CN116236591A - 用于将核酸递送至耳蜗和前庭细胞的材料和方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了用于将核酸有效递送至耳蜗和前庭细胞的材料和方法。

Description

用于将核酸递送至耳蜗和前庭细胞的材料和方法
本申请是基于申请日为2016年12月12日，优先权日为2015年12月11日，申请号为201680079432.3，发明名称为：“用于将核酸递送至耳蜗和前庭细胞的材料和方法”的专利申请的分案申请。
技术领域
本公开内容一般地涉及用于将核酸递送至耳蜗和前庭细胞的材料和方法。
背景技术
基于遗传的听力丧失是一个重要问题，除了人工耳蜗以外，其治疗选择较少。遗传性听力问题通常是由于单基因缺陷造成的。有1/500的婴儿被诊断为语前耳聋，其中的约50％具有遗传病因。Usher综合征占幼儿耳聋的3至6％，该综合征与多种不同的临床亚型相关，每种亚型均可能由多种不同基因的任意一种突变引起，而在TMC1基因中发生的一种遗传缺陷较为普遍，估计占所有遗传性耳聋的1-2％。
内耳(例如，耳蜗，特别是在耳蜗中的内毛细胞和外毛细胞(IHC和OHC))是用于干预各种病因导致的听力丧失和耳聋(最直接的是单基因形式的遗传性耳聋)的基因疗法的有吸引力的靶点。然而，有效靶向和转导IHC和OHC以及可能与基因治疗方法相关的其他内耳细胞一直都是一项挑战。
发明内容
听力丧失是世界范围内最常见的感觉障碍，半数语前耳聋是由遗传因素导致。尽管如此，由于缺乏安全、临床相关和有效的递送方式，使得耳蜗基因疗法向临床的转化已经减缓。然而，本申请所述的新基因递送方式向包括IHC和OHC在内的内耳细胞提供高效的基因转移，该方式包括基于含有Anc80衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)的新组合物和方法。如本申请所示，含有被称为Anc80或特异性Anc80衣壳蛋白(例如，Anc80-0065)的亲代支架(ancestral scaffold)衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)在体内靶向内耳中包括IHC和OHC在内的不同细胞方面令人吃惊的有效。
在一个方面中，提供了一种AAV载体，所述AAV载体包含Anc80衣壳蛋白和TMC1或TMC2转基因。在另一个方面中，提供了一种AAV载体，所述AAV载体包含Anc80衣壳蛋白和一种或多种选自下组的转基因：MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7。在一个实施方式中，AAV载体还包含异源启动子。
在又一个方面中，提供了一种向受试者内耳中的一种或多种细胞递送转基因的方法。此类方法通常包括向受试者的内耳施用腺相关病毒(AAV)，其中所述AAV包含Anc80衣壳蛋白和转基因。
在再一个方面中，提供了一种在受试者中治疗听力障碍(例如，使听力恢复)或预防听力丧失(或进一步的听力丧失)的方法。此类方法通常包括向受试者施用AAV，其中所述AAV包含Anc衣壳蛋白和转基因，当所述转基因在内耳的一种或多种细胞中表达时，使受试者的听力恢复。
在一个实施方式中，内耳中的一种或多种细胞选自下组：内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)。在一些实施方式中，转基因被递送至至少80％的内毛细胞和至少80％的外毛细胞。在一些实施方式中，内耳中的一种或多种细胞选自下组：螺旋神经节神经元、前庭毛细胞、前庭神经节神经元、支持细胞和在血管纹中的细胞。
在一些实施方式中，转基因选自下组：ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN和XIAP。
在一些实施方式中，转基因编码神经营养因子(例如，GDNF、BDNF、NT3和HSP70)。在一些实施方式中，转基因编码抗体或其片段。在一些实施方式中，转基因编码免疫调节蛋白。在一些实施方式中，转基因编码抗-致癌性转录物。在一些实施方式中，转基因编码反义、沉默或长的非编码RNA种类。在一些实施方式中，转基因编码选自下组的基因组编辑***：经基因工程改造的锌指核酸酶、TALEN和CRISPR。
在一些实施方式中，Anc80衣壳蛋白具有SEQ ID NO：1中所示的序列。在一些实施方式中，Anc80衣壳蛋白具有SEQ ID NO：2中所示的序列。在一些实施方式中，转基因在异源启动子序列的控制下。代表性的异源启动子序列包括但不限于CMV启动子、CBA启动子、CASI启动子、PGK启动子、EF-1启动子、α9烟碱受体启动子、动力蛋白启动子、KCNQ4启动子、Myo7a启动子、Myo6启动子、Gfi1启动子、Vglut3启动子和Atoh1启动子。
在一些实施方式中，施用步骤包括通过从圆窗注射Anc AAV。在一些实施方式中，Anc AAV通过从圆窗注射施用。在一些实施方式中，在耳蜗造口术期间或在管造口术期间施用Anc AAV。在一些实施方式中，通过一种或多种药物递送载剂向中耳和/或圆窗施用AncAAV。
在一些实施方式中，转基因的表达导致内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)、螺旋神经节神经元、血管纹、前庭毛细胞和/或前庭神经节神经元的再生，从而恢复听力或前庭功能。
在一个方面中，提供了一种制品，所述制品包含AAV载体和药物组合物。在此类制品中，AAV载体包含Anc80衣壳蛋白和与启动子可操作地连接的转基因。在一些实施方式中，转基因选自下组：ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1,PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN和XIAP。
在另一个方面中，提供了一种向受试者内耳中的一种或多种细胞递送TMC1或TMC2转基因的方法。此类方法通常包括向受试者的内耳施用腺相关病毒(AAV)，其中所述AAV包含Anc80衣壳蛋白和转基因。在又一个实施方式中，提供了一种在受试者中治疗听力障碍的方法。此类方法通常包括向受试者施用AAV，其中所述AAV包含Anc80衣壳蛋白和TMC1或TMC2转基因，当转基因在内耳的一种或多种细胞中表达时，使受试者的听力恢复或阻止受试者的听力丧失(例如，进一步的听力丧失)。
在又一个方面中，提供了一种向受试者内耳中的一种或多种细胞递送Usher转基因的方法。此类方法通常包括向受试者的内耳施用腺相关病毒(AAV)，其中所述AAV包含Anc80衣壳蛋白和转基因。在再一个实施方式中，提供了一种在受试者中治疗听力障碍的方法。此类方法可以包括向受试者施用AAV，其中所述AAV包含Anc80衣壳蛋白和Usher转基因，当转基因在内耳的一种或多种细胞中表达时，使受试者的听力恢复。代表性的Usher转基因包括但不限于MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7。
在一个实施方式中，内耳中的一种或多种细胞选自下组：内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)。在一个实施方式中，转基因被递送至至少80％的内毛细胞和至少80％的外毛细胞。在一个实施方式中，内耳中的一种或多种细胞选自下组：螺旋神经节神经元、前庭毛细胞、前庭神经节神经元、支持细胞和在血管纹中的细胞。
在一个实施方式中，Anc80衣壳蛋白具有SEQ ID NO：1中所示的序列。在一个实施方式中，Anc80衣壳蛋白具有SEQ ID NO：2中所示的序列。在一个实施方式中，转基因在异源启动子序列的控制下。代表性的异源启动子序列包括但不限于CMV启动子、CBA启动子、CASI启动子、PGK启动子、EF-1启动子、α9烟碱受体启动子、动力蛋白启动子、KCNQ4启动子、Myo7a启动子、Myo6启动子、Gfi1启动子、Vglut3启动子和Atoh1启动子。
在一个实施方式中，施用步骤包括通过从圆窗注射Anc AAV。在一个实施方式中，Anc AAV通过从圆窗注射施用。在一个实施方式中，在耳蜗造口术期间或在管造口术期间施用Anc AAV。在一个实施方式中，通过一种或多种药物递送载剂向中耳和/或圆窗施用AncAAV。
在一个实施方式中，转基因的表达导致内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)、螺旋神经节神经元、血管纹、前庭毛细胞和/或前庭神经节神经元(例如，Atoh1、NF2)的再生，从而恢复听力或前庭功能和/或阻止听力丧失(例如，进一步的听力丧失)。
本申请进一步涉及以下实施方式：
1.一种AAV载体，所述载体包含Anc80衣壳蛋白和一种或多种选自下组的转基因：TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、LRN1、PDZD7。
2.一种向受试者内耳中的一种或多种细胞递送转基因的方法，所述方法包括：
向受试者的所述内耳施用腺相关病毒(AAV)，其中所述AAV包含Anc80衣壳蛋白和转基因。
3.根据实施方式2所述的方法，其中所述内耳中的所述一种或多种细胞选自下组：内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)。
4.根据实施方式3所述的方法，其中将所述转基因递送到至少80％的内毛细胞和至少80％的外毛细胞。
5.根据实施方式2所述的方法，其中在所述内耳中的所述一种或多种细胞选自下组：螺旋神经节神经元、前庭毛细胞、前庭神经节神经元、支持细胞和在血管纹中的细胞。
6.根据实施方式2所述的方法，其中所述转基因选自下组：ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1,PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN和XIAP。
7.根据实施方式2所述的方法，其中所述转基因编码神经营养因子。
8.根据实施方式7所述的方法，其中所述神经营养因子选自下组：GDNF、BDNF、NT3和HSP70。
9.根据实施方式2所述的方法，其中所述转基因编码抗体或其片段。
10.根据实施方式2所述的方法，其中所述转基因编码免疫调节蛋白。
11.根据实施方式2所述的方法，其中所述转基因编码抗-致癌性转录物。
12.根据实施方式2所述的方法，其中所述转基因编码反义、沉默或长的非编码RNA种类。
13.根据实施方式2所述的方法，其中所述转基因编码选自下组的基因组编辑***：经基因工程改造的锌指核酸酶、TALEN和CRISPR。
14.根据实施方式2所述的方法，其中所述Anc80衣壳蛋白具有SEQ ID NO：1中所示的序列。
15.根据实施方式2所述的方法，其中所述Anc80衣壳蛋白具有SEQ ID NO：2中所示的序列。
16.根据实施方式3所述的方法，其中所述转基因在异源启动子序列的控制下。
17.根据实施方式16所述的方法，其中所述异源启动子序列选自下组：CMV启动子、CBA启动子、CASI启动子、PGK启动子、EF-1启动子、α9烟碱受体启动子、动力蛋白启动子、KCNQ4启动子、Myo7a启动子、Myo6启动子、Gfi1启动子、Vglut3启动子和Atoh1启动子。
18.根据实施方式2所述的方法，其中所述施用步骤包括通过从圆窗注射所述AncAAV。
19.根据实施方式2所述的方法，其中所述Anc AAV通过经由圆窗的注射施用。
20.根据实施方式2所述的方法，其中在耳蜗造口术期间或在管造口术(canalostomy)期间施用所述Anc AAV。
21.根据实施方式2所述的方法，其中通过一种或多种药物递送载剂向中耳和/或圆窗施用所述Anc AAV。
22.根据实施方式2所述的方法，其中所述转基因的表达导致内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)、螺旋神经节神经元、血管纹、前庭毛细胞和/或前庭神经节神经元的再生，从而恢复听力或前庭功能。
23.一种制品，所述制品包含AAV载体和药物组合物，其中所述AAV载体包含Anc80衣壳蛋白和与启动子可操作地连接的转基因。
24.根据实施方式23所述的制品，其中所述转基因选自下组：ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP,NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN和XIAP。
25.一种向受试者内耳中的一种或多种细胞递送TMC1或TMC2转基因的方法，所述方法包括：
向受试者的所述内耳施用腺相关病毒(AAV)，其中所述AAV包含Anc80衣壳蛋白和转基因。
26.一种向受试者内耳中的一种或多种细胞递送Usher转基因的方法，所述方法包括：
向受试者的所述内耳施用腺相关病毒(AAV)，其中所述AAV包含Anc80衣壳蛋白和转基因。
27.根据实施方式25或26所述的方法，其中所述Usher转基因选自下组：MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、CLRN1、PDZD7。
28.根据实施方式25或26所述的方法，其中在所述内耳中的所述一种或多种细胞选自下组：内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)。
29.根据实施方式28所述的方法，其中将所述转基因递送到至少80％的内毛细胞和至少80％的外毛细胞。
30.根据实施方式25或26所述的方法，其中在所述内耳中的所述一种或多种细胞选自下组：螺旋神经节神经元、前庭毛细胞、前庭神经节神经元、支持细胞和在血管纹中的细胞。
31.根据实施方式25或26所述的方法，其中所述Anc80衣壳蛋白具有SEQ ID NO：1中所示的序列。
32.根据实施方式25或26所述的方法，其中所述Anc80衣壳蛋白具有SEQ ID NO：2中所示的序列。
33.根据实施方式25或26所述的方法，其中所述转基因在异源启动子序列的控制下。
34.根据实施方式33所述的方法，其中所述异源启动子序列选自下组：CMV启动子、CBA启动子、CASI启动子、PGK启动子、EF-1启动子、α9烟碱受体启动子、动力蛋白启动子、KCNQ4启动子、Myo7a启动子、Myo6启动子、Gfi1启动子、Vglut3启动子和Atoh1启动子。
35.根据实施方式25或26所述的方法，其中所述施用步骤包括通过从圆窗注射所述Anc AAV。
36.根据实施方式25或26所述的方法，其中所述Anc AAV通过经由圆窗的注射施用。
37.根据实施方式25或26所述的方法，其中在耳蜗造口术期间或在管造口术期间施用所述Anc AAV。
38.根据实施方式25或26所述的方法，其中通过一种或多种药物递送载剂向中耳和/或圆窗施用所述Anc AAV。
39.根据实施方式25或26所述的方法，其中所述转基因的表达导致内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)、螺旋神经节神经元、血管纹、前庭毛细胞和/或前庭神经节神经元的再生，从而恢复听力或前庭功能。
除非另外定义，否则本申请中使用的所有技术和科学术语具有与物质的方法和组成所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。尽管可以将与本申请所述的那些相似或等同的方法和材料用于实施或检测物质的方法和组成，但是下文描述了适宜的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅是说明性的并且并非旨在限制。本申请中提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入。
附图说明
第1部分：高效的耳蜗基因转移
图1的A-G是显示对在C57BL/6小鼠耳蜗外植体中eGFP转基因表达的几种AAV血清型进行体外比较的代表性共聚焦投影的图像。图1的A-G显示了所有血清型耳蜗基部的表达，以及所示AAV顶部和基部的表达。比例尺＝100μM。上图：Myo7A+TuJ1；下图：仅eGFP；中图：重叠；S细胞：支持细胞，OHC：外毛细胞，IHC：内毛细胞。图1的H-K是显示在孵育48h或48h+5天后每100μM中eGFP-阳性毛细胞的百分比的图。48h的N＝3，以及48h+5d的N＝2。误差线表示平均值(SEM)的标准误差。
