CN116223639A - 一种噁拉戈利中间体的检测方法 - Google Patents

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CN116223639A CN202111465726.9A CN202111465726A CN116223639A CN 116223639 A CN116223639 A CN 116223639A CN 202111465726 A CN202111465726 A CN 202111465726A CN 116223639 A CN116223639 A CN 116223639A
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Abstract

本发明涉及噁拉戈利中间体3‑[(2R)‑2‑氨基‑2‑苯乙基]‑5‑(2‑氟‑3‑甲氧基苯基)‑1‑[[2‑氟‑6‑(三氟甲基)苯基]甲基]‑6‑甲基‑2,4‑二氧杂‑1(1H,3H)‑嘧啶二酮或其盐的对映异构体检测方法，具体涉及使用衍生试剂衍生后采用高效液相色谱进行检测分离。本发明检测成本低、灵敏度高、专属性强，能够有效检测分离前述中间体或其盐中对映异构体，从源头上控制保证终产品质量。

Description

一种噁拉戈利中间体的检测方法
技术领域
本发明属于化学分析检测领域，具体涉及噁拉戈利的中间体的检测方法。
背景技术
噁拉戈利钠，是一种GnRH受体拮抗剂，通过与内源性GnRH受体结合后，抑制GnRH诱导的信号转导和促性激素的分泌，降低促性激素、卵巢性激素、***和***水平。用于治疗中重度内异症相关疼痛，如痛经和非经期骨盆疼痛，也可显著改善经期大出血。噁拉戈利钠对内异症相关疼痛具有明显的临床缓解作用，并且其作为非肽类GnRH受体拮抗剂，半衰期较短，停药后能很快恢复下丘脑-垂体-性腺轴的功，是一款较为理想的治疗子宫内膜异位症的药品。该品种尚未发现有药典收载。使该产品在现阶段没有可参考的分析标准。因此，建立稳定、有效的噁拉戈利钠及其合成中间体的分析方法是非常必要的。
中间体A，3-[(2R)-2-氨基-2-苯乙基]-5-(2-氟-3-甲氧基苯基)-1-[[2-氟-6-(三氟甲基)苯基]甲基]-6-甲基-2,4-二氧杂-1(1H,3H)-嘧啶二酮为噁拉戈利合成过程的中间体，其结构中有一个手性碳，存在対映异构体杂质a。中间体A与杂质a结构如下：
Figure BDA0003391362970000011
在现有的公开发表的文献或者专利中，均未收载中间体A与对映异构体杂质a的分离检测方法。然而对中间体A的对映异构体杂质a进行有效的分离检测，对于控制噁拉戈利钠产品的手性非常重要，其可以从中间体A进行手性控制，以方便简化终产品的检测与纯化难度。采用现有常用的方法，难以将中间体A与对映体杂质a在各类手性色谱柱上均无法有效分离。因此需要一种新的检测方法，将中间体A与对映体杂质a有效分离、定量检测。
发明内容
本发明提供了一种噁拉戈利中间体A或其盐的检测方法，分离检测中间体A或其盐中的对映异构体杂质a，检测方法适用性强，灵敏度、耐用性高，能够有效对中间体A或其盐中的对映异构体杂质a进行定性和定量。本发明使用2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯作为衍生试剂，将样品进行衍生，通过后处理，在一定的色谱条件下对中间体A或其盐中的对映体杂质a进行定性检测和定量分析。通过本发明对中间体A或其盐进行对映体杂质a的分离检测，能够有效对中间体A或其盐进行异构体纯度控制，减少了终产品异构体的检测、纯化难度。本发明中，所述中间体A的盐包括不限于水杨酸盐、龙胆酸盐、2,4-二羟基苯甲酸盐、2,6-二羟基苯甲酸盐、2,3-二羟基苯甲酸盐、草酸盐、盐酸盐、硫酸盐、氢溴酸盐等，通过本领域常规方法即可制备获得中间体A的盐。具体的，本发明的方法包括如下步骤：
a)将供试品与2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯进行柱前衍生得到待测样品；
