CN116286759A - 氨基酸产量相关蛋白cynT及其生物材料和应用 - Google Patents

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CN116286759A CN202211724762.7A CN202211724762A CN116286759A CN 116286759 A CN116286759 A CN 116286759A CN 202211724762 A CN202211724762 A CN 202211724762A CN 116286759 A CN116286759 A CN 116286759A
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Abstract

本发明公开了氨基酸产量相关蛋白cynT及其生物材料和应用。解决的技术问题是如何提高微生物氨基酸产量。本申请具体公开了A1)蛋白质，所述蛋白为cynT蛋白或将所述cynT蛋白的氨基酸序列的第74位苯丙氨酸残基替换为其他氨基酸残基得到的cynT突变蛋白；所述cynT蛋白是氨基酸序列为序列2的蛋白质；A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有提高微生物的氨基酸产量的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。提高cynT蛋白基因表达的物质可用于提高微生物的氨基酸产量或氨基酸产量菌株的育种。

Description

氨基酸产量相关蛋白cynT及其生物材料和应用
技术领域
本申请具体涉及氨基酸产量相关蛋白cynT及其生物材料和应用。
背景技术
L-苏氨酸是一种重要的营养强化剂，常用于食品添加剂、饲料添加剂、肥料添加剂等。可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有恢复人体疲劳，促进生长发育的效果。对人体皮肤具有持水作用。氨基酸类药。主要用于氨基酸输液、综合氨基酸制剂、食品营养强化剂。如缺乏苏氨酸会引起食欲不振，体重减轻，脂肪肝，睾丸萎缩，脑垂体前叶细胞染色性变化及影响骨骼发育。其作为营养增补剂与葡萄糖共热易生成焦香和巧克力香味，有增香作用，也可用于生化研究。作为饲料营养强化剂，L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸，添加于以小麦，大麦等谷物为主的饲料中。作为营养添加剂，亦用于配制氨基酸输液和综合氨基酸制剂。亦可用于消化溃疡的辅助治疗，也可治贫血及心绞痛、主动脉炎、心功能不全等心血管***疾患。同时，在动物体内具有极其重要的生理作用，如促进生长、提高免疫机能等，平衡日粮氨基酸，使氨基酸比例更接近于理想蛋白质，从而降低畜禽对饲料中蛋白含量的要求。因此，如何提高L-苏氨酸产量是当前的需求。
发明内容
本申请公开了氨基酸产量相关蛋白cynT及其生物材料和应用，解决的技术问题是如何提高L-苏氨酸产量。
为了解决上述问题，本申请提供了一种蛋白质。
所述蛋白质为下述任一种：
A1)蛋白质，所述蛋白为所述cynT蛋白或将所述cynT蛋白的氨基酸序列的第74位苯丙氨酸残基替换为下述任一种氨基酸残基得到的cynT突变蛋白：
半胱氨酸残基、精氨酸酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸、甲硫氨酸残基、缬氨酸残基、丝氨酸残基、脯氨酸残基、苏氨酸残基、丙氨酸残基、酪氨酸残基、组氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、赖氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、色氨酸残基、丝氨酸残基或甘氨酸残基；所述cynT蛋白是氨基酸序列为序列2的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有提高微生物的氨基酸产量的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
上述的蛋白质中，所述蛋白为cynT蛋白或将所述cynT蛋白的氨基酸序列的第74位苯丙氨酸残基替换为下述任一种；
所述氨基酸残基为亮氨酸残基、酪氨酸残基、半胱氨酸残基、脯氨酸残基、色氨酸残基或组氨酸残基；所述cynT蛋白是氨基酸序列为序列2的蛋白质。
上文中，所述cynT突变蛋白的氨基酸序列可为序列6(L)、16(Y)、18(C)、20(P)、22(W)和24(H)中的一种或多种。上文中，将序列2的第74位苯丙氨酸突变为亮氨酸残基得到的蛋白质的氨基酸序列是序列6。
上文中，将序列2的第74位苯丙氨酸突变为亮氨酸残基得到的蛋白质的氨基酸序列是序列6。
上文中，将序列2的第74位苯丙氨酸突变为酪氨酸残基得到的蛋白质的氨基酸序列是序列16。
上文中，将序列2的第74位苯丙氨酸突变为半胱氨酸残基得到的蛋白质的氨基酸序列是序列18。
上文中，将序列2的第74位苯丙氨酸突变为脯氨酸残基得到的蛋白质的氨基酸序列是序列20。
上文中，将序列2的第74位苯丙氨酸突变为色氨酸残基得到的蛋白质的氨基酸序列是序列22。
上文中，将序列2的第74位苯丙氨酸突变为组氨酸残基得到的蛋白质的氨基酸序列是序列24。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述80％以上的同一性可为至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白质中，序列2(SEQ ID No.2)由个207个氨基酸残基组成。
为了解决上述问题，本申请还提供了生物材料。
所述生物材料为下述任一种：
B1)、编码上述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中，B1)所述的核酸分子为下述任一种：
Z1)编码序列是SEQ ID No1所示的DNA分子；
Z2)编码序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；
Z3)编码序列是SEQ ID No.15所示的DNA分子；
Z4)编码序列是SEQ ID No.17所示的DNA分子；
Z5)编码序列是SEQ ID No.19所示的DNA分子；
Z6)编码序列是SEQ ID No.21所示的DNA分子；
Z7)编码序列是SEQ ID No.23所示的DNA分子；
Z8)核苷酸序列是SEQ ID No1所示的DNA分子；
Z9)核苷酸序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；
Z10)核苷酸序列是SEQ ID No.15所示的DNA分子；
Z11)核苷酸序列是SEQ ID No.17所示的DNA分子；
Z12)核苷酸序列是SEQ ID No.19所示的DNA分子；
Z13)核苷酸序列是SEQ ID No.21所示的DNA分子；
Z14)核苷酸序列是SEQ ID No.23所示的DNA分子。
为了解决上述问题，本申请还提供了下述用途。
下述任一种材料在调控微生物氨基酸产量、或制备调控微生物氨基酸产量、或微生物育种中的用途：
C1)蛋白质，所述蛋白质为上述的蛋白质：
C2)调控所述蛋白质的编码基因表达的物质；
C3)调控所述蛋白质的活性或含量的物质。
上述的用途中，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
D1)、编码C1)所述蛋白质的核酸分子；
D2)、含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)、含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)、含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物。
