CN116240166A - 一种骨软骨类器官自组装方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物材料领域,具体涉及一种骨软骨类器官自组装方法及应用。本发明提供一种基于普通微载体进行个性化改造的策略,利用透明质酸诱导干细胞成软骨分化的特性,以及羟基磷灰石诱导干细胞成骨分化的特性,制备出具有更强成软骨和成骨诱导分化能力的微载体。软骨微载体和骨微载体具有良好的生物相容性,能够促进细胞增殖和粘附,与普通微载体相比,双向自组装微载体具有更强的成软骨和成骨诱导分化能力,本发明所得微载体在骨软骨损伤修复领域将发挥重要作用和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料领域,具体涉及一种用于骨软骨类器官自组装方法及应用。
背景技术
三维多孔细胞培养载体能够模拟三维细胞生长环境,有利于保留细胞的生理特性;三维多孔结构能够为细胞的粘附、增殖生长提供巨大的空间,而且能够更好地模拟细胞在体内的微环境,并且能够具有大量扩增细胞的潜力。专利《多孔微冰胶细胞三维培养载体及其制备方法和制备***》(申请公布号CN106978384A)和《多孔微冰胶细胞三维培养载体的制备***》(授权公告号CN207405148U)所涉及到多孔微载体,该微载体孔隙率较大,能够在较高水平上维持细胞活性,促进细胞功能,同时还具有较强的机械弹性,能够很好的保护所培养的细胞免受生物反应器内较强机械剪切力的损伤,提高其存活率。
关节软骨由于无血液供应、神经支配和淋巴循环的特殊结构,导致其损伤后难以自我修复。关节软骨损伤往往伴随着软骨下骨损伤,由于二者微环境的不同,导致其再生难度较大。因此,再生修复材料除了良好的生物相容性及可注射性等优势以外,还需要具备更强的成软骨和成骨诱导分化的能力。
目前,亟需开发一种双向自组装微载体,用于骨软骨一体化再生修复。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此,本发明第一方面提供一种骨软骨类器官自组装方法,所述方法包括下述步骤:
(1)将软骨微载体与干细胞置于成软骨分化培养基中进行预分化共培养,获得软骨微载体-预分化软骨细胞;
(2)将骨微载体与干细胞置于成骨分化培养基中进行预分化共培养,获得骨微载体-预分化成骨细胞;
(3)将所述软骨微载体-预分化软骨细胞与所述骨微载体-预分化成骨细胞接触,置于混合培养基中进行混合共培养,以便获得自组装后的骨软骨类器官,
其中,所述软骨微载体中含有透明质酸;
所述骨微载体中含有羟基磷灰石;
所述混合培养基中含有成软骨分化培养基和成骨分化培养基。
透明质酸能够促进干细胞向软骨细胞方向分化,羟基磷灰石混入生物材料后能够促进干细胞向成骨方向分化,本发明基于以上特点,结合微载体生物相容性良好,具有促进细胞粘附增殖的优势,并且通过分别引入透明质酸和羟基磷灰石增强微载体对干细胞的成软骨和成骨诱导分化能力,有望解决骨软骨一体化再生的科学问题。
本发明提供的改造后的骨微载体具有以下优势:其一,制备方法相对简便,可以可大量获取的特点,低温下能长期保存,经济廉价;其二,该产品通过引入羟基磷灰石等成分,无需加入外源性生长因子或活性分子等,具有更强的稳定性和长期保存的特性;其三,改造后微载体与普通微载体,其生物相容性均良好,但骨微载体具有更强的成骨诱导分化特性。
在本发明的一些实施方案中,所述干细胞源自成体干细胞。
在本发明的一些实施方案中,所述干细胞源自人源成体干细胞,所述人源成体干细胞包括选自间充质干细胞、诱导性多功能干细胞、骨髓干细胞中的至少之一。
在本发明的一些实施方案中,步骤(1)和(2)中共培养时间为4-8天。
在本发明的一些实施方案中,所述预分化共培养在4-8天范围内,能使得所述干细胞在相应的诱导培养基内初步分化为未成熟的软骨细胞或未成熟的成骨细胞,优选地,所述预分化共培养时间为7天。
在本发明的一些实施方案中,步骤(1)和(2)中共培养时间为6-8天。
在本发明的一些实施方案中,步骤(1)和(2)中共培养时间为7天。
在本发明的一些实施方案中,所述接触的方式为面接触。
在本发明的一些实施方案中,步骤(3)中,所述混合培养基中成软骨分化培养基和成骨分化培养基的体积比为1:(0.5-3)。
在本发明的一些实施方案中,所述混合培养基中成软骨分化培养基和成骨分化培养基的体积比为1:(1-2)。
在本发明的一些实施方案中,所述混合培养基中成软骨分化培养基和成骨分化培养基的体积比为1:1。
在本发明的一些实施方案中,所述成软骨分化培养基和成骨分化培养基的体积比为1:(0.5-3),在此范围内,能够更好的实现骨软骨类器官的自组装,优选地,所述体积比为1:1。
在本发明的一些实施方案中,所述混合共培养时间为4-8天。
在本发明的一些实施方案中,所述混合共培养时间为6-8天。
在本发明的一些实施方案中,所述混合共培养时间为7天。
在本发明的一些实施方案中,所述混合共培养时间在4-8天范围内,能使得所述未成熟的软骨细胞和所述未成熟的成骨细胞,进一步分别形成成熟软骨细胞和成熟成骨细胞,优选地,所述混合共培养时间为7天。
在本发明的一些实施方案中,所述软骨微载体的制备方法包括:
(a)将明胶与透明质酸混合,制备软骨前体溶液;
(b)制备交联剂溶液;
(c)将所述软骨前体溶液与所述交联剂溶液混合,并将混合液倒入模具进行冷冻处理,获得软骨微载体,
