CN116242951A - 一种测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法 - Google Patents

一种测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，(1)制备供试品溶液：取供试品加入稀释液溶解，定量稀释至设定浓度后获得供试品溶液；(2)设置色谱条件：采用三键键合酰胺基键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用Hilic分离模式，以酸性水溶液为流动相A，有机溶剂为流动相B，进行等度洗脱，检测波长为205nm～220nm；(3)测定分析：取供试品溶液10μl～50μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算葡萄糖酸‑δ‑内酯及其有关物质葡萄糖酸‑γ‑内酯与葡萄糖酸的含量。本发明实现了葡萄糖酸‑δ‑内酯2个有关物质的定量检测，可高效、准确用于葡萄糖酸‑δ‑内酯有关物质的质量控制，满足研发需求。

Description

一种测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法
技术领域
本发明涉及药物分析领域，尤其涉及一种测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法。
背景技术
葡萄糖酸内酯为葡萄糖酸-δ-内酯(Glucono-δ-lactone)的简称，外观为白色晶体或结晶性粉末，极易溶于水，微溶于乙醇，不溶于***。其水溶液在室温或较低温度下缓慢水解生成葡糖糖酸，温度升高，水解加快。葡萄糖酸-δ-内酯是目前国际上公认的无毒食品添加剂，主要用作牛奶蛋白和大豆蛋白的凝固剂，禽畜肉中的保鲜剂，糕点面包的疏松剂等。此外，还广泛用作合成列净类降糖药的起始物料。
列净类降糖药是一种钠-葡萄糖共转运蛋白2(SGLT2)抑制剂，该蛋白分布在肾小管，发挥着将原尿中的葡萄糖重吸收回血液的作用。当抑制了SGLT2后，肾小管对葡萄糖的重吸收就会受到抑制，尿糖增多，从而起到降血糖的作用。其中，肾脏葡萄糖重吸收的90％是通过SGLT2蛋白完成的。值得注意的是，SGLT2抑制剂是很安全的，因为他们的降糖效果不依赖于胰岛素，并且空腹会增加肝脏内源性葡萄糖的代偿性生成。
常见列净类降糖药有达格列净(Dapaglifiozin)
Figure BDA0004085936440000011
卡格列净(Canagliflozin)/>
Figure BDA0004085936440000012
恩格列净(Empagliflozin)
Figure BDA0004085936440000013
及脯氨酸恒格列净(HenagliflozinProline Tablets)
Figure BDA0004085936440000014
等。
以达格列净合成路线为例，从起始物料至最终产品的合成路线式如下：
Figure BDA0004085936440000021
葡萄糖酸-δ-内酯为合成列净类降糖药的关键起始物料之一，CAS号为：90-80-2，分子式为：C6H10O6，分子量为：178.14，结构式为
Figure BDA0004085936440000022
通常葡萄糖酸-δ-内酯中可能含有关物质：葡萄糖酸-γ-内酯(异构化五元环杂质)、葡萄糖酸(水解杂质)以及还原糖(参考国标方法GB7657-2020单独检测)。
现有技术中常见关于葡萄糖酸-δ-内酯的分析方法主要分为3种：一种是葡萄糖酸-δ-内酯含量的分析方法，通常采用滴定的方式；一种是显色法，通常参考食品安全国家标准来检测，仅用来鉴别还原糖；还有一种是高效液相色谱法，通常是将葡萄糖酸-δ-内酯作为其他物料中的杂质来控制。但是，现有技术缺少针对上述葡萄糖酸-δ-内酯及其2个有关物质(葡萄糖酸-γ-内酯和葡萄糖酸)的检测方法，不利于研发时对葡萄糖酸-δ-内酯有关物质进行质量控制。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，实现了葡萄糖酸-δ-内酯2个有关物质的定量检测，可高效、准确用于葡萄糖酸-δ-内酯有关物质的质量控制，满足研发需求。
技术方案：本发明的测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，包括下述步骤：
(1)制备供试品溶液：取供试品加入稀释液溶解，定量稀释至设定浓度后获得供试品溶液；
(2)设置色谱条件：采用三键键合酰胺基键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用Hilic分离模式，以酸性水溶液为流动相A，有机溶剂为流动相B，进行等度洗脱，检测波长为205nm～220nm；
(3)测定分析：取供试品溶液10μl～50μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算葡萄糖酸-δ-内酯及其有关物质葡萄糖酸-γ-内酯与葡萄糖酸的含量。
其中，所述的步骤(1)中稀释液为乙腈和水的混合溶液，乙腈的体积占比不低于90％。优选乙腈:水为9:1(V/V)。
其中，所述的步骤(1)中供试品溶液在使用时制备，或者制备后1.5h内使用。供试品溶液浓度为每1ml中约含2mg葡萄糖酸-δ-内酯。
其中，所述的步骤(2)中酸性水溶液为浓度0.05％～0.5％的磷酸水溶液，有机溶剂为乙腈。优选浓度0.1％磷酸水溶液。
其中，所述的步骤(2)中等度洗脱时，流动相中有机相体积占比不低于25％。优选为流动相A:流动相B＝75:25(V:V)。
其中，所述的步骤(2)中色谱柱为Waters xbridge BEH Amide色谱柱，规格为4.6*250mm,5μm。
其中，所述的步骤(2)中流动相流速为0.9ml/min～1.1ml/min。
其中，所述的步骤(2)中色谱柱柱温为15℃～40℃；考虑到样品溶液水溶液在低温下水解慢，样品盘控温为2℃～10℃。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明通过筛选出特定的稀释液，解决了葡糖糖酸内酯水溶液不稳定的问题；使用特定的Hilic分离模式，解决了葡萄糖酸内酯在反相色谱模式上无保留的难题，实现了葡萄糖酸-δ-内酯2个有关物质的定量检测。