图2的A-G是显示在上面每个小图所示的滴度下所示AAV血清型体内耳蜗转导情况的图像。图2的A是Corti小鼠器官的共聚焦图像，使用Alexa-546-鬼笔环肽(红色)复染并对eGFP(绿色)成像。比例尺＝50μm。图2的B是显示对注射AAV-eGFP的耳蜗的基部和顶部中eGFP-阳性IHC进行定量的图。图2的C是显示对注射AAV-eGFP的耳蜗的基部和顶部中eGFP-阳性OHC进行定量的图。图2的D是显示在eGFP-阴性OHC(黑色)和eGFP-阳性OHC(绿色)的P7(左图)记录的感觉传导电流簇的图像。垂直比例尺表示200pA；垂直比例尺表示20msec。来自eGFP阴性(黑色)和eGFP-阳性(绿色)P35 IHC的电流如右图所示。垂直比例尺表示100pA；水平比例尺表示20msec。图2的E是显示在底部所示的年龄下对103个IHC和OHC绘制的感觉传导电流幅度的图。显示了来自eGFP-阴性(黑色)和eGFP-阳性(绿色)的数据。在图中显示了每组中的细胞数。图2的F是显示平均值±标准偏差(SD)的图。对4个注射Anc80的耳(绿色)和4个未注射耳(黑色)以及来自1个具有注射相关损伤但无eGFP荧光的注射耳(红色)的数据绘制ABR阈值。图2的G是显示平均值±SD的图。对4个注射Anc80的耳(绿色)和4个未注射耳(黑色)以及具有注射损伤但无eGFP荧光的1个阴性对照耳(红色)绘制DPOAE阈值。图2的B-G中数据点的注射滴度如图2的A中所示。
图3的A-D是显示在前庭感觉上皮细胞中Anc80-eGFP转导情况的图像。图3的A是显示来自使用1μL Anc80-eGFP(1.7x 1012GC/mL)注射的P1小鼠的小鼠椭圆囊的图像。收集该组织、固定、使用Alexa546-鬼笔环肽(红色)染色并针对eGFP(绿色)成像。比例尺＝100μm。图3的B是显示来自图3的A中所示相同小鼠后半规管的脊的图像。比例尺＝50μm。图3的C是显示人椭圆囊感觉上皮的图像。将该组织暴露于Anc80-eGFP载体、培养、固定、使用Alexa546-鬼笔环肽(红色)染色并针对eGFP荧光(绿色)成像。比例尺＝100μm。图3的D是显示使用Alexa546-鬼笔环肽(红色)和Myo7A(蓝色)染色的人卵圆囊上皮高放大倍数视图的图像，其是在与图3的C相同条件下转导的eGFP(绿色)的图像。在重叠图中的白色箭头表示所选定的eGFP-阳性/Myo7A-阳性细胞。比例尺＝20μm。
图4的A-J是显示对在CBA/CaJ小鼠耳蜗外植体中eGFP转基因表达的几种AAV血清型进行体外比较的代表性图像。图4的A-F显示了在等剂量AAV血清型孵育后所得到的结果的图像。比例尺＝200μm。图4的G-J中所示的误差线表示SEM。
图5的A-H是显示范围从0(图5的D，H)(最低表达)至3(图5的A，E)(最高水平表达)的eGFP定量表达评分***的图像，以便在强度和所感染的细胞数方面说明强度范围，其中“0”表示无值得注意的表达(图5的D，H)，“1”表示选择的细胞数具有模糊的表达(图5的C，G)，“2”表示每个显微镜视野中有显著数量的细胞存在较低至中等水平的表达(图5的B，F)以及“3”表示有较高百分比的细胞具有中等至较高水平的eGFP表达(图5的A，E)。图5的A(针对图5的A-D)和E中所示的比例尺(针对图5的E-H)＝20μm。
图6显示了使用上图5中详述的eGFP评分***的在C57BL/6小鼠的边缘、支持细胞和螺旋神经节神经元中eGFP表达情况的图。误差线表示SEM。通过每个显微镜视野的eGFP-阳性细胞计数评价SGN的转导情况。
图7显示了使用上图5中详述的eGFP评分***的在CBA/CaJ小鼠的边缘、支持细胞和螺旋神经节神经元中eGFP表达情况的图。误差线表示SEM。通过每个显微镜视野的eGFP-阳性细胞计数评价SGN的转导情况。
图8的A-E是显示使用Anc80对小鼠耳蜗中的内毛细胞和外毛细胞进行广泛转导的图像。图8的A是显示使用Anc80-eGFP注射的小鼠耳蜗整个顶部的低放大倍数的图像。收集耳蜗，使用Alexa546-鬼笔环肽(红色)染色并针对eGFP(绿色)成像。比例尺＝100μm。图8的B是显示使用Anc80-eGFP注射的不同小鼠耳蜗基部的高放大倍数视图的图像。收集耳蜗，使用Alexa546-鬼笔环肽(红色)染色并针对eGFP(绿色)成像。比例尺＝20μm。图8的C和D是显示对C57BL/6小鼠进行圆窗注射后定量比较内毛细胞和外毛细胞转导效率的图。图8的E是显示Anc80毛细胞转导的剂量依赖性的图像。将耳蜗暴露于两个不同的Anc80-eGFP滴度、固定、使用Alexa546-鬼笔环肽(红色)染色并针对eGFP(绿色)成像。比例尺＝20μm。
图9的A-H是显示在使用TuJ1(红色)和Myo7A(石榴红色)染色的组织切片中针对eGFP转基因的表达评价在小鼠耳蜗中从基部到顶部的双侧耳蜗转导情况的图像。在延伸至顶部的注射耳蜗中(图9的A/F)以及还在对侧未注射的耳中(图9的B-E＝从顶部至基部)观察到了有效的Anc80转导。eGFP-阳性和TuJ1-阳性螺旋神经节神经元的特写图像(图9的G)。用于Anc80转导的SGN评价的重建3D图像(图9的H)。比例尺为100μm(图9的A-E)和20μm(图9的F/G)。
图10的A-B显示了单侧耳蜗注射Anc80后的小鼠脑纵向切片的显微镜下图像(图10的A)。在小脑中(特别是在浦肯野细胞中(白色箭头))观察到了优势表达(图10的B)。比例尺为1mm(图10的A)和300μm(图10的B)。图10的C是显示在未注射和注射Anc80 RWM动物的血清和脑脊液(CSF)中抗-AAV中和抗体(NAB)滴度的图像。滴度反映了在NAB测定中观察到转导50％抑制的血清或CSF的稀释度。由于样品体积有限，血清和CSF NAB的灵敏度限度为1/4和1/52.5。
图11的A-B分别是显示Anc80耳蜗转导后的前庭功能的图像和图。注射给予小鼠Anc80-eGFP并且评价表达情况和在转棒装置上的平衡功能。图11的A是显示通过共聚焦显微镜使用Myo7A(红色)免疫荧光染色测定的前庭组织中eGFP(绿色)表达情况的图像。图11的B是显示直至小鼠从装置上跌落的平均时间+/-SEM的图。比例尺＝50μm。
第2部分—使Usher综合征小鼠模型恢复功能的基因疗法
图12的A-L显示了在Ush1c c.216G>A突变小鼠中Corti氏器官的扫描电镜的图像。图12的A-F显示了在c.216GA和c.216AA突变小鼠中成像的Corti氏器官的基部、中部和顶部区域的图像。图12的G-L是OHC(图12的G-H)和IHC(图12的I-J)的高放大倍数图像。星号表示被保护的毛束；箭头表示杂乱的毛束；以及箭号表示波浪状的IHC束。比例尺为低放大倍数：5μm(图12的A-F)；高放大倍数：2μm(图12的G)、3μm(图12的H)、2μm(图12的I-J)和1μm(图12的K，L)。
图13的A-H是显示在Ush1c c.216G>A新生突变小鼠的毛细胞中机械传导情况的图像。图13的A-D是显示FM1-43染色的图像，以评估在c.216GA和c.216AA小鼠的毛细胞中开放传导通道的存在情况。IHC FM1-43荧光看起来更暗，因为IHC在不同的焦平面上。左图：DIC，右图：FM1-43；比例尺10μm；图13的C，比例尺50μm；图13的D，比例尺10μm。图13的D上的白线表示沟纹(无摄取)和额外的-沟纹区域(摄取)。图13的E-H是显示在新生c.216GA和c.216AA小鼠的OHC、IHC和VHC中评估的机械传导情况的图。绘制典型的传导电流(图13的E)、经二阶玻尔兹曼函数拟合的其相关的电流/位移曲线(图13的F)和平均峰传导电流(图13的G-H)。在两个基因型之间，OHC、IHC和VHC的平均峰传导明显不同(***P<0.01，单因素ANOVA)。
图14的A-E是显示在体外和体内暴露于腺相关病毒载体的组织中荧光标记的harmonin的表达和定位的图像。图14的A-C显示了将暴露于AAV2/1载体的内耳组织迅速解剖、培养、固定、复染(Alexa Fluor鬼笔环肽，Invitrogen)并使用共聚焦显微镜成像。图14的A的比例尺：10μm-上图；5μm-下图；
图14的B的比例尺：10μm；图14的C的比例尺：3μm；图14的D的比例尺：30μm；图14的E的比例尺：5μm。
图15的A-C是显示注射Anc80 harmoni载体的小鼠毛细胞中机械传导恢复情况的图像。图15的A-C显示了在c.216AA未注射对照小鼠和使用Anc80harmonin-b1注射或者使用Anc80 harmonin-b1和Anc80 harmonin-a1联合注射的c.216AA小鼠的IHC中记录的机械传导电流。制备器官型培养物并进行记录。每个数据集记录相应的I/X曲线以及双玻尔兹曼拟合函数。各自的最大机械传导电流Imax＝102.1pA(c.216AA)；424.3pA(c.216AA+harmonin-b1)和341.1pA(c.216AA+harmonin-a1&-b1)(图15的B)。与未注射小鼠相比，注射harmonin-b1和harmonin-a1+-b1的平均应答(平均值±SD)显示出明显的传导恢复(***P<0.001)。在注射harmonin-b1的小鼠和c.216GA对照小鼠中的平均传导电流不存在显著性差异(NS P>0.5)。当将harmonin-a和harmonin-b联用时，也未见机械传导恢复的显著改善。图15的C显示了单因素ANOVA。
图16的A-E是显示在注射Anc80 harmonin-b1的小鼠中ABR和DPOAE阈值恢复情况的图像。图16的A显示了在c.216AA对照小鼠以及使用编码harmonin-a1、harmonin-b1或者这两者的组合的载体注射的c.216AA小鼠中针对16kHz声调的典型ABR应答的图像。在仅注射harmonin-b1或者注射harmonin-a1和b1的小鼠中测得恢复的ABR阈值为接近30dB SPL。图16的B显示了从下述中获得的平均ABR应答的图像：c.216AA；c.216GA；c.216AA+harmonin-a1；c.216AA+harmonin-b1；c.216AA+harmonin-a1&-b1。平均值±SE，连续线。虚线：图16的A中显示16kHz记录的小鼠在整个频率范围的ABR阈值。图16的C显示了从下述中获得的平均DPOAE应答：c.216AA；c.216GA；c.216AA+harmonin-a1；c.216AA+harmonin-b1；c.216AA+harmonin-a1&-b1。平均值±SE，连续线。虚线：在图16的A中显示其记录的4只小鼠的DPOAE阈值。箭号表示阈值高于所测试的最大刺激水平。图16的D-E显示了在初始ABR阈值低于或等于45dB的小鼠中在6周和3个月时获得的ABR和DPOAE应答。8只小鼠中的6只保持了6个月并且评估了ABR和DPOAE(虚线)。平均值±SE。尽管ABR和DPOAE的阈值变化在前三个月是明显的，但是在较低频率范围内在6月龄时的听力挽救仍是显著的。
图17的A-E是显示在注射Anc80 harmonin-a1和Anc80 harmonin-b1的小鼠中惊跳应答、转棒能力和旷场行为恢复情况的图像。图17的A显示了在对照c.216GA、c.216AA和注射c.216AA的小鼠中记录的对白噪音刺激的惊跳应答。在注射harmonin-b1而非harmonin-a1的小鼠中显示出对惊跳的部分挽救。平均值显示为±SE。图17的B显示了在对照c.216GA、c.216AA和注射c.216AA的小鼠中的转棒能力。在注射harmonin-b1和harmonin-a1/b1的小鼠中观察到了完全恢复；在仅注射harmonin-a1的小鼠中未观察到恢复。平均值显示为±SE。图17的C-E显示在对照c.216GA、c.216AA以及注射c.216AA和c.216GA的小鼠中进行5min的旷场观察结果。显示了2.5min的典型轨迹(图17的B)。当c.216AA突变小鼠探索整个场地并进行重复的全身旋转时，在P1时注射harmonin-a1、harmonin-b1或这两种载体的组合的c.216AA小鼠显示出与其杂合子c.216GA对应体或注射截短载体的c.216GA小鼠类似的正常行为。图17的C显示了说明每分钟的转动次数和覆盖距离的平均值±SD的图。在未注射小鼠和注射小鼠之间观察到了显著恢复***P<0.001。利用单因素ANOVA进行统计分析。
图18是注射Anc80 harmonin-b1的小鼠Corti氏器官的扫描电镜图像。对c.216GA、c.216AA和c.216AA小鼠Corti氏器官的基部、中部和顶部成像。在c.216GA小鼠中OHC和IHC毛束得到保护，而在c.216AA小鼠的Corti氏器官中其表现出是杂乱的。在c.216AA小鼠中观察到明显的毛细胞损失(星号)和毛束解体，在该器官的基端具有更显著的降解。c.216AA小鼠的毛束缺乏正常的静纤毛行。较短的行似乎缩回，而最高的行保持在c.216AA小鼠中(箭号)。尽管在挽救的c.216AA小鼠中毛细胞损失和束解体仍是明显的，但是在该器官基部和中部区域中毛细胞的存活显著更高。在柱状图中总结了毛细胞计数。在c.216AA小鼠中总共计数了1824个细胞以及在挽救的c.216AA小鼠中总共计数了792个细胞。平均值±SE。高放大倍数成像显示在注射的c.216AA小鼠(箭号)的很多但不是所有细胞(箭头)中阶梯阵列被挽救。比例尺低放大倍数：5μm；高放大倍数：1μm。
图19的A-L是显示通过SEM对Ush1c c.216G>A小鼠中的毛束形态进行分析的图像。图19的A-C显示了杂合c.216GA小鼠显示出的正常毛束形态。图19的D-I显示了在纯合c.216AA突变小鼠的器官中观察到的杂乱的毛束。图19的J-L显示了在c.216AA小鼠中IHC毛束轻度破坏。从顶部尖端到下述测得的距离：基部3.5-4mm；中部1.8-2.2mm；顶部0.6-0.8mm。比例尺低放大倍数：5μm；高放大倍数：1μm。
图20的A-J是显示在c.216AA突变小鼠中的机械传导性质的图像。图20的A-E显示了对在耳蜗中部和中部-顶回的新生儿OHC的机械传导分析。使用双指数衰减函数对来自～Po＝0.5典型电流轨迹进行拟合以评估在c.216GA和c.216AA突变体中的适应情况(图20的A)。将拟合用于产生快速(图20的C)和慢速(图20的D)时间常熟以及适应的程度(图20的E)。10-90％的工作范围没有显著改变(图20的B)。如在该散点图中所示，在c.216AA小鼠中的适应程度显著低于杂合OHC(图20的E)。图20的F-J显示了对在新生儿IHC中的机械传导分析。与c.216AA IHC相比，在c.216GA IHC中的10-90％工作范围值更小(图20的G)。在c.216AAIHC中适应总是存在的，尽管略为更慢并且具有显著更低的程度(图20的H-J)。在每个图中显示的统计分析：*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001，单因素ANOVA。
图21的A-C是显示P1双载体注射后在c.216AA的Corti氏器官中6周时荧光标记的harmonin-a和harmonin-b Anc80载体表达情况的数据。图21的A-C显示了P1共注射AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::harmonin-a1(0.5μl；4.11E^12gc/ml)和AAV2/Anc80.CMV.eGFP::harmonin-b1(0.5μl；2.99E^12gc/ml)后在6周龄c.216AA小鼠中底回的共聚焦图像。分别占细胞总数69％和74％的细胞表达了eGFP(图21的A)和tdTomato(图21的C)以及65％表达了这两种标记物，这表明成功进行了共转导。比例尺：20μm。
图22的A-F是显示在对照c.216GA和注射挽救的c.216AA小鼠中对ABR应答分析的数据。图22的A和D显示了对照c.216GA和挽救的c.216AA小鼠在8和16kHz下ABR应答的实例。图22的B-C和E-F显示了在具有可比阈值的6周龄小鼠中(n＝8c.216GA，n＝5c.216AA+Harmonin-b1 RWM P1)在8-11.3和16kHz下平均第1峰幅度(图22的B-D)和潜伏期(图22的C-D)。平均值±SE：单因素ANOVA。
