CN116218761B - 组织来源的细胞外囊泡制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
一种组织来源的细胞外囊泡制备方法及应用，通过在Ⅰ型胶原酶中加入DMEM配备成Ⅰ型胶原酶溶液；将离体背部皮肤浸泡在DMEM培养基或PBS缓冲液中；将离体背部皮肤切成指定大小的皮肤组织块，将所述皮肤组织块转移至预冷的DMEM培养基中进行第一次离心；弃除第一次离心后的上清液，加入所述Ⅰ型胶原酶溶液重悬，随后置于水浴锅中振荡孵育达到预定时长后，再用预冷的DMEM培养基终止消化；第二次离心去除皮肤组织块，第三次离心去除细胞和碎片，第四次离心去除杂质颗粒，第五次离心分离得到皮肤组织细胞外囊泡。本发明具有产量大、纯度高、耗时短、成本低、工艺简单等特点，具有较高的生物安全性，能用于创面修复、细胞增殖、血管再生和ECM重塑。
Description
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡技术领域，具体涉及一种组织来源的细胞外囊泡制备方法及应用。
背景技术
基于细胞外囊泡(Extracellularvesicle,EV)的新型疗法已成为促进多种组织损伤后修复的有效手段。例如，体外培养的细胞如间充质干细胞(MSCs)分泌的EV已显示出促进皮肤和肾脏等组织修复的潜能。EV作为一种细胞分泌的纳米级囊泡，其相比于合成纳米颗粒具有诸多优势，如具有较低的免疫原性、较高的生物安全性、稳定性及跨越生物屏障的能力等。
然而，当前EV疗法的疗效和临床转化前景仍不尽如人意，常用EV生产策略面临多种问题，包括培养上清中EV含量相对较低，成本高且耗时长，因为其需要长期培养大量细胞，反复处理大量培养基和消耗大量试剂/材料。此外，长期的细胞培养也会影响EV供体细胞尤其是原代细胞的表型，从而削弱其产生EV的生物学功能。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种组织来源的细胞外囊泡制备方法及应用，以解决传统技术细胞外囊泡含量相对较低，成本高且耗时长，生物学功能削弱的问题。
本发明实现上述目的的技术方案如下：一种组织来源的细胞外囊泡制备方法，在Ⅰ型胶原酶中加入DMEM配备成Ⅰ型胶原酶溶液；将离体背部皮肤浸泡在DMEM培养基或PBS缓冲液中；
将离体背部皮肤切成指定大小的皮肤组织块，将所述皮肤组织块转移至预冷的DMEM培养基中进行第一次离心；
弃除第一次离心后的上清液，加入所述Ⅰ型胶原酶溶液重悬，随后置于水浴锅中振荡孵育达到预定时长后，再用预冷的DMEM培养基终止消化；
第二次离心去除皮肤组织块，第三次离心去除细胞和碎片，第四次离心去除杂质颗粒，第五次离心分离得到皮肤组织细胞外囊泡。
作为组织来源的细胞外囊泡制备方法优选方案，制备的Ⅰ型胶原酶溶液浓度为1mg/mL；皮肤组织块的大小为1mm3。
作为组织来源的细胞外囊泡制备方法优选方案，第一次离心条件为：350g离心力下离心5min。
作为组织来源的细胞外囊泡制备方法优选方案，重悬后置于37℃水浴锅中振荡孵育2h。
作为组织来源的细胞外囊泡制备方法优选方案，第二次离心条件为：300g离心力下离心10min。
作为组织来源的细胞外囊泡制备方法优选方案，第三次离心条件为：4℃，2000g离心力下离心30min。
作为组织来源的细胞外囊泡制备方法优选方案，第四次离心条件为：4℃，4000g离心力下离心60min。
作为组织来源的细胞外囊泡制备方法优选方案，第五次离心条件为：4℃，120000g离心力下离心70min。