b)将所述待测样品采用高效液相色谱进行检测。
本发明的实施方案中，前述供试品与2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯的摩尔比为1:4～12，进一步为1:6～10，更进一步为1:6～9。本发明某些具体实施方案中，前述供试品与2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯的摩尔比优选为1:6、1:7、1:8、1:9，更优选为1:8。
本发明的某些实施方案中，前述柱前衍生的温度为40～80℃，进一步为60～80℃，更进一步为80℃。
本发明的某些实施方案中，前述柱前衍生的时间为0.5h以上，进一步为0.5h～6h，优选地，为2h～4h，更优选地为2h。
本发明的实施方案中，高效液相色谱的色谱柱为反相柱。所述反相柱，指填料是非极性的、官能团为烷烃的色谱柱，包括不限于十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱、苯基硅烷键合硅胶色谱柱、五氟苯基硅烷键合硅胶色谱柱等。本发明某些具体实施方案中，前述反相柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。
本发明的实施方案中，高效液相色谱的检测柱温为50～70℃，进一步所述柱温为55～70℃，更进一步为58～70℃。本发明某些具体实施方案中，高效液相色谱的检测柱温优选60℃～70℃，更优选60℃。
本发明的实施方案中，高效液相色谱的洗脱程序可选是等度的，采用流动相体系包括乙酸铵水溶液和乙腈。
本发明某些实施方案中，前述乙酸铵水溶液占流动相体系体积分数为25％～45％，进一步所述体积分数为30％～40％，更进一步为35％～40％。本发明某些具体实施方案中，乙酸铵水溶液与乙腈比例更优选40:60。
本发明某些实施方案中，前述乙酸铵水溶液pH为3.0～6.5，进一步为4.0～6.0，更进一步为4.8～6.0。本发明中，乙酸铵水溶液pH值用本领域常用有机酸或碱性物质进行调节，酸性物质包括乙酸、三氟乙酸等，碱性物质包括三乙胺、二乙胺、氨水等。本发明pH值范围内中间体A或其盐与对映体杂质a均能有效得到有效分离。
本发明某些实施方案中，前述高效液相色谱的检测波长为190～280nm，进一步为195～275nm。本发明某些具体实施方案中，前述高效液相色谱的检测波长为214～254nm，使得待测样品、中间体A或其盐、柱前衍生样品获得较大的紫外吸收。在某些具体实施方案中，前述高效液相色谱的检测波长为254nm，图谱基线较好，基线波动较214nm更小。
本发明某些实施方案中，乙酸铵水溶液浓度为0.01mol/L～0.1mol/L，进一步为0.01mol/L～0.05mol/L。本发明乙酸铵水溶液浓度范围下中间体A或其盐与对映体杂质a均能有效得到有效分离。
本发明某些实施方案中，将供试品与2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯按摩尔比为1:6～9，在60～80℃下柱前衍生0.5h～6h；然后采用高效液相色谱检测，所述高效液相色谱包括以下色谱条件，采用反相柱在流动相等度洗脱的条件下检测，检测柱温为50～70℃，所述流动相为乙酸铵水溶液与乙腈的混合溶液，其中所述乙酸铵水溶液占流动相体积分数为25％～40％；进一步前述检测柱温优选55～70℃，更优选60～70℃，前述乙酸铵水溶液体积分数优选30％～40％，更优选35％～40％；更进一步所述高效液相色谱检测波长可选为195～275nm。
本发明某些具体实施方案中，前述供试品与2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯的摩尔比为1:8，在80℃下柱前衍生3h～4h；然后采用包括以下色谱条件进行高效液相色谱检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测柱温为60～70℃，检测波长为195～275nm，在流动相等度洗脱的条件下检测，所述流动相为0.01moL～0.05moL的乙酸铵水溶液与乙腈按40:60体积比混合所得，其中所述乙酸铵水溶液pH为3.0～6.5；进一步所述检测波长为254nm，所述pH为4.8～6.0。