图23的A-D显示了在Ush1c c.216G>A小鼠中表达的harmonin的突变形式不改变毛细胞或听觉功能。图23的A是野生型harmonin-b1蛋白与截短的harmonin之间的序列比对，截短的harmonin是Ush1c基因的外显子3中与acadian G>A突变相关的隐蔽剪接和移码后分泌的产物。图23的B显示对来自野生型小鼠、c.216GA和c.216AA突变小鼠听觉器官的半定量RT-PCR确证了在c.216GA和c.216AA小鼠中野生型(450bp)和截短的(-35bp)harmonin的表达。图23的C-D显示了在c.216GA注射小鼠以及对照c.216GA和c.216AA小鼠中测得的听觉脑干应答(ABR，图23的C)和畸变产物(DPOAE，图23的D)。曲线以平均值±SE表示。
图24的A-C是显示注射给予6周龄小鼠AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1后内耳中正确Ush1c剪接恢复情况的图像。图24的A显示了来自Ush1c.216A等位基因的正确剪接(450bp)和异常(415bp)mRNA的半定量RT-PCR扩增情况，结果表明在c.216AA挽救小鼠#1和#2的注射(I)和对侧耳中(图24的C)恢复了正确Ush1c剪接(注射耳在11.3kHz处的应答为35dB SPL)。具有较弱ABR应答(在11.3kHz为90dB SPL)的小鼠#3显示出适度正确mRNA表达的恢复，小鼠#4(在11.3kHz为100dB SPL)未显示出恢复。在未注射c.216AA小鼠(小鼠#5,6)中未检测到正确剪接，但是在c.216GA小鼠(小鼠#7,8,9)中检测到正确的和截短的剪接形式。在下面的图中显示了扩增的相应小鼠的GAPDH以确认材料的相对量。图24的B是显示证实在Ush1c.216AA小鼠的注射耳和对侧耳中存在AAV-mUsh1c的半定量放射性标记PCR分析图像。在小鼠#3和#4中存在AAV-mUsh1c DNA，但是其相对水平降低。图24的C显示了使用ABR阈值校正的AAV-mUsh1c的相对量。显示了针对11.3和16kHz的分析。线性回归表明这两者之间存在较高的相关性。
图25是显示与在听觉器官的中部至顶部区域中OHC的存活相关的长期ABR阈值恢复情况的图。在将3只未注射的c.216AA和5只注射的c.216AA的左耳解剖后进行整个Corti氏器官的毛细胞计数。在注射的小鼠中IHC和OHC毛细胞总数增加。对挽救的注射小鼠和经注射但挽救较差的小鼠进行比较后发现，其IHC数不具有差异，但是在挽救小鼠中注意到显著数量的OHC。在整个器官长度上的分析显示，可以将差异解释为是从器官的中部至顶部区域的毛细胞存活增加所致。插图：2只小鼠(小鼠#1,2)在整个测试范围内显示出较差的ABR应答(≥95dB SPL)，而3只小鼠(小鼠#3,4,5)针对5.6至16kHz之间的声刺激显示出阈值范围从35至55dB SPL的应答。
第3部分—听力丧失中涉及的其他突变的基因疗法
图26的A-D是来自使用Anc80-Harmonin::GFP(即，将GFP与Harmonin多肽融合)通过RWM注射的Ush1c突变小鼠耳蜗的代表性共聚焦图像，收集耳蜗、对肌动蛋白(红色；图26的A)和Myo7a(蓝色；图26的B)染色并针对GFP成像(绿色；图26的C)。图26的A、B和C的重叠图像如图26的D中所示。
图27是显示针对Ush1c突变小鼠(方块)和使用Anc80-Harmonin::GFP载体注射的Ush1c突变小鼠(圆圈)的作为声频率的函数绘制的ABR阈值的图。
图28的A-C显示了使用Anc80-KCNQ4通过RWM注射的KCNQ4-/-耳蜗在低放大倍数(图28的A)或高放大倍数(图28的B)下相对于在高放大倍数下的未注射耳蜗(图28的C)的代表性共聚焦图像，收集耳蜗并使用Alexa 546–鬼笔环肽(红色)和针对KCNQ4的抗体(绿色)染色。
图29的A-C是显示在野生型小鼠(图29的A)、P10 KCNQ4-/-小鼠(图29的B)和注射Anc80-KCNQ4的P10 KCNQ4-/-小鼠(图29的C)中的KCNQ4电流的一系列图。注射8天后收集耳蜗。
图30是显示在使用Anc80 Tmc1载体注射的Tmc1-/-组织中FM1-43摄取情况(FM1-43仅穿透功能性Tmc1通道)的一系列三幅图像。
图31的A是显示从野生型小鼠(左图)、Tmc1-/-小鼠(中图)和注射Anc80 Tmc1的Tmc1-/-小鼠(右图)的IHC中记录的感觉传导电流的代表性家族的图像。注射8天后收集耳蜗。
图31的B是图31的A中所示小鼠的恢复率的图示。图31的B中的图表示野生型小鼠(左图)、Tmc1-/-小鼠(中图)和注射Anc80 Tmc1的Tmc1-/-小鼠(右图)中功能性细胞的百分比。
图32是显示针对野生型、Tmc1-/-小鼠和注射Anc80 Tmc1的Tmc1-/-小鼠的作为刺激频率函数的畸变产物耳声发射(DPOAE)阈值的图。
具体实施方式
由于成人哺乳动物耳蜗的感觉细胞缺乏自我修复的能力，目前的治疗策略(取决于损伤的水平和确切位置)依赖于放大(助听器)，更好的声音传播(中耳假体/主动植入物)或直接神经元刺激(人工耳蜗)，以补偿对初级感觉毛细胞或螺旋神经节神经元的永久性损伤，其形成听觉神经并将声学信息传递到大脑。尽管这些方法已产生了变革，但是其在恢复对现代生活重要的复杂人类听觉功能方面仍远未达到最佳状态。具体地，主要问题仍然包括频率灵敏度有限、声音感知不自然以及在嘈杂环境中的语音辨别能力有限。
已考虑将治疗性基因转移到耳蜗以进一步改善目前对范围从年龄相关和环境导致的听力丧失到遗传形式耳聋的标准护理。超过300个基因位点与遗传性听力丧失有关，已描述了超过70个致病基因(Parker&Bitner-Glindzicz,2015,Arch.Dis.Childhood,100:271-8)。这些方法的治疗成功显然依赖于将外源性基因构建体安全和有效地递送至耳蜗Corti氏器官(OC)中相关治疗性细胞靶点。
OC包含两类感觉毛细胞：IHC，其将由声音携带的机械信息转化为电信号向神经元结构传递，以及OHC，其用于放大和调谐耳蜗应答，这是复杂听力功能所需的过程。内耳中的其他潜在靶点包括螺旋神经节神经元、螺旋缘的柱状细胞，其对于维持相邻的覆膜或支持细胞是重要的，其具有保护功能并且能够被触发以反式分化为毛细胞直至早期新生儿阶段。
向充满高钾内淋巴液的耳蜗导管注射可以直接进入毛细胞。然而，这种微量液体环境的改变可能会破坏内耳蜗，增加注射相关毒性的风险。通过椭圆形或圆形窗膜(RWM)可以从中耳进入耳蜗导管、鼓阶和前庭阶周围充满外淋巴液的空间。RWM是进入内耳的唯一非骨性开口，在许多动物模型中相对容易接近，并且使用该途径施用病毒载体是良好耐受的。在人体内，人工耳蜗植入通常依赖于通过RWM***手术电极。
此前在器官型耳蜗外植物和体内内耳注射评价AAV血清型的研究表明，其在遗传性耳聋小鼠模型中仅能挽救部分听力。出乎意料的是，含有亲代AAV衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)高效转导OHC。该发现克服了低转导率，其限制了使用常规AAV血清型的耳蜗基因疗法的成功开发。如本申请所述的含有亲代AAV衣壳蛋白的AAV提供了用于向IHC和OHC以及被遗传性听力和平衡障碍损伤的其他内耳细胞阵列递送内耳基因的有价值的平台。除了提供高转导率以外，如本申请所述的含有亲代AAV衣壳蛋白的AAV全身注射后在小鼠和非人灵长类中显示出具有类似的安全型性质，并且其在抗原性上不同于循环AAV，这在限制常规AAV载体有效性的预先存在的免疫性方面提供了潜在获益。
然而，本申请所述的组合物和方法能够向细胞高效递送核酸，特别是在内耳中的细胞，例如在耳蜗中(或者耳蜗的细胞或耳蜗细胞)。如在本申请中所使用的，内耳细胞指但不限于内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)、螺旋神经节神经元、前庭毛细胞、前庭神经节神经元、支持细胞和在血管纹中的细胞。支持细胞指耳中不可兴奋的细胞，例如不是毛细胞或神经元的细胞。支持细胞的实例是施旺细胞。
可以将向内耳细胞递送本申请所述的一种或多种核酸用于治疗任何数量的遗传性或获得性听力障碍，其通常由部分听力丧失或完全性耳聋定义。可以将本申请所述的方法用于治疗听力障碍，例如但不限于隐性耳聋、显性耳聋、Usher综合征和其他综合征性耳聋以及由于创伤或衰老引起的听力丧失。制备携带特定转基因的病毒的方法
如在本申请中所使用的，含有亲代AAV衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)在向内耳细胞递送核酸(例如，转基因)方面特别有效，并且特别有效的一类亲代AAV衣壳蛋是称为Anc80的亲代支架，其如SEQ ID NO：1中所示。在Anc80亲代衣壳蛋白分类中的一种特定的亲代衣壳蛋白是Anc80-0065(SEQ ID NO：2)，然而，WO 2015/054653中描述了多种在Anc80亲代衣壳蛋白分类中的其他亲代衣壳蛋白。
可以将本申请所述的含Anc80衣壳蛋白的病毒用于向内耳细胞递送多种核酸。通常将为了表达的目的向细胞递送的核酸序列称为转基因。能够递送至并在内耳细胞中表达的代表性转基因包括但不限于编码神经营养因子(例如，神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT3)或热休克蛋白(HSP)-70)、免疫调节蛋白或抗-致癌性转录物的转基因。此外，能够递送至并在内耳细胞中表达的代表性转基因还包括但不限于编码抗体或其片段、反义，沉默或长的非编码RNA种类或基因组编辑***(例如，经基因修饰的锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR))的转基因。此外，能够递送至并在内耳细胞中表达的代表性转基因包括称为下述的核酸：ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1、PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN和XIAP。本申请中使用的命名法的描述和定义可以参见万维网上的hereditaryhearingloss.org/。
转基因的表达可以由转基因的天然启动子(例如，天然存在于转基因编码序列中的启动子)所引导或者转基因的表达可以由异源启动子引导。例如，可以将本申请所述的任何转基因与其天然启动子一起使用。或者，可以将本申请所述的任何转基因与异源启动子一起使用。如在本申请中所使用的，异源启动子指不是天然引导该序列表达的启动子(即，在自然界中未发现与该序列一起)。可以用于引导本申请所示的任何转基因表达的代表性异源启动子包括例如巨细胞病毒(CMV)启动子、鸡β肌动蛋白(CBA)启动子、合成的CASI启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延伸因子(EF)-1启动子、α烟碱受体启动子、动力蛋白启动子、生长因子非依赖性(GFI1)启动子和囊泡谷氨酸转运蛋白3(VGLUT3)启动子。此外，可以将天然引导上述参比转基因之一表达的启动子(例如，KCNQ4启动子、Myo7a启动子、Myo6启动子或ATOH1启动子)作为引导转基因表达的异源启动子。
制备用于包装成含有Anc80衣壳蛋白的病毒的转基因的方法是本领域公知的，并且利用常规分子生物学和重组核酸技术。在一个实施方式中，提供了一种构建体，该构建体包含编码Anc80衣壳蛋白的核酸序列，并且该构建体携带翼侧为适宜的反向末端重复(ITR)的转基因，其使得将转基因包装在Anc80衣壳蛋白中。
使用例如包装宿主细胞可以将转基因包装在含有Anc80衣壳蛋白的AAV中。可以使用如本申请所述的一种或多种构建体将病毒颗粒的成分(例如，rep序列、cap序列、反向末端重复(ITR)序列)瞬时或稳定地引入包装宿主细胞中。本申请所述的病毒至少含有Anc80衣壳蛋白；病毒颗粒的其他成分(例如，rep序列、ITR序列)可以基于亲代序列或当代序列。在某些情况下，例如，整个病毒颗粒可以基于亲代序列。可以使用常规方法纯化此类病毒。
应当理解的是，可以将一种或一种以上转基因递送至内耳。还应当理解的是，可以使用包含Anc80衣壳蛋白的单一AAV载体或者使用包含Anc80衣壳蛋白的多个AAV载体将一种以上转基因递送至内耳。
在通常情况下，如在本申请中所使用的，“核酸”可以包括DNA和RNA，以及还可以包括含有一种或多种核苷酸类似物或骨架修饰的核酸。核酸可以是单链的或双链的，其通常取决于其预期用途。可以用于本申请所述方法中的核酸可以与已知核酸序列相同，或者可以用于本申请所述方法中的核酸可以是与此类已知序列不同的序列。举例来说，核酸(或编码的多肽)可以与已知序列具有至少75％的序列同一性(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。
在计算序列同一性百分比时，对两条序列进行比对并确定两条序列之间的核苷酸或氨基酸残基的相同匹配数。将相同匹配数除以比对区域的长度(即，比对的核苷酸或氨基酸残基的数量)并乘以100以得到序列同一性百分比值。应意识到的是，比对区域的长度可以是一条或两条序列的一部分直到最短序列的全长大小。还应意识到的是，可以将单一序列与一条以上其他序列进行比对，因此可以在每个比对区域上具有不同的序列同一性百分比值。
使用计算机程序ClustalW以及缺省参数对两条或多条序列进行比对以确定序列同一性百分比，其能够在其全长进行核酸或多肽序列的比对(全局比对)。Chenna等，2003,Nucleic Acids Res.,31(13):3497-500。ClustalW计算查询序列与一条或多条目标序列之间的最佳匹配并将其对齐以确定同一性、相似性和差异。可以将一个或多个残基的空位***查询序列、目标序列或者这两者以最大化序列比对。对于核酸序列的配对比对，使用缺省参数(即，字号：2；窗口大小：4；评分方法：百分比；顶部对角线数：4；以及空位罚分：5)；对于多个核酸序列的比对，使用下述参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；以及权重转移：是。对于多肽序列的配对比对，使用下述参数：字号：1；窗口大小：5；评分方法：百分比；顶部对角线数：5；以及空位罚分：3。对于多肽序列的多重比对，使用下述参数：权重矩阵：BLOSUM(模块替换矩阵)；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：开；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；以及残基特异性空位罚分：开。ClustalW可以在Baylor College of Medicine Search Launcher网站或万维网上的欧洲生物信息学研究所网站上运行。
可以将变化引入核酸序列中，如果核酸序列是编码序列，则其能够导致所编码多肽氨基酸序列的变化。例如，可以使用诱变(例如，位点定向诱变，PCR-介导的诱变)或通过化学合成具有此类变化的核酸分子将变化引入核酸编码序列。此类核酸变化可以导致在一个或多个氨基酸残基处的保守性和/或非保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是指其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的不同氨基酸残基取代(参见例如，Dayhoff等，(1978，在Atlas of Protein Sequence and Structure中，5(Suppl.3):345-352)，其提供了氨基酸取代的频率表)，以及非保守性取代是指其中的氨基酸残基被不具有相似侧链的氨基酸残基取代。
可以将核酸包含在构建体中，还可以将构建体称为载体或质粒。构建体是市售的或者可以采用本领域常规的重组技术生产。含有核酸的构建体可以具有引导和/或调控此类核酸表达的表达元件，以及还可以含有诸如用于维持构建体的那些序列(例如，复制原点、选择标记)。表达元件是本领域公知的，并且包括例如启动子、内含子、增强子序列、应答元件或诱导元件。
向内耳细胞递送核酸的方法
向细胞递送核酸的方法通常是本领域公知的，以及本申请中描述了在体内向内耳细胞递送含有转基因的病毒(还可以将其称为病毒颗粒)的方法。如在本申请中所使用的，可以向受试者施用约108至约1012个病毒颗粒，以及可以将病毒混悬在适宜体积的(例如，10μL、50μL、100μL、500μL或1000μL)例如人工外淋巴液中。