B1)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质cynT的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质cynT的核苷酸序列80％或80％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质cynT且具有蛋白质cynT功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述80％或80％以上同一性，可为81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为所述蛋白质的编码基因。
上文中，所述序列2编码基因如序列1所示。
上文中，所述序列2的第74位苯丙氨酸突变为亮氨酸所示序列的蛋白质如序列6所示。其编码基因如序列5所示。
上文中，所述序列2的第74位苯丙氨酸突变为酪氨酸所示序列的蛋白质如序列16所示。其编码基因如序列15所示。
上文中，所述序列2的第74位苯丙氨酸突变为半胱氨酸所示序列的蛋白质如序列18所示。其编码基因如序列17所示。
上文中，所述序列2的第74位苯丙氨酸突变为脯氨酸所示序列的蛋白质如序列20所示。其编码基因如序列19所示。
上文中，所述序列2的第74位苯丙氨酸突变为色氨酸所示序列的蛋白质如序列22所示。其编码基因如序列21所示。
上文中，所述序列2的第74位苯丙氨酸突变为组氨酸所示序列的蛋白质如序列24所示。其编码基因如序列23所示。
本文中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pEASY-Blunt和/或pCAMBIA-139；
上述生物材料中，B2)或D2)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述基因的DNA，该DNA不但可包括启动基因转录的启动子，还可包括终止基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
上述生物材料中，B5)所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
B2)所述表达盒中启动子可为GapA启动子。
B3)所述载体可为pXMJ19。
B5)所述核酸分子中，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质cynT的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质cynT的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质cynT且具有蛋白质cynT功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
为了解决上述问题，本申请还提供了一种上调或增强或提高微生物氨基酸产量的方法。
所述方法包括上调或增强或提高目的微生物中上述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量，来上调或增强或提高微生物氨基酸产量。
为了解决上述问题，本申请还提供了一种构建重组微生物的方法。
所述方法包括上调或增强或提高目的微生物中上述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量，得到氨基酸产量变化的重组微生物，所述重组微生物的氨基酸产量高于所述目的微生物。
其中，上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量能够上调或增强或提高微生物氨基酸产量。所述氨基酸可为L-苏氨酸。
上文中，调控所述蛋白质的编码基因(简称基因)的表达可为进行如下6种调控中的至少一种调控：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述的方法中，所述上调或增强或提高目的微生物中上述蛋白质的编码基因的表达通过下述任一种方法实现：
E1)向所述目的微生物中导入上述的蛋白质的编码基因；
E2)向所述目的微生物中导入序列2、序列6、序列16、序列18、序列20、序列22或序列24所述蛋白质编码基因的至少一种。
上文中，E1可通过将所述编码基因***染色体实现。***染色体的位点具体可为yaiT编码区。E1还可通过表达所述编码基因的重组质粒导入所述目的微生物中实现，所述重组质粒可作为染色体外的遗传因子存在。所述重组质粒，所述编码基因的核苷酸序列可为序列1、序列5、序列15、序列17、序列19、序列21和序列23中的至少一种。
上文中，E1可通过将所述编码基因以质粒形式进行表达。
所述质粒可为pXMJ19。
为了解决上述问题，本申请提供了一种制备氨基酸的方法。
所述方法包括利用上述的蛋白质或上述的生物材料或上述的重组微生物生产氨基酸。
上述的蛋白质、上述的生物材料、上所述的用途或上述的方法中，所述微生物为如下任一种：
C1)细菌界；
C2)肠杆菌科；
C3)埃希氏菌属；
C4)大肠杆菌。
所述大肠杆菌可为W3110、CGMCC No.25404。
本申请中，所述氨基酸可为L-苏氨酸。
上述重组微生物可以用于生产多种产物，包括但不限于实施例中的赖氨酸、谷氨酸与缬氨酸，所生产的产物还可为甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、精氨酸、组氨酸、莽草酸、原儿茶酸、丁二酸、a酮戊二酸、柠檬酸、鸟氨酸，瓜氨酸等。
本发明还提供了一种生产氨基酸的方法，所述方法包括：上述生物材料导入能合成目的氨基酸的生物细胞中，得到重组生物细胞，培养所述重组生物细胞，得到目的氨基酸。
上述方法中，所述生物细胞可为能合成目的氨基酸的酵母、细菌、藻、真菌、植物细胞或动物细胞。所述生物细胞为任何可以合成目的氨基酸的生物细胞。所述细菌可为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、乳酸发酵短杆菌、黄色短杆菌(brevibacterium flavum)、北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense)、噬氨短杆菌、钝齿棒状杆菌或泛菌(Pantoea)。
本申请中，优选大肠杆菌，任何型号的大肠杆菌都可以使用，实施例选取的菌株仅代表性的菌株，具有大肠杆菌普遍实用性。
有益效果
本申请根据yaiT sgRNA构建了基因敲除载体pGRB-yaiT。并构建具有同源臂的序列1、序列5、序列15、序列17、序列19、序列21和序列23的重组序列。利用cas9蛋白和同源序列将序列1、序列5、序列15、序列17、序列19、序列21和序列23***模式菌株W3110和产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404的yaiT区域，分别获得YPW3110-cynT和YPThr-cynT、YPW3110-cynT F74L和YPThr-cynT F74L、YPW3110-cynT F74Y和YPThr-cynT F74Y、YPW3110-cynT F74C和YPThr-cynT F74C、YPW3110-cynT F74P和YPThr-cynT F74P、YPW3110-cynT F74W和YPThr-cynTF74W及YPW3110-cynT F74H和YPThr-cynT F74H。与模式菌株W3110和产苏氨酸的菌株CGMCCNo.25404相比，其L-苏氨酸产量明显升高。
结果表明无论对于CGMCC No.25404菌株还是模式菌株W3110，cynT蛋白的氨基酸序列第74位苯丙氨酸被半胱氨酸残基、精氨酸酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸、甲硫氨酸残基、缬氨酸残基、丝氨酸残基、脯氨酸残基、苏氨酸残基、丙氨酸残基、酪氨酸残基、组氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、赖氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、色氨酸残基、丝氨酸残基或甘氨酸残基，其中被亮氨酸残基、酪氨酸残基、半胱氨酸残基、脯氨酸残基、色氨酸残基或组氨酸残基取代后，效果较为明显，尤其是被亮氨酸残基取代后，效果最为明显。