本发明的实施方案中，柱前衍生优选在有机溶剂中进行，所述有机溶剂用于溶解中间体A或其盐、对映异构体杂质a和衍生试剂，包括不限于乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯等。本发明某些具体的实施方案中，有机溶剂为乙腈。
本发明的实施方案中，柱前衍生结束时可选加入试剂终止衍生，所述试剂包括不限于甲醇、乙醇、水或其混合。本发明某些具体的实施方案中，所述试剂为50％甲醇。
本发明中所使用的溶剂，如乙腈、甲醇优选色谱纯，其余试剂可选为分析纯。
本发明能够有效分离检测中间体A或其盐中的对映异构体杂质a，分离度较好；部分实施方式可达到分离度2.0以上，能够将中间体A供试品中痕量的对映体杂质a完全分离而不产生重叠包裹，避免误差产生导致的定性定量不准确。本发明能够进行准确定量，供试品浓度0.03％以上均可准确定量，灵敏度高，利于准确检测确认中间体A或其盐的纯度，以保障后续终产品纯度，并从源头控制产品质量。本发明检测方法简单，可操作性、适用性强，衍生试剂、空白溶剂不影响检测结果。
附图说明
图1-1为实施例4柱温为58℃的HPLC图谱。
图1-2为实施例4柱温为60℃的HPLC图谱。
图2为实施例6流动相乙酸铵占比35％的HPLC图谱。
图3为实施例7***适用性空白溶液HPLC图谱。
图4为实施例7***适用性溶液HPLC图谱。
图5为对比例1正相体系中间体A溶液HPLC图谱。
图6为对比例1正相体系对映体杂质a溶液HPLC图谱。
图7为对比例1混合溶液HPLC图谱。
图8-1为对比例3乙腈溶液体系HPLC图谱。
图8-2为对比例3磷酸溶液体系HPLC图谱。
图9为实施例9供试品HPLC图谱。
图10为实施例9加标对照溶液HPLC图谱。
具体实施方式
仪器与试剂
仪器：岛津LC-20ADXR液相色谱仪；百万分之一电子天平；十万分之一电子天平；万分之一天；pH计；
色谱柱1：Waters公司，
Figure BDA0003391362970000041
HSS T3，4.6×250mm，3.5μm，；
色谱柱2：菲罗门Chiral MX2-RH，4.6×250mm，5μm。
对照品：对映体杂质a对照品、中间体A对照品购自TLC pharmaceuticalStandards，纯度分别为99.9％、99.7％。
供试品：本发明具体实施方式中所用供试品为参照现有技术(如WO2005007633A1)制备并纯化得到的中间体A。
实施例1
称取2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯适量，加入乙腈溶解稀释至约11.25mg/mL的溶液作为衍生试剂储备液。
称取对映体杂质a对照品适量，加入乙腈溶解稀释成约5.0ug/mL的溶液作为杂质a对照品储备液。
称取7.8mg中间体A的供试品，加入2.0mL杂质a对照品储备液混合溶剂均匀，平行配制四份溶液，在每份中分别加入2.0mL、3.0mL、4.0mL、6.0mL的衍生试剂储备液，分别将每份溶液置于60℃水浴中加热0.5h，冷却至室温后，各加入50％甲醇10mL，再用乙腈分别稀释至20mL，摇匀获得4份待测样品。采用以下色谱条件分别对前述样品进行HPLC检测，
Figure BDA0003391362970000051
，得到数据结果如下，
Figure BDA0003391362970000052
实施例2
称取7.8mg中间体A供试品，加入4.0mL实施例1中的衍生试剂储备液混合均匀，平行配制三份溶液，将每份溶液分别置于40℃、60℃、80℃水浴中加热0.5h，冷却至室温后，各加入50％甲醇10mL，再用乙腈分别稀释至20mL，摇匀获得3份待测样品。采用实施例1中色谱条件分别对前述三样品进行HPLC检测，得到结果如下，