其中,所述明胶与所述透明质酸的质量比为(2-20):(0.01-1)。
在本发明的一些实施方案中,所述明胶与所述透明质酸的质量比在(2-20):(0.01-1)范围内,能使获得的软骨微载体在保持良好的生物相容性的同时,有促进干细胞向软骨细胞方向分化,促进未成熟的软骨细胞形成成熟软骨细胞的能力。
在本发明的一些实施方案中,所述透明质酸能促进干细胞向软骨细胞方向分化,促进未成熟的软骨细胞形成成熟软骨细胞。
在本发明的一些实施方案中,所述明胶溶液的质量体积浓度为2%-20%。
在本发明的一些实施方案中,所述明胶溶液的质量体积浓度为5-10%。
在本发明的一些实施方案中,所述明胶溶液的质量体积浓度为8%。
在本发明的一些实施方案中,所述透明质酸的质量体积浓度为0.01%-1%。
在本发明的一些实施方案中,所述透明质酸的质量体积浓度为0.1%-0.5%。
在本发明的一些实施方案中,所述透明质酸的质量体积浓度为0.25%。
在本发明的一些实施方案中,所述交联剂溶液中的交联剂包括选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、四甲基乙二胺、硫酸铵、京尼平、二乙烯基苯、二异氰酸酯、转谷酰胺酶中的至少之一。
在本发明的一些实施方案中,所述交联剂溶液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液质量体积浓度为2%-25%。
在本发明的一些实施方案中,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液质量体积浓度为5%-15%。
在本发明的一些实施方案中,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液质量体积浓度为10%。
在本发明的一些实施方案中,所述软骨前体溶液与所述交联剂溶液混合的体积比为10:1。
在本发明的一些实施方案中,步骤(c)中,所述冷冻处理的温度为-10~-30℃。
在本发明的一些实施方案中,步骤(c)进一步包括对冷冻处理后获得的微载体进行清洗。
在本发明的一些实施方案中,所述清洗液包括ddH2O。
在本发明的一些实施方案中,所述骨微载体的制备方法包括:
(A)将明胶与羟基磷灰石混合,制备骨前体溶液;
(B)将交联剂、致孔剂与所述骨前体溶液混合,并将混合液倒入模具进行冷冻处理,获得骨微载体,
其中,
所述明胶与所述羟基磷灰石的质量比为(2-20):(1-20)。
在本发明的一些实施方案中,所述明胶与所述羟基磷灰石的质量比在(2-20):(0.01-1)范围内,能使获得的骨微载体在保持良好的生物相容性的同时,有促进干细胞向成骨细胞方向分化,促进未成熟的成骨细胞形成成熟成骨细胞的能力。
在本发明的一些实施方案中,所述羟基磷灰石够促进干细胞向成骨方向分化,促进未成熟的成骨细胞形成成熟成骨细胞。
在本发明的一些实施方案中,所述明胶溶液质量体积浓度为2%-20%。
在本发明的一些实施方案中,所述明胶溶液质量体积浓度为5-10%。
在本发明的一些实施方案中,所述明胶溶液质量体积浓度为8%。
在本发明的一些实施方案中,所述羟基磷灰石质量体积浓度为1%-20%。
在本发明的一些实施方案中,所述羟基磷灰石质量体积浓度为2%-10%。
在本发明的一些实施方案中,所述羟基磷灰石质量体积浓度为6%。
在本发明的一些实施方案中,所述交联剂包括选自1,5-戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺中至少之一。
在本发明的一些实施方案中,所述交联剂为1,5-戊二醛,所述1,5-戊二醛质量体积浓度为0.5%-2%。
在本发明的一些实施方案中,所述1,5-戊二醛质量体积浓度为1%。
在本发明的一些实施方案中,所述致孔剂包括选自二甲基亚砜溶液、蔗糖、氯化钠、聚乙二醇(PEG)中至少之一。
在本发明的一些实施方案中,步骤(B)进一步包括,对冷冻处理后的微载体进行清洗。
在本发明的一些实施方案中,所述清洗剂包括选自硼氢化钠溶液、dd H2O、硼氢化钾中至少之一。
在本发明的一些实施方案中,所述清洗剂为硼氢化钠溶液,所述硼氢化钠溶液的质量体积浓度为0.05%-0.4%。
在本发明的一些实施方案中,所述硼氢化钠溶液的质量体积浓度为0.1%-0.2%。
在本发明的一些实施方案中,步骤(B)中,所述冷冻处理的温度为-10℃~-30℃。
本发明另一方面提供一种骨软骨类器官,所述骨软骨类器官由上述的方法制得。
本发明又一方面提供上述的骨软骨类器官在制备与骨软骨相关的疾病模型中的用途。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了本发明实施例2中软骨微载体制备过程;
图2显示了本发明实施例3中骨微载体制备过程;
图3显示了本发明实施例4中普通微载体、软骨微载体和骨微载体的大体观图,其中,(A)为普通微载体,呈现白色不透明的粉末状结构;(B)为软骨微载体,呈现白色粉末状结构;(C)为骨微载体,呈现灰黄色不透明的粉末状结构;
图4显示了本发明实施例4中普通微载体、软骨微载体和骨微载体的扫描电子显微镜(SEM)图像;
图5显示了本发明实施例5中普通微载体、软骨微载体和骨微载体的死/活染色共聚焦结果图,其中标尺长度为100微米,其中,绿色荧光代表活细胞,用细箭头表示,红色荧光代表死细胞,用粗箭头表示;
