CDS序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等功能的衍生的核苷酸序列，利用表达载体转化到植物中获得抗干旱胁迫的转基因植物。且若能够在转基因植物中进行拟南芥基因COLD1的超表达，可获得更加耐旱的转基因植物。

可见，现有技术中仍有很多技术是通过转入外源基因来实现提高植物耐盐、耐旱等性能，而转入外源基因的方法存在稳定性不好等诸多缺陷，关于本发明一种可变剪切产物在提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短生长周期中的应用还未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短生长周期中的可变剪切产物及其应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，本发明提供了如下任一所述在提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短生长周期中的应用，

(1)SIK1.1基因或其在其他物种中的同源基因；

(2)如(1)所述基因编码的蛋白质；

(3)含有(1)所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

优选地，所述SIK1.1基因序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述应用的方法为：将含有SIK1.1基因或其在其他物种中的同源基因的表达载体转化到目的植物中，获得具有高生物量、高产量、高抗盐性以及短生长周期的植物。

优选地，提高目的植物中如上所述蛋白的表达量。

优选地，所述重组表达载体包括SIK1.1基因或其在其他物种中的同源基因。

第二方面，本发明提供了一种提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短生长周期的重组表达载体、表达盒或重组菌，所述重组表达载体、表达盒或重组菌包括如上所述的SIK1.1基因或其在其他物种中的同源基因。

第三方面，本发明提供了一种获得转基因株系的方法，将一个基因不同剪切产物的编码序列用自身启动子分别转入该基因的敲除突变体中。

本发明优点在于：

本发明通过实验发现在拟南芥SIK1.1基因及其在其他物种中的同源基因敲除突变体中，用SIK1.1基因及其在其他物种中的同源基因自身启动子驱动SIK1.1的CDS(codingsequence)表达，即得到了仅表达SIK1.1基因及其在其他物种中的同源基因。该方法不仅涉及外源基因的转入，可以避免转基因育种的争议，而且得到的植物株系具有如下优点：叶片增大，生物量增大、种子增大，产量提高、抽薹和开花时间提前，生长周期缩短、耐盐性提高。

在没有突变体的物种，以及仅有SIK1.1的同源基因，而无SIK1.2的同源基因的物种中，通过增加SIK1.1的同源基因的表达水平可能也能实现上述优点。

附图说明

附图1是长日照条件下，不同株系的生长结果：sik1/SIK1.1株系较WT株系、SIK1株系、sik1/SIK1.2株系长得最快，生长周期缩短。

附图2是对照(上)和盐胁迫(下)条件下，不同株系的生长结果：sik1/SIK1.1株系均比WT长势好。

附图3是短日照条件，不同株系的生长结果：sik1/SIK1.1株系较WT株系、SIK1株系、sik1/SIK1.2株系莲座叶和生物量均明显增加。

附图4是不同株系的生长结果：sik1/SIK1.1株系较WT株系、SIK1株系、sik1/SIK1.2株系种子明显增大，产量明显提高。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

器官大小调控机制的研究对于提高作物生物量和产量提供理论基础。拟南芥SIK1是控制器官大小的基因，对其分子功能和调控机制的研究可能可以指导作物育种。

可变剪切在真核生物体内广泛存在，指的是在mRNA前体到成熟mRNA的过程当中，不同的剪切方式使得同一个基因可以产生多个不同的成熟mRNA,最终产生不同的蛋白质。可变剪切导致了转录本和蛋白质结构与功能的多态性，是一种重要的转录调控机制。

拟南芥SIK1基因存在可变剪切，两个剪切产物SIK1.1和SIK1.2在体内均存在，两个剪切产物只相差81bp，SIK1.1蛋白比SIK1.2蛋白仅仅多27个氨基酸残基。为了分别研究SIK1.1和SIK1.2在拟南芥体内的功能，在拟南芥sik1敲除突变体中，用SIK1自身启动子驱动SIK1.1的CDS(coding sequence)表达，即得到了仅表达SIK1.1而没有SIK1.2的拟南芥株系(sik1/SIK1.1)。该方法不涉及外源基因的转入，可以避免转基因育种的争议。

实验原料及来源：

拟南芥野生型(Wild Type,WT)为Col-0生态型(Columbia-0)，WT和SIK1(Salk_051369)种子购自拟南芥生物研究中心(ABRC，https://www.arabidopsis.org/)；

实验所用克隆菌株为大肠杆菌(Escherichia coli.)DH5α；

拟南芥转化所用菌株为农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101；

载体为pCAMBIA1302；

所用试剂及厂家如下：

引物合成及基因测序 金唯智(Genewiz)

Murashige&Skoog basal medium with vitamins Duchefa Biochemie

PrimeSTAR HS DNA Polymerase 宝生物(Takara)

ClonExpress II One Step Cloning Kit 诺唯赞(Vazyme)

AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit 爱思进(Axygen)

AxyPrepTM PCR Cleanup Kit 爱思进(Axygen)

AxyPrepTM PCR DNA Gel Extraction Kit 爱思进(Axygen)

实施例1

1实验方法

1.1重组表达载体的构建

以WT拟南芥的DNA为模板，用表1中引物、高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase)PCR扩增SIK1的启动子(ProSIK1，序列如SEQ ID NO.3所示)，用PCR产物回收试剂盒(AxyPrepTM PCR Cleanup Kit)回收约420bp的DNA产物片段。