温度 中间体A衍生物峰面积(mAU*min)
40℃ 17.9965
60℃ 55.6952
80℃ 74.0246
。
实施例3
称取7.8mg中间体A对照品，加入2.0mL实施例1中的杂质a对照品储备液，4.0mL实施例1中的衍生试剂储备液，混合均匀，平行配制5份溶液，将每份溶液置于80℃水浴中分别加热0.5h、1h、2h、3h、4h，冷却至室温后，各加入50％甲醇10mL，再用乙腈分别稀释至20mL，摇匀获得5份待测样品。采用
Figure BDA0003391362970000053
HSS T3，4.6×250mm，3.5μm色谱柱，在柱温60℃、柱流速1.2mL/min、检测波长254nm、进样体积20μL、流动相为0.01mol/L乙酸铵溶液(用冰乙酸调节pH值至5.0):乙腈等于4:6的色谱条件下，分别对前述五样品进行HPLC检测，得到数据结果如下，
Figure BDA0003391362970000061
，衍生时间0.5h衍生转化接近90％；衍生时间2～4h，衍生转化效果更佳，且高于2h后，随着衍生化时间延长，衍生化效率差异不明显。
实施例4
申请人在实践考察中出乎意料的发现，柱温对于中间体A及其对映体杂质a的分离效果有十分显著的影响。称取7份中间体A供试品，每份7.8mg，分别加入约2.0mL实施例1中杂质a对照品和4.0mL实施例1中的衍生试剂储备液，在80℃水浴中加热0.5h，冷却至室温后分别加入50％甲醇10mL，用乙腈分别稀释至20mL，摇匀作为待测样品。依照实施例1中色谱条件，在柱温50℃、55℃、58℃、60℃、62℃、65℃、70℃下，分别进行HPLC检测待测样品，结果表明，柱温低于60℃时，中间体A和杂质a无法完全分离，难以准确定性定量，柱温高于60℃时，中间体A与对映体杂质a能够完全分离，可以准确定性和定量。附图1-1和1-2分别显示了58℃和60℃柱温条件下的分离效果。
实施例5
精密称取对映体杂质a对照品并加乙腈溶解稀释成5.0ug/mL的加标溶液。精密称取中间体A对照品5.0mg，精密移取1.0mL加标溶液并混合，加入2.6mL实施例1的衍生试剂储备液，在80℃水浴中加热3h，冷却至室温后分别加入50％甲醇2.5mL，用乙腈分别稀释至10mL，摇匀作为对映体杂质a含量为0.1％的待测样品。
依照实施例1中色谱条件，分别按下表改变柱温、乙酸铵溶液pH进行HPLC检测待测样品并计算对映体杂质a含量，结果如下，
名称 柱温60℃ 柱温58℃ 柱温62℃ pH 4.8 pH 5.2 pH 6.0
对映体杂质a含量(％) 0.11 0.09 0.11 0.11 0.10 0.10
其中，各柱温条件下的对映体杂质a含量均根据由检测***自动积分的HPLC图谱计算所得。
实施例6
称取3.9mg中间体A对照品、3.9mg对映体杂质a对照品，加入4mL乙腈溶解，加入4mL实施例1中的衍生试剂储备液，在80℃水浴中加热2h，冷却至室温后加入50％甲醇10mL，用乙腈稀释至20mL。使用色谱柱
Figure BDA0003391362970000071
HSS T3，4.6×250mm，3.5μm，控制柱温60℃、柱流速1.2mL/min、检测波长254nm、进样体积20uL的条件下，分别采用0.01mol/L乙酸铵溶液(用冰乙酸调节pH值至5.0)与乙腈体积比为25:75、35:65、40:60的流动相体系进行HPLC检测，得结果如下，
乙酸铵溶液与乙腈体积比 中间体A衍生物与对映体杂质a衍生物分离度
25:75 1.3
35:65 1.8
40:60 2.1
。
实施例7
取4mL乙腈、4.0mL实施例1的衍生试剂储备液混合均匀后在80℃水浴中加热3h，放至室温，加入50％甲醇10mL，用乙腈稀释至20ml，摇匀作为空白溶液。
称取7.8mg中间体A对照品，加入2.0ml实施例1中的杂质a对照品储备液，4.0mL实施例1中的衍生试剂储备液，在80℃水浴中加热2h，冷却至室温，加入50％甲醇10mL，用乙腈稀释至20mL，摇匀作为***适用性溶液。
用以下色谱条件下进行HPLC***适用性分析，