本发明提供的分析方法，灵敏度高、线性范围宽、专属性强、准确性高，能有效地洗脱、分离和定量检测葡萄糖酸-δ-内酯中的各杂质，使杂质峰与主峰、杂质与杂质峰之间完全分离；同时为列净类药物的制备过程提供有效监测数据，继而减少反应中副产物及杂质的生成，实现质量可控。
附图说明
图1为对比例1的色谱图；
图2为实施例1的色谱图；
图3为对比例2的色谱图；
图4为对比例3的色谱图；
图5为实施例2的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
对比例1：等度洗脱中流动相A:流动相B＝85:15(V/V)
高效液相色谱仪：Agilent 1260液相色谱仪
流动相A：0.1％磷酸水溶液
流动相B：乙腈
等度洗脱：流动相A:流动相B＝85:15(V/V)
色谱柱：Waters Xbridge BEH Amide，规格为4.6*250mm 5μm
检测波长：205nm
流速：1.0ml/min
柱温：20℃
进样量：10ul
样品盘温度：10℃
稀释液：水
混合溶液配制：取葡萄糖酸-δ-内酯、葡萄糖酸-γ-内酯、葡糖糖酸钠各适量，加稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中约含2mg葡萄糖酸-δ-内酯、0.01mg葡萄糖酸-γ-内酯、0.01mg葡萄糖酸的溶液，摇匀；(临用新制)。
检测结果：本实施例中，RT＝8.333min为葡萄糖酸-δ-内酯的峰，RT＝5.320min为葡萄糖酸-γ-内酯的峰，葡萄糖酸未能洗脱出来。
实施例1：等度洗脱中流动相A:流动相B＝75:25(V/V)
高效液相色谱仪：Agilent 1260液相色谱仪
流动相A：0.1％磷酸水溶液
流动相B：乙腈
等度洗脱：流动相A:流动相B＝75:25(V/V)
色谱柱：Waters Xbridge BEH Amide，规格为4.6*250mm 5μm
检测波长：205nm
流速：1.0ml/min
柱温：20℃
进样量：10ul
样品盘温度：10℃
稀释液：水
混合溶液配制：取葡萄糖酸-δ-内酯、葡萄糖酸-γ-内酯、葡糖糖酸钠、各适量，加稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中约含2mg葡萄糖酸-δ-内酯、0.01mg葡萄糖酸-γ-内酯、0.01mg葡萄糖酸的溶液，摇匀；(临用新制)。
检测结果：本实施例中，RT＝5.487min为葡萄糖酸-δ-内酯的峰，RT＝4.180min为葡萄糖酸-γ-内酯的峰，RT＝7.280min为葡萄糖酸的峰，各目标峰间分离良好。通过实施例1与对比例1等的比较，流动相中有机相体积占比不低于25％，优选为流动相A:流动相B＝75:25(V:V)。
对比例2：稀释液为水
高效液相色谱仪：Agilent 1260液相色谱仪
流动相A：0.1％磷酸水溶液
流动相B：乙腈
等度洗脱：流动相A:流动相B＝75:25(V/V)
色谱柱：Waters Xbridge BEH Amide，规格为4.6*250mm 5μm
检测波长：205nm
流速：1.0ml/min
柱温：20℃
进样量：10ul
样品盘温度：2℃
稀释液：水
混合溶液配制：取葡萄糖酸-δ-内酯、葡萄糖酸-γ-内酯、葡糖糖酸钠、各适量，加稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中约含2mg葡萄糖酸-δ-内酯、0.01mg葡萄糖酸-γ-内酯、0.01mg葡萄糖酸的溶液，摇匀；(临用新制)。
检测结果：在本实施例中考察了样品溶液的稳定性，发现葡萄糖酸-δ-内酯的水溶液不稳定，在120分钟内降解了38％。
对比例3：稀释液为甲醇
高效液相色谱仪：Agilent 1260液相色谱仪
流动相A：0.1％磷酸水溶液
流动相B：乙腈
等度洗脱：流动相A:流动相B＝75:25(V/V)
色谱柱：Waters Xbridge BEH Amide，规格为4.6*250mm 5μm
检测波长：205nm
流速：1.0ml/min
柱温：20℃
进样量：10ul
样品盘温度：2℃
稀释液：甲醇
混合溶液配制：取葡萄糖酸-δ-内酯、葡萄糖酸-γ-内酯、葡糖糖酸钠、各适量，加稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中约含2mg葡萄糖酸-δ-内酯、0.01mg葡萄糖酸-γ-内酯、0.01mg葡萄糖酸的溶液，摇匀；(临用新制)。
检测结果：在本实施例中，RT＝4.220min为葡萄糖酸-γ-内酯的峰，存在明显溶剂效应，RT＝5.440min为葡萄糖酸-δ-内酯的峰，存在酯交换杂质，且与葡萄糖酸-δ-内酯分离度差。
实施例2：稀释液为乙腈:水＝90:10(V/V)
高效液相色谱仪：Agilent 1260液相色谱仪
流动相A：0.1％磷酸水溶液
流动相B：乙腈
等度洗脱：流动相A:流动相B＝75:25(V/V)
色谱柱：Waters Xbridge BEH Amide，规格为4.6*250mm 5μm
检测波长：205nm
流速：1.0ml/min
柱温：15℃
进样量：10ul
样品盘温度：2℃
稀释液：乙腈:水＝90:10(V/V)
混合溶液配制：取葡萄糖酸-δ-内酯、葡萄糖酸-γ-内酯、葡糖糖酸钠、各适量，加稀释液溶解并定量稀释制成每1ml中约含2mg葡萄糖酸-δ-内酯、0.01mg葡萄糖酸-γ-内酯、0.01mg葡萄糖酸的溶液，摇匀；(临用新制或1.5小时内使用)。
检测结果：本实施例中，采用乙腈:水＝90:10(V/V)作为稀释液，形成的萄糖酸-δ-内酯的乙腈-水溶液在90min内能保持稳定，故样品溶液需临用新制或在1.5小时内使用。通过实施例2与对比例2、对比例3等的比较，稀释液为乙腈和水的混合溶液，乙腈的体积占比不低于90％，优选乙腈:水＝90:10(V/V)。进一步的，通过实施例2与实施例1相比，稀释液选择乙腈:水＝90:10(V/V)，效果更佳。
对本发明提供的分析测定方法进行方法学验证，结果如下：
Figure BDA0004085936440000071
/>
Figure BDA0004085936440000081
根据实施例2验证结果可知，本发明所述的葡萄糖酸-δ-内酯有关物质的分析方法，灵敏度高，线性范围宽、专属性强、且具有良好的色谱条件耐用性，可用于葡萄糖酸-δ-内酯有关物质的质量控制，满足研发需求。

