CN116218918A - 一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途。该效应细胞的构建是通过在Jurkat细胞中，对Nur77基因终止密码子区域进行基因编辑的同时，将两个报告基因GFP和luciferase定点敲入Nur77基因的编码框后，以保证报告基因的表达调控同内源性Nur77基因的表达一致。该效应细胞可通过Nur77信号强弱来反应和评估CAR和TCR分子的特异性功能，包括抗原依赖信号和非抗原依赖Tonic信号的强弱。本发明方法高效、经济、便捷且结果稳定准确。

Description

一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途
技术领域
本发明涉及一种效应细胞及其构建方法和用途，具体涉及一种Jurkat效应细胞及其构建方法和用途。
背景技术
肿瘤免疫治疗是通过调动机体的免疫***，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。近几年，随着CAR-T和TCR-T技术的发展，使得肿瘤免疫治疗焕发新春，并进入大爆发阶段。其中，CAR-T已经在血液肿瘤上显示出治愈肿瘤的潜力。嵌合抗原受体(CAR)和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞是当前过继性细胞治疗技术中最新和最富有成效的技术，实现了从基础免疫学机制研究到临床肿瘤免疫治疗应用的转变。因其能够表达人工合成受体并能特异性识别靶细胞，CAR-T和TCR-T正成为振奋人心的肿瘤治疗方法。
CAR和TCR特异性分子序列设计和筛选，以及结构优化和评价是目前各大公司和学术结构在开发CAR-T和TCR-T产品中所面临的最关键问题。比如，目前传统筛选方法以高亲和力为指标选择CAR分子，无法区分肿瘤细胞和正常细胞。在临床中，肿瘤特异性不高的CAR-T细胞在杀伤癌细胞的同时会攻击正常细胞，从而对患者正常生理功能产生副作用。此外，CAR除了特异性识别肿瘤靶抗原以激活T细胞发挥杀伤功能，其本身CAR分子在T细胞表面的表达密度，折叠构象，以及共刺激因子等结构特性都可能会激活T细胞的非抗原依赖的信号，被称为Tonic信号。当这种Tonic信号过强时，在没有靶抗原刺激下，该信号便可过度激活T细胞，诱导T细胞分化，加速T细胞耗竭，从而减少CAR-T在体内的存续性，进而影响其抗肿瘤功能。因此，开发同时能够评价CAR以及TCR分子亲和性、特异性和Tonic信号的高效甚至高通量的评估体系，是推动CAR-T和TCR-T疗法进一步拓展的关键步骤。
Jurkat细胞是人白血病T淋巴细胞，具有原代T淋巴细胞的相应特点与功能，表面表达CD3等抗原，通过基因工程改造可成为用于CD3双抗以及CAR或TCR分子特异性评估的效应细胞。目前常用的如Jurkat-NFAT-LUC细胞，该效应细胞构建的原理是基于TCR/CD3复合物或CAR分子被靶向刺激后导致细胞内PLC-γ的磷酸化和活化，进而激活NFAT通路的转录，从而使NFAT-RE介导的荧光产生，最终利用荧光信号的强弱来反应抗体或CAR分子的特异性。与NFAT相类似的还有如基于41-BB或CD69信号通路构建的Jurkat效应细胞，但是这些基因的表达调控不仅通过直接的抗原刺激而被激活，而且还被其他炎症介质(例如I型干扰素和白介素)间接激活。因此，并不是很合适用于Tonic信号的评估。Nur77(NR4A1)作为核受体家族转录因子，它的表达可作为淋巴细胞抗原特异性激活的分子标志物，已经在人胸腺组织和基因报告小鼠中得到证实，同时在小鼠模型中也证明它对I型干扰素或细胞因子刺激没有反应。
因此，本发明提供了一种基于Nur77信号通路的基因工程改造的Jurkat效应细胞的构建方法以及该效应细胞的具体用途，对CAR或者TCR分子的功能评估具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于解决传统的Jurkat效应细胞面临的无法同时高效精准的检测CAR以及TCR分子亲和性、抗原依赖的特异性信号以及非抗原依赖的Tonic信号等问题。通过基因编辑的策略，构建一种基于Nur77信号通路的Jurkat效应细胞，可同时高效精准并且快捷方便的评估CAR或TCR分子的抗原依赖的特异性信号以及非抗原依赖的Tonic信号。