Figure BDA0003391362970000072
。得到HPLC图谱如图3、4，中间体A衍生物与对映体杂质a衍生物分离度为2.2，能够完全分离，并且空白溶剂不干扰中间体A与对映体杂质a的检测，***适用性满足准确定性定量的要求。
实施例8
称取7.8mg中间体A对照品，加入2mL乙腈溶解，加入4.0mL实施例1中的衍生试剂储备液，在80℃下反应3h后，冷却至室温，加入10mL50％甲醇，然后用乙腈不断稀释，并采用实施例7中的色谱条件分析记录，至S/N在10～30(其中中间体A峰高为S，噪声峰高为N)。
取7.8mg对映体杂质a对照品，加入2mL乙腈溶解，加入4.0mL实施例1中的衍生试剂储备液，在80℃下反应3h后，冷却至室温，加入50％甲醇10mL，然后用乙腈不断稀释，并采用实施例7中的色谱条件检测分析记录，至S/N在10～30(其中对映体杂质a峰高为S，噪声峰高为N)。具体结果如下，
Figure BDA0003391362970000081
，结果表明，本发明的检测方法灵敏度较高，中间体A及对映体杂质a在约0.03％以上均可被准确定量，且本发明定量限重复性良好。
实施例9
称取中间体A水杨酸盐供试品10mg，加入4mL乙腈溶解，加入4.0mL实施例1中的衍生试剂储备液，于80℃水浴加热3h，放至室温，加入50％甲醇约10mL混合均匀，用乙腈稀释至20mL，摇匀作供试品溶液。
称取中间体A水杨酸盐供试品10mg，加入4mL实施例1中的杂质a对照品储备液，加入4.0mL实施例1中的衍生试剂储备液，于80℃水浴加热3h，放至室温，加入50％甲醇约10mL混合均匀，用乙腈稀释至20mL，摇匀作加标对照溶液。采用实施例7的色谱条件进行HPLC检测，得到HPLC图谱如图9、图10。供试品中未检出对映异构体杂质a。
对比例1
称取中间体A对照品约20mg，置20ml容量瓶，加入稀释剂溶解定容至刻度，作为正相体系中间体A溶液。称取对映体杂质a对照品约20mg，置20ml容量瓶，加入稀释剂溶解定容至刻度，作为正相体系对映体杂质a溶液。称取中间体A约20mg，置20ml容量瓶，加入0.2ml前述正相体系对照品溶液，加入稀释剂溶解定容至刻度，作为混合溶液。采用以下正相手性色谱条件对三溶液进行分离，
柱温 30℃
柱流速 1.0ml/min
检测波长 274nm
进样体积 10μl
流动相体系 正己烷：乙醇：二乙胺(40:60:0.1)
稀释剂 正己烷：乙醇：二乙胺(900:100:1)
色谱柱 菲罗门Chiral M2(2)4.6×250mm
。实验结果表明，采用目前常用的正相手性柱无法有效分离中间体A、对映体杂质a，其色谱峰在正相体系中出现严重裂分，并且中间体A与对映体杂质a混合后无法有效分离。参见附图5、图6、图7。
对比例2
称取(-)-α-甲基苄基异硫氰酸酯适量，加入乙腈溶解稀释至3mg/mL的溶液作为衍生试剂储备液2。
称取中间体A对照品约100mg，对映体杂质a对照品约1mg，用乙腈溶解稀释至20mL，作为混合母液。
反应液I：取混合母液0.5ml，(-)-α-甲基苄基异硫氰酸酯储备液0.5mL，置5mL容量瓶，置80℃水浴加热1h，放至室温，加入50％甲醇2.5ml，用乙腈定容至刻度，摇匀即得。
反应液II：取混合母液0.5mL，(-)-α-甲基苄基异硫氰酸酯储备液1.0mL，置5ml容量瓶，置80℃水浴加热1h，放至室温，加入50％甲醇2.5ml，用乙腈定容至刻度，摇匀即得。
反应液III：称取中间体A对照品约5mg，置10mL容量瓶，加入1mL乙腈使溶解，再加入(-)-α-甲基苄基异硫氰酸酯储备液1.0mL，置80℃水浴加热1h，放至室温，加入50％甲醇5mL，用乙腈定容至刻度，摇匀即得。
反应液IV：称取中间体A对照品约5mg，置10mL容量瓶，加入1mL乙腈使溶解，再加入3mg/mL的2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯乙腈溶液1.0mL，置80℃水浴加热1h，放至室温，加入50％甲醇5mL，用乙腈定容至刻度，摇匀即得
