CN116254260B - 一种栗疫霉黑水病菌的特异性检测靶标g7300及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)的特异性检测新靶标g7300，该检测靶标g7300的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，CDS序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。同时，还公开了特异性检测靶标g7300的引物组合，其正向引物序列如SEQ IDNO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。本发明是基于全基因组筛选发掘的新靶标和基于该靶标建立的检测方法，用于常规PCR，其特异性强，灵敏度高，证明g7300适合栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的检测靶标。对于港口的进境植物上携带的P.cambivora实现即检即防，对保护我国生态安全具有重要作用。
Description
技术领域
本发明属于栗疫霉黑水病菌检测技术领域，具体涉及一种栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300及应用。
背景技术
栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)是疫霉属，寄主植物广泛，主要危害苹果、栗树、松树、李子、杏等经济类植物。栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)在形态上与樟疫霉(P.cinnamomi),其在PDA培养基上25℃培养4d菌落直径为25-46mm，7d菌落直径65-70mm。气生菌丝羊绒状，白色至浅灰色，大多数菌株不产生色素而呈奶油色，少数菌株菌落背面可产生紫色色素。产生大量假头生的小型分生孢子，椭圆形、卵形或肾形，比较宽，0-1分隔，8-15μm×2.5-4.5μm。大型孢子最宽处在中线上部，两端较钝，顶细胞稍弯，基细胞足跟明显或钝圆形，整个孢形态较短较胖，称为马特型。2-6分隔，多为3隔，25-55μm×4-6μm。在气生菌丝上长出的产孢细胞为长筒形的单瓶梗。易产生蓝绿色粘孢团型分生孢子座。易产生球形，单生、对生或串生，直径5-10μm的厚垣孢子。藏卵器大多具疣状突起。栗疫霉黑水病菌主要为害寄主植物的根部及茎基部，引发根腐、颈腐、茎溃疡和坏死等症状，茎一周会出现变黑腐烂或者有明显的棕色圆形病斑，散发酒糟味，潮湿条件下并不表面可长出白色菌丝。传播速度快，具有流行性和毁灭性，可导致植物大量减产，甚至绝产、死亡。如果该疫霉传入我国，必将对我国国内及出口经济贸易造成巨大障碍。因此建立栗疫霉黑水病菌的快速检测方法很重要。
刘跃庭等建立了丁香疫霉(P.syringae)和栗疫霉黑水病菌(P.cambi vora)的三重PCR检测方法，朱林慧等建立了冬生疫霉、丁香疫霉和栗疫霉黑水病菌的特异四重PCR检测方法，但在灵敏度方面较单重PCR低。
因此，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确的单重PCR检测技术体系对提升对栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。
发明内容
针对现有技术中栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低、特异性检测靶标较少的问题，本发明提供一种新的栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的检测新靶标g7300及基于该测靶标PCR检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的PCR检测试剂盒。
第一方面，本发明提供了一种栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示：ATGGATGGCCTGCAAATGTCGGACTTCGCAACGTGCGATCCTCCCGAGCCAATGGTACCTGCTTGCAAAATACCCAAGAAAGTGGTCGCGGCGATGATGTCTGCTGGTGCCAAGATGGGGCAATCGGACGGGGAGAATTTGTGCGTTCTGCGCGTTGGTGGCGTGGATACGGAAGCGTGGAATTTGTATGAAGACTGGGCTTGCTCTCTTGGAGAGGTTGACCCTATGGTAGTGGCTCACTTCGCTCCACCGCTTCAATTACGACGCACGCTTCTGTGCCCTCCGAATGCGTTGGTTGCTGACATTCTGGATGAAGCCAACAGTATCATCAACCTATTCGCGCTTCTTGTCATGGACGACTTGGCTGCAGGGATTCCAGCACTTCTCGCGAATTTTGCACCCCTTCCGGCTCCAGTGGCTCCGATCAACATCCACCACGCGAAAGCTGCCGTCACCGCCGTGCAGCGTGCGATTCGCAACCCAGGTCCAAACTTTCCGGTGATCAACGGGTTGCTCAGAGGACTCTACATTTGTCAAGTGGAATTCACTTGGAACGGTGTCGTGGTCGTTGTGCCGATCTACCGAATGTGA。
第二方面，本发明还提供了一种栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300，所述检测标靶的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示：MDGLQMSDFATCDPPEPMVPACKIPKKVVAAMMSAGAKMGQSDGENLCVLRVGGVDTEAWNLYEDWACSLGEVDPMVVAHFAPPLQLRRTLLCPPNALVADILDEANSIINLFALLVMDDLAAGIPALLANFAPLPAPVAPINIHHAKAAVTAVQRAIRNPGPNFPVINGLLRGLYICQVEFTWNGVVVVVPIYRM。
第三方面，本发明还提供了一种检测栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300的引物组合，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列如SEQ IDNO：3所示：GCTCCACCGCTTCAATTACG，所述反向引物序列如SEQ ID NO：4所示：GACCTGGGTTGCGAATCGCA。
第四方面，本发明还提供了一种检测栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300的试剂盒，至少包括1次用量的含有本发明提供的所述引物组合的检测溶液。
第五方面，本发明还提供了所述试剂盒还包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg2+，100μL 1％BSA，50单位Taq酶。
第六方面，本发明还提供了所述的栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300、所述的引物组合以及所述的试剂盒在检测栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)中的应用。
第七方面，本发明还提供了一种检测栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的方法，包括以下步骤：取1μL检测对象的DNA溶液，加入23μL权利要求7中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒钟；64℃退火30秒；72℃延伸45秒钟；33个循环，最后72℃延伸10分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)本发明提供了一个新的且高信赖度特异性分子检测靶标g7300，为栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的检测提供了一个新的检测途径。
2)基于该新靶标建立灵敏、准确、高通量的PCR检测技术体系，克服了现有技术中栗疫霉黑水病菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题，对提升栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。