图6显示了本发明实施例6中普通微载体、软骨微载体和骨微载体的细胞骨架共聚焦图,其中标尺长度为50微米;
图7显示了本发明实施例7中普通微载体、软骨微载体和骨微载体负载人脐带间充质干细胞培养14天的结果图;
图8显示了本发明实施例8中普通微载体、软骨微载体和骨微载体成软骨、成骨诱导分化14天后细胞骨架染色图,其中细箭头代表纤维网状结构,粗箭头代表细胞核;
图9显示了本发明实施例9中普通微载体和软骨微载体成软骨诱导分化14天后阿利新蓝和甲苯胺蓝染色图;
图10显示了本发明实施例10中普通微载体和骨微载体成骨诱导分化14天后茜素红染色图;
图11显示了本发明实施例11中骨软骨类器官自组装示意图,其中,A表示软骨微载体,B表示骨微载体;
图12显示了本发明实施例12中骨软骨类器官大体形态图;
图13显示了本发明实施例12中骨软骨类器官扫描电镜图;
图14显示了本发明实施例13中骨软骨类器官cell tracker检测结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是,术语“第一”、“第二”仅用于描述目的,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地,在本发明的描述中,除非另有说明,“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义,否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中,术语“包含”或“包括”为开放式表达,即包括本发明所指明的内容,但并不排除其他方面的内容。
在本文中,术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生,并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况,以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中,术语“微载体”是指直径在60-250μm,能适用于贴壁细胞生长的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各种合成的聚合物组成,包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。
在本文中,术语“交联剂”常是分子中含多个官能团的物质,如有机二元酸、多元醇等;或是分子内含有多个不饱和双键的化合物,如二乙烯基苯和二异氰酸酯,N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)等。可同单体一起投料,待缩聚(或聚合)到一定程度发生交联,使产物变为不溶的交联聚合物;也可在线型分子中保留一定数量的官能团(或双键),再加入特定物质进行交联,如酚醛树脂的固化和橡胶的硫化等。
在本文中,术语“羟基磷灰石”又称羟磷灰石,碱式磷酸钙,是钙磷灰石(Ca5(PO4)3(OH))的自然矿物化,但是经常被写成(Ca10(PO4)6(OH)2)的形式以突出它是由两部分组成的:羟基与磷灰石。OH-能被氟化物、氯化物和碳酸根离子代替,生成氟基磷灰石或氯基磷灰石,其中的钙离子可以被多种金属离子通过发生离子交换反应代替,形成对应金属离子的M磷灰石(M代表取代钙离子的金属离子)。羟基磷灰石是人体和动物骨骼的主要无机成分。它能与机体组织在界面上实现化学键性结合,其在体内有一定的溶解度,能释放对机体无害的离子,能参与体内代谢,对骨质增生有刺激或诱导作用,能促进缺损组织的修复,显示出生物活性。
在文本中,术语“脐带间充质干细胞”(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞,它能分化成许多种组织细胞,具有广阔的临床应用前景,应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞,培养的细胞具有间充质干细胞的基本特性,为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据。
在文本中,术语“DMSO”指二甲基亚砜,一种含硫有机化合物,分子式为C2H6OS,常温下为无色无臭的透明液体,是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性,能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物,被誉为“万能溶剂”。在酸存在时加热会产生少量甲基硫醇、甲醛、二甲基硫、甲磺酸等化合物。在高温下有分解现象,遇氯能发生剧烈反应,在空气中燃烧发出淡蓝色火焰。可作有机溶剂、反应介质和有机合成中间体。也可用作合成纤维的染色溶剂、去染剂、染色载体以及回收乙炔、二氧化硫的吸收剂。
在文本中,术语“GA溶液”指戊二醛,是一种有机化合物,化学式为C5H8O2,为无色或淡黄色透明液体,溶于水,易溶于乙醇、***等有机溶剂,常用作杀菌剂、食品工业加工助剂、消毒剂、鞣革剂、木材防腐剂、药物和高分子合成原料等。
在文本中,术语“质量体积浓度”指质量与体积的比,用百分比(%)表示,单位为g/ml或者kg/L。
一种软骨微载体制备方法