作为组织来源的细胞外囊泡制备方法优选方案，将第五次离心分离得到的皮肤组织细胞外囊泡用PBS缓冲液洗涤，PBS缓冲液洗涤后进行第六次离心，第六次离心条件为：4℃，120000g离心力下离心70min，收集洗涤后的皮肤组织细胞外囊泡。
本发明还提供一种组织来源的细胞外囊泡注射剂，采用上述的组织来源的细胞外囊泡制备方法制得。
本发明还提供一种组织来源的细胞外囊泡注射剂在组织修复中的应用，所述组织修复中的应用包括创面修复、细胞增殖、血管再生和ECM重塑。
本发明的有益效果是，通过在Ⅰ型胶原酶中加入DMEM配备成Ⅰ型胶原酶溶液；将离体背部皮肤浸泡在DMEM培养基或PBS缓冲液中；将离体背部皮肤切成指定大小的皮肤组织块，将所述皮肤组织块转移至预冷的DMEM培养基中进行第一次离心；弃除第一次离心后的上清液，加入所述Ⅰ型胶原酶溶液重悬，随后置于水浴锅中振荡孵育达到预定时长后，再用预冷的DMEM培养基终止消化；第二次离心去除皮肤组织块，第三次离心去除细胞和碎片，第四次离心去除杂质颗粒，第五次离心分离得到皮肤组织细胞外囊泡。本发明具有产量大、纯度高、耗时短、成本低、工艺简单等特点，在促进细胞的增殖和迁移方面具有相似的生物学功能，具有较高的生物安全性，能用于创面修复、细胞增殖、血管再生和ECM重塑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例中提供的组织EV和细胞EV的生产参数和生物学特性比较；
图2为本发明实施例中提供的组织EV和细胞EV的生物学功能比较；
图3为本发明实施例中提供的组织EV具有较高的生产批次间稳定性验证；
图4为本发明实施例中提供的异种组织EV进入小鼠体内生物安全性验证；
图5为本发明实施例中提供的大鼠皮肤组织EV促进小鼠皮肤创面愈合验证；
图6为本发明实施例中提供的大鼠皮肤组织EV促进小鼠皮肤创面细胞增殖、血管新生和ECM重塑的验证；
图7为本发明实施例中提供的大鼠皮肤组织EV促进小鼠皮肤创面胶原生成验证。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
细胞外囊泡(Extracellularvesicle,EV)是由活细胞分泌的具有脂双层结构的纳米级微囊泡，存在于细胞培养上清和多种体液中。根据其大小和生物发生途径，主要分为外泌体(～30-200nm)和微囊泡(～200-1000nm)等。EV具有多种内容物，如核酸、蛋白质、脂质、小分子代谢物等，其可以进入体液循环中被不同的组织细胞吸收，实现细胞间的物质和信息传递。EV已被证明对多种组织损伤具有修复作用。
当前EV疗法的疗效和临床转化前景仍不尽如人意，其主要原因之一在于通常采取的EV生产方法是通过对某一特定类型细胞进行体外长期培养，期间连续收集培养上清，然后通过超高速离心等从大量培养上清中分离制备。这种常用EV生产策略面临多种问题，包括培养上清中EV含量相对较低，成本高且耗时长，因为其需要长期培养大量细胞，反复处理大量培养基和消耗大量试剂/材料。此外，长期的细胞培养也会影响EV供体细胞尤其是原代细胞的表型，从而削弱其产生EV的生物学功能。
有鉴于此，本发明实施例提供一种组织来源的细胞外囊泡制备方法，包括如下步骤：
在Ⅰ型胶原酶中加入DMEM配备成Ⅰ型胶原酶溶液，制备的Ⅰ型胶原酶溶液浓度为1mg/mL；将离体背部皮肤浸泡在DMEM培养基或PBS缓冲液中；
将离体背部皮肤切成1mm3大小的皮肤组织块，将所述皮肤组织块转移至预冷的DMEM培养基中进行第一次离心，第一次离心条件为：350g离心力下离心5min；