为实现上述目的，本发明提供了一种构建Jurkat效应细胞的方法，包括以下具体步骤：
通过在Jurkat细胞中对Nur77基因终止密码子区域进行基因编辑的同时，将报告基因定点并同框敲入Nur77基因的编码框，以保证报告基因的表达调控同内源性Nur77基因的表达一致。
较佳的，将基因编辑物质递送至Jurkat细胞所使用的基因编辑方法可以是ZFN、TALEN或/和CRISPR-Cas9等；优选CRISPR-Cas9，Cas9可以为SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9、cpf1或其它不同菌属的Cas9；更优选SpCas9。
较佳的，基因编辑物质可以是质粒、病毒、DNA、mRNA或/和RNA蛋白复合体；优选RNA蛋白复合体或/和同源修复的模板dsDNA。
较佳的，基因编辑物质的递送可以使用脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射或基因枪的转染方法；优选电穿孔转染。
在一些实施方案中，CRISPR-Cas9基因编辑物质包括Cas9 mRNA、Cas9蛋白或/和sgRNA。优选使用Cas9蛋白和sgRNA形成的RNP复合体进行电转。RNP复合体可以通过直接混合温育Cas9蛋白和sgRNA获得，或者通过将二者混合于特定缓冲液(诸如电转缓冲液)中获得。
在一些实施方案中，sgRNA的设计是首先明确敲入的基因组位点，利用该位点周围的DNA序列设计的。设计的原则是PAM区序列为NGG，其中N为A、T、C和G中的任一碱基。sgRNA包括靶向的crRNA序列和tracrRNA序列，其中crRNA可以是17、18、19、20、21或22个碱基，优选20个碱基。
在一些实施方案中，sgRNA是未经修饰的或化学修饰的。化学修饰包括2-O-甲基化、3-硫代、2-O-甲基化结合3-硫代等。
在一些实施方案中，5’和3’端3个碱基同时进行2-O-甲基化和3-硫代修饰。化学修饰可以发生在sgRNA的5’和3’端的1至10个碱基。设计好的sgRNA可以通过T7体外转录获得，也可以直接体外合成。
在一些实施方案中，基因编辑物质还包括用于编辑位点处同源修复的模板dsDNA。同源修复模板dsDNA包括左同源臂DNA、敲入的外源报告基因、右同源臂DNA。模版DNA的左同源臂与DNA切口5’端序列同源，右同源臂与DNA切口3’端序列同源。
在一些实施方案中，左右同源臂片段长度可选50至1000个碱基，优选150个碱基。敲入的报告基因需要与内源性Nur77基因同框表达，以通过报告基因的表达来反映内源性基因的表达水平。报告基因可以是荧光蛋白基因、荧光素酶基因、氯霉素乙酰基转移酶基因、二氢叶酸还原酶基因、β-半乳糖苷酶基因和β葡萄糖醛酸酶基因中的至少一种；优选绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因组合的双重报告基因。
在一些实施方案中，内源Nur77基因和报告基因以剪切肽隔开，剪切肽可选自T2A、P2A、E2A和F2A中的至少一种；优选P2A和T2A的组合。
在一些实施方案中，同源修复模板dsDNA合成完成后可克隆连接至质粒载体中，质粒载体可以是任意的一种，例如pUC57、pCDNA3.1、pCMV等，连接的位置也可以是灵活的。也可以不连接至质粒载体，直接进入后续步骤。
在一些实施方案中，同源修复dsDNA的获得可以利用未修饰或修饰的引物进行PCR扩增，修饰引物采用5’-硫代磷酸结合5’-Biotin-TEG或5’-锁核酸进行修饰。模版dsDNA在经过PCR扩增后，可分别或联合采用以下几种方法进行纯化浓缩：各试剂公司的DNA纯化试剂盒纯化、各种DNA结合磁珠纯化、凝胶层析、离子层析、亲和层析、超滤管超滤、透析膜透析等。