采用实施例1色谱条件对前述反应液I、II、III进行HPLC检测，得到结果如下，
Figure BDA0003391362970000091
，采用(-)-α-甲基苄基异硫氰酸酯对中间体A对照品进行衍生，会生成对映体杂质a衍生物，容易产生误导，无法有效检测供试品中对映体杂质a的情况。
对比例3
称取中间体A对照品和对映体杂质a对照品各约1mg，分别加入对比例2中衍生试剂储备液2稀释至2mL，在80℃水浴加热0.5h，放至室温，分别取前述两溶液各0.5ml，加入50％甲醇0.5ml混匀即得待测溶液。
采用实施例1色谱条件进行HPLC检测待测溶液，得图8-1。再依照实施例1色谱条件，流动相换为0.1％磷酸溶液与乙腈按体积比25:75的混合溶液，对待测溶液进行HPLC检测，得到图8-2。磷酸溶液色谱***中，未衍生对照品峰形很差，分叉明显，无法准确计量未衍生对照品峰面积。

Claims (10)

1.一种噁拉戈利中间体A或其盐的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
a)将供试品与2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯进行柱前衍生得到待测样品；
b)将所述待测样品采用高效液相色谱进行检测；
其中，所述中间体A具有如下所示结构，
Figure FDA0003391362960000011
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述供试品与2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯摩尔比为1:4～12；进一步为1:6～10。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述柱前衍生的温度为40～80℃，进一步为60～80℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述柱前衍生的时间为0.5h以上，进一步为0.5～6h。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱为反相柱，检测柱温为50～70℃；进一步所述柱温为55～70℃。
6.根据权利要求1～4任意一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的洗脱程序是等度的，采用流动相体系包括乙酸铵水溶液和乙腈。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述乙酸铵水溶液占所述流动相体系体积分数为25％～45％；进一步所述体积分数为30％～40％。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述乙酸铵水溶液pH为3.0～6.5，进一步为4.0～6.0。
9.根据权利要求1～4所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的检测波长为190～280nm，进一步为195～275nm。
10.根据权利要求1～4所述的检测方法，其特征在于，所述供试品与2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖异硫氰酸酯的摩尔比为1:8，在80℃下柱前衍生3h～4h；然后采用包括以下色谱条件进行高效液相色谱检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，检测柱温为60～70℃，检测波长为195～275nm，在流动相等度洗脱的条件下检测，所述流动相为0.01moL～0.05moL的乙酸铵水溶液与乙腈按40:60体积比混合所得，其中所述乙酸铵水溶液pH为3.0～6.5。
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