弃除第一次离心后的上清液，加入所述Ⅰ型胶原酶溶液重悬，随后置于37℃水浴锅中振荡孵育2h，再用预冷的DMEM培养基终止消化；
第二次离心去除皮肤组织块，第二次离心条件为：300g离心力下离心10min；第三次离心去除细胞和碎片，第三次离心条件为：4℃，2000g离心力下离心30min；第四次离心去除杂质颗粒，第四次离心条件为：4℃，4000g离心力下离心60min；第五次离心分离得到皮肤组织细胞外囊泡，第五次离心条件为：4℃，120000g离心力下离心70min；
将第五次离心分离得到的皮肤组织细胞外囊泡用PBS缓冲液洗涤，PBS缓冲液洗涤后进行第六次离心，第六次离心条件为：4℃，120000g离心力下离心70min，收集洗涤后的皮肤组织细胞外囊泡。
本实施例中，采用新生大鼠皮肤2克、Ⅰ型胶原酶15mg、DMEM培养基15mL制备皮肤组织来源的细胞外囊泡：
(1)准备新生大鼠皮肤2克、Ⅰ型胶原酶15mg、DMEM培养基15mL；
(2)在Ⅰ型胶原酶中加DMEM配备成Ⅰ型胶原酶溶液，Ⅰ型胶原酶溶液浓度为1mg/mL；
(3)在超净工作台内，无菌取下新生鼠背部皮肤，皮肤浸泡在DMEM培养基或PBS缓冲液中；用手术刀或剪刀将皮肤组织尽量切成1mm3左右的皮肤组织块，将切好的皮肤组织块移至预冷DMEM中，在350g条件下离心5min；
(4)弃上清，加入15mL的Ⅰ型胶原酶溶液重悬，随后置于37℃水浴锅中振荡孵育2h，随后用大量预冷的DMEM培养基终止消化；
(5)在300g条件下离心10min去除皮肤组织块；在4℃，2000g条件下离心30min去除细胞和碎片；在4℃，4000g条件下离心60min去除杂质颗粒；在4℃，120000g条件下超速离心70min分离得到皮肤组织细胞外囊泡；
(6)皮肤组织细胞外囊泡用20mLPBS洗涤，随后在4℃，120000g条件下超速离心70min，收集洗涤后的皮肤组织细胞外囊泡。
参见图1，为皮肤组织细胞外囊泡和细胞来源的细胞外囊泡的生产参数和生物学特性比较。其中，图1中(A1)部分示出皮肤组织细胞外囊泡和细胞来源的细胞外囊泡的生产过程示意图；图1的(B1)部分示出透射电镜下皮肤组织细胞外囊泡和细胞来源的细胞外囊泡的显微结构；图1中(C1)部分示出免疫印迹法检测细胞外囊泡的阳性标记物；图1中的(D1)部分示出细胞外囊泡纳米粒径分布情况；图1中(E1)部分示出基于图1中(A1)所示生产方案生产的皮肤组织细胞外囊泡和细胞来源的细胞外囊泡的产量(通过细胞外囊泡颗粒数和蛋白总量进行量化)比较；图1中的(F1)部分示出1克皮肤组织和100万个成纤维细胞的细胞外囊泡产量比较；图1中的(G1)部分示出基于图1中(A1)所示生产方案生产的皮肤组织细胞外囊泡和细胞来源的细胞外囊泡的纯度比较。
参见图2，为皮肤组织细胞外囊泡和细胞来源的细胞外囊泡的生物学功能比较；其中，图2中(A2)部分示出经皮肤组织细胞外囊泡和细胞来源的细胞外囊泡处理后HaCaT细胞的增殖率；图2中(B2)部分示出经皮肤组织细胞外囊泡和细胞来源的细胞外囊泡处理后HaCaT细胞的迁移情况；图2中(C2)部分示出经皮肤组织细胞外囊泡和细胞来源的细胞外囊泡处理后HaCaT细胞的迁移率的定量分析；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，
***p＜0.001，NS＝无显著学差异。
参见图3，示出了皮肤组织细胞外囊泡具有较高的生产批次间稳定性。其中，图3中(A3)部分示出不同批次的皮肤组织细胞外囊泡的透射电镜图像；图3中(B3)部分示出不同批次的皮肤组织细胞外囊泡的纳米粒径分布；图3中(C3)部分示出不同批次的皮肤组织细胞外囊泡的纯度比较；图3中(D3)部分示出不同批次的皮肤组织细胞外囊泡处理后HaCaT的增殖率；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，NS＝无显著学差异。