根据本发明的一些实施方案,本发明提供一种软骨微载体的制备方法,所述方法包括:
(a)将明胶与透明质酸混合,制备软骨前体溶液;
(b)制备交联剂溶液;
(c)将所述软骨前体溶液与所述交联剂溶液混合,并将混合液倒入模具进行冷冻处理,获得软骨微载体,
其中,所述明胶与所述透明质酸的质量比为(2-20):(0.01-1)。
根据本发明的一些实施方案,所述交联剂为本领域已知的任何能使明胶与透明质酸发生交联的试剂,包括EDC在内的任何能使明胶与透明质酸发生交联的试剂均在本发明保护范围内。
根据本发明的一些更具体的实施方案,本发明提供一种软骨微载体的制备方法,所述方法包括:
(1)称量160mg明胶(cold water fish skin)和5mg透明质酸粉末溶于2ml ddH2O水中,放置于60℃烘箱孵育1-2h彻底溶解,放置于冰上冷却至室温,制备浓度为8%的软骨前体溶液备用;
(2)称取100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)粉末加入到1ml水中,涡旋震荡溶解,制备浓度为10%的EDC溶液备用;
(3)取200μl浓度为10%的EDC溶液与1.8ml浓度为8%的明胶溶液均匀混合,快速取出425μl的混合溶液,平铺加入到模具中,注意先将四周加载溶液,然后是中间,避免气泡产生;
(4)将平皿放置在饭盒内,盖盖后快速放到-20℃冰箱中,过夜预冷;
(5)冷冻时间结束后取出胶,在圆皿模具中加满ddH2O,将冰融化;
(6)用白枪头沿着四周将胶从模具中顶出,再统一转到盛有dd H2O的新皿中,冰上摇床洗,每隔20min换一次水,换2-3次,然后放摇床上过夜清洗,清洗时间不低于16小时;
(7)过夜清洗后,再换洗1次,平皿里的水留大约500ul,恰好没过微载体,用纸将平皿底和盖子擦拭干净,转入-20℃冰箱,冷冻2小时以上,然后转入冻干机,冻干4小时以上,取出真空罐保存。
一种骨微载体制备方法
根据本发明的一些实施方案,本发明提供一种骨微载体的制备方法,所述方法包括:
(A)将明胶与羟基磷灰石混合,制备骨前体溶液;
(B)将交联剂、致孔剂与所述骨前体溶液混合,并将混合液倒入模具进行冷冻处理,获得骨微载体,
其中,所述明胶与所述羟基磷灰石的质量比为(2-20):(1-20)。
根据本发明的一些更具体的实施方案,本发明提供一种骨微载体的制备方法,所述方法包括:
(1)称量160mg明胶(cold water fish skin)溶于2ml ddH2O水中,放置于60℃烘箱孵育1-2h彻底溶解,放置于冰上冷却至室温,制备浓度为8%的明胶溶液备用;
(2)称量120mg的羟基磷灰石粉末加入到2ml 8%gelatin溶液中,涡旋震荡后,加入200ul的纯DMSO再次混匀;
(3)取50%的1,5-戊二醛(GA)溶液(50X)40ul,加入到上述溶液中,快速混匀后转移到模具中;
(4)将平皿放置在饭盒内,盖盖后快速放到-20℃冰箱中,过夜预冷;
(5)配制硼氢化钠溶液,0.1g(0.2%用于高硬度)/0.05g(0.1%用于中或软)溶于50ml dd H2O(体量视样品数而定,一个圆皿2-3mL左右),之后放于4℃冰箱预冷,盖子松点,容易出气;
(6)冷冻时间结束后取出胶,在圆皿模具中加满ddH2O,将冰融化;
(7)准备一批新的小皿,将硼氢化钠分别加到各个新皿中,随后放到饭盒里,饭盒放到冰上;
(8)用白枪头沿着四周将胶从模具中顶出,再统一转到盛有硼氢化钠的新皿中,冰上摇床洗10min;
(9)然后换为dd H2O清洗,每隔20min换一次水,换2-3次,然后放摇床上过夜清洗,清洗时间不低于16小时;
(10)过夜清洗后,再换洗1次,平皿里的水留大约500ul,恰好没过微载体,用纸将平皿底和盖子擦拭干净,转入-20℃冰箱,冷冻2小时以上,然后转入冻干机,冻干4小时以上,取出真空罐保存。
根据本发明的一些实施方案,所述交联剂包括本领域已知的任何能使明胶与羟基磷灰石发生交联的试剂,包含1,5-戊二醛(GA)在内的任何能使明胶与羟基磷灰石发生交联的试剂均在本发明的保护范围内。
根据本发明的一些实施方案,所述致孔剂包括本领域已知的任何能使所述骨前体成孔的物质,包含DMSO在内的任何能使所述骨前体成孔的物质均在本发明的保护范围内。
根据本发明的一些实施方案,所述硼氢化钠溶液为一种清洁剂,当所述交联剂为醛类化合物时,所述硼氢化钠能洗脱反应剩余的醛,这里,本领域已知的任何易溶于醛类,且能溶于水的物质,都可做为本发明的清洁剂;当所述交联剂不为醛类时,所述清洁剂也随着交联剂的改变而做适应变化,其原则为,易溶于交联剂且能溶于水。
一种骨软骨类器官自组装方法
根据本发明的一些实施方案,本发明提供一种骨软骨类器官自组装方法,所述方法包括:
(1)将软骨微载体与干细胞置于成软骨分化培养基中进行共培养,获得软骨微载体-预分化软骨细胞;
(2)将骨微载体与干细胞置于成骨分化培养基中进行共培养,获得骨微载体-预分化成骨细胞;
(3)将所述软骨微载体-预分化软骨细胞与所述骨微载体-预分化成骨细胞接触,置于混合培养基中进行共培养,以便获得自组装后的骨软骨类器官,
其中,所述软骨微载体中含有透明质酸;
所述骨微载体中含有羟基磷灰石;
所述混合培养基中含有成软骨分化培养基和成骨分化培养基。
根据本发明的一些实施方案,所述干细胞源自成体干细胞。