在一个实施方案中，本发明还公开了一种在Nur77编码框后定点敲入绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因双重报告基因的Jurkat效应细胞的建立方法，将合成的gRNA同修复模板dsDNA电转染Jurkat细胞，经筛选得到所述Jurkat效应细胞。
较佳地，其包括以下步骤：
步骤1、Nur77 gRNA序列的设计和评估；
步骤2、同源修复模板dsDNA的分子设计和制备；
步骤3、用电转的方法将cas9-sgRNA RNP复合物以及模板dsDNA转染进Jurkat细胞；
步骤4、采用荧光素酶活性测定的方法，筛选和验证报告基因敲入的细胞池；
步骤5、从报告基因敲入的细胞池中筛选和验证正确敲入的单细胞克隆。
其中所述sgRNA如SEQ ID NO:1～7中至少一项所示，优选为SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3或/和SEQ ID NO:6所示；其中所述修复模板dsDNA如SEQ ID NO:8所示。
本发明还提供了一种Jurkat效应细胞的应用，其一方面可用于CAR、TCR和BCR分子以及抗体特异性功能筛选和评价，尤其是对CAR分子抗原依赖信号和非抗原依赖的Tonic信号的精准检测；其另一方面可用于高通量筛选抗体展示文库的CAR分子。
本发明的优点是：选择了在Jurkat细胞中同时将两种报告基因(GFP和luciferase基因)定点敲入Nur77基因的编码框，以构建一种基于Nur77信号通路的Jurkat效应细胞。该效应细胞可通过流式和荧光素酶实验来测定Nur77信号强弱以评估CAR或TCR的特异性功能。
1、通过选择靶向Nur77信号通路构建效应细胞，相比现有技术，可以更精准的测定CAR或TCR分子非抗原依赖的Tonic信号，更利于快速筛选和评估出较优的CAR或TCR分子用于体内或临床验证，有利于加速CAR-T或TCR-T项目的研发进程。
2、通过选择双重报告基因，实验方法上选择将更加灵活和方便。由于多数CAR分子在抗原刺激下将诱发T细胞上CAR分子的内吞，不适合流式精准检测CAR阳性细胞群的抗原特异性信号，因此，可选择测定荧光素酶来代替流式检测GFP信号，更利于综合评估出最优的CAR或TCR分子。
3、目前CAR分子基本来源于已经经过亲和性和特异性验证的抗体序列的scFv或VHH，而大量的实验结果也表明优异的抗体分子并不一定适合在CAR-T上使用。因此，适合CAR-T的CARs分子和结构的高通量筛选技术平台需要建立和完善。而本发明构建的Jurkat效应细胞，将非常适合用于抗体展示文库起始的CAR分子高通量筛选，相比传统抗体文库的多轮淘选和验证，基于Jurkat效应细胞的筛选流程将更方便、更快捷和更经济，筛选出的CAR分子和结构本身就是为CAR-T量身定制的。
4.本发明方法可以高效地建立Nur77位点定点同框敲入LUC和GFP双重报告基因的稳定细胞系。
附图说明
图1是基于Nur77信号通路的Jurkat效应细胞构建示意图，
图2是基于Nur77信号通路的Jurkat效应细胞工作原理图，
图3是基因编辑细胞池荧光素酶的表达检测，
图4是单细胞克隆荧光素酶的表达检测，
图5是Jurkat效应细胞单细胞克隆基因型鉴定，
图6是MSLN CAR表达以及非抗原依赖的Tonic信号检测，
图7是MSLN CAR抗原依赖信号的检测，
图8是MSLN CAR抗原依赖和非抗原依赖信号的比较分析。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用生物或化学试剂，均为市售产品。
实施例1：靶向Nur77位点的sgRNA设计合成和筛选
为了实现高效的将报告基因定点***Nur77基因的编码框，将选择Nur77终止密码子前后大约50bp，共约100bp序列，通过在线sgRNA设计网址(http://crispor.tefor.net/)进行sgRNA设计，筛选评分较高的7条序列进行体外合成(由南京金斯瑞提供sgRNA合成服务)。优选的，在本实施例中所有sgRNA在5'端和3'端各3个碱基均进行3’-硫代和2’-O-甲基化修饰，以使sgRNA更稳定而不容易在转导入细胞后被核酸酶迅速降解。化学合成的sgRNA序列详见表1(Nur77 sgRNA列表及切割效率)