保藏说明
菌种名称：大肠埃希氏菌
拉丁名：Escherichia coli
菌株编号：YP0158
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年07月25日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.25404。
附图说明
图1为YPThr-cynTP和YPThr-cynTM 96孔板发酵结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-wayANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。
碳酸酐酶是涉及二氧化碳和碳酸氢根相互转化的酶(EC 4.2.1.1)，能在微生物代谢过程中捕获二氧化碳，提高微生物的碳源利用效率。在谷氨酸棒杆菌中，已发现β型和γ型碳酸酐酶，且β型发挥主要功能，是一种锌金属酶。在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，β型碳酸酐酶由cynT编码，其核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，核苷酸序列624bp，其编码的碳酸酐酶由207个氨基酸组成。
本发明旨在研究谷氨酸棒杆菌碳酸酐酶编码基因cynT及其突变体对Escherichiacoli CGMCC No.25404发酵生产L-苏氨酸中的作用，以提高L-苏氨酸的产量和转化率。
实施例1构建包含质粒上过表达的碳酸酐酶活性的cynT工程菌株
利用大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pXMJ19(货号BiovectorpXMJ19，购自Biovector公司)将谷氨酸棒杆菌ATCC13032碳酸酐酶编码基因cynT导入Escherichia coliCGMCC No.25404中，并以大肠杆菌GapA启动子启动cynT在质粒pXMJ19中的表达，从而在高产菌株中研究cynT编码的外源碳酸酐酶对大肠杆菌合成L-苏氨酸的影响。
一、具有碳酸酐酶活性的野生型cynT表达载体及其工程菌株的构建
依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列为模板，利用KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶(货号KK2501，购自Kapa Biosystems)以引物P1/P2 PCR扩增大肠杆菌GapA启动子，核苷酸序列如SEQ ID No.3，341bp；依据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032基因组DNA为模板，利用KAPA HiFi HotStartDNA聚合酶以引物P3/P4 PCR扩增cynT编码区。
PCR扩增体系：5×HiFi with Mg2+Buffer 10μL，dNTPMixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPAHiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH2O至总体积50μL.
PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸30s；30个循环)，72℃过度延伸5min。
回收上述引物P1/P2 PCR扩增的GapA启动子和引物P3/P4 PCR扩增的cynT DNA片段与经EcoR I/Kpn I酶切回收的表达载体pXMJ19用NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒(货号E2621S，购自New England Biolabs)50℃连接30min，连接产物分别转化野生型菌株W3110和产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404，涂布到含有氯霉素(34mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。对培养的单克隆用Premix TaqTM DNA聚合酶(货号RR901A，购自TaKaRa)以引物M13R(-48)(5'AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGA 3')/T1TER(5'
CGTTCACCGACAAACAACAG3')PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1305bp(序列如SEQIDNo.4)片段的即为含pXMJ19-PGapA-cynT重组载体的阳性转化子，将其分别命名为YPW3110-cynTP和YPThr-cynTP。
所述pXMJ19-PGapA-cynT重组载体为将核苷酸序列是序列SEQ ID No.3-SEQ IDNo.1(SEQ ID No.3为GapA启动子序列)的片段替换pXMJ19载体的限制性核酸内切酶EcoR I和Kpn I识别位点间的片段，保持pXMJ19载体的其它核苷酸序列不变，得到pXMJ19-PGapA-cynT重组载体。
上述SEQ ID No.3-SEQ ID No.1为SEQ ID No.3以磷酸二酯键连接SEQ ID No.1形成的DNA片段。
上述磷酸二酯键是天然基因的脱氧核糖核苷酸的之间连接方式。
磷酸二酯键是一种化学基团，指一分子磷酸与两个醇(羟基)酯化形成的两个酯键。磷酸二酯键成了两个醇之间的桥梁。即前一个核苷酸的羰基中的3'碳上—OH(羟基)和后一个核苷酸的5'—磷酸基形成酯键，此处的磷酸基同时与前后两个羟基形成酯键，故称磷酸二酯键。依次连下去，形成多核苷酸链，即核酸大分子链。
下述SEQ ID No.A-SEQ ID No.B均表示SEQ ID No.A以磷酸二酯键连接SEQ IDNo.B形成的DNA片段。
PCR扩增体系：2×Premix TaqTM 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH2O至总体积25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
引物设计如下(上海派森诺基因科技有限公司合成)：
P1:
5'-GCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTGCTCACATCTCACTT-3'，
P2:5'-CAACATTACGCAAAGGCATATATTCCACCAGCTATTTGT-3'，
P3:5'-ACAAATAGCTGGTGGAATATATGCCTTTGCGTAATGTTG-3'，
P4:
5'-ATCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCCAAAACCTAACCCACGTTCTTGCT-3'。二、具有碳酸酐酶活性的突变型cynT表达载体及其工程菌株的构建
为了获得具有更高酶活性的碳酸酐酶，利用随机诱变试剂盒(GeneMorph IIRandom Mutagenesis Kit)(货号200550，购自Agilent Technologies)对cynT基因进行随机突变。以重组质粒pXMJ19-PGapA-cynT为模板，用GeneMorph II Random MutagenesisKit以引物P3/P4PCR扩增，获得了包含随机点突变的cynT基因624bp。
PCR扩增体系：10×Mutazyme II Buffer 5μL，dNTPMixture(40mM)1μL，引物(10pM)各0.5μL，Mutazyme II DNApolymerase(2.5U/μL)0.5μL，模板0.5μL，补ddH2O至总体积50μL.