根据本发明的一些实施方案,所述干细胞源自人源成体干细胞,所述人源成体干细胞包括选自间充质干细胞、诱导性多功能干细胞、骨髓干细胞中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施方案,所述成软骨诱导分化培养基包括本领域已知的任何能使所述干细胞特异性向软骨细胞方向分化的培养基,例如DMEM无血清培养基,所述培养基包含:***0.1μmol/L、牛血清白蛋白(1.25mg/m1)、维生素C(37.5μg/m1)、丙酮酸钠(1mmol/L)、TGF—B(10ng/ml)、β-FGF(1ng/m1)、ITS(6.25pg/ml牛胰岛素、6.25μg/ml转铁蛋白等成分,需要说明的是,本领域所有能使所述干细胞特异性向软骨分化的培养基均在本发明保护范围内。
根据本发明的一些具体实施方案,所述成骨诱导分化培养基包括本领域已知的任何能使所述干细胞特异性向成骨细胞方向分化的培养基,例如DMEM低糖培养基,所述培养基包括10%FBS、100nmol/L***、0.2mmol/L抗坏血酸、1% PS(Penicillin-Streptomycin Solution)、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,需要说明的是,本领域所有能使所述干细胞特异性向成骨细胞分化的培养基均在本发明保护范围内。
根据本发明的一些实施方案,所述培养基成分能初步决定所述干细胞的分化方向,将所述干细胞附着于软骨微载体上用成软骨诱导分化培养基进行分化诱导,将所述干细胞附着于骨微载体上用成骨诱导分化培养基进行分化诱导,获得软骨微载体-预分化软骨细胞和骨微载体-预分化成骨细胞,其中的软骨细胞和成骨细胞是未分化成熟的细胞。再将软骨微载体-预分化软骨细胞与骨微载体-预分化成骨细胞接触,用成软骨诱导分化培养基和成骨诱导分化培养基混合共培养,混合共培养以及微载体中组分不改变未分化成熟的细胞的分化方向,但能够进一步促进软骨细胞和成骨细胞的进一步分化,形成分化成熟的细胞。
根据本发明的一些实施方案,本发明中软骨微载体含有透明质酸,可使由干细胞初步分化形成的未成熟软骨细胞继续形成成熟软骨细胞,骨微载体含有羟基磷灰石,可使由干细胞初步分化形成的未成熟成骨细胞继续形成成熟成骨细胞。
根据本发明的一些实施方案,两种培养基混合培养后,附着在软骨微载体上的未成熟软骨细胞进一步形成成熟软骨细胞,附着在骨微载体上的未成熟成骨细胞进一步形成成熟成骨细胞。
根据本发明的一些实施方案,所述接触的方式为面接触。
根据本发明的一些实施方案,所述面接触包括最大横截面之间上下叠放,左右平放。
根据本发明的一些实施方案,所述上下叠放包括软骨微载体在骨微载体上层,上下叠放更符合人体形态学需求。
透明质酸能够促进干细胞向软骨细胞方向分化,羟基磷灰石混入生物材料后能够促进干细胞向成骨方向分化,本发明基于以上特点,结合微载体生物相容性良好,具有促进细胞粘附增殖的优势,并且通过分别引入透明质酸和羟基磷灰石增强微载体对干细胞的成软骨和成骨诱导分化能力,有望解决骨软骨一体化再生的科学问题。
本发明提供的改造后软骨微载体和骨微载体具有以下优势:(1)制备方法相对简便,可以可大量获取的特点,低温下能长期保存,经济廉价;(2)该产品通过引入透明质酸和羟基磷灰石等成分,无需加入外源性生长因子或活性分子等,具有更强的稳定性和长期保存的特性;(3)改造后微载体与普通微载体,其生物相容性均良好,但软骨微载体具有更强的成软骨诱导分化特性,骨微载体具有更强的成骨诱导分化特性。
下面将结合实施例对本公开的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本公开,而不应视为限定本公开的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1普通微载体制备
(1)称量160mg明胶(cold water fish skin)溶于2ml ddH2O水中,放置于60℃烘箱孵育1-2h彻底溶解,放置于冰上冷却至室温,制备浓度为8%的明胶溶液备用;
(2)称取100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)粉末加入到1ml水中,涡旋震荡溶解,制备浓度为10%的EDC溶液备用;
(3)取200μl浓度为10%的EDC溶液与1.8ml浓度为8%的明胶溶液均匀混合,快速取出425μl的混合溶液,平铺加入到模具中,注意先将四周加载溶液,然后是中间,避免气泡产生;
(4)将平皿放置在饭盒内,盖盖后快速放到-20℃冰箱中,过夜预冷;
(5)冷冻时间结束后取出胶,在圆皿模具中加满ddH2O,将冰融化;
(6)用白枪头沿着四周将胶从模具中顶出,再统一转到盛有dd H2O的新皿中,冰上摇床洗,每隔20min换一次水,换2-3次,然后放摇床上过夜清洗,清洗时间不低于16小时;
(7)过夜清洗后,再换洗1次,平皿里的水留大约500ul,恰好没过微载体,用纸将平皿底和盖子擦拭干净,转入-20℃冰箱,冷冻2小时以上,然后转入冻干机,冻干4小时以上,取出真空罐保存。
实施例2软骨微载体制备
软骨微载体具体制备过程如图1所示:
(1)称量160mg明胶(cold water fish skin)和5mg透明质酸粉末溶于2ml ddH2O水中,放置于60℃烘箱孵育1-2h彻底溶解,放置于冰上冷却至室温,制备浓度为8%的明胶溶液备用;