Claims (8)

1.一种测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)制备供试品溶液：取供试品加入稀释液溶解，定量稀释至设定浓度后获得供试品溶液；
(2)设置色谱条件：采用三键键合酰胺基键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用Hilic分离模式，以酸性水溶液为流动相A，有机溶剂为流动相B，进行等度洗脱，检测波长为205nm～220nm；
(3)测定分析：取供试品溶液10μl～50μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算葡萄糖酸-δ-内酯及其有关物质葡萄糖酸-γ-内酯与葡萄糖酸的含量。
2.根据权利要求1所述的测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，其特征在于：所述的步骤(1)中稀释液为乙腈和水的混合溶液，乙腈的体积占比不低于90％。
3.根据权利要求1所述的测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，其特征在于：所述的步骤(1)中供试品溶液在使用时制备，或者制备后1.5h内使用。
4.根据权利要求1所述的测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，其特征在于：所述的步骤(2)中酸性水溶液为浓度0.05％～0.5％的磷酸水溶液，有机溶剂为乙腈。
5.根据权利要求1所述的测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，其特征在于：所述的步骤(2)中等度洗脱时，流动相中有机相体积占比不低于25％。
6.根据权利要求1所述的测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，其特征在于：所述的步骤(2)中色谱柱为Waters xbridge BEH Amide色谱柱，规格为4.6*250mm,5μm。
7.根据权利要求1所述的测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，其特征在于：所述的步骤(2)中流动相流速为0.9ml/min～1.1ml/min。
8.根据权利要求1所述的测定葡萄糖酸内酯有关物质的分析方法，其特征在于：所述的步骤(2)中色谱柱柱温为15℃～40℃，样品盘控温为2℃～10℃。
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