3)采用本发明提供的检测引物组合针对栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)菌株和其他疫霉菌、真菌以及松材线虫、病原卵菌等进行检测，结果显示仅有栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的检测结果为阳性，能够扩增出特异性条带，条带大小为244bp；同时，经过特异性实验证明，通过常规PCR法，通过设计一对引物(正向引物和反向引物)进行扩增的技术，最终检测栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)基因组DNA的灵敏度为100pgμL-1。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1基于栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300的不同种之间特异性检测结果图。
图2基于栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300的不同属之间特异性检测结果图。
图3基于栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300的灵敏度检测结果图。
图4基于栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性检测靶标g7300的实际样品检测结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本研究通过Blast序列搜索，序列提取、比对与分析，挖掘大规模的基因组数据库，从而发掘疫霉菌的检测靶标。通过全基因组比对，共计获得P.cambivora特异性检测靶标1000个以上；随机从P.cambivora1000多个特异性基因中挑选出部分基因作为候选基因，设计了并筛选特异性引物，表1列出其中4个靶标基因(表1)。采用PCR技术对设计的特异性引物进行验证。特异性评价选择与栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)不同种(樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)；隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)；烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)；柑橘褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)；冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；荔枝疫霉(Phytophthora litchii)；寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)；大豆疫霉(Phytophthora sojae)；大雄疫霉(Phytophthoramegasperma)；松果疫霉(Phytophthora pini)；丁香疫霉(Phytophthora syringae)；橡树疫霉(Phytophthora ramorum)；辣椒疫霉(Phytophthora capsici)等)和不同属的菌(湖滨疫腐霉(Phytopythium litorale)；旋柄疫腐霉(Phytopythium helicoides)；暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)；松材线虫(Bursaphelenchus xylophillus)；葡萄座腔菌(Boryosphaeria dothidea)；藤仓镰孢菌(Fusarium fujikuroi)；亚洲镰刀菌(Fusariumasiaticum)；腐皮镰孢菌(Fusarium solani)；禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)；尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)；轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)；层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)；(Fusarium circinatum)；燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)；锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)；(刺腐霉(Phytopythium spinosum)；终极腐霉(Phytopythium ultimum)；瓜果腐霉(Phytopythium aphanidermatum)等的DNA作为模板，进行PCR特异性和灵敏度验证，最终获得1个栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的检测新靶标基因g7300。
表1栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)4个特异性基因序列表
新靶标基因g7300其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示，CDS序列如SEQ ID NO：1所示，并基于该新靶标建立灵敏、准确的PCR检测技术体系。
该检测技术体系所使用的PCR检测引物组合物包括正向引物和反向引物，引物序列具体如下：
g7300PCR-F1：GCTCCACCGCTTCAATTACG(SEQ ID NO：3)
g7300PCR-R1：GACCTGGGTTGCGAATCGCA(SEQ ID NO：4)
通过设计的引物(正向引物和反向引物)进行扩增的技术，进行扩增DNA，提取待检微生物的DNA，取1μL DNA溶液，加入23μL试剂盒中的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒钟；64℃退火30秒；72℃延伸45秒钟；33个循环，最后72℃延伸10分钟。其中，所述1mL所述的检测溶液包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg2+，100μL 1％BSA，50单位Taq酶(TaKaRa)、特异引物g7300 PCR-F1和g7300PCR-R120μM引物，加入超纯水制备成1mL检测溶液。
反应结束后取7μL扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像***上检测并拍照。每个实验至少重复3次。
实施例2
为了验证栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的特异性引物序列，本实施例以1株栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)菌株和病原卵菌以及其它真菌为供试材料(表2)，采用CTAB法提取发病组织中栗疫霉黑水病菌(P.ca mbivora)的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μL 2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH8.0)溶解沉淀(含20μg/mL RNas e)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。
表2用于栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)PCR检测的卵菌和真菌菌株