可以使用任意数量的机制将如本申请所述的含有转基因的病毒递送至内耳细胞(例如，耳蜗中的细胞)。例如，通常可以以相对简单(例如，门诊患者)的方式通过圆窗或卵圆窗注射治疗有效量的组合物，该组合物包含如本申请所述的含有一种或多种不同类型的转基因的病毒颗粒。在一些实施方式中，可以在手术过程中(例如，内耳开窗术或canalostomy)将如本申请所述的组合物递送至耳内的适宜位置，所述组合物包含治疗有效数量的含有一种转基因的病毒颗粒，或含有一个或多个不同病毒颗粒的集合，其中在每个集合中的每个颗粒含有相同类型的转基因，但是其中每个颗粒的集合与其他集合相比含有不同类型的转基因。
此外，递送载剂(例如，聚合物)可用于促进药剂穿过鼓膜和/或通过圆窗转移，并且可以将任意此类递送载剂用于递送本申请所述的病毒。参见，例如，Arnold等，2005,Audiol.Neurootol.,10:53-63。
本申请所述的组合物和方法能够向内耳细胞(例如，耳蜗细胞)高效递送核酸。例如，本申请所述的组合物和方法能够将至少80％(例如，至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的转基因递送至以及在内毛细胞中表达，以及将至少80％(例如，至少85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％)的转基因递送至以及在外毛细胞中表达。
如在本申请中所示，使用含有Anc80衣壳蛋白的AAV递送的转基因的表达能够使得内毛细胞(IHC)、外毛细胞(OHC)、螺旋神经节神经元、血管纹、前庭毛细胞和/或前庭神经节神经元(例如，Atoh1、NF2)再生，以使得听觉或前庭功能在一段延长的时间内(例如，数月、数年、数十年、终生)恢复。
如在WO 2015/054653中所讨论的，可以使用血清阳性率和/或相对于常规AAV(即，不含Anc80衣壳蛋白的AAV)的中和程度对含有Anc80衣壳蛋白的AAV进行表征。本领域理解的血清阳性率是指血清阳性群体中(即，已暴露于特定病原体或免疫原)受试者的比例，以及根据群体中产生针对特定病原体或免疫原的抗体的受试者数除以所考察群体中个体的总数计算。确定病毒的血清阳性率是本领域常规进行的并且通常包括使用免疫测定确定特定个体群体的样品(例如，血样)中一种或多种抗体的阳性率。此外，可以使用几种方法确定血清样品中中和抗体的程度。例如，中和抗体测定法测量与不含抗体的对照样品相比含有中和50％或更多感染的抗体浓度的实验样品的滴度。亦参见，Fisher等(1997,NatureMed.,3:306-12)和Manning等(1998,Human Gene Ther.,9:477-85)。代表性的常规AAV包括但不限于AAV8(或含有AAV8衣壳蛋白的病毒)和/或AAV2(或含有AAV2衣壳蛋白的病毒)。
Usher综合征
人Usher综合征(USH)是一种可导致失聪和失明的罕见遗传病。作为一种常染色体隐性遗传病，其在美国影响了16,000至20,000人，并且导致3至6％的幼儿早期耳聋。根据症状的严重程度将Usher综合征分为三种临床亚型(USH-1、-2和-3)。USH1是最严重的形式。受USH1影响的患者患有先天性双侧深度感音神经性听力丧失、前庭无反射和***前视网膜色素变性(视网膜杆和锥功能的进行性、双侧、对称变性)。除非配备人工耳蜗，否则个体通常不具备生成语音的能力。尽管目前对Usher患者尚无生物学治疗，但是早期重新引入野生型缺陷基因可能使得疾病逆转。
6种Usher基因与USH1相关：MYO7A(myosin 7a)、USH1C(harmonin)、CDH23(钙粘蛋白23)、PCDH15(原钙粘蛋白15)、SANS(sans)和CIB2(钙和整理蛋白结合蛋白2)。这些基因编码参与内耳中毛束形态发生的蛋白并且是相互作用组的一部分(参见例如，Mathur&Yang,2015,Biochim.Biophys.Acta,1852:406-20)。Harmonin位于USH1相互作用组的中心，其在此与其他Usher 1蛋白结合。由于其具有PDZ(PSD-59 95/Dlg/ZO-1)相互作用结构域，因而已提出harmonin具有作为支架蛋白的功能。体外结合研究表明，所有其他已知USH1蛋白与harmonin的PDZ结构域结合，两种USH2蛋白、usherin和VLGR1也是如此。USH1C基因由28个外显子组成，其编码harmonin的10种可选的剪接形式，根据蛋白结构域的组成将其分成三个不同亚类(a、b和c)。三个同种型在PDZ蛋白-蛋白相互作用结构域、卷曲螺旋(CC)结构域和富含脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸(PST)的结构域数量上不同。
USH1蛋白位于机械感觉毛束中毛细胞的顶部，其由数百个通过很多胞外连接相互连接的静纤毛组成。钙粘蛋白23和原钙粘蛋白15是Usher基因的产物(分别为USH1D和USH1E)，其在位于静纤毛远端形成尖端连接。Harmonin-b与CDH23、PCDH15、F-肌动蛋白及其自身结合。发现其在毛细胞中尖端连接***点附近的静纤毛尖端处，认为其在毛细胞中的转导和适应中发挥作用。Harmonin-b在出生后早期阶段表达，但是其在耳蜗和前庭中的表达在出生后第30天(P30)左右减少。Harmonin-a还与钙粘蛋白23结合并且发现其存在于静纤毛中。最新报道揭示了harmonin-a在突触中的另一个作用，其与Cav1.3 Ca2+结合通过泛素依赖性通路限制通道的可用性。
在过去的十年中，已经鉴定或设计了几种针对Usher综合征的小鼠模型，其中七种影响harmonin。其中，仅有一个模型(Ush1c c.216G>A模型)再现了人Usher综合征听觉和视网膜缺陷的特征。Ush1c c.216G>A是敲入小鼠模型，该模型由于存在与在French-AcadianUSH1C患者队列中发现的类似点突变影响所有常规harmonin同种型的表达。该突变在Ush1c基因的外显子3末端引入隐蔽剪接位点。使用这种隐蔽剪接位点产生具有35bp缺失的移码转录物，并导致缺乏PDZ、PST和CC结构域的严重截短的蛋白质翻译。纯合c.216AA敲入小鼠在1月龄时就具有严重听力丧失，而杂合c.216GA小鼠不存在任何异常表型。c.216AA小鼠的耳蜗组织学检查发现在P30时中部和基回出现毛束解离、异常细胞行以及内外毛细胞丧失。
特别地，可以使用本申请所述的亲代AAV衣壳蛋白联合harmonin转基因治疗被诊断为患有Usher综合征相关性耳聋的患者(例如，USH1C-相关的耳聋)以成功转导毛细胞并驱动harmonin剪接形式的表达和正确定位，从而重新引入野生型harmonin。而且，本申请已证实，早期出生后圆窗膜注射如本申请所述的含有亲代AAV衣壳蛋白的AAV成功恢复了纯合c.216AA小鼠的听觉和前庭功能。注射小鼠中听觉功能的恢复与编码野生型harmonin的mRNA表达的恢复以及保持了毛束形态和机械传导相关。
TMC1/TMC2
在导致耳聋的TMC1中已鉴定出超过40种不同突变。将其细分为35种隐性突变和5种显性突变。大部分隐性突变导致严重的、先天性听力丧失(例如，DFNB7/11)，但少数导致后期发病的、中度至重度听力丧失。所有显性突变都会引起进行性听力丧失(例如，DFNA36)，其在青少年时期开始发病。特别地，可以将如本申请所述的包含Anc80衣壳蛋白的AAV载体用于递送非突变的(例如，野生型)TMC1序列或TMC2序列，从而阻止听力丧失(例如，进一步的听力丧失)和/或恢复听力功能。
根据本公开内容可以使用本领域公知的常规分子生物学、微生物学、生物化学和重组DNA技术。这些技术在文献中有充分说明，并在下面的某些实施例中举例说明。下述实施例将对本发明进行进一步描述，这些实施例不限制在权利要求中描述的方法和物质组成的范围。
实施例
第1部分：高效的耳蜗基因转移
实施例1—含有亲代AAV衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)导致安全和有效的耳蜗基因 转移
在实施例1中使用了下述和方法和材料。
病毒载体
如此前所述(Zinn等，2015,Cell Reports,12:1056-68)在Massachusetts Eyeand Ear的Gene Transfer Vector Core(vector.meei.harvard.edu)制备具有CMV驱动的eGFP转基因和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)表达盒的AAV2/1、2/2、2/6、2/8、2/9和AAV2/Anc80L65。通过addgene.com获得AAV2/Anc80L65质粒试剂。
体外外植物培养物
为了按照早期出版物(Dilwali等，2015,Scientific Reports,5:18599)中的描述进行评估，在出生后第4天使用两个品系的小鼠幼崽制备了共计156个耳蜗外植物培养物。简言之，断头后取小鼠颞骨，并剖出与螺旋神经节神经元区域相连耳蜗作为器官型外植物进行培养。每个耳蜗获得两个标本，一个由顶部以下构成(“顶部”)，一个由基回以上构成(“基部”)。对于每个血清型，接种最少4个(CBA/CaJ，48h)、2个(CBA/CaJ，48h+5d)、3个(C57BL/6，48h)和2个(C57BL/6，48h+5d)基部和顶部标本。将在培养期间没有保持耳蜗形态的标本剔除。选择样品编号以显示转导的变异性并作为选择进行进一步的体内评价的基础。使用50μl含1010GC AAV的培养基(98％经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)，1％氨苄西林，以及在前12小时内加入1％ N2补充剂，外加1％胎牛血清(FBS))培养外植物48h。对于48h+5d的条件，在另外5天使用不含AAV的新鲜培养基替代含AAV的培养基。根据此前所述(Kesser等，2007,Gene Ther.,14:1121-1131)，培养来自从4名已同意的行前庭神经鞘瘤切除术成年患者获得的卵圆囊的人前庭上皮，将其暴露于1010GC AAV 24小时并在培养基中培养10天，随后将组织固定并使用鬼笔环肽染色和成像。研究已经Surrey Borders NRESCommittee London(卫生研究局)批准，编号为11/LO/0475。
动物模型和一般方法
野生型C57BL/6J和CBA/CaJ小鼠来自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME)，并且任一性别的动物估计以50/50比例用于实验。通过获得标本和技术可行性确定用于体外和体内转导测定以及随后的终点的每项实验的组别规模。在随后使用不同载体批次的实验中对关于Anc80转导已报告的观察结果进行定性验证(由于所获得标本的独特和有限的性质，人前庭组织转导除外)。由于所获得标本是有限的且所报告结果的定性性质，因而未对血清型之间的转导效率进行统计学分析。
CSF和血液取样
在一个终末程序中从小脑延髓池(Lui&Duff,2008,J.Visualized Exp.,21:e960)采集脑脊液(CSF)和通过胸腔切开术进行心内取血。通过微毛细管，将每只动物最大量(可达5μL)的透明CSF收集到体积为60μL的PBS中，因初始稀释度略有不同，随后在实验开始之前加入对照PBS进行标准化处理。在1.1mL Z-Gel微量管(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)中获得血液样品后，将其以8,000rpm离心8分钟，并将血清与CSF样品(在PBS中)一起储存在-80℃直到进一步使用。
实施例1A—组织学分析
在5至29天随访期后，处死动物并根据此前的报道制备耳蜗全组织标本包埋物(Sergeyenko等，2013,J.Neurosci.,33:13686-94)。使用针对肌球蛋白7A(Myo7A,#25-6790Proteus Biosciences,Ramona,CA,1:400)和β-微管蛋白(TuJ1,#MMS-435PBiolegend,San Diego,CA,1:200)的抗体，以及其相应的二抗(Alexa Fluor 555抗-小鼠抗体和Alexa Fluor 647抗-家兔抗体，#A-21422and#A-21245 Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,1:1000)对耳蜗全组织标本包埋物和外植物进行染色(Dilwali等，2015,Scientific Reports,5:18599)。通过共聚焦显微镜观察标本的载玻片。使用相同实验设置获得给定实验系列的每个图像，根据具有最强eGFP信号的标本选择激光强度以防止荧光饱和。获得用于概览图像的Z-协议栈以及用于Corti氏器官和螺旋神经节神经元(SGN)区域的放大图。使用AMIRA进行3D重建以便更准确地地确定SGN转染情况。
图1和图4中的结果显示了通过分别对在C57BL/6和CBA/CaJ中编码eGFP的AAV表达情况的监测获得的5种血清型的趋向性。值得注意的是，在暴露于Anc80的耳蜗培养物中eGFP的表达在定性上更加明显，其在很多耳蜗细胞类型中具有明显的表达。
实施例1B—eGFP表达的定量
对于体外数据，对耳蜗进行人工定量确定eGFP-阳性内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)的百分比，通过在每个标本基部和顶部样品1个或2个100μm切片中eGFP阳性细胞数除以外毛细胞或内毛细胞总数确定。根据其eGFP表达情况对耳蜗外植物中所有可见SGN进行评价。以从0(无表达)至3分(最强信号)进行评分的定量方式(如上所示，针对每个实验系列进行校正)评估螺旋缘和支持细胞的面积。使用不含AAV的对照样品以排除自发荧光。数据表明在这两个所检测小鼠品系的顶部和基部中Anc80以60至100％之间的效率靶向IHC和OHC。与AAV2相比，Anc80显示出一致的且在定性上更加明亮的IHC和OHC eGFP表达(图1和图4)。
为了控制可能导致的在2天(早期)时间点低估表达在不同AAV之间表达起始时的潜在差异，进行了更长的实验。在相同条件下转导一组新的耳蜗，使用AAV培养48h后，弃去含载体的外植物培养物的培养基，并换成维持培养物存活的新鲜培养基再培养5天(称为48h+5d)。在针对AAV2和Anc80的这项更长期的研究中观察到类似的表达模式。注意到在CBA/CaJ小鼠中AAV6、8和9的表达适度增加，特别是在基回处(图1的J、K和图4的I、J)。其他细胞类型被所有血清型所靶向，其中边缘比支持细胞更加容易，其次是SGN(图5、6和7)。一致的是，由具有更亮的eGFP荧光所证实，Anc80转导具有更高的效率和更强的表达。
实施例1C—体内注射
使用斜面玻璃显微注射移液管通过圆窗膜(RWM)向小鼠幼崽(P0至P2)注射。在P-2000移液管拉制仪(Sutter Instrument,Novato,CA)上用玻璃毛细管拉制出移液管，并使用微量移液斜切机(Sutter Instrument,Novato,CA)斜切(尖端直径～20μm，28°角)。使用无菌拭子将手术部位(左乳突突起)覆盖EMLA乳膏(利多卡因2.5％和丙胺卡因2.5％)以外用进行镇痛。手术前在38℃温热垫上维持体温。通过放入冰/水中2-3分钟快速诱导低温直至其意识丧失对幼崽进行麻醉，并在手术期间在冷板上保持该状态5-10分钟。通过使用必妥碘擦洗并使用70％乙醇重复擦拭三次对手术部位进行消毒。行耳后切口以暴露透明鼓泡，手动推进微量移液器通过鼓泡和覆盖的筋膜，并用微量移液器尖端穿过RWM。在1min内手动将约1μL病毒单侧注射进入5(AAV1)、4(AAV2)、2(AAV8)、1(AAV6)、3(Anc80)只C57BL/6动物的左耳。为了控制与特定载体制备相关的因素(如质量和纯度)，在随后的研究中使用来自独立制备的不同载体批次确证了Anc80的结果，这证实了我们在此呈现的定性结果(数据未显示)。以非盲方式对每组进行注射。有时会出现注射针***过深、过浅或角度错误的情况。如果中耳或内耳结构有可见损伤，则将样品从进一步分析中排除。注射成功率的范围在～50％至～80％之间，其取决于注射者的经验水平。注射后，使用6-0号黑色单丝缝合线(Surgical Specialties,Wyomissing,PA)关闭皮肤切口。随后将幼崽送回38℃温热垫上放置5-10min，然后将其放回到母亲处进行哺乳。