(2)称取100mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)粉末加入到1ml水中,涡旋震荡溶解,制备浓度为10%的EDC溶液备用;
(3)取200μl浓度为10%的EDC溶液与1.8ml浓度为8%的明胶溶液均匀混合,快速取出425μl的混合溶液,平铺加入到模具中,注意先将四周加载溶液,然后是中间,避免气泡产生;
(4)将平皿放置在饭盒内,盖盖后快速放到-20℃冰箱中,过夜预冷;
(5)冷冻时间结束后取出胶,在圆皿模具中加满ddH2O,将冰融化;
(6)用白枪头沿着四周将胶从模具中顶出,再统一转到盛有dd H2O的新皿中,冰上摇床清洗,每隔20min换一次水,换2-3次,然后放摇床上过夜清洗,清洗时间不低于16小时;
(7)过夜清洗后,再换洗1次,平皿里的水留大约500ul,恰好没过微载体,用纸将平皿底和盖子擦拭干净,转入-20℃冰箱,冷冻2小时以上,然后转入冻干机,冻干4小时以上,取出真空罐保存。
实施例3骨微载体制备
骨微载体具体制备过程如图2所示:
(1)称量160mg明胶(cold water fish skin)溶于2ml ddH2O水中,放置于60℃烘箱孵育1-2h彻底溶解,放置于冰上冷却至室温,制备浓度为8%的明胶溶液备用;
(2)称量120mg的羟基磷灰石粉末加入到2ml 8%gelatin溶液中,涡旋震荡后,加入200ul的纯DMSO再次混匀;
(3)取50%的1,5-戊二醛(GA)溶液(50X)40ul,加入到上述溶液中,快速混匀后转移到模具中;
(4)将平皿放置在饭盒内,盖盖后快速放到-20℃冰箱中,过夜预冷;
(5)配制硼氢化钠溶液,0.1g(0.2%用于高硬度)/0.05g(0.1%用于中或软)溶于50ml dd H2O(体量视样品数而定,一个圆皿2-3mL左右),之后放于4℃冰箱预冷,盖子松点,容易出气;
(6)冷冻时间结束后取出胶,在圆皿模具中加满ddH2O,将冰融化;
(7)准备一批新的小皿,将硼氢化钠分别加到各个新皿中,随后放到饭盒里,饭盒放到冰上;
(8)用白枪头沿着四周将胶从模具中顶出,再统一转到盛有硼氢化钠的新皿中,冰上摇床洗10min;
(9)然后换为dd H2O清洗,每隔20min换一次水,换2-3次,然后放摇床上过夜清洗,清洗时间不低于16小时;
(10)过夜清洗后,再换洗1次,平皿里的水留大约500ul,恰好没过微载体,用纸将平皿底和盖子擦拭干净,转入-20℃冰箱,冷冻2小时以上,然后转入冻干机,冻干4小时以上,取出真空罐保存。
实施例4三种微载体形态观察
实施例1-3中的微载体,其大体观察见图3,取适量三种微载体置于硅片之上,真空下表面喷金,通过扫描电镜观察微观形貌。
图3结果展示三种微载体实物图:(A)为普通微载体,呈现白色不透明的粉末状结构;(B)为软骨微载体,呈现白色粉末状结构;(C)为骨微载体,呈现灰黄色不透明的粉末状结构。
图4结果展示了三种微载体微观形貌:(A)为普通微载体的微观结构,微载体直径介于250-450μm之间,表面呈现明显的疏松多孔的结构,不同孔隙之间相互连通。(B)为软骨微载体的微观结构,可见微载体直接约为150-400μm,表明呈现典型的疏松多孔的结构,微孔直径大约为10-30μm,微孔之间相互连通,可见随着透明质酸的加入,并没有明显改变微载体的表面形貌。图(C)为骨微载体的微观形貌,可见微载体直径介于50-200μm,表面呈现起伏不定的突起状结构,未见明显的疏松多孔状结构,且个别微载体之间相互融合。
实施例5三种微载体细胞死活染色检测
将紫外线灭菌后的微载体与人脐带间充质干细胞(北京华龛生物科技有限公司)共培养,细胞负载于支架之上体外培养7天后进行死活染色。在取1μL钙黄绿素-AM及4μL乙锭二聚体-1加到2ml无菌PBS溶液之中,浸置细胞-微载体复合物于溶液中室温下30min,继续用无菌PBS轻柔清洗3次后吸净PBS溶液,激光共聚焦显微镜下拍照观察。
死/活染色结果(图5)显示,其中,绿色荧光代表活细胞,用细箭头表示,红色荧光代表死细胞,用粗箭头表示;普通微载体和软骨微载体组中人脐带间充质干细胞绝大多数显示绿色荧光(活细胞,细箭头),仅有少量红色荧光(死细胞,粗箭头);骨微载体组中,由于材料非特异性吸附乙锭二聚体-1,因此,显示出球形的微载体红色形貌,但并不能认为是死细胞。由于三种微载体负载细胞数量是相同的,通过与普通微载体和软骨微载体的绿色荧光对比可知,骨微载体中细胞呈现出较强的绿色信号,可以认定为大量的活细胞。说明三种微载体均具有良好的生物相容性。
实施例6三种微载体细胞骨架染色观察
将紫外线灭菌后的微载体与人脐带间充质干细胞共培养,细胞负载于支架之上体外培养7天后进行细胞骨架染色。将培养7天后的细胞与微载体复合物使用4%多聚甲醛固定20分钟后,经过反复PBS冲洗,0.1%Triton 100破膜等步骤后,使用绿色罗丹明染料和DAPI染料对复合物进行染色30分钟,PBS清洗3遍后激光共聚焦显微镜下拍照观察。
如图所示(图6),普通微载体上细胞较为密集粘附在微载体表面,呈现典型的半球形结构。软骨微载体表面有明显的细胞粘附,细胞延展性良好,细胞形态较为铺展。骨微载体表面呈现出更为密集的细胞粘附形态,呈现出典型的半球形结构。以上结果均说明了细胞在微载体粘附良好,延展性强。
实施例7三种微载体负载MSC培养14天后微观形态检测