用限制性内切酶HindIII和NcoⅠ双酶切pCAMBIA1302载体，切掉35S启动子，用凝胶回收试剂盒(AxyPrepTM PCR DNA Gel Extraction Kit)回收约10kbp的线性化载体。

用同源重组试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将上述得到的ProSIK1和线性化载体进行重组连接，转化大肠杆菌，提取重组表达载体(AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit)进行测序，选取测序正确的重组表达载体保存，即得到ProSIK1:GFP的pCAMBIA1302载体。

表1

注：下划线标记序列为用于同源重组的同源臂，无下下划线标记序列为扩增序列。

以WT拟南芥的cDNA为模板，用表2中引物、高保真酶(PrimeSTAR HS DNAPolymerase)PCR扩增SIK1(包括SIK1.1和SIK1.2)，用PCR产物回收试剂盒(AxyPrepTM PCRCleanup Kit)回收约2.5k bp的DNA产物片段。

用限制性内切酶HindIII切ProSIK1的pCAMBIA1302载体，PCR产物回收试剂盒(AxyPrepTM PCR Cleanup Kit)回收约10kbp的线性化载体。

用同源重组试剂盒(ClonExpress II One Step Cloning Kit)将上述得到的SIK1和线性化载体进行重组连接，转化大肠杆菌，提取重组表达载体(AxyPrepTM PlasmidMiniprep Kit)进行测序，选取测序正确的ProSIK1:SIK1.1-GFP和ProSIK1:SIK1.2-GFP重组表达载体保存。

表2

注：下划线标记序列为用于同源重组的同源臂，无下下划线标记序列为扩增序列。

1.2sik1/SIK1.1和sik1/SIK1.2回补株系的获得

将重组表达载体ProSIK1:SIK1.1-GFP和ProSIK1:SIK1.2-GFP通过冻融法导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

采用拟南芥花序浸花转化法(记载于如下文献中Clough，S.J.，and Bent，A.F..Floraldip：asimplified method for Agrobacterium mediated transformationofArabidopsis thaliana.Plant J.(1998)16，735 743.)，将ProSIK1:SIK1.1-GFP和ProSIK1:SIK1.2-GFP转至拟南芥SIK1突变体中，获得T1代转基因拟南芥种子。

将T1代种子播种于含有25mg/L潮霉素的1/2MS固体等培养基上，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代阳性苗，单株收种子即得到T2种子。

不同株系的T2代播种于含有25mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为SIK1基因***一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3。

T3代播种于含有25mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合株系。分别挑选3个SIK1/ProSIK1:SIK1.1-GFP(sik1/SIK1.1)和SIK1/ProSIK1:SIK1.2-GFP(sik1/SIK1.2)株系进行后续实验。

1.3植物培养

种子消毒：将充分干燥的拟南芥种子装在1.5mL离心管中，为了保证杀菌消毒彻底，每管所装干种子体积不超过0.1mL。在超净工作台中向每管加入1mL 75％乙醇，持续摇动5min后吸掉乙醇，然后用灭过菌的蒸馏水洗涤5次，然后置于4℃冰箱黑暗环境春化2天。

固体培养基培养：在超净台中将春化过的种子铺在1/2MS固体培养基(配方：MS盐2.2g/L，MES 0.5g/L，蔗糖10g/L，琼脂8g/L，pH 5.7)上垂直放置生长。培养7-10天移至泥炭土基质中培养，或培养至所需天数用于实验。

固体平板培养、泥炭土培养的正常培养条件为：温度22℃，16h光照/8h黑暗，光照强度为100μE m-2sec-1，土苗移土后需覆膜保湿，3-4天后揭膜，定期浇水。短日照条件为温度22℃，10h光照/18℃，14h黑暗，光照强度为100μE m-2sec-1。

1.4表型观察

扫描仪(爱普生perfect V33)捕捉幼苗的表型。土培植物是用数码相机(佳能Powershot A800)记录表型，板苗和莲座叶用扫描仪(爱普生perfect V33)捕捉记录表型，种子用体视显微镜(Olympus MVX10)记录表型。

2实验结果

结果见图1-4，图1表明：长日照条件下，sik1/SIK1.1株系较WT株系、SIK1株系、sik1/SIK1.2株系长得最快，生长周期缩短。

图2表明：对照(上)和盐胁迫(下)条件下，sik1/SIK1.1株系均比WT长势好。

图3表明：短日照条件，sik1/SIK1.1株系较WT株系、SIK1株系、sik1/SIK1.2株系莲座叶和生物量均明显增加。

图4表明：sik1/SIK1.1株系较WT株系、SIK1株系、sik1/SIK1.2株系种子明显增大，产量明显提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.如下任一所述在提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短生长周期中的应用，

(1)SIK1.1基因或其在其他物种中的同源基因；

(2)如(1)所述基因编码的蛋白质；

(3)含有(1)所述基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SIK1.1基因序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将含有SIK1.1基因或其在其他物种中的同源基因的表达载体转化到目的植物中，获得具有高生物量、高产量、高抗盐性以及短生长周期的植物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，提高目的植物中权利要求1所述蛋白的表达量。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体包括SIK1.1基因或其在其他物种中的同源基因。

6.一种提高植物生物量、产量、抗盐性以及缩短生长周期的重组表达载体、表达盒或重组菌，其特征在于，所述重组表达载体、表达盒或重组菌包括权利要求1所述的SIK1.1基因或其在其他物种中的同源基因。

7.一种获得转基因株系的方法，其特征在于，将一个基因不同剪切产物的编码序列用自身启动子分别转入该基因的敲除突变体中。

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