与此前报道一致，AAV1以中度至较高效率转导IHC(图2的A，B)。这些研究表明AAV2、6和8靶向较低数量的IHC，仅AAV8在顶部和基部显示出大致相同的转导(图2的B)。而且，与此前报道一致，对于所检测的所有常规AAV血清型，均为最低的OHC转导(<5％)。然而，在低20倍(针对AAV1)至3倍(针对AAV2)的剂量下，Anc80转导接近100％的IHC和～90％的OHC(图2的A-C)。对于所有血清型在相同剂量1.36x 1012GC下的转导使得大量IHC和OHC被Anc80所转导，但是通过表面荧光显微镜观察活细胞成像后发现AAV1、2和8仅极少量靶向IHC并且在OHC中未观察到(图8的C，D)。
随后将经Anc80转导的样品固定、染色并通过共聚焦显微镜成像，结果揭示了毛细胞转导的剂量依赖性(图8的E)。无以伦比的OHC靶向性(图2的C，图8)表明，与其他AAV相比，Anc80具有在性质上独特的转导生物学。在共计3只Anc80注射的小鼠中，从基部到顶点的整个耳蜗中发现了相似水平的Anc80转导(图2的A，B，C)。耳蜗顶部的低放大倍数视图(图8的A)显示了远离注射部位的位置具有较强的eGFP表达。基底的高放大倍数图像揭示了100％IHC和95％ OHC被转导(图8的B)。
在一些动物中，在对侧未注射耳中发现了强大的eGFP表达(图9)。在小鼠中，耳蜗导水管专门提供了从耳蜗外淋巴进入CSF、对侧导水管和对侧耳蜗的流体路径。因此，还研究了通过RWM注射的Anc80-eGFP是否能够转导脑中的神经元。实际上，小脑的横截面显示在小脑浦肯野神经元中具有较强的eGFP表达(图10的A，B)。
由于一些形式的遗传性耳聋也会导致前庭功能障碍，因此Anc80可能是将基因递送到人前庭器官的有用载体。为了研究这种可能性，从行前庭神经鞘瘤切除术的4名成年患者中收集人前庭上皮；如此前所述将感觉上皮置于培养基中(Kesser等，2007,Gene Ther.,14:1121-31)。对于已转导样品，图3的C表明在毛细胞和支持细胞中的整个人前庭上皮中具有较强的eGFP荧光。在图3的D中使用Myo7A复染的上皮的高放大倍数视图显示83％(19/23)的Myo7A-阳性毛细胞也是eGFP-阳性的，这表明Anc80能够有效转导小鼠和人毛细胞。
实施例1D—免疫学测定
通过中和测定确定了CSF和血清中Anc80的抗体滴度(Zinn等，2015,CellReports,12:1056-68)。使用96孔板形式，将热灭活的CSF或血清样品(如上所述收集)在无血清培养基(Life Technologies,Carlsbad,CA)中连续稀释，然后使用Anc80-荧光素酶(106GC/孔)在37℃下处理1小时。然后将样品/Anc80-荧光素酶混合物转移到HEK293细胞上，该细胞已在前一天用腺病毒进行了处理(MOI 20)。在37℃下1小时后，将经稀释的血清培养基(1份无血清，2份含血清)加入各孔中。
2天后，使用裂解缓冲液(Promega,Madison,WI)对细胞进行处理并在-80℃下冷冻30分钟。然后将细胞在37℃下解冻15分钟，随后使用底物缓冲液处理(Tris-HCl，MgCl2，ATP(Life Technologies,Carlsbad,CA)，D-荧光素(Caliper Life Sciences,Hopkinton,MA))。使用Synergy BioTek Plate Reader(BioTek，Winooski，VT)读取发光输出。
在测定和取样灵敏度的水平下，在注射小鼠的血清中检测到了针对载体低水平的中和，但是在CSF中没有检测到(图10的C)。
实施例1E—毛细胞电生理学
将耳蜗切下，封装在玻璃盖玻片上并在配有63x水浸物镜和微分干涉反差光学器件的Axio Examiner.A1正置显微镜(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)上观察。在室温下(22℃-24℃)在含有下述的标准溶液(以mM计)中进行电生理记录：在MEM(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中含137NaCl、5.8KCl、10HEPES、0.7NaH2PO4、1.3CaCl2、0.9MgCl2和5.6D-葡萄糖，维生素(1:100)和氨基酸(1:50)(pH 7.4；～310mOsm/kg)。
记录电极(3–4MΩ)使用R-6玻璃(King Precision Glass,Claremont,CA)拉制并且填充有含有下述的细胞内溶液(以mM计)：140CsCl、5EGTA-KOH、5HEPES、2.5Na2ATP、3.5MgCl2和0.1CaCl2(pH 7.4；～280mOsm/kg)。使用Axopatch 200B(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)采用全细胞、紧封接技术记录机械传导电流。将毛细胞保持在–84mV。使用低通贝塞尔滤波器以5kHz过滤电流，使用12位采集板(Digidata 1440A,Molecular Devices,Sunnyvale,CA)以≥20kHz数字化，并使用pCLAMP 10软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)记录。
使用安装在由LVPZT放大器(E-500.00,Physik Instrumente,Karlsruhe,Germany)驱动的PICMA芯片压电致动器(Physik Instrumente,Karlsruhe,Germany)上的刚性玻璃探针偏转来自IHC和OHC的毛束并使用8-极点贝塞尔滤波器(Model 3384filter,Krohn-Hite Corporation,Brockton,MA)以40kHz过滤以消除残留的移液管共振。设计刚性玻璃探针以适于用于整束记录的毛细胞静纤毛阵列的凹面(OHC的直径为3-4μm和IHC的直径为4-5μm)。对于>P10时的全细胞电生理记录，在P5-7时解剖耳蜗组织并且在37℃，5％CO2下使用含1％ FBS的MEM(1X)+GlutaMAXTM-I培养基孵育长达30天。
由P7 OHC和P35 IHC的毛束偏转引起的代表性电流显示了eGFP阳性和eGFP阴性对照细胞之间在幅度、灵敏度或动力学方面不存在差异(图2的D)。从耳蜗的所有区域以及从暴露于Anc80后1周至5周之间的年龄中记到51个eGFP阳性和52个eGFP阴性毛细胞。在所有情况下，应答与野生型无法区分(图2的E)，这证实了Anc80转导对感觉细胞功能没有不利影响。
实施例1F—听力测试
如此前所述(Askew等，2015,Science Translational Med.,7:285ra108)收集听觉脑干应答(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)数据。DPOAE是对正确的耳蜗放大和调谐的测定并且是外毛细胞活力的灵敏度量(Guinan等，2012,Hearing Res.,293:12-20)。在麻醉小鼠中检测的刺激在5.6、8、11.3、16、22.6和32kHz的频率下在10至90dB之间的声压级下变化。在P28-P30分析4只Anc80-注射耳和4只未注射耳以及1只具有注射损伤但无EGFP荧光的阴性对照耳。
绘制了引起ABR所需的最小声阈值(图2的F)并且结果表明在注射和未注射耳之间的阈值没有差异。组织学分析表面在所有4只注射耳中均具有较强的eGFP荧光(数据未显示)。在一种情况下，没有eFGP-阳性细胞和ABR阈值升高(图2的F)，提示注射失败并且针头可能已经破坏了耳蜗导管并导致永久性损伤。尽管Anc80-eGFP具有强大的外毛细胞转导作用，但是相对与未注射的对照耳，未见DPOAE阈值的差异(图2的G)。因此，来自ABR和DPOAE的数据表明RWM注射、Anc80转导以及在IHC和OHC中的转基因表达对于听觉功能均是安全的。
实施例1G—转棒测试
在转棒装置上检测了5只C57BL/6小鼠的平衡行为。已知具有受损的前庭功能的小鼠在旋转装置上表现不佳(Parker&Bitner-Glindzicz,2015,Archives Dis.Childhood,100:271-8)。此前的研究强调仅当一只耳朵受到影响时，这种转棒测试能够检测平衡障碍(Fukui&Raphael,2013,Hearing Res.,297:99-105；Geleoc&Holt,2014,Science,344:1241062)。在P1时对3只小鼠进行注射并且在P36时进行检测，在P79时对2只未注射的对照小鼠进行检测。使用下述转棒方案对所有小鼠进行检测。在第1天，将小鼠放在以4RPM转动的转棒上5分钟以训练其平衡。在第2天，对小鼠进行5次检测，每次检测间隔5分钟。对于每次检测，将转棒加速1RPM(Fukui&Rapheal,2013,Hearing Res.,297:99-105)，转棒的初始速率为2RPM。记录直到小鼠从装置上掉落的时间(以秒计)。
由于耳蜗的外淋巴溶液与前庭迷路的外淋巴溶液是连续的，因而评估了是否通过耳蜗RWM进行Anc80-eGFP注射是否会转导前庭感觉器官。事实上，对前庭上皮的全组织标本包埋物显示在卵圆囊的I型和II型毛细胞中具有较强的eGFP表达，卵圆囊是一种对重力和线性头部运动敏感的前庭器官并且其在半规管中，其对转动头部运动敏感(图3的A，B)。因此，为了解决Anc80转导可能影响平衡的安全性问题，使用已确认具有前庭表达的注射小鼠进行了转棒测试，结果表明其前庭功能与未注射对照类似(图11)。
第2部分——使Usher综合征小鼠模型恢复功能的基因疗法
实施例2—Usher综合征的小鼠模型
在实施例2中使用了下述方法和材料。
组织制备
从出生后第0天至第8天(P0至P8)收集Ush1c c.216G>A杂合子或纯合突变小鼠的卵圆囊和Corti氏器官用于进行电生理学研究。通过快速断头处死出生后的小鼠幼崽。切下颞骨并浸泡在补充了10mM HEPES的MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)中(pH 7.4)。如前所述，在不使用酶的情况下分离Corti氏器官。经0.1mg/ml的蛋白酶(蛋白酶XXIV，Sigma)处理10分钟后除去卵圆囊。将切下的器官封装在圆形玻璃盖玻片上。将预先胶合到盖玻片上的一对薄玻璃纤维放置在组织的边缘上，以使其稳定在平坦位置。立即使用组织或将其保存在含1％胎牛血清的培养基中。将培养物保持7至8天并且每2至3天更换一次培养基，将其用于体外涉及病毒载体感染的实验。
动物
Ush1c c.216G>A敲入小鼠来自Louisiana State University Health ScienceCenter。这种在C57BL6背景下的输入品系此前具有Cdh23(Ahl)突变所致的年龄相关的听力丧失。使用趾夹(P8之前)或耳孔(P8之后)以及如此前所述进行PCR(Lentz等，2007,Mutat.Res.,616:139-44)对小鼠进行基因分型。对于所有研究，雄性和雌性小鼠的使用比例大致相等。没有以其他方式进行随机化模式。
病毒载体的产生
从c.216AA突变小鼠耳蜗中分离总RNA(RNAqueous微量试剂盒，Ambion)并使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)进行逆转录。用高保真Platinum Taq DNA聚合酶(Invitrogen)和下述引物通过PCR对trunc-harmonin的cDNA进行扩增：Trunc-harmonin.F(KpnI)GAG GTACCA TGG ACC GGA AGG TGG CCC GAG(SEQ ID NO：9)；Trunc-harmomin.RV(BamHI)CAG GAT CCG GAC AAT TTC ATC CCC TAC(SEQ ID NO：10)。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆387bp的PCR产物，并通过测序对其进行确证。为了产生GFP融合构建体，使用KpnI和BamHI将截短的harmonin片段亚克隆至pEGFP-C1。将NheI-XbaI EGFP::trunc-harmonin cDNA转移进入AAV穿梭载体。将定制载体与AAV2反向末端重复序列(ITR)一起包装进入AAV1衣壳中，其中由CMV启动子驱动转基因表达盒(AAV2/1.CMV.EGFP::trunc-harmomin.hGH，1.92E14gc/m，BCH)。
在我们实验室由Lily Zheng和James Bartles(Zheng等，2010,J.Neurosci.,30:7187-201)(Department of Cell and Molecular Biology,Northwestern University,Feinberg School of medicine,Chicago,IL)此前惠赠的EGFP标签标记的构建体制备Harmonin-a1和Harmonin-b1质粒。Harmonin-a1最初来自于小鼠肾脏和Harmonin-b1是从小鼠耳蜗感觉上皮分离得到的。对Harmonin-a1构建体进行进一步修饰以便在其N末端使用tdTomato取代EGFP标签。将荧光标记和未标记的构建体包装入AAV载体。病毒载体由在Boston Children’s Hospital的病毒核心实验室和在Massachusetts Eye and EarInfirmary的Gene Transfer Vector Core产生。产生了下述载体：AAV2/1.CMV.tdTomato::harmonin-a1 4.33 10^13gc/ml(BCH)；AAV2/1.CMV.EGFP::harmonin-b1 2.73 564 10^14gc/ml(BCH)；AAV2/1.CMV.EGFP-harmonin-a1 2.81 10^12gc/ml(MEEI)；AAV2/1.CMV.EGFP-trunc-harmonin 1.92 10^14gc/ml(BCH)；AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a11.93 10^12gc/ml(MEEI)；AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1 1.74 10^12gc/ml(MEEI)；AAV2/Anc80.CMV.trunc-harm.WPRE 9.02 567 10^12gc/ml(MEEI)。对于体外实验，在存在1％胎牛血清的情况下，将10μl浓缩载体加入在立即解剖组织上的1ml MEM补充培养基中，培养24h。随后将培养物保持长达10天。
圆窗膜(RWM)注射
依照经波士顿儿童医院的机构动物管理和使用委员会批准的动物试验方案#15-01-2878R进行RWM注射。在P0-P1和P10-P12向新生小鼠注射0.8μl-1μl AAV载体。首先使用低温暴露对P0-P1小鼠进行麻醉，使用异氟烷对P10-P12小鼠进行麻醉。麻醉后，行耳后切口以暴露透明鼓泡并使耳蜗可见。使用由微量操纵器控制的玻璃微量注射器通过RWM进行注射(Askew等，2015,Sci.Transl.Med.,7:295ra108)。将注射物质的体积控制在约0.02μl/min，注射10min。采用标准术后护理。在连续的基础上确定体内研究的样本量以优化样本量并减小方差。
电生理学记录
在含有下述的标准人工外淋巴溶液(以mM计)中进行记录：144NaCl、0.7NaH2PO4、5.8KCl、1.3CaCl2、0.9MgCl2、5.6D-葡萄糖和10HEPES-NaOH，调整至pH 7.4和320mOsmol/kg。使用浓缩物(Invitrogen,Carlsbad,CA)加入维生素(1:50)和氨基酸(1:100)。使用配有63x水浸物镜和微分干涉反差光学器件的正置Axioskop FS显微镜(Zeiss,Oberkochen,Germany)从顶表面观察毛细胞。记录移液管(3–5MΩ)使用硼硅毛细管玻璃(Garner Glass,Claremont,CA)拉制并且填充有含有下述的细胞内溶液(以mM计)：135KCl、5EGTA-KOH、10HEPES、2.5K2ATP、3.5MgCl2、0.1CaCl2，pH 7.4。在室温下，在-64mV的钳制电位下，使用全细胞电压钳记录电流。使用Axopatch Multiclamp 700A或Axopatch 200A(Moleculardevices,Palo Alto,CA)采集数据，利用低通贝塞尔滤波器以10kHz滤波，通过12位采集板(Digidata 1322)以≥20kHz数字化，并使用pClamp 8.2和10.5(Molecular Devices,PaloAlto,CA)。使用OriginLab软件离线分析数据，除非另有说明，否则以平均值±标准偏差表示。