PCR扩增程序：95℃预变性5min，(95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸60s；30个循环)，72℃过度延伸5min。
以QlAquick胶回收试剂盒(货号28706，购自QIAGEN GmbH)回收上述DNA片段，与步骤一中扩增的GapA启动子和经EcoR I/Kpn I酶切回收的表达载体pXMJ19用NEBuilderHiFi DNA组装克隆试剂盒50℃连接30min，连接产物转化CGMCC No.25404，涂布到含有氯霉素(34mg/L)的2-YT琼脂平板上37℃培养。
对培养长出的单克隆用Premix TaqTM DNA聚合酶以引物M13R(-48)(5'AGCGGATAACAATTTCACAC AGGA 3')/T1TER(5'CGTTCACCGACAAACAACAG3')PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1305bp片段的即为含pXMJ19-PGapA-cynTM重组载体的阳性转化子，将其命名为YPThr-cynTM。获得了54株突变植株，命名为YPThr-cynTM1-YPThr-cynTM54，简称M1-M54(如图1所示)。
PCR扩增体系：2×Premix TaqTM 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH2O至总体积25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
三、cynT菌株的96孔板发酵实验
为了鉴定步骤一和步骤二中构建的野生型和突变型cynT工程菌株的L-苏氨酸生产性能，将YPThr-cynTP和YPThr-cynTM在氯霉素(34mg/L)的2-YT琼脂平板上连续传代三次后，接种到装有200μL L-苏氨酸发酵培养基的96孔板中，置于ZQZY-88BH型号(上海知楚仪器有限公司)的摇床上发酵24h。发酵条件为湿度85％，温度37℃、转速800rpm。
发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖20g/L，(NH4)2SO42g/L，NaNO30.5g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，MnSO4·H2O 0.05g/L，ZnSO40.025g/L，VH 20mg/L，VB11.5mg/L，VB31.5mg/LVB121.5g/L，氢氧化钠调节pH7.0。
发酵培养结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-苏氨酸的浓度。CK0为产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404，CK1为CGMCC No.25404转入空载体pXMJ19的菌株，CK2为YPThr-cynTP，M1-M54为YPThr-cynTM的54株突变株。
如图1所示，导入外源cynT的CK2比只导入空载体pXMJ19的CK1和出发菌株CGMCCNo.25404的L-苏氨酸产量都高，说明外源导入cynT后有助于L-苏氨酸产量的提高。M2、M7、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M30、M31、M35和M36的L-苏氨酸产量均比CK0和CK1高；其中M2、M7、M16、M17和M18 L-苏氨酸生产能力比CK2高，说明对cynT进行突变后更有助于L-苏氨酸产量的提高，其中M2和M7更具优越性。
四、YPW3110-cynTP、YPThr-cynTP和YPThr-cynTM菌株的发酵实验
将上述产酸优势菌株M2、M7、M16、M17和M18分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-苏氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。发酵结束后以高效液相色谱法(HPLC)检测L-苏氨酸含量，结果取三次重复的平均值，如表1所示。
L-苏氨酸发酵培养基：溶剂是水，溶质及其浓度为葡萄糖13g/L，(NH4)2SO41g/L，H3PO40.5g/L，KCl 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.8g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MnSO4·H2O 0.01g/L，ZnSO40.05g/L，FM902酵母粉1.5g/L，玉米浆5g/L，糖蜜17g/L，通氨调节pH7.0.