将紫外线灭菌后的微载体与人脐带间充质干细胞共培养14天后,经2.5%戊二醛溶液固定等预处理后,在扫描电镜下观察细胞粘附和生长情况,以评估其生物相容性。
细胞粘附结果如图7所示,三种微载体表面大量细胞粘附,生长状态良好,细胞形态多变,产生大量细胞外基质,提示细胞存活率高且增殖性能更为明显,说明本发明的微载体具有良好的细胞相容性,且具有一定的促细胞粘附和生长性能。
实施例8三种微载体成软骨和成骨分化14天后细胞骨架染色观察
为了更清晰地观察分化诱导后各组细胞之间的形态差异,将紫外线灭菌后的微载体与人脐带间充质干细胞成软骨和成骨分化诱导14天,然后将细胞消化至培养板后过夜贴壁,使用F-actin和DAPI对细胞骨架和细胞核分别进行染观察。
如图8所示,普通微载体和软骨微载体成软骨诱导分化培养14天后,二者细胞形态轮廓隐约可见,其中,细箭头代表纤维网状结构,粗箭头代表细胞核,由图8可见,细胞内呈现粗细不等的纤维网状结构,多个细胞相互交融,细胞纤维相互交织,细胞延展性好。普通微载体和骨微载体成骨分化诱导14天后,二者细胞形态相似,细胞边缘纤维较为明显,细胞内部纤维信号稍弱,相邻细胞间纤维相互交织。
实施例9普通微载体和软骨微载体成软骨分化14天后阿利新蓝和甲苯胺蓝染色
为了探究改造后微载体是否具有更强的成软骨分化诱导能力,将紫外线灭菌后的微载体与人脐带间充质干细胞成软骨分化诱导14天,然后将细胞消化至培养板后过夜贴壁后进行阿利新蓝和甲苯胺蓝染色。其中,阿利新蓝染色步骤为:PBS溶液清洗后,将阿利新蓝染色液(索莱宝公司)浸染5分钟,蒸馏水洗2分钟,光镜下待观察。甲苯胺蓝染色:将甲苯胺蓝染色液(索莱宝公司)浸染5分钟,蒸馏水洗2分钟,光镜下待观察。
从图9阿利新蓝染色结果可以看出,普通微载体中染色程度比软骨微载体更浅,并且软骨微载体组呈现出多点分布的深染区,表明其具有更多的酸性黏多糖产生。甲苯胺蓝染色结果可以看出,软骨微载体组细胞呈现明显的深染色区,并且深染色区域远大于微载体组。两个结果均表明,软骨微载体具有更强的诱导干细胞向软骨细胞分化的能力。
实施例10普通微载体和骨微载体成骨分化14天后茜素红染色
为了探究改造后微载体是否具有更强的成骨分化诱导能力,将紫外线灭菌后的微载体与人脐带间充质干细胞成骨分化诱导14天,然后将细胞消化至培养板后过夜贴壁后进茜素红染色。
从图10中可以看出,微载体组细胞呈现斑斑点点染色区,而骨微载体组呈现出更多的钙结节染色区,表明了骨微载体具有更强的诱导干细胞向成骨细胞分化的能力。
实施例11骨软骨类器官体外自组装
体外探究软骨和骨微载体能否自组装成骨软骨类器官。首先将灭菌后的软骨微载体与人脐带间充质干细胞成软骨分化诱导7天,同时将灭菌后的骨微载体与人脐带间充质干细胞成骨分化诱导7天,然后根据图11所示,其中,A表示软骨微载体,B表示骨微载体,将骨微载体放置于模具下层,软骨微载体放置于上层,培养基为成软骨分化培养基(武汉维诺赛生物技术有限公司):成骨分化培养基(赛业(广州)生物科技有限公司)=1:1,继续分化诱导7天后,即为自组装骨软骨类器官。
实施例12骨软骨类器官分化后扫描电镜检测
对上述骨软骨类器官进行大体观察和扫描电镜观察。具体步骤为,沿着类器官纵轴切开,PBS溶液清洗3次后,使用2.5%戊二醛溶液固定4小时,冻干后表面喷金,通过扫描电镜观察微观形貌。
图12所示,自组装骨软骨类器官大体观呈现白色不透明状,骨、软骨层交界处隐约可见交界线,图13扫描电镜结果显示左上方为软骨层,右下角为骨层,隐约可见微载体,其外包裹大量细胞外基质,形成致密的组织。软骨层和骨层二者融合较好,虚线处即为分界线。
实施例13Cell tracker示踪软骨微载体和骨微载体中细胞行为
为了研究不同微载体中细胞行为,选择了Cell tracker来区分细胞。在细胞接种之前,根据制造商的说明,将细胞与试剂盒(SigmaAldrich,MO,USA)中提供的稀释剂C中制备的1x染料孵育,并分别用PKH26红色荧光细胞连接(用于软骨微载体)和用PKH67绿色荧光细胞连接器(用于骨微载体)标记MSC。然后将细胞接种到不同的微载体中,并根据实施例11中的程序进行自组装培养。自组装完成后,使用TCS-SP8共焦显微镜(Leica,Germany)在490nm(PKH67)和551nm(PKH26)激发下对骨软骨类器官进行成像。
如图14所示,上层红色是软骨层,下层绿色是骨层,二者呈现明显的分界,说明在自组装过程中,两种微载体并没有混合,而是在各自的位置进行分化。
综合以上结果表明,改造后的软骨微载体和骨微载体,具有良好的生物相容性,能够促进细胞增殖,粘附,并且相对于普通微载体而言,具有更强的成软骨分化和成骨分化诱导的能力,在体外能够自发组装成骨软骨类器官,对于解决骨软骨一体化损伤,有望提供新思路。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种骨软骨类器官自组装方法,其特征在于,所述方法包括:
(1)将软骨微载体与干细胞置于成软骨分化培养基中进行预分化共培养,获得软骨微载体-预分化软骨细胞;
(2)将骨微载体与干细胞置于成骨分化培养基中进行预分化共培养,获得骨微载体-预分化成骨细胞;
(3)将所述软骨微载体-预分化软骨细胞与所述骨微载体-预分化成骨细胞接触,置于混合培养基中进行混合共培养,以便获得自组装后的骨软骨类器官,
其中,所述软骨微载体中含有透明质酸;