统计分析
在每个时间点在每组至少三只小鼠中对待测和对照载体进行评价以确保再现性。在图例中注明了样本量。将成功进行RWM注射的所有动物纳入研究分析中。将注射不成功的那些动物从平均值中排除，但是包括在图例中以供完全公开。根据ABR恢复(阈值>90dBSPL)确定注射成功。使用Origin2016(OriginLab Corporation)进行统计分析。如在文本和图例中所述，数据以平均值±标准偏差(SD)或平均值的标准误差(SEM)表示。使用单因素方差分析(ANOVA)确定平均值之间差异的显著性。
实施例2A—在小鼠Usher模型中的扫描电镜(SEM)
在P7、P18和～P42(6周)对对照和突变小鼠的Corti氏器官进行SEM。P18 SEM与华盛顿大学的Edwin Rubel博士合作进行。将内耳在含4％戊二醛的0.1M磷酸钠中于4℃下固定过夜。次日将标本在0.1M磷酸钠缓冲液(PB)中洗涤三次并在冰浴中在含1％四氧化锇的0.1M PB中后固定30min。然后在0.1M PB中洗涤标本并通过梯度乙醇逐级脱水：35％、70％、95％和100％(x2)。将样品在临界点干燥，置于SEM柱上并使用Au/Pd溅射涂覆。使用JEOLJSM-840A扫描电子显微镜进行SEM分析。针对P8和6周阶段进行类似的制备。使用补充了2mMCaCl2的含2.5％戊二醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲液(Electron Microscopy Sciences)将Corti氏器官外植物在室温下固定1h。将标本在丙酮中逐级脱水，使用液态CO2进行临界点干燥，溅射涂覆4-5nm的铂(Q150T,Quorum Technologies,United Kingdom)以及使用场发射扫描电子显微镜(S-4800,Hitachi,Japan)观察。
纯合c.216AA突变小鼠是耳聋的并显示出表现为转圈和摇头行为的前庭障碍特征。此前的工作(Lentz等，2010,Dev.,Neurobiol.,70:253-67)描述了在P30时在耳蜗基部处出现显著的内毛细胞和外毛细胞退化。1月龄时，在中回处也观察到退化和毛细胞死亡，但是器官的顶部保持较好。假设在内耳器官发育过程中逐渐出现毛细胞退化，为了评估早期阶段毛细胞的存活，在P8和P18时对Corti氏器官进行SEM分析。在这些年龄中，杂合c.216GA小鼠的外毛细胞(OHC)和内毛细胞(IHC)被保留并且其毛束正确定向(图12的A-C，G，I和图19的A-C，K)。然而，在所分析的这两个年龄中，纯合c.216AA小鼠在Corti氏器官全长的毛束均出现显著解体(图12的D-F，H，J-L和图19的D-J，L)。在P8时，在基部、中部和顶部区域的IHC束略显杂乱(图12的D-F，J)。很多IHC束呈现出波浪状图案以及静纤毛行略显杂乱(图12的J)。尽管c.216AA突变小鼠的很多OHC具有保存完好的毛束(图12的H，K)，但是沿着器官零星可见明显的片段化和解体的毛束(图12的D-F，L)。尽管如此前报道的那样(Lentz等，2013,Nat.Med.,19:345-50)大多数毛细胞仍存在，但是在P18时破坏更加明显(图19的D-F)。
为评估在使用harmonin-b1基因疗法的小鼠中毛束的形态，制备6周龄未经治疗(或未经注射)和经治疗(或经注射)小鼠的颞骨用于SEM分析。未经治疗c.216AA小鼠在器官的基部和中部区域显示出严重的毛细胞丧失(图18)。在基部区域中，OHC在第一排中大多不存在，在第二和第三排中零星存在。在器官的中部区域中，第一排也基本上不存在OHC。在顶部末端中观察到更轻微的表型。高放大倍数SEM还显示了c.216AA突变小鼠在器官的整个长度上均出现了严重的毛束解体。值得注意的是，在6周龄c.216AA小鼠中，在所有三排静纤毛保留的典型阶梯结构中没有观察到毛束。而相反的是，c.216AA小鼠的毛细胞显示出杂乱的毛束，沿着第一排具有回缩的静纤毛，第二排是异常且保持非常完整的排。而相比之下，在使用harmonin-b1治疗的c.216AA小鼠中观察到毛细胞丧失减少和正常的毛束。由在视图的典型视野中存在或不存在毛束估计毛细胞技术。
数据表明在注射小鼠中从器官的基部到顶部的毛细胞数非常显著的被保持，在基部为40至79％，在中部为68至95％以及在顶部为93至99％(来自n＝4只c.216AA小鼠耳时n＝1824个细胞以及来自n＝2只挽救的c.216AA耳时n＝792个细胞)。尽管在注射harmonin-b1的小鼠中异常毛束仍是明显的，但是大部分毛束具有三排静纤毛且其形态与其杂合对照几乎无法区分(图18)。
实施例2B—在Usher小鼠模型中的FM1-43成像
使用细胞外记录溶液稀释制备5微摩FM1-43(Invitrogen)并将其用于组织10秒，然后在细胞外记录溶液中洗涤3次以除去过量染料并防止通过胞吞作用摄取。5分钟后，使用配有落射荧光光源、微分干涉反差光学器件和FM1-43滤光片组(Chroma Technologies)的Zeiss Axioscope FS通过水浸20x、40x和63x物镜对胞内FM1-43成像。使用CCD相机和Argus-20图像处理器(Hamamatsu)扣除背景荧光后以16位捕获图像。对采集的所有图像保持相同的增益和对比度设置并使用Adobe Photoshop或Image-J软件进行离线分析。
为评估在早期阶段的毛细胞功能，分析了P4时立即解剖内耳器官中FM1-43的摄取情况。在短暂应用(<10秒)后，FM1-43渗入具有功能性机械敏感通道的毛细胞。在c.216GA小鼠的毛细胞中观察到了均匀的FM1-43摄取(图13的A)，但是c.216AA小鼠OHC的摄取水平不同，表明一些而非全部细胞保留了功能性转导通道(图13的B)。在耳蜗的整个长度上进行了类似的观察。未发现音质分布的差异。在出生后第一周，c.216AA小鼠IHC中的FM1-43摄取也减少(数据未显示)。还在突变小鼠的卵圆囊毛细胞中评估了FM1-43的摄取。有趣的是，在c.216AA突变小鼠中，在P6时摄取仅限于沟纹以外区域，表明静息时沟纹区域的毛细胞缺乏机械敏感性通道开放(图13的C，D)。
实施例2C—在Usher小鼠模型中的机械刺激
OHC和IHC：通过安装在由400mA ENV400放大器(Piezosystem Jena Germany)驱动的一个524维PICMA芯片压电致动器(Physik Instruments,Waldbronn,Gernamy)上的刚性玻璃探针传输机械刺激。对探针的尖端进行烧制抛光(Fire polisher,H602,WorldPrecision Instruments Inc.,Sarasota,FL)以适于静纤毛束(Stauffer&Holt,2007,J.Neurophysiol.,98:3360-9)。通过施加电压阶跃来引起偏转，该电压阶跃在50kHz下用8-极点贝塞尔滤波器(Khron-Hite，528Brockton，MA)过滤以消除残留的移液管共振。使用C2400CCD相机(Hamamatsu,Japan)监控毛细胞偏转。使用电压阶跃校正刺激探针在其静息位置±2μm附近运动。记录探针的视频图像以确认没有轴外运动并校正探针运动(空间分辨率～4nm)。10-90％探针的上升时间为～20μsec。
VHC：通过安装在压电双压电晶片元件上的刚性玻璃探针传输机械刺激。通过将动纤毛温和地吸入刺激移液管中进行偶联。通过向压电装置施加电压阶跃来引起偏转，该压电装置由串联安装并直接耦合到刺激探针的两个双压电晶片组成。电压阶跃由pClamp 8.0软件控制，并在1kHz下用8极点贝塞尔滤波器(Khron-Hite,Brockton,MA)过滤。使用C2400CCD相机(Hamamatsu,Japan)监控毛束偏转。实验之前，将刺激探针的运动校正为在其静息位置附近(±2μm)。
在出生后第一周期间，听觉和前庭上皮保留了机械敏感性毛细胞。包括一些具有相对正常形态的毛细胞(图12)。在Corti氏器官中，从P3至P6c.216AA小鼠耳蜗的中部和顶回获得了记录，这些记录来自于具有看似正常的毛束和具有更严重破坏的毛束的毛细胞。在c.216AA突变体中，OHC保留了机械敏感性，但是其应答的幅度显著降低，由～63％降至170±80pA(n＝24；p<0.001，图13的E，F，G)。在c.216AA小鼠的OHC中观察到了宽泛的应答幅度，其在31至292pA之间。当根据毛束形态对数据分组时观察到了显著的差异(p<0.01)：在严重解体毛束的突变毛细胞中诱发的电流小于更多地保留了毛束的突变细胞中诱发的电流，其分别为120±65pA(n＝9)和201±74pA(n＝15)。尽管电流幅度降低，但是毛细胞对机械位移的应答保持了与杂合c.216GA小鼠相似的性质。使用二阶玻尔兹曼方程拟合刺激应答[I(X)]曲线(图13的F)，并使用拟合确定10-90％的工作范围(图20的B)。在从c.216GA和c.216AA记录的OHC之间没有观察到工作范围的显着差异(p＝0.054)。类似地，尽管在DIC显微镜下观察到c.216AA突变小鼠IHC的毛束为轻度破坏，但是在P6时的传导电流显著降低(图13的E，F，G)。在-64mV的钳制电位下，在杂合c.216GA IHC中的最大传导电流(P6-P7)平均为587±96pA(n＝21)，但是在c.216AA IHC中下降了46％，变为316±127pA(n＝19；p<0.001)。在c.216AA突变小鼠的IHC中测得工作范围显著降低(p<0.01)(图20的G)。
将适应定义为在存在恒定束偏移的情况下的传导电流下降，其也存在于c.216AA突变小鼠中。使用双指数拟合分析适应动力学以确定快速和慢速组分。尽管c.216AA突变小鼠IHC和OHC中的这两种组分均减慢，但是仅慢速组分的差异具有显著性(在OHC中p<0.05，和在IHC中p<0.001；图20的C，D，H，I)。另一方面，在Popen＝0.5时测得的适应程度，在c.216AA的OHC和IHC中显著低于在c.216GA的毛细胞中(图20的E，J；p<0.001)。总之，这些结果表明，在c.216AA小鼠的内毛细胞和外毛细胞中机械敏感性受到略微受损，并且重要的是这两种细胞类型在出生后第一周存活，这是基因疗法和恢复细胞功能的先决条件。
在前庭毛细胞中，在c.216AA小鼠中也观察到机械传导电流降低。在沟纹以外的区域中，与c.216GA的电流231±53pA(n＝8，P6-P7)相比，c.216AA电流显著降至109±30pA(n＝9，P5-P7)(p<0.001)(图13的E，F，H)。在沟纹区域仅记录到非常小的电流或无电流(6±13pA，n＝6，P5-P7)，这与在该区域缺乏FM1-43摄取一致(见下文；图13的C，D)。尽管通过DIC显微镜大体上显示了卵圆囊毛束保持完好，但是在沟纹以外和沟纹中的毛细胞的传导电流分别出现显著降低或不存在。因此，除了沟纹区域以外，这些结果表明转导装置在突变小鼠中正确组装和靶向，但是在新生小鼠中功能性复合物的数量减少。
接下来，对暴露于驱动harmonin表达的AAV载体的c.216AA毛细胞的功能进行了评估。为了增强使用外源性harmonin进行功能挽救的可能性，将由CMV启动子引导的未标记harmonin-a1或harmonin-b1编码序列包装入称为Anc80(Zinn等，2015,Cell Rep.,12:1056-68)的AAV衣壳蛋白中。如本申请所示，Anc80衣壳蛋白在体内转导100％的IHC和80-90％的OHC。据推测，harmonin-b是在IHC和OHC中的机械传导所需要的以及是这两种细胞类型的听觉功能所必需的。RWM注射AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1(0.8μl，1.9×10^12gc/ml)以及单独的AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1(1.7×10^12gc/ml)+AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1(0.5μl+0.5μl)的混合物，并且在治疗后2周评估机械传导应答情况。
在耳蜗骨化之前，在P5-P6时提取组织，并且在培养基中保持10天。尽管成熟OHC(>P10)不能在离体记录条件下存活，但是在相当于P14-P16时从IHC中获得了稳定的电生理记录。结果见图15。尽管来自未注射小鼠的IHC在P16时显示出了显著的传导电流降低(79±43pA，n＝8)，但是在接受AAV治疗的小鼠中感觉传导的恢复是明显的。在P1时在注射小鼠中观察到了显著的恢复(***P<0.001)，使用harmonin-b1或者b1和a1联用时其各自的平均最大传导分别为388±66pA(n＝15)和352±28pA(n＝7；图15的C)。使用harmonin-b1治疗后传导电流的幅度与对照c.216GA小鼠相比不存在显著性差异。将harmonin-b1和harmonin-a1共同注射没有显著改变恢复的水平。这些结果表明在早期阶段通过RWM注射递送外源性harmonin-b1能够在IHC中恢复机械传导。
实施例2D—在Usher小鼠模型中的共聚焦成像
为了从P0-P8的出生后小鼠中制备用于共聚焦成像的组织，使用4％多聚甲醛(PFA)固定15分钟。使用0.01％triton透化并使用Alexa Fluor鬼笔环肽(Invitrogen,1/200)复染以标记肌动蛋白丝。在LSM700 Zeiss共聚焦显微镜上获得图像。在周龄略大的小鼠中(4至8周)，将小鼠处死后取出颞骨并将其置于4％ PFA中1小时，随后使用120mM EDTA脱钙24至36小时。然后分离感觉上皮并如上所述注射用于免疫染色。使用小鼠抗-CTBP2(BDbioscience#612044,1/200)孵育48小时并使用Alexa Fluor山羊抗-小鼠(1/200)在4℃下复染过夜以标记带状突触。使用Zeiss LSM 710激光共聚焦显微镜(IDDRC Imaging Coregrant P30 HD18655)采集图像并使用Zeiss LSM图像浏览器4.2处理。
此前的工作揭示了在感觉毛细胞中harmonin以两种可选的剪接形式表达。为了评估AAV载体驱动外源性harmonin剪接形式表达的能力，将来自新生c.216AA和野生型(C57BL/6J)小鼠的卵圆囊和Corti氏器官暴露于编码与harmonin-b1的N-末端融合的eGFP(eGFP::harmonin-b1)或与harmonin-a1的N-末端融合的tdTomato(tdTomato::harmonin-a1)的AAV2/1载体。在体外或在体内通过RWM注射(1μl)在P1时应用载体。当在体外应用时，将P0-P1组织与载体孵育24小时并且保持培养1周。共聚焦图像表明野生型、c.216GA和c.216AA小鼠的毛细胞均成功转导(图14的A-C，E)。EGFP::harmonin-b1信号在VHC(图14的A)、IHC和OHC(图14的B，C)中静纤毛的尖端处是明显的。P60时，在P1注射小鼠耳蜗基部的OHC和IHC中也检测到了EGFP信号(图14的D)。在听觉毛细胞的基部检测到了TdTomato::harmonin-a1(图14的E)。使用带状突触标记物CTBP2的共染色显示通常在P7 IHC中存在共定位(图14的E)，而在P7卵圆囊中无共定位(数据未显示)。
外源性融合构建体的定位与此前的工作一致，在该工作中将harmonin-b定位于静纤毛的远端，在尖端连接***附近，以及将harmonin-a定位于突触。
实施例2E—听觉脑干应答(ABR)和畸变产物(DPOAE)