L-苏氨酸发酵培养条件：
校正DO 100％：温度37℃、风量5L/min、转速800rpm、罐压0Mpa，5min后标定；
接种量10％；
初始条件：pH7.0、培养温度37℃、罐压0Mpa、风量0.5L/min、转速400rpm；
全程控制：1、溶氧＜30％时，依次提转速500rpm→600rpm→风量
1L/min→700rpm→800rpm；2、发酵8h提罐压0.01Mpa；12h提罐压
0.02Mpa→0.03Mpa→0.04Mpa→0.05Mpa；
残糖控制：F12h前0.1-0.5％；F12h后结合DO要求控制残糖0.1-0.3％；
流加物料：25％氨水、55％浓糖、10％泡敌；
发酵周期：30h左右,控制过程以溶氧20-30％做提降风量标准。
表1YPThr-cynTP和YPThr-cynTM菌株的发酵实验结果
Figure BDA0004029225770000111
由表1可以看出，无论是模式菌株W3110还是产酸酸的菌株CGMCC No.25404导入外源cynT后，L-苏氨酸产量都有所提升；对cynT进行突变后，由96孔发酵初筛的突变株2和突变株7其L-苏氨酸产量相比出发菌株CGMCC No.25404具有极显著差异。
实施例2突变型cynT的测序
对上述优势菌株YPThr-cynTM2和YPThr-cynTM7中的突变型cynT进行测序，测序结果显示，YPThr-cynTM2中cynT的第222位胸腺嘧啶(T)突变为鸟嘌呤(G)，导致其第74位密码子TTT突变为TTG，其编码的第74位苯丙氨酸(F)突变为亮氨酸(L)，突变后的核苷酸序列cynTF74L为SEQ ID No.5，SEQ ID No.5所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ IDNo.6突变型碳酸酐酶(所述突变碳酸酐酶名称为cynTF74L)，所述突变碳酸酐酶cynTF74L氨基酸序列(SEQID No.6)中的第74位亮氨酸(L)由苯丙氨酸(F)突变而来。
YPThr-cynTM7中第37位鸟嘌呤(G)突变为胞嘧啶(C)，导致其第13位密码子GTA突变为CTA，其编码的第13位缬氨酸(V)突变为亮氨酸(L)；其第137位腺嘌呤(A)突变为鸟嘌呤(G)，导致其第46位密码子CAA突变为CGA，但其编码的第46位谷氨酰胺(Q)突变为精氨酸(R)。突变后的核苷酸序列cynTV13LQ46R为SEQ ID No.7，SEQ ID No.7所示的DNA分子编码氨基酸序列为SEQ ID No.8突变型碳酸酐酶(所述突变型碳酸酐酶名称为cynTV13LQ46R)，所述突变型碳酸酐酶cynTV13LQ46R氨基酸序列(SEQ ID No.8)中的第13位亮氨酸(L)由缬氨酸(V)突变而来、第46位精氨酸(R)由谷氨酰胺(Q)突变而来。
实施例3构建包含表达碳酸酐酶活性的cynT工程菌株
依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在模式菌株W3110和产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404yaiT位编码区内分别引入谷氨酸棒杆菌cynT基因或cynTF74L基因。
一、sgRNA的构建
依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，使用CRISPRRGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)设计sgRNA靶序列，选择好合适的sgRNA靶序列后，在靶序列的5'和3'最末端添加线性化pGRB克隆载体(货号71539，购自addgene公司)末端序列，以便通过重组形成完整的sgRNA质粒。
扩增sgRNA片段，无需模板，只需进行PCR退火过程即可，体系及程序如下。PCR反应体系：yaiTF 10μL，yaiTR 10μL；PCR反应程序：95℃变性5min，50℃退火1min。退火完成后，采用QlAquick胶回收试剂盒(货号28706，购自QIAGEN GmbH)回收目的片段(又称sgRNA)。
提取pGRB质粒并用Spe I酶切及去磷酸化处理，以防止pGRB质粒自连。酶切体系：10xBuffer 5μL，SpeⅠ2.5μL，pGRB质粒DNA 3000-5000ng，补ddH2O至50μL。37℃酶切3h后琼脂糖凝胶电泳切胶回收后去磷酸化反应，去磷酸化体系：10xBuffer 5μL，pGRB质粒DNA1000-2000ng，CIAP 2.5μL，补ddH2O至50μL。37℃处理1h后采用DNA纯化试剂盒回收去磷酸化线性pGRB质粒。再利用NEBuilder HiFi DNA组装克隆试剂盒(货号E2621S，购自NewEngland Biolabs)进行sgRNA(上述的回收目的片段)和pGRB质粒(上述去磷酸化线性pGRB质粒)的重组。重组体系：NEBuilder HiFi DNA重组酶2.5μL，上述去磷酸化线性pGRB质粒2μL，sgRNA(上述的回收目的片段)0.5μL。50℃组装30min后将产物转化DH5α感受态细胞。以引物sgRNAF/sgRNAR PCR获得639bp(SEQ ID No.9)的为阳性转化子，并进一步提取质粒测序，将构建好的质粒命名为pGRB-yaiT。
本实验所用引物设计如下(上海派森诺基因科技有限公司合成)，带下划线的碱基为pGRB克隆载体同源臂序列，小写字体的碱基为yaiT sgRNA序列：
yaiTF:5'-TGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATACTAGTggcaactatg taaactatagGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG-3'
yaiTR:5'-CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACctatagttta catagttgccACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCA-3'’
sgRNAF：5'-GTCTCATGAGCGGATACATATTTG-3'
sgRNAR：5'-ATGAGAAAGCGCCACGCT-3'
二、PCR扩增W3110和CGMCC No.25404基因组过表达的cynT或cynTF74LDNA序列
依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，设计并合成三对扩增上下游同源臂序列及cynT基因和cynTF74L基因编码区及GapA启动子区的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式在模式菌株W3110和产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404yaiT编码区内分别引入cynT基因或cynTF74L基因。
引物设计如下(上海派森诺基因科技有限公司合成)：
P5:5'-AAGAGAATGG AAGAGAGGCC-3'，
P6:5'-AAGTGAGATG TGAGCAA AGTGCATTTGTC ATCCCTCC-3'，
P7:5'-GGAGGGATGA CAAATGCACT TTGCTCACATCTCACTT-3'，
P8:5'-CGGTAGTGTA GGTTTCGTTG CTAACCCACGTTCTTGCT-3'，
P9:5'-AGCAAGAACGTGGGTTAG CAACGAAACC TACACTACCG-3'，
P10:5'-CGACCTGTAG TATCCCATTC-3'。