按照实施例1中PCR检测结果如图1、图2所示，栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)菌株均可特异地扩增出一条244bp的条带，其余病原卵菌以及真菌琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。选择与栗疫霉黑水病菌(Phytopht hora cambivora)不同种(樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)；隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)；烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)；柑橘褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)；冬生疫霉(Phytophthora hibernali s)；荔枝疫霉(Phytophthora litchii)；寄生疫霉(Phytophthora parasitica)；大豆疫霉(Phytophthora sojae)；大雄疫霉(Phytophthoramegasperma)；松果疫霉(Phytophthora pini)；丁香疫霉(Phytophthora syringae)；橡树疫霉(Phytophthora ramorum)；辣椒疫霉(Phytophthora capsici)等)和不同属的菌(湖滨疫腐霉(Phytopythium litorale)；旋柄疫腐霉(Phyto pythium helicoides)；暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)；松材线虫(Bursaphelenchus xylophillus)；葡萄座腔菌(Boryosphaeria dothidea)；藤仓镰孢菌(Fusarium fujikuroi)；亚洲镰刀菌(Fusariumasiaticum)；腐皮镰孢菌(Fusarium solani)；禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)；尖镰孢菌(Fusarium oxysporum)；轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)；层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)；(Fusarium circinatum)；燕麦镰孢菌(Fusarium avenaceum)；锐顶镰孢菌(Fusarium acuminatum)；(刺腐霉(Phytopythium spinosum)；终极腐霉(Phytopythium ultimum)；瓜果腐霉(Phytopythium aphanidermatum)等的DNA作为模板，取1μL DN A溶液，加入23μL试剂盒检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒钟；64℃退火30秒；72℃延伸45秒钟；33个循环，最后72℃延伸10分钟。
证明所设计的特异性引物上游引物和下游引物PCR特异性引物具有种的特异性,g7300是一个特异性较强的新检测靶标。这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织或者出入境检验检疫中栗疫霉黑水病菌菌的快速可靠的检测鉴定。当用于发病组织中存在栗疫霉黑水病菌菌时，采用NaOH快速裂解法提取栗疫霉黑水病菌菌的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10μL 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5μL上清液加入495μL 0.1mM Tris(pH 8.0)，混匀后取1μL直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无PCR抑制物存在。
实施例3
用栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的菌株的不同浓度的基因组DNA作为扩增模板，进行PCR扩增反应，使用Nanodro 2000微量分光光度计测出实施例1提取DNA的浓度为100ng·μL-1。将其依次稀释为10ng·μL-1、1ng·μL-1、100pg·μL-1、10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1，通过设计的引物(正向引物和反向引物)进行扩增DNA。对不同浓度的DNA进行PCR检测。结果如图4所示，25μL的反应体系中分别含有10ng·μL-1、1ng·μL-1、100pg·μL- 1P.cambivora DNA的出现244bp特异性阳性条带，呈阳性反应，25μL的反应体系中分别含有10pg·μL-1、1pg·μL-1、100fg·μL-1P.cambivora DNA的未出现特异性条带呈阴性反应；结果表明PCR检测的灵敏度达到100pg·μL-1(图3)；
实施例4
采用NaOH碱裂解法提取接种栗疫霉黑水病菌菌的发病杜鹃组织的DNA，将其作为模板用于PCR扩增。取1uL DNA溶液，按实施例2的方法，进行PCR反应。结果如图4所示，其中图4A(1-3)为人工接种一天到三天的栗疫霉黑水病菌的杜鹃叶片，图4A(4)为人工接种琼脂块的杜鹃(Rhododendron simsii)，图4B为人工接种栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的发病杜鹃的PCR检测结果。PCR检测结果图中从左边到右边分别为Marker(500bp)、(1)为栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)、(2-4)人工接种栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的杜鹃(R.simsii)一至三天接种所提取的DNA、(5)人工接种琼脂块的杜鹃(R.simsii)提取的DNA、(6)NC(阴性对照)。结果显示，栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)菌株及人工接种栗疫霉黑水病菌(P.cambivora)的杜鹃(R.simsii)提取的DNA均可特异地扩增出一条244bp的条带，且在发病第一天可检测到，而人工接种琼脂块的杜鹃(R.simsii)提取的DNA及阴性对照没有出现扩增条带。`
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
Claims (4)
1.检测栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)特异性检测靶标g7300的引物组合在检测栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)中的应用，其特征在于，所述栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)特异性检测靶标g7300的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物组合包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。
2.检测栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)特异性检测靶标g7300的试剂盒在检测栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)中的应用，其特征在于，所述栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)特异性检测靶标g7300的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，所述试剂盒包括检测溶液，所述检测溶液包括至少1次用量的引物组合，所述引物组合包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，所述反向引物序列如SEQ IDNO：4所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测溶液还包括：4种dNTP各2000μM，100μL10×PCR反应缓冲液，80mM Mg2+，100μL 1％BSA，50单位Taq酶。
4.一种检测栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)的方法，其特征在于，所述栗疫霉黑水病菌(Phytophthora cambivora)的特异性检测靶标g7300的DNA序列如SEQ IDNO：1所示，所述方法包括以下步骤：取1μL检测对象的DNA溶液，加入23μL权利要求3中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒钟，64℃退火30秒，72℃延伸45秒钟，33个循环，最后72℃延伸10分钟；产物于凝胶中电泳得到244bp特异性阳性条带。
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