从用甲苯噻嗪(5-10mg/kg i.p.)和***(60-100mg/kg i.p.)麻醉的小鼠记录ABR和DPOAE。将皮下针状电极***皮肤：a)两耳之间的背侧(参比电极)；b)左耳廓后面(记录电极)；和c)动物臀部的背侧(接地电极)。修剪耳廓基部的通道以暴露耳道。对于ABR记录，向耳道和听力设备(EPL Acoustic system,MEEI,Boston)提供5毫秒的短音。在基于PC的数据采集***(EPL,Cochlear function test suite,MEEI,Boston)中使用模拟-数字板将应答放大(10,000倍)、过滤(0.1–3kHz)和平均化。以5至10dB的步长将声级从0升高至110dB声压级(分贝SPL)。在每个级别中，“排除伪迹”后平均为512至1024个应答(与刺激极***替出现)。通过目测检查确定阈值。使用Origin-2015(OriginLab Corporation,MA)对数据进行分析和作图。除非另有说明，否则阈值以平均值±标准偏差表示。对于DPOAE，提供f1和f2主要音调(f2/f1＝1.2)，其中f2以半音阶步长在5.6至45.2之间变化，以及L1–L2＝10dB SPL。在每个f2中，L2以10dB SPL的增量在10至80dB SPL之间变化。DPOAE阈值由平均谱定义为L2-水平，即引起高于噪音本底的量级为5dB SPL的DPOAE。在所有频率下的平均噪音本底水平均低于0dB SPL。在我们定制的声学***中，使用在PXI-1042Q机箱中的24位数字I-O卡(National Instruments PXI-4461)产生刺激，由SA-1扬声器驱动器(Tucker–Davis Technologies,Inc.)放大，并由两个静电驱动器(CUI CDMG15008-03A)传递。将在小探针管末端的驻极体麦克风(Knowles FG-23329-P07)用于监测耳道声压。这些实验中的大部分均不是在盲态条件下进行的。
为了确定截短的harmonin是否干扰正常的听觉功能，产生Anc80.CMV.trunc-harm载体以过表达截短的蛋白。通过RWM将载体注射进入c.216GA小鼠的内耳。在4、6和12周测量ABR和DPOAES，未发现注射和未注射c.216GA小鼠的阈值之间存在差异(来自图23的C-D中所示的6周龄小鼠的记录)。将该数据作为注射技术和载体的对照，重要的是其认为外源性截短的harmonin不与内源性全长harmonin竞争，提示在c.216AA毛细胞中的内源性截短形式不可能干扰通过基因疗法载体表达的外源性全长harmonin。
为了确定harmonin基因扩增是否能够在Ush1c小鼠中挽救听觉和平衡功能，在P0-P1进行AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1(0.8μl，1.7×10^12gc/ml)或AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1(0.8μl，1.9×10^12gc/ml)的RWM注射，并且评估听觉脑干应答(ABR)、畸变产物耳声发射(DPOAE)、声惊跳反射、旷场和转棒行为。在6周时对小鼠进行评估，此时是c.216AA小鼠出现严重听力丧失和前庭障碍的阶段。在3个月和6个月时对一些小鼠进行进一步检测。
12只注射了AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1的小鼠在6周时均未恢复听觉功能(图16的A-C)，表明harmonin-a1的外源性表达不足以进行听觉挽救。然而，25只注射了AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1的小鼠中有19只在6周时听觉功能明显恢复。在低频率下(5.6至16kHz)，在AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1注射耳中的最佳ABR阈值为25-30dB SPL，这与野生型小鼠的阈值非常类型(图16的A-B)。在22.6kHz时观察到部分挽救，在32kHz时几乎无挽救。DPOAE阈值的挽救也是明显的，其与在OHC中对功能的挽救一致(图16的C)。在晚期阶段中，对在8-11.3kHz刺激下听觉阈值<45dB SPL的8只小鼠进行了检测以评估挽救的持续时间。从6周至3个月，在低频率范围内观察到～10dB SPL ABR阈值迁移，在高频率范围内观察到～30dB SPL ABR阈值迁移(图16的D)。在DPOAE阈值中也观察到了类似的迁移(图16的E)。在该时间点之后，ABR阈值和DPOAE仍稳定至达6月龄(图16的D-E)，这是所检测的最后一个时间点。
为了评估是否harmonin-a1和harmonin-b1两者是更完全的听觉挽救所需的(特别是在高频端)，将AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::harmonin-a1(0.5μl；238 4.1E^12gc/ml)和AAV2/Anc80.CMV.eGFP::harmonin-b1(0.5μl；3.0E^12gc/ml)共注射。从两个荧光标签阳性的细胞可以看出，65％的毛细胞表达了harmonin-a1和harmonin-b1两者(图21)。在暴露于AAV2/Anc80.CMV.tdTomato::harmonin-a1小鼠的静纤毛中有时会观察到荧光标记的harmonin-a1，这也许是由于过表达导致的。在使用未标记harmonin-a1和harmonin-b1载体共注射小鼠中的ABR和DPOAE阈值(图16)与仅使用harmonin-b1注射的小鼠相似，其并未提供进一步的改善，这表明harmonin-a1对于听觉功能可能是不必要的。重要的是，数据表明在低频率下单独的harmonin-b1就足以明显恢复听觉阈值(图16)。
为了进一步评价挽救的程度，对阈值≤45dB SPL的小鼠的ABR波形进行分析，并在8只对照c.216GA小鼠与5只注射AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1的c.216AA小鼠之间进行比较。对在8-11.3kHz和16kHz下应答的分析显示了正常的第1波幅度(无显著性差异，P>0.2，Student t-检验)和更长的第1峰延迟(P>0.001)(图22)，提示在突触中的神经传递可能出现滞后。在很多动物中，在对侧耳中也观察到了听觉挽救，这些对侧耳在11.3kHz时的ABR阈值低至20dB SPL(harmonin-b1：平均值59.7±5.3dB SPL，n＝15/25；harmonin-a1+-b1：平均值76.2±10.3dB SPL，n＝4-6)。此前已观察到了AAV载体向对侧耳的扩散，其可能通过在新生小鼠中与蛛网膜下腔保持连续的外***发生。
我们还考察了在晚期发育阶段注射是否可以导致部分听觉挽救。在P10-P12时进行AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1(0.8μl)的RWM注射，并在6周时评估听觉阈值。P10-P12注射的小鼠均无可检测的DPOAE并且其ABR阈值与未注射的c.216AA对照小鼠之间无差异(n＝10；数据未显示)，这表明干预的机会窗可能限于出生后的早期阶段，这可能是由于更老组织中的病毒转导效率较低或在晚期发育阶段中Corti氏器官退化所致。
实施例2F—在Usher小鼠模型中的RT-PCR
使用
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逆转录试剂盒(Qiagen)由P2-P3野生型、杂合和纯和Ush1c c.216G>A小鼠的6个听觉器官制备cDNA。使用下述引物扩增编码全长(450bp)或截短的harmonin(-35bp)的cDNA：正向引物mUsh1c_Ex2F：5’CTC ATT GAA AAT GAC GCA GAG AAGG 3’(SEQ ID NO：11)，反向引物mUsh1c_Ex5R：5’TCT CAC TTT GAT GGA CAC GGT CTT 3’(SEQ ID NO：12)。这些引物对小鼠Ush1c序列是特异性的，并且将扩增内源性和来源于AAV2的Ush1c，因为靶序列位于人敲入Ush1c c.216A等位基因部分的区域之外。还评估了在治疗后6周采集的小鼠组织中的DNA和RNA水平。根据生产厂商的方案使用TRIzol试剂(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)从耳蜗中分离DNA和RNA。使用GoScript逆转录***(Promega,Madison,WI)对RNA逆转录。使用GoTaq Green Master Mix(Promega,Madison,WI)进行放射性标记的PCR。对于病毒DNA扩增，使用特异性针对小鼠Ush1c的引物：mUsh1c_Ex3F(5’-GAACCC AAC CGC CTG CCG(SEQ ID NO：13))和mUsh1c_Ex4WTR(5’-TGC AGA CGG TCC AAG CGT-3’(SEQ ID NO:14))。
这些引物将仅扩增病毒Ush1c DNA，因为纯合Ush1c.216AA小鼠在外显子3和4中敲入了人USH1C c.216A基因，其替代了小鼠序列(Lentz等，2007,Mutat.Res.,616:139-44)。对于全长(450bp)和异常剪接/截短harmonin(415bp)的cDNA扩增，使用与上文所述相同的引物((mUsh1c_Ex2F和mUsh1c_Ex5R)。Gapdh引物为：mGapdh_Ex3F(5’-611GTG AGG CCG GTGCTG AGT ATG-3’(SEQ ID NO：15))和mGapdh_Ex4R(5’-GCC AAA GTT GTC ATG GAT GAC-3’(SEQ ID NO:16))。使用6％非变性聚丙烯酰胺凝胶分离产物并使用Typhoon 9400磷成像仪(GE Healthcare)定量。
由于此前的研究提出截短的harmonin可能通过与作为内源性结合配合体的全长harmonin竞争来破坏其功能的可能性，因此探讨了截短蛋白的持续表达是否可能限制使用表达内源性全长harmonin的载体注射的c.216AA小鼠的恢复(图23的A)。为解决这一问题，使用RT-PCR测定检测了在c.216GA和c.216AA小鼠中Ush1c转录物的表达。与此前的报道一致，在c.216GA耳蜗中检测到了编码全长和截短harmonin的Ush1c转录物，在c.216AA耳蜗中仅检测到了编码截短harmonin的转录物(图23的B)。
为了确认AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1的表达以及探索病毒表达水平与ABR阈值之间的关系，从注射和对侧耳蜗中分离DNA和RNA并分别通过PCR和RT-PCR进行定量。在6周龄c.216GA以及AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1(0.8μl；1.93 10^12gc/ml)注射和未注射c.216AA小鼠中对表达进行评估。样品包括2只具有较好ABR挽救的注射小鼠(在11.3kHz时阈值≤35dB SPL)和2只具有较差ABR挽救(在11.3kHz时阈值≥90dB SPL)的注射小鼠。在所有注射耳蜗中以及在较小程度上在所有检测动物的对侧耳蜗中检测到了编码harmonin正确剪接形式的RNA(图24的A)和AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1 DNA(图24的B)。
ABR阈值以及DNA和RNA的表达量在动物之间存在变异性(图24的C)。然而，发现在AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1 DNA水平、编码harmonin正确剪接形式的RNA的量与ABR阈值水平之间存在较强的相关性，这表明ABR数据中的变异性可能是AAV表达的直接结果。为评估在已成功恢复ABR阈值的小鼠中毛细胞的长期存活情况，对5只6月龄的小鼠进行组织制备以及IHC和OHC计数(图25)。尽管在两个队列中的IHC数未发生改变，但是在显示出长期ABR挽救的3只小鼠中保持了50％或更多的OHC。在除基回以外的整个器官中均观察到了OHC存活(图25)。
实施例2G—在Usher小鼠模型中的声音惊跳应答
使用惊跳监测仪(Kinder Scientific)测量声音惊跳应答(ASR)。将小鼠置于固定在压电/有机玻璃传感组件上的小尺寸、非限制性立方形树脂玻璃记录室(27cm×10cm×12.5cm)中，并使其对60dB SPL背景白噪音适应5分钟。每组由35次试验构成，在此期间以平均为30s(范围为25-35s)的试验间间隔提供在10dB SPL强度下范围从60-120db SPL的单次噪音脉冲。脉冲在恒定60dB SPL背景噪音下以伪随机顺序排布以限制外部噪音干扰。惊跳监测仪将对每次脉冲的应答减少至测量第一个N、最大N和应答的最长时间(ms)，以计算峰惊跳应答(ASR幅度)和从刺激到峰惊跳应答的时间(ASR潜伏期)。ASR都是在盲态下进行的。
为评估是否ABR/DPOAE恢复产生了行为相关的听觉功能恢复，在注射AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1、AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1以及注射这两种载体的小鼠中测量了声音惊跳应答。对白噪音的惊跳应答分析表明，在使用AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1注射的6周龄小鼠中以及在使用两种载体共注射的小鼠中显示出对应答的部分挽救(图17的A)。仅接受harmonin-a1的小鼠与未注射c.216AA小鼠类似并且未显示出惊跳应答的恢复。
实施例2H—在Usher小鼠模型中的前庭评估
使用旷场和转棒平衡测试评估前庭功能。使用直径42cm的圆形框架进行旷场测试，将其放置在声室内，其顶部具有LED照明，将中央设定为30lux，且在昏暗的房间内。在圆形旷场中一次放置一只小鼠，并允许其探索5min。使用Ethovision XT记录和追踪行为，从而可以测量行进距离和速度。旷场评估均在盲态下进行。转棒性能实验涉及将小鼠置于在封闭壳体中的棒上，该棒最初以4rpm旋转并且以0.1rpm s-1的速度加速。在第1天将小鼠放置在棒上5min使其熟悉该设备。次日，将动物放置在棒上共进行5次试验。在试验之间设置5min休息期。计时器上显示在掉落到仪器壳体板上之前动物能够在设备上坚持的时长并且在每个测试批次之后记录。
由于耳蜗和前庭迷路之间的外淋巴空间是连续的，因此通过RWM注射AAV载体也可能转导前庭感觉器官。为评估前庭行为，对小鼠在转棒上的表现进行测试。尽管在c.216AA和使用AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1注射的c.216AA小鼠中观察到的转棒表现较差(至跌落的潜伏期平均<22sec)，但是使用AAV2/Anc80.CMV.harmonin-b1注射以及使用harmonin-a1和-b1载体共注射的c.216AA小鼠在转棒上保持平衡功能60-120秒，这与对照c.216GA小鼠一致(图17的B)。
在harmonin-b1以及harmonin a1和b1双注射c.216AA小鼠中还观察到了旷场行为的恢复。代表性的旷场探索轨迹如图17的C中所示。c.216GA小鼠探索了该区域的边界并且显示出最小的全身转动，而c.216AA小鼠显示出在整个室内更多的活动以及以转动/min定量的全身转动增加(图17的D-E)。令人吃惊的是，尽管在使用AAV2/Anc80.CMV.harmonin-a1注射的小鼠中未观察到ABR挽救，但是旷场数据表明其前庭功能恢复至对照小鼠的水平。注射AAV2/Anc80.CMV.trunc-harmonin的c.216GA小鼠的行为与对照c.216GA小鼠之间不存在差异，这再次表明了截短的和野生型harmonin之间不存在干扰(图17的C-E)。
行为测定表明使用harmonin-a1产生了部分前庭挽救，因为旋转行为消除，但使用harmonin-a1注射的小鼠未通过转棒测试。另一方面，注射harmonin-b1的小鼠在这两项测试中均具有功能恢复(图17)。在沟纹区域不存在转导和FM1-43摄取表明沟纹区域的毛细胞以及可能的I型细胞功能可能依赖于正确的harmonin表达(图13)。
尽管在低频率而非高频率下听觉挽救是显著的(图16)，但是在整个器官中在6周时观察到了毛束形态的保留(图18)。在高频率下不存在挽救不太可能是由于注射损伤所致。在使用AAV载体注射的任何c.216GA中均为观察到高频听力丧失(图23的C-D)。作为解释，AAV靶向耳蜗整个长度反驳了在基部缺乏转导效率。一种可能性是存在其他harmonin同种型，如短harmonin-c，其可能是在耳蜗基部高频端挽救功能所必需的。或者，由于耳蜗发育始于基端，因此可能在P0时基部高频端的毛细胞已经成熟，超过了其修复时间点。如果是这种情况，则进行胚胎干预可能对高频区产生更好的挽救。