以W3110基因组DNA为模板，使用KAPAHiFi HotStart DNA聚合酶(货号KK2501，购自Kapa Biosystems)以引物P5/P6和P9/P10 PCR扩增，获得上同源臂458bp(SEQ IDNo.101-458位)和下同源臂片段603bp(SEQ ID No.101389-1991位)；分别以pXMJ19-PGapA-cynT和pXMJ19-PGapA-cynTM2质粒DNA为模板，使用KAPAHiFi HotStartDNA聚合酶以引物P7/P8分别PCR扩增PGapA-cynT 1005bp(SEQ ID No.10422-1426位)和PGapA-cynTF74L1005bp(SEQ ID No.11422-1426位)。PCR反应结束后，采用QlAquick胶回收试剂盒(货号28706，购自QIAGEN GmbH)分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA使用KAPAHiFi HotStart DNA聚合酶以引物P5和P10 overlap PCR分别获得基因组过表达的DNA重组片段Up-cynT-Down(SEQ ID No.10)和Up-cynTF74L-Down(SEQ ID No.11)1991bp。
PCR扩增体系：5×HiFi with Mg2+Buffer 10μL，dNTP Mixture(10mM)1.5μL，引物(10pM)各1.6μL，KAPAHiFi HotStart(1U/μL)0.5μL，补ddH2O至总体积50μL。
PCR扩增程序：95℃预变性5min，(98℃变性20s；56℃退火15s；72℃延伸90s；30个循环)，72℃过度延伸5min。
三、感受态的制备及转化
制备模式菌株W3110和产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404感受态细胞，转化pREDCas9质粒(货号71541，购自addgene公司)，以鉴定引物pCF/pCR PCR获得943bp(SEQ IDNo.12)的为阳性转化子，获得模式菌株W3110-Cas9和CGMCC No.25404-Cas9菌株，pREDCas9携带sgRNA质粒消除***，λRed重组***及Cas9蛋白表达***，结合yaiT sgRNA完成CGMCCNo.25404基因组上cynT及cynTF74L的CRISPR同源重组。
制备模式菌株W3110-Cas9和CGMCC No.25404-Cas9感受态细胞，当菌体长至OD600＝0.1加入终浓度0.1mM的IPTG以诱导λ-Red介导的同源重组。当OD600＝0.6时，收集菌体制备感受态细胞，并分别转化pGRB-yaiT质粒和基因组过表达DNA片段Up-cynT-Down或Up-cynTF74L-Down，涂布到含有壮观霉素(100mg/L)和氨苄霉素(100mg/L)的2-YT琼脂平板上32℃培养。对培养产生的单菌落通过Premix TaqTM DNA聚合酶(货号RR901A，购自TaKaRa)以引物P11/P12 PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1457bp(不含点突变的序列如SEQ ID No.13所示，含点突变序列第1116位为G，其余如SEQ ID No.13)的片段为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
将阳性转化子接种于含壮观霉素(100mg/L)和终浓度至0.2％的***糖的2-YT培养基中以消除质粒pGRB-yaiT，挑选在壮观霉素(100mg/L)上生长而在氨苄霉素(100mg/L)上不生长的菌落，再将这些菌落转接到2-YT培养基上42℃培养以消除pREDCas9质粒，挑选在壮观霉素(100mg/L)上不生长而在无抗的2-YT上生长的菌落，通过Premix TaqTMDNA聚合酶以引物P13/P14 PCR鉴定，PCR扩增出含有大小1512bp(不含点突变的序列如SEQIDNo.14所示，含点突变序列第334位为G，其余如SEQ ID No.14)的为阳性转化子，扩增不到片段的为原菌。
将模式菌株W3110基因组过表达的野生型cynT基因和突变型cynTF74L基因的菌株分别命名为YPW3110-cynT(不含突变点)和YPW3110-cynTF74L(含突变点)。
将Escherichia coli CGMCC 25404基因组过表达的野生型cynT基因和突变型cynTF74L基因的菌株分别命名为YPThr-cynT(不含突变点)和YPThr-cynTF74L(含突变点)。
重组菌YPThr-cynT含有来自谷氨酸棒杆菌的SEQ ID No.1所示的cynT基因；具体地，重组菌YPW3110-cynT是将模式菌株W3110和基因组上yaiT部分编码区替换为谷氨酸棒杆菌cynT基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.1)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有谷氨酸棒杆菌cynT基因的重组菌可以稳定地表达β型碳酸酐酶。
具体地，重组菌YPThr-cynT是将Escherichia coli CGMCC 25404基因组上yaiT部分编码区替换为谷氨酸棒杆菌cynT基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.1)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有谷氨酸棒杆菌cynT基因的重组菌可以稳定地表达β型碳酸酐酶。
重组菌YPW3110-cynTF74L和YPThr-cynTF74L含有来自谷氨酸棒杆菌的SEQ ID No.5所示的突变型cynTF74L基因；具体地，重组菌YPW3110-cynTF74L是将模式菌株W3110基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74L基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.5)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有谷氨酸棒杆菌cynTF74L基因的重组菌可以稳定地表达β型碳酸酐酶。
重组菌YPThr-cynTF74L含有来自谷氨酸棒杆菌的SEQ ID No.5所示的突变型cynTF74L基因；具体地，重组菌YPThr-cynTF74L是将产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74L基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.5)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。含有谷氨酸棒杆菌cynTF74L基因的重组菌可以稳定地表达β型碳酸酐酶。
引物设计如下(上海派森诺基因科技有限公司合成)：
pCF:5'-GCAGTGGCGG TTTTCATG-3'，
pCR:5'-CCTTGGTGATCTCGCCTTTC-3'，
P11:5'-GGGCGTTGGA TTAAGTCTGT-3'，
P12:5'-CCAATGATTC CCAACTCACC-3'，
P13:5'-GGCACAGGAT TGATTTGTCG-3'，
P14:5'-CCCACCCAGT AGATTCGGTC-3'。
PCR扩增体系：2×Premix TaqTM 12.5μL，引物(10pM)各1μL，补ddH2O总体积25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸90s(30个循环)，72℃过度延伸10min。
实施例4构建包含表达碳酸酐酶活性的cynTF74*工程菌株
为了获得更多cynT第74位氨基酸的突变株以提高其L-苏氨酸的生产能力，构建cynT第74位氨基酸用5种不同氨基酸取代的突变株。依据NCBI公布的大肠杆菌(Escherichia coli)W3110基因组序列，设计并合成四对扩增上下游同源臂序列及cynTF74*基因编码区及启动子区的引物，以CRISPR/Cas9基因编辑的方式在模式菌株W3110和产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404yaiT编码区内分别引入cynT第74位氨基酸用不同氨基酸取代的5种突变体，突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称如表2。