表1
编号 序列编号 PAM Indel％
sgRNA-01 SEQ ID NO:1 GGG 81
sgRNA-02 SEQ ID NO:2 TGG 13
sgRNA-03 SEQ ID NO:3 TGG 67
sgRNA-04 SEQ ID NO:4 TGG 22
sgRNA-05 SEQ ID NO:5 GGG 15
sgRNA-06 SEQ ID NO:6 AGG 63
sgRNA-07 SEQ ID NO:7 AGG 34
为了筛选最佳的sgRNA，将合成的200pmol sgRNA分别与100pmol TrueCutTMCas9蛋白(购买自Thermo Fisher)混匀后室温孵育20min；使用LONZA Nucleofector System，按照电转推荐程序CL-120电转RNP至5E5 Jurkat细胞中，电转后的细胞立即转移至含预热培养基的12孔板中，标记好名称。3～5天后，取电转后的细胞根据基因组DNA提取试剂盒说明书(TIANGEN)抽提基因组DNA，未经编辑的野生型Jurkat基因组作为对照。通过切割位点前后设计的特异性引物Nur77-SF(SEQ ID NO:9)与Nur77-SR(SEQ ID NO:10)，PCR扩增基因编辑区域以进行Sanger测序。测序结果同对照序列对比，以检测相应sgRNA的特异性编辑效率。具体编辑效率是通过在线分析工具ICE Analysis进行分析(https://ice.synthego.com)，分析结果如表1所列。结果显示SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6具有更高的编辑效率。
实施例2：同源修复模板dsDNA的分子设计和制备
本发明构建的Jurkat效应细胞的基因改造方案是首先利用CRISPR-Cas9对Nur77基因组位点的终止密码子区域产生DNA切口，进而利用同源修复模板dsDNA(包含报告基因)对DNA切口进行同源重组修复，最终将报告基因LUC和GFP定点敲入Nur77基因编码框内，该基因改造可使定点导入LUC和GFP基因，利用内源基因Nur77启动子转录表达。具体的构建示意图如图1所示。同源修复模板dsDNA包括两大部分：
a.左右同源臂：左右同源臂主要用于识别目的DNA，并进行重组交换，为了使敲入基因能正确表达，将敲入基因定点到Nur77基因最后一个外显子的3’端区域。同时，为保证选择的sgRNA不会对修复模板进行编辑，故在左同源臂的互补区域进行了个别碱基的同义突变。另外，同源臂的长短对整个基因敲入的效率较为重要，一般同源臂越长，敲入效率会越高，但是整个基因敲入序列的长度是受限的，鉴于本发明需敲入的报告基因长度偏长，优选的，故本实施例选择切割位点上下游大约150bp的序列作为同源臂。
b.报告基因：本发明选择同时敲入两个报告基因，荧光素酶基因LUC和绿色荧光蛋白基因GFP。为了保证***的两个基因能够同内源的Nur77基因表达一致，本发明在这三个基因之间加入了剪切肽，本实施例选择了P2A和T2A的组合。
同源修复模板dsDNA的所有组分按顺序设计后，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。该序列基因合成后(由上海生工提供基因合成服务)直接克隆到克隆质粒pUC57上。以该质粒为模板，以设计的未修饰同源模板引物Nur77-LG-F(SEQ ID NO:11)和Nur77-LG-R(SEQID NO:12)，PCR大量扩增用于同源修复的dsDNA分子。PCR产物经MN试剂盒纯化回收以获得高浓度和高纯度的同源修复dsDNA(SEQ ID NO:8)。
实施例3：Jurkat效应细胞的构建
1)Jurkat细胞的电转