第3部分—听力丧失中涉及的其他突变的基因疗法
实施例3A—体内实验
如此前所述使用辅助无病毒***和双转染法产生携带由经修饰的CMV启动子驱动的小鼠TMC1编码序列的Anc80载体(Grimm等，2003,Mol.Ther.,7:839:50)。将三重flag-标签(FLAG)序列与TMC编码序列的C-末端融合以使得所表达的蛋白能够可视化。使用碘克沙醇不连续梯度后接离子交换色谱纯化Anc80-CMV-Tmc载体。使用对人β-珠蛋白内含子元件具有特异性的引物对通过定量PCR测得滴度范围从1×1012至1×1013gc/ml。将病毒分装物在-80℃下保存并在使用前解冻。
根据波士顿儿童医院的机构动物管理和使用委员会批准的方案(方案#2659，#2146)如下所述将年龄为P0-P2的小鼠用于病毒载体的体内递送。将C57BL/6J(JacksonLaboratories)或Swiss Webster小鼠品系(Taconic)作为野生型对照小鼠，以及如此前所述(Kawashima等，2011,J.Clin.Invest.,121:4796-809)携带TMC1突变体等位基因(TMC1Δ/Δ或Tmc1-/-)的小鼠是C57BL/6J背景的。
为制备用于评价的组织，在P0-P10时从小鼠幼崽收集颞骨。通过快速断头处死幼崽并在补充了10mM HEPES、0.05mg/ml氨苄西林和0.01mg/ml环丙沙星的pH 7.40的MEM(Invitrogen)中解剖颞骨。在解剖野下分离膜迷路，将Reissner膜剥离，以及机械移除覆膜和血管纹。将Corti氏器官培养物平放在一对薄玻璃纤维下面，该纤维一端用Sylgard粘附到18mm圆形玻璃盖玻片上。将组织立即用于电生理学研究。对于年龄大于P10的小鼠，在吸入CO2将动物处死后收集颞骨，并制备耳蜗全组织标本包埋物。
在图中的所有平均值和误差线表示平均值±SD。使用双侧配对t检验对注射耳与未注射耳之间的统计学显著性进行比较。将P<0.05认为具有显著性。
实施例3B—病毒载体的体内注射
使用斜面玻璃显微注射移液管通过圆窗膜(RWM)向小鼠幼崽(P0-P2)注射。在P-2000移液管拉制仪(Sutter Instrument)上用玻璃毛细管拉制出移液管，并使用微量移液斜切机(Sutter Instrument)斜切(尖端直径～20μm，28°角)。使用无菌拭子将手术部位(左乳突突起)覆盖EMLA乳膏(利多卡因2.5％和丙胺卡因2.5％)以外用进行镇痛。手术前在37℃温热垫上放置30-60分钟以维持体温。
通过快速诱导低温2-3分钟直至其意识丧失对幼崽进行麻醉，并在手术期间在冷板上保持该状态10-15分钟。通过使用必妥碘擦洗并使用70％乙醇重复擦拭三次对手术部位进行消毒。行耳后切口以暴露透明鼓泡，推进微量移液器(MP-30,Sutter InstrumentCompany)通过鼓泡和覆盖的筋膜，并用微量移液器尖端穿过RWM。
使用气动显微注射器(WPI Nanoliter 2010)以0.1μl/min将滴度在1012至1014gc/mL(总病毒颗粒为109至1011)之间约1μl的病毒单侧注射至左耳。使用6-0号单丝缝合线(Ethicon)关闭皮肤切口。然后将幼崽送回温热垫上恢复。
实施例3C—免疫荧光
进行免疫染色以确定由病毒载体递送的转基因表达的分布。为此，在新解剖的Corti氏器官上进行免疫染色，使用在PBS中稀释的4％多聚甲醛将其在室温下浸没固定1h。然后，在PBS中洗涤组织，在0.01-0.1％ Triton X-100中透化30分钟，并使用AlexaFluor546-鬼笔环肽(Molecular Probes，1:200稀释)复染1h以标记肌动蛋白丝。
对于外源性表达的TMC::FLAG融合蛋白的定位，使用2％ BSA和5％正常山羊血清将组织封闭1小时，并且使用针对FLAG基序的抗体(BD Biosciences，1:200稀释)在4℃下孵育过夜。对于毛细胞计数，将组织在正常山羊血清中封闭1小时，在4℃下使用家兔抗-肌球蛋白VIIa一抗(Proteus Biosciences，1:1000稀释)染色过夜，以及使用与AlexaFluor488偶联的山羊抗-家兔抗体(Life Technologies，1:200稀释)标记1h。用Vectashield封固剂(Vector Laboratories)将样品固定在玻璃盖玻片上，并使用Zeiss LSM700共聚焦显微镜以10X-63X的放大倍数成像。
图26显示了表明将Harmonin向Ush1c突变小鼠均匀Anc80递送的免疫荧光，以及图28显示了表明将KCNQ4向KCNQ4突变小鼠中的细胞Anc80递送的免疫荧光。因此，Anc80是用于治疗导致听力丧失的多种不同遗传缺陷(在多个不同的基因座)的有效载体。
实施例3D—毛细胞电生理学
将器官型耳蜗培养物浸泡在含有137mM NaCl、0.7mM NaH2PO4、5.8mM KCl、1.3mMCaCl2、0.9mM MgCl2、10mM Hepes和5.6mM D-葡萄糖的标准人工外淋巴液中。使用浓缩物(Invitrogen)向溶液中加入维生素(1:50)和氨基酸(1:100)，以及使用NaOH将最终的pH调节至7.40(310mosmol/kg)。记录移液管(3至5兆欧)使用R6毛细管玻璃(King PrecisionGlass)拉制并且填充有含有下述的细胞内溶液：135mM CsCl、5mM Hepes、5mM EGTA、2.5mMMgCl2、2.5mM Na2–三磷酸腺苷和0.1mM CaCl2，其中使用CsOH将最终的pH调节至7.40(285mosmol/kg)。在室温(22°至24℃)和-84mV下，使用Axopatch 200B(MolecularDevices)采用全细胞、紧封接电压钳记录。使用低通贝塞尔滤波器以10kHz过滤感觉传导电流，在≥20kHz使用16位采集板(Digidata 1440A)数字化，并使用pCLAMP 10软件(Molecular Devices)记录。存储数据，使用OriginPro 8(OriginLab)进行离线分析。
图29显示了与突变小鼠(图29的B)相比在使用Anc80-KCNQ4转染的KCNQ4-/-细胞(图10的C)中钾电流恢复至接近野生型水平(图29的A)，从而表明使用Anc80的基因疗法能够恢复功能。
实施例3E—听觉脑干应答(ABR)
如此前所述(Maison等，2010,J.Neurosci.,30:6751-62)进行ABR记录。简言之，使用稀释入5ml 0.9％盐水的50mg***和5mg甲苯噻嗪通过IP注射(0.1ml/10g-体重)麻醉P25-P30小鼠。在32℃下的隔音室中进行ABR实验。为了测试听力功能，给小鼠提供5.6kHz、8kHz、11.3k Hz、16kHz、22.6kHz或32kHz的纯音刺激，声压级在10至115dB之间，步长为5dB，直到检测到达到引起可重复ABR波形(峰I-IV)的阈值强度。使用交替极性刺激，收集512至1024个应答并对每个声压级取平均值。通过“排除伪迹”功能剔除幅度大于15μV(峰至谷)的波形。
在开始进行ABR测试之前，用解剖剪刀修剪通常遮盖外耳道入口的皮肤和软骨，以及在所有刺激频率下针对每个测试受试者校正耳道入口处的声压。通过定制的探针管扬声器/麦克风组件(EPL PXI***)向所研究的耳直接传送声学刺激，该组件由用于产生主要音调的两个静电耳机(CUI Miniature Dynamics)和用于记录耳道声压的Knowles微型麦克风(Electret Condenser)组成。声刺激由5-ms音频脉冲(以cos2开始的0.5ms升-降，以40/s传输)构成。
使用***耳廓(有源电极)、顶点(参比电极)和臀部(接地电极)的皮下针电极采集ABR信号。将ABR电位放大(10,000x)、通过滤波(0.3-10kHz)并使用定制的数据采集软件(LabVIEW)数字化。使用数字I-O板(National Instruments)以40-μs间隔对声音刺激和电极电压进行采样并存储用于离线分析。将阈值定义目测最低分贝水平，在该水平下任何波(I-IV)可以被检测到并且其随着声强的增加而再现的。对每个实验组中的ABR阈值取平均值并将其用于统计学分析。
图27图示表明了编码和表达Harmonin的Anc80病毒载体的递送能够提供听觉功能几乎完全恢复，特别是在较低频率下(例如，约5至约22kHz)。
实施例3F—定量RT-PCR分析
进行该实验以评价体内施用后在耳蜗中存在的病毒量。在P1时向2只TMC1-/-小鼠的左耳中注射。从左耳和右耳中分离耳蜗并在培养基中保持3天(相当于P10)。提取RNA并使用Agilent生物分析仪(Agilent Technologies)确认其质量，将其逆转录为cDNA，用于如此前所述(Kawashima等，2011,J.Clin.Invest.,121:4796-809)使用特异性针对TMC1的有效引物对和SYBR GreenER qPCR试剂(Invitrogen)进行定量RT-PCR分析。
为扩增TMC1片段，使用了下述引物：5’-CAT CTG CAG CCA ACT TTG GTG TGT-3’(SEQ ID NO：17)和5’-AGA GGT AGC CGG AAA TTC AGC CAT-3’(SEQ ID NO：18)。将表达水平归一化为使用5’-TGA GCG CAA GTA CTC TGT GTG GAT-3’(SEQ ID NO：19)和5’-ACT CATCGT ACT CCT GCT TGC TGA-3’(SEQ ID NO：20)扩增的Actb(编码β-肌动蛋白。将所有引物设计为跨内含子，并使用熔点曲线分析和阴性对照进行验证。使用ΔΔCT法对数据进行分析，确定相对于Actb的变化以及注射和未注射耳之间的差异。
这些结果表明在注射耳中TMC1 mRNA的表达是未注射耳的12倍。
实施例3G—FM1-43标记
如此前所述进行FM1-43染料负载实验(Gale等，2001,J.Neurosci.,21:7013-25；Meyers等，2003,J.Neurosci.,23:4054-65；以及Géléoc&Holt,2003,Nat.Neurosci.,10:1019-20)。将粘附有耳蜗培养物的盖玻片置于正置显微镜(Zeiss Axioscope FS Plus)的玻璃底室上。将使用人工外淋巴液稀释的5-μM FM1-43FX(Invitrogen)应用10sec并将组织在人工外淋巴液中洗涤3次以便从细胞膜的外叶除去染料。5分钟后，使用FM1-43滤光片组和具有63X水浸物镜的落射荧光光源对细胞内FM1-43成像。如上文所述对组织进行固定和处理以用于免疫荧光检测。
图30是显示暴露于如在本申请中所使用的Anc80病毒载体的细胞的FM1-43染料摄取情况的免疫染色图像，以及图31图示说明了由如本申请所述的Anc80病毒载体递送的TMC1能够在体内恢复Tmc1-缺陷毛细胞的感觉传导。
实施例3H—畸变产物耳音发射(DPOAE)
在与ABR数据相同的条件下和在相同记录组中采集DPOAE数据。为了在2f1-f2处产生DPOAE，以1.2(f2/f1)的频率比产生主音，其中对于每个f2/f1对，f2水平为10dB，声压级低于f1水平。以5-dB的步长从20至80dB扫描f2水平。在每个级别使用波形和频谱平均来增加所记录的耳道声压的信噪比。从平均频谱中提取2f1-f2处的DPOAE的幅度，以及频谱中附近点处的噪音本底。在DPOAE振幅与声级曲线中***等应答曲线。将阈值定义为在0dB时产生DPOAE所需的f2水平。
图32图示说明了使用如本申请所述的Anc80你病毒载体递送的TMC1能够在TMC1-/-小鼠中挽救外毛细胞的功能，特别是在较低频率下(例如，约5至约16kHz)。
其他实施方式
应当理解的是，尽管本申请已经结合很多不同方面描述了方法和物质的组合物，但是前述各个方面的描述旨在说明而不是限制方法和物质的组合物的范围。其他的方面、优点和修订在下述权利要求的范围内。
公开了能够用于，能够用于联用，能够用于制备所公开的方法和组合物或者是其产物的方法和组合物。本申请公开了这些和其他物质，并且应当理解的是公开了这些方法和组合物的组合、亚集、相互作用、组等。也就是说，虽然可能未明确公开对这些组合物和方法的每种不同的个体和集体组合以及排列的具体参考，但是在本申请中具体考虑和描述了每一种。例如，如果公开和讨论了特定的物质组合物或特定方法以及讨论了多种组合物或方法，则除非特别指出相反的情况，否则特别考虑组合物和方法的每种组合和排列。同样地，还特别考虑和公开了这些的任何子集或组合。

Claims (10)

1.一种AAV载体，所述载体包含Anc80衣壳蛋白和一种或多种选自下组的转基因：TMC1、TMC2、MYO7A、USCH1C、CDH23、PCDH15、SANS、CIB2、USH2A、VLGR1、WHRN、LRN1、PDZD7。
2.一种向受试者内耳中的一种或多种细胞递送转基因的方法，所述方法包括：
向受试者的所述内耳施用腺相关病毒(AAV)，其中所述AAV包含Anc80衣壳蛋白和转基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述内耳中的所述一种或多种细胞选自下组：内毛细胞(IHC)和外毛细胞(OHC)。
4.根据权利要求3所述的方法，其中将所述转基因递送到至少80％的内毛细胞和至少80％的外毛细胞。
5.根据权利要求2所述的方法，其中在所述内耳中的所述一种或多种细胞选自下组：螺旋神经节神经元、前庭毛细胞、前庭神经节神经元、支持细胞和在血管纹中的细胞。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因选自下组：ACTG1、ADCY1、ATOHI、ATP6V1B1、BDNF、BDP1、BSND、DATSPER2、CABP2、CD164、CDC14A、CDH23、CEACAM16、CHD7、CCDC50、CIB2、CLDN14、CLIC5、CLPP、CLRN1、COCH、COL2A1、COL4A3、COL4A4、COL4A5、COL9A1、COL9A2、COL11A1、COL11A2、CRYM、DCDC2、DFNA5、DFNB31、DFNB59、DIAPH1、EDN3、EDNRB、ELMOD3、EMOD3、EPS8、EPS8L2、ESPN、ESRRB、EYA1、EYA4、FAM65B、FOXI1、GIPC3、GJB2、GJB3、GJB6、GPR98、GRHL2、GPSM2、GRXCR1、GRXCR2、HARS2、HGF、HOMER2、HSD17B4、ILDR1、KARS、KCNE1、KCNJ10、KCNQ1、KCNQ4、KITLG、LARS2、LHFPL5、LOXHD1、LRTOMT、MARVELD2、MCM2、MET、MIR183、MIRN96、MITF、MSRB3、MT-RNR1、MT-TS1、MYH14、MYH9、MYO15A、MYO1A、MYO3A、MYO6、MYO7A、NARS2、NDP、NF2、NT3、OSBPL2、OTOA、OTOF、OTOG、OTOGL、P2RX2、PAX3、PCDH15、PDZD7、PJVK、PNPT1、POLR1D、POLR1C、POU3F4、POU4F3、PRPS1,PTPRQ、RDX、S1PR2、SANS、SEMA3E、SERPINB6、SLC17A8、SLC22A4、SLC26A4、SLC26A5、SIX1、SIX5、SMAC/DIABLO、SNAI2、SOX10、STRC、SYNE4、TBC1D24、TCOF1、TECTA、TIMM8A、TJP2、TNC、TMC1、TMC2、TMIE、TMEM132E、TMPRSS3、TRPN、TRIOBP、TSPEAR、USH1C、USH1G、USH2A、USH2D、VLGR1、WFS1、WHRN和XIAP。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因编码神经营养因子。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述神经营养因子选自下组：GDNF、BDNF、NT3和HSP70。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因编码抗体或其片段。
10.根据权利要求2所述的方法，其中所述转基因编码免疫调节蛋白。
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