表2cynTF74*突变体取代的氨基酸及在各自突变体中使用的引物名称
Figure BDA0004029225770000161
引物设计如下(上海派森诺基因科技有限公司合成)：
P6Y:5'-GATTTCTCCGGCAGTACGGACAACATAGAGGTCACCGAGA-3'，
P7Y:5'-TCTCGGTGACCTCTATGTTGTCCGTACTGCCGGAGAAATC-3'，
P6C:5'-GATTTCTCCGGCAGTACGGACAACACAGAGGTCACCGAGA-3'，
P7C:5'-TCTCGGTGACCTCTGTGTTGTCCGTACTGCCGGAGAAATC-3'，
P6P:5'-GATTTCTCCGGCAGTACGGACAACAGGGAGGTCACCGAGA-3'，
P7P:5'-TCTCGGTGACCTCCCTGTTGTCCGTACTGCCGGAGAAATC-3'，
P6W:5'-GATTTCTCCGGCAGTACGGACAACCCAGAGGTCACCGAGA-3'，
P7W:5'-TCTCGGTGACCTCTGGGTTGTCCGTACTGCCGGAGAAATC-3'，
P6H:5'-GATTTCTCCGGCAGTACGGACAACATGGAGGTCACCGAGA-3'，
P7H:5'-TCTCGGTGACCTCCATGTTGTCCGTACTGCCGGAGAAATC-3'，
以W3110基因组DNA为模板，使用KAPAHiFi HotStart DNA聚合酶以引物P5/P6和P9/P10 PCR扩增，获得上同源臂458bp(SEQ ID No.111-458位)和下同源臂片段603bp(SEQID No.111389-1991位)；分别以本实验室构建的pXMJ19-PGapA-cynT质粒DNA为模板，使用KAPAHiFi HotStart DNA聚合酶以引物P7/P6Y、P7/P6C、P7/P6P、P7/P6W和P7/P6H PCR扩增PGapA及5’端246bp的cynTF74*607bp(SEQ ID No.11422-1028位)，以引物P7Y/P8、P7C/P8、P7P/P8、P7W/P8和P7H/P8 PCR扩增cynTF74*438bp(SEQ ID No.11989-1426位)，但SEQ IDNo.11中的第1002-1004位分别突变为表2中的密码子。
PCR反应结束后，采用QlAquick胶回收试剂盒分别进行琼脂糖凝胶电泳回收。回收后的DNA使用KAPAHiFi HotStart DNA聚合酶以引物P5和P10 overlap PCR分别获得基因组过表达的DNA重组片段Up-cynTF74*-Down 1991bp。
以实施例3中的方法将上述5种突变型cynTF74*转化入模式菌株W3110和产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404中，将构建的含突变型cynT的菌株分别命名为YPW3110-cynTF74Y、YPW3110-cynTF74C、YPW3110-cynTF74P、YPW3110-cynTF74W和YPW3110-cynTF74H以及YPThr-cynTF74Y、YPThr-cynTF74C、YPThr-cynTF74P、YPThr-cynTF74W和YPThr-cynTF74H。
重组菌YPW3110-cynTF74Y和YPThr-cynTF74Y含有来自谷氨酸棒杆菌的SEQ ID No.15所示的突变型cynTF74Y基因；具体地，重组菌YPW3110-cynTF74Y和是将模式菌株W3110基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74Y基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.15)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
具体地，重组菌YPThr-cynTF74Y是将产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74Y基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.15)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
重组菌YPW3110-cynTF74C和YPThr-cynTF74C含有来自谷氨酸棒杆菌的SEQ ID No.17所示的突变型cynTF74C基因；具体地，重组菌YPW3110-cynTF74C是将模式菌株W3110基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74C基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.17)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
具体地，重组菌YPThr-cynTF74C是将产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74C基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.17)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
重组菌YPW3110-cynTF74P和YPThr-cynTF74P含有来自谷氨酸棒杆菌的SEQ ID No.19所示的突变型cynTF74P基因；具体地，重组菌YPW3110-cynTF74P是将模式菌株W3110基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74P基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.19)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
具体地，重组菌YPThr-cynTF74P是将产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74P基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.19)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
重组菌YPW3110-cynTF74W和YPThr-cynTF74W含有来自谷氨酸棒杆菌的SEQ ID No.21所示的突变型cynTF74W基因；具体地，重组菌YPW3110-cynTF74W是将模式菌株W3110基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74W基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.21)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
具体地，重组菌YPThr-cynTF74W是将产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74W基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.21)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