所述骨微载体中含有羟基磷灰石;
所述混合培养基中含有成软骨分化培养基和成骨分化培养基。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述干细胞源自成体干细胞;
任选地,所述干细胞源自人源成体干细胞,所述人源成体干细胞包括选自间充质干细胞、诱导性多功能干细胞、骨髓干细胞中的至少之一;
任选地,步骤(1)和(2)中所述预分化共培养时间为4-8天;
任选地,步骤(1)和(2)中所述预分化共培养时间为6-8天;
任选地,步骤(1)和(2)中所述预分化共培养时间为7天。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述接触的方式为面接触;
任选地,步骤(3)中,所述混合培养基中成软骨分化培养基和成骨分化培养基的体积比为1:(0.5-3);
任选地,所述混合培养基中成软骨分化培养基和成骨分化培养基的体积比为1:(1-2);
任选地,所述混合培养基中成软骨分化培养基和成骨分化培养基的体积比为1:1;
任选地,所述混合共培养时间为4-8天;
任选地,所述混合共培养时间为6-8天;
任选地,所述混合共培养时间为7天。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述软骨微载体的制备方法包括:
(a)将明胶与透明质酸混合,制备软骨前体溶液;
(b)制备交联剂溶液;
(c)将所述软骨前体溶液与所述交联剂溶液混合,并将混合液倒入模具进行冷冻处理,获得软骨微载体,
其中,所述明胶与所述透明质酸的质量比为(2-20):(0.01-1)。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述明胶溶液的质量体积浓度为2%-20%;
任选地,所述明胶溶液的质量体积浓度为5-10%;
任选地,所述明胶溶液的质量体积浓度为8%;
任选地,所述透明质酸的质量体积浓度为0.01%-1%;
任选地,所述透明质酸的质量体积浓度为0.1%-0.5%;
任选地,所述透明质酸的质量体积浓度为0.25%;
任选地,所述交联剂溶液中的交联剂包括选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、四甲基乙二胺、硫酸铵、京尼平、二乙烯基苯、二异氰酸酯、转谷酰胺酶中的至少之一;
任选地,所述交联剂溶液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液质量体积浓度为2%-25%;
任选地,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液质量体积浓度为5%-15%;
任选地,所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐水溶液质量体积浓度为10%;
任选地,所述软骨前体溶液与所述交联剂溶液混合的体积比为10:1。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(c)中,所述冷冻处理的温度为-10~-30℃;
任选地,步骤(c)进一步包括对冷冻处理后获得的微载体进行清洗;
任选地,清洗时采用的清洗液包括ddH2O。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述骨微载体的制备方法包括:
(A)将明胶与羟基磷灰石混合,制备骨前体溶液;
(B)将交联剂、致孔剂与所述骨前体溶液混合,并将混合液倒入模具进行冷冻处理,获得骨微载体,
其中,
所述明胶与所述羟基磷灰石的质量比为(2-20):(1-20)。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,所述明胶溶液质量体积浓度为2%-20%;
任选地,所述明胶溶液质量体积浓度为5-10%;
任选地,所述明胶溶液质量体积浓度为8%;
任选地,所述羟基磷灰石质量体积浓度为1%-20%;
任选地,所述羟基磷灰石质量体积浓度为2%-10%;
任选地,所述羟基磷灰石质量体积浓度为6%;
任选地,所述交联剂包括选自1,5-戊二醛、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基硫代琥珀酰亚胺中至少之一;
任选地,所述交联剂为1,5-戊二醛,所述1,5-戊二醛质量体积浓度为0.5%-2%;
任选地,所述1,5-戊二醛质量体积浓度为1%;
任选地,所述致孔剂包括选自二甲基亚砜溶液、蔗糖、氯化钠、聚乙二醇中至少之一;
任选地,步骤(B)进一步包括对冷冻处理后的微载体进行利用清洗剂进行清洗;
任选地,所述清洗剂包括选自硼氢化钠溶液、ddH2O、硼氢化钾中至少之一;
任选地,所述清洗剂为硼氢化钠溶液,所述硼氢化钠溶液的质量体积浓度为0.05%-0.4%;
任选地,所述硼氢化钠溶液的质量体积浓度为0.1%-0.2%;
任选地,步骤(B)中,所述冷冻处理的温度为-10℃~-30℃。
9.一种骨软骨类器官,其特征在于,所述骨软骨类器官由权利要求1-8任意一项所述的方法制得。
10.权利要求9所述的骨软骨类器官在制备与骨软骨相关的疾病模型中的用途。
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