针对每条sgRNA，取1E6个Jurkat细胞进行电转以递送spCas9蛋白(购买自ThermoFisher)、sgRNA和同源修复dsDNA(实施例2中获得的PCR纯化产物)，从而一次性实现剪切Nur77基因组位点和敲入报告基因，电转过程使用Lonza电转试剂盒(货号：V4XP-3024)和Lonza电转设备(4D-Nucleofector)。具体流程为：配制Lonza电转缓冲液后，将100pmolspCas9蛋白分别与设计合成的200pmol sgRNA-01和sgRNA-03混匀后室温孵育20min，再加入6μg同源修复dsDNA。为了进一步增强编辑效率，可选择再加入200pmol Alt-RElectroporation Enhancer(购买自IDT)，室温混匀后与1E6 Jurkat细胞沉淀混匀并加入电转杯中，按照推荐程序CL-120电击，电击完成后加入至含2ml预热培养基的6孔板中，标记好名称。可选择连续重复2～3次上述电转过程。
2)单细胞克隆筛选验证
a.细胞池验证：Jurkat细胞电穿孔后继续培养7天，采用荧光素酶实验来检测细胞池中报告基因的敲入效果。由于T细胞在PMA和Ionomycin两种激动剂的刺激下，会诱导和激活Nur77基因的表达。因此，当报告基因成功敲入Nur77基因座的话，其报告基因也会随着Nur77的激活而同时表达，故将取1E5个所有经编辑的细胞，同包括未编辑的对照组Jurkat细胞于96孔板。针对每种细胞，设置两组和两个复孔，一组均添加2.5μM Ionomycin和20ng/mL PMA(购买自碧云天)作为实验组，另一组未添加作为对照组。37度培养箱放置2h后，每孔加入50uL荧光底物One-Glo(购买自Promega)，利用荧光光度仪(Envision)测定荧光值，并分析结果。结果分析如图3所示。该结果显示，sgRNA-01和sgRNA-03组细胞池中，相比对照都具有正确敲入的细胞克隆存在，其中在两次重复中，sgRNA-01组的编辑效率都要高于sgRNA-03组。
b.单细胞克隆筛选：采取有限稀释法，将sgRNA-01组的细胞按每孔0.5和1接种到96孔板中，37度CO2培养箱中培养10～14天，挑选明显单克隆的细胞至48孔板中继续放大培养。培养4天后，每孔取出一半细胞采用荧光素酶实验方法进行初筛，具体方法同前。大致流程为：从挑取的58个克隆中，取出100uL(大约1半的细胞)于黑色不透明96孔板中，每孔各加添加2.5μM Ionomycin和20ng/mL PMA，反应2h后，每孔加入50uL荧光底物One-Glo(购买自Promega)，利用荧光光度仪(Envision)测定荧光值，分析结果如图4所示。最终挑选细胞增殖较好以及荧光信号较高的NLG-1、NLG-8、NLG-31、NLG-46和NLG-57号单细胞克隆做进一步的放大扩增及冻存，同时提取其中的基因组DNA做进一步的基因型鉴定和测序分析。基因型鉴定引物为：Nur77-SF、Nur77-SR和LUC-GFP-R(SEQ ID NO:13)。PCR电泳图如图5所示，结果显示NLG-8为纯合子，即两个等位基因均***报告基因，而其它4个克隆为杂合子，即只有一个等位基因顺利***报告基因，而另外一个等位基因为野生型。进一步测序结果证实5个克隆在Nur77的最后一个外显子的3’端均正确***设计的报告基因。
实施例4：Jurkat效应细胞用于CAR分子的功能筛选和评估
本实施例选择MSLN-BBz CAR分子的功能筛选流程作为实例介绍，其他CAR或TCR分子或结构的功能筛选及评估流程基本类似。
CAR-Jurkat细胞的制备
将构建及制备的不同MSLN-BBz CAR分子(共6条，包括一条经过Novartis临床验证的BMK分子M5)的慢病毒感染实施例3中筛选验证的Jurkat效应细胞株NLG-8#克隆，MOI等于1。感染后的细胞转移至37℃，5％CO2细胞培养箱培养3～7天，每隔2天换液或传代。
MSLN CAR表达以及非抗原依赖Tonic信号的检测
取培养3～7天的MSLN CAR-Jurkat细胞，通过FACS的方法检测MSLN CAR的表达以及非抗原依赖的Tonic信号，具体检测流程为：