重组菌YPW3110-cynTF74H和YPThr-cynTF74H含有来自谷氨酸棒杆菌的SEQ ID No.23所示的突变型cynTF74H基因；具体地，YPW3110-cynTF74H是将模式菌株W3110基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74H基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.23))，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
具体地，重组菌YPThr-cynTF74H是将产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404基因组上yaiT部分编码区替换为cynTF74H基因及GapA启动子(SEQ ID No.3-SEQ ID No.23)，保持其基因组中的其它核苷酸不变得到的重组菌。
实施例5L-苏氨酸发酵实验
将模式菌株W3110、YPW3110-cynTF74Y、YPW3110-cynTF74C、YPW3110-cynTF74P、YPW3110-cynTF74W和YPW3110-cynTF74H以及CGMCC No.25404、YPThr-cynT、YPThr-cynTF74L、YPThr-cynTF74Y、YPThr-cynTF74C、YPThr-cynTF74P、YPThr-cynTF74W和YPThr-cynTF74H菌株分别接种在BLBIO-5GC-4-H型号的5L发酵罐(上海百仑生物科技有限公司)中以L-苏氨酸发酵培养基和培养条件进行发酵实验，每个菌株重复三次。
L-苏氨酸发酵培养基和培养条件见实施例1的第四部分。
表3基因组过表达的cynT菌株的发酵实验结果
Figure BDA0004029225770000181
Figure BDA0004029225770000191
以上发酵结果所示，来自谷氨酸棒杆菌的cynT及其突变体cynTF74*均能提高L-苏氨酸的产量，比出发菌株W3110和产苏氨酸的菌株CGMCC No.25404具有显著性差异和极显著差异；其中YPThr-cynTF74L产量更高。因此，cynT编码的碳酸酐酶其氨基酸序列第74位苯丙氨酸被亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、色氨酸和组氨酸等氨基酸取代后，均有助于L-苏氨酸产量的提高，而取代为亮氨酸的突变株更具有优势，具有极显著差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (11)

1.蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为下述任一种：
A1)蛋白质，所述蛋白为所述cynT蛋白或将所述cynT蛋白的氨基酸序列的第74位苯丙氨酸残基替换为下述任一种氨基酸残基得到的cynT突变蛋白：
半胱氨酸残基、精氨酸酸残基、亮氨酸残基、异亮氨酸、甲硫氨酸残基、缬氨酸残基、丝氨酸残基、脯氨酸残基、苏氨酸残基、丙氨酸残基、酪氨酸残基、组氨酸残基、谷氨酰胺残基、天冬酰胺残基、赖氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、色氨酸残基、丝氨酸残基或甘氨酸残基；所述cynT蛋白是氨基酸序列为序列2的蛋白质；
A2)将A1)的蛋白质经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有提高微生物的氨基酸产量的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.如权利要求1所示的蛋白质，其特征在于，所述蛋白为cynT蛋白或将所述cynT蛋白的氨基酸序列的第74位苯丙氨酸残基替换为下述任一种；
所述氨基酸残基为亮氨酸残基、酪氨酸残基、半胱氨酸残基、脯氨酸残基、色氨酸残基或组氨酸残基；所述cynT蛋白是氨基酸序列为序列2的蛋白质。
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
B1)、编码权利要求1或2所述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
4.如权利要求3所述的生物材料，其特征在于，B1)所述的核酸分子为下述任一种：
Z1)编码序列是SEQ ID No1所示的DNA分子；
Z2)编码序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；
Z3)编码序列是SEQ ID No.15所示的DNA分子；
Z4)编码序列是SEQ ID No.17所示的DNA分子；
Z5)编码序列是SEQ ID No.19所示的DNA分子；
Z6)编码序列是SEQ ID No.21所示的DNA分子；
Z7)编码序列是SEQ ID No.23所示的DNA分子；
Z8)核苷酸序列是SEQ ID No1所示的DNA分子；
Z9)核苷酸序列是SEQ ID No.5所示的DNA分子；
Z10)核苷酸序列是SEQ ID No.15所示的DNA分子；
Z11)核苷酸序列是SEQ ID No.17所示的DNA分子；
Z12)核苷酸序列是SEQ ID No.19所示的DNA分子；
Z13)核苷酸序列是SEQ ID No.21所示的DNA分子；
Z14)核苷酸序列是SEQ ID No.23所示的DNA分子。
5.下述任一种材料在调控微生物氨基酸产量、或制备调控微生物氨基酸产量、或微生物育种中的用途：
C1)蛋白质，所述蛋白质为权利要求1或2所述的蛋白质：
C2)调控所述蛋白质的编码基因表达的物质；
C3)调控所述蛋白质的活性或含量的物质。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述调控所述蛋白质的编码基因表达的物质为下述任一种：
D1)、编码C1)所述蛋白质的核酸分子；
D2)、含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)、含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)、含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物。
7.一种上调或增强或提高微生物氨基酸产量的方法，其特征在于，所述方法包括上调或增强或提高目的微生物中权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量，来上调或增强或提高微生物氨基酸产量。
8.一种构建重组微生物的方法，所述方法包括上调或增强或提高目的微生物中权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量，得到氨基酸产量变化的重组微生物，所述重组微生物的氨基酸产量高于所述目的微生物。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述上调或增强或提高目的微生物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达通过下述任一种方法实现：
E1)向所述目的微生物中导入权利要求1或2所述的蛋白质的编码基因；
E2)向所述目的微生物中导入序列2、序列6、序列16、序列18、序列20、序列22或序列24所述蛋白质编码基因的至少一种。
10.一种制备氨基酸的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1或2所述的蛋白质或权利要求3或4所述的生物材料或权利要求3或4所述的重组微生物生产氨基酸。
11.如权利要求1或2所述的蛋白质、3或4所述的生物材料、权利要求5或6所述的用途、权利要求6-10任一所述的方法，其特征在于，所述微生物为如下任一种：
C1)细菌界；
C2)肠杆菌科；
C3)埃希氏菌属；
C4)大肠杆菌。
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