a.抗体的染色：每组取1E5的细胞于96孔板，350g离心5min，去除上清，加入PBS洗1遍后，加入Fc标记的Mesothelin抗原(购买自Acro)4度孵育30min。离心，PBS洗1遍后，加入AF647标记的抗人Fc二抗(购买自Jackson)4度孵育。孵育30min后离心，并用100uL PBS重悬细胞，流式检测。其中BMK平行设置两组，一组为阳性对照组，在抗体孵育前于96孔板中添加2.5μM Ionomycin和20ng/mL PMA预处理1h，而另一组未处理。
b.流式检测及分析：经过染色的细胞通过BD流式仪进行FACS检测APC和FITC通道，流式结果采用FlowJo进行分析，结果如果6所示。FACS结果显示除了CAR-4#分子表达较差，其他CAR分子都有较好的表达。由于采用抗原检测CAR的表达，可以通过CAR表达的强弱反映其抗体序列的亲和性，而本次结果显示CAR-1#相比BMK具有较高的表达强度，而CAR-5#具有类似和CAR-2#具有较低的表达强度。因此采用Jurkat效应细胞，相比原代T细胞和传统的抗体亲和性检测，其感染效率高，简单方便和更经济。同时，通过检测CAR-Jurkat细胞中本底GFP的表达水平，可以反映CAR在未接受抗原刺激下的自激活程度，即Tonic信号。本实验结果显示BMK CAR具有非常低的GFP表达，说明其Tonic信号弱，当加入激动剂Ionomycin和PMA刺激后其CAR阳性群细胞会从GFP阴性转为阳性，表明本专利发明构建的Jurkat效应细胞特异很好。进一步的MSLN CAR分子的GFP表达，发现CAR-3#分子在CAR阳性群中具有很高的GFP表达，说明其Tonic信号很高，不适合作为CAR分子，而CAR-1#和CAR-5#具有和BMK一样较低的GFP表达水平，说明其Tonic信号都较弱，可作为进一步开发的候选CAR分子。
MSLN CAR抗原依赖信号的检测
由于多数靶点的CAR分子在受到抗原刺激后会介导CAR分子在细胞膜上的内吞，故采用FACS方法不能直接用于CAR分子抗原依赖信号的检测，因此，本发明采用CAR-Jurkat效应细胞在抗原和非抗原刺激下荧光素酶表达的强弱来反映CAR分子抗原依赖的信号，而该信号可进一步反映CAR的靶向特异性和杀伤功能。具体实验流程为：取培养3～7天的MSLNCAR-Jurkat细胞，根据CAR的表达水平，将所有组的CAR表达水平调整到一致水平。按1:1或2:1的效靶比，将CAR-Jurkat细胞分别与不同MSLN表达水平的靶细胞共孵育3～5小时。本实施例选择按1:1的效靶比，取各组经CAR表达水平调整一致后的CAR-Jurkat细胞分别与MSLN不表达的靶细胞A2780、MSLN弱表达的靶细胞SKOV3和MSLN高表达的靶细胞OVCAR3于黑色不透明96孔板中共孵育4小时，其中未感染CAR的Jurkat细胞作为对照组。每孔效应细胞或靶细胞的数量为4E4，设置2个复孔。共孵育4h后，每孔加入50uL荧光底物One-Glo(购买自Promega)，并利用荧光光度仪(Envision)测定荧光值，分析结果如图7所示。荧光素酶的表达检测结果表明，CAR-1#和CAR-5#具有类似于BMK的靶向特异性激活，表现为在MSLN阴性细胞A2780的刺激下显示极低的荧光素酶的活性，在MSLN高表达细胞OVCAR3刺激下显示较高的荧光素酶活性，而在弱表达细胞SKOV3刺激下显示相对较弱的荧光素酶活性。综合分析图6非抗原依赖信号和图7抗原依赖信号的实验数据(如图8所示)，就不难评价出CAR-1#和CAR-5#具有类似于BMK CAR分子的功能，表现为较低的非抗原依赖的Tonic信号和较高和较特异的抗原依赖的信号，可作为候选分子做进一步的体内验证或临床开发，而其他CAR分子将不值得做进一步的开发。
因此，从以上实例数据可以看出，基于本发明开发的Jurkat效应细胞可非常经济和快速高效的筛选出更合适的CAR分子用于进一步的CAR-T项目开发，对加速CAR-T项目的开发具有十分重要意义。
实施例5：Jurkat效应细胞用于展示文库CAR分子的筛选流程
本专利发明的Jurkat效应细胞除了可以用于抗体序列来源的scFv或VHH的筛选评估，也非常适合用于高通量筛选抗体展示文库的CAR分子。由于筛选出的CAR分子和结构本身就是为CAR-T量身定制的，因此将更方便、更经济和更高效。推荐的高效筛选流程为：
淘选富集：采用特定抗原或靶细胞通过1～2轮初步淘选抗体(scFv)展示文库(包括但不限于是免疫文库或
Figure BDA0003932716230000111
文库)以富集特定靶点的抗体序列。
CAR病毒库的构建：设计通用引物以抗体展示文库基因组DNA为模板扩增抗体的scFv序列，并组装到常规二代CAR结构中，例如CD8sp-scFv-CD8Hinge-CD8TM-41BB-CD3z。最后转化大肠杆菌，并提取混合克隆的质粒，包装慢病毒或逆转录病毒，以构建CAR病毒库。
CAR-Jurkat细胞库的构建：将包装好的CAR病毒感染Jurkat细胞，以构建CAR-Jurkat细胞库。
CAR分子的筛选：取适当CAR-Jurkat细胞库与特异靶细胞共孵育，通过流式分选出GFP阳性群细胞，进一步培养或提取DNA，最后用CAR引物扩增出CAR序列，TA克隆，测序以获得初筛的CAR序列。如果获取的序列偏多可选择进行两轮或多轮重复筛选，对获取的序列可以按照实施例4做进一步的筛选验证。
采用本专利发明的Jurkat效应细胞，按照推荐的筛选流程，最快可在一个月内筛选出较优的CAR分子用于进一步CAR-T项目的开发，十分经济和高效。

Claims (10)

1.一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：通过在Jurkat细胞中对Nur77基因终止密码子区域进行基因编辑的同时，将报告基因定点并同框敲入Nur77基因的编码框后，以保证报告基因的表达调控同内源性基因Nur77的表达一致。
2.根据权利要求1所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，使用选自ZFN、TALEN或/和CRISPR-Cas9的基因编辑方法递送基因编辑物质。
3.根据权利要求1或2所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，基因编辑物质为同源修复模板dsDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
4.根据权利要求1或2所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，使用Cas9蛋白和sgRNA形成的RNP复合体进行电转。
5.根据权利要求4所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，所述sgRNA的靶向核苷酸序列如SEQ ID NO:1～7中至少一项所示。
6.根据权利要求1或2所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，所述报告基因为绿色荧光蛋白和荧光素酶基因组合的双重报告基因。
7.根据权利要求1或2所述的一种构建Jurkat效应细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下具体步骤：
1)Nur77 gRNA序列的设计和评估；
2)同源修复模板dsDNA的分子设计和制备；
3)用电转的方法将cas9-sgRNA RNP复合物以及模板dsDNA转染进Jurkat细胞；
4)采用荧光素酶活性测定的方法，筛选和验证报告基因敲入的细胞池；
5)从报告基因敲入的细胞池中筛选和验证正确敲入的单细胞克隆。
8.一种基于Nur77信号通路的Jurkat效应细胞其特征在于，根据权利要求1或2所述的方法制备。
9.权利要求8所述的Jurkat效应细胞在CAR和TCR分子特异性功能筛选和评估中的应用。
10.权利要求8所述的Jurkat效应细胞在抗体展示文库高通量筛选CAR分子中的应用。
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