参见图4，示出了异种皮肤组织细胞外囊泡具进入小鼠体内生物安全性高；其中，图4中(A4)部分示大鼠皮肤组织细胞外囊泡处理后第7天小鼠血清肝功能(ALB、BILT、ALT和AST)和肾功能(BUN和CREA)水平；图4中(B4)部分示出大鼠组织EV处理后第7天小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的H&E染色图像；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，NS＝无显著学差异。
参见图5，示出了大鼠皮肤组织细胞外囊泡促进小鼠皮肤创面愈合,其中，图5中(A5)部分示出了大鼠皮肤组织细胞外囊治疗小鼠皮肤损伤的实验设计；图5中(B5)部分示出了小鼠皮肤创面不同时间点照片；图5中(C5)部分示出了小鼠皮肤创面愈合率；图5中(D5)部分示出了小鼠皮肤创面H&E染色；图5中(E5)部分示出了小鼠皮肤创面Masson染色；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，NS＝无显著学差异。
参见图6，示出了大鼠皮肤组织细胞外囊泡促进小鼠皮肤创面细胞增殖、血管新生和ECM重塑。其中，图6中(A6)部分示出了小鼠皮肤创面PCNA和CD31组化染色；图6中(B6)部分示出了免疫组化染色定量统计结果；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
参见图7，示出了大鼠皮肤组织细胞外囊泡促进小鼠皮肤创面胶原生成；其中，图7中(A7)部分示出了小鼠皮肤创面TGF-β、CollageI和FN组化染色；图7中(B7)部分示出了免疫组化染色定量统计结果；与对照组相比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
可见，本发明实施例的皮肤组织细胞外囊泡避免传统地只选用单一细胞来源的细胞外囊泡，并且与传统的基于细胞培养的细胞外囊泡生产策略相比，皮肤组织细胞外囊泡的生产相比于原代细胞来源细胞外囊泡以及细胞系来源细胞外囊泡的生产而言，具有产量大、纯度高、耗时短、成本低、工艺简单等特点；皮肤组织细胞外囊泡相比于原代细胞来源细胞外囊泡以及细胞系来源细胞外囊泡而言，在促进细胞的增殖和迁移方面具有相似的生物学功能；皮肤组织细胞外囊泡的生产具有高度的批次间稳定性；异种来源的皮肤组织细胞外囊泡具有较高的生物安全性；在小鼠背部全层皮肤切除模型中，将上述皮肤组织细胞外囊泡滴加或注射于创面内，贴上无菌敷贴，皮肤组织细胞外囊泡治疗组可以显著地促进小鼠创面的整体愈合率、细胞增殖、血管再生和ECM重塑等。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.组织来源的细胞外囊泡制备方法，其特征在于，在Ⅰ型胶原酶中加入DMEM配备成Ⅰ型胶原酶溶液；将离体背部皮肤浸泡在DMEM培养基或PBS缓冲液中；
将离体背部皮肤切成指定大小的皮肤组织块，将所述皮肤组织块转移至预冷的DMEM培养基中进行第一次离心；
弃除第一次离心后的上清液，加入所述Ⅰ型胶原酶溶液重悬，随后置于水浴锅中振荡孵育达到预定时长后，再用预冷的DMEM培养基终止消化；
第二次离心去除皮肤组织块，第三次离心去除细胞和碎片，第四次离心去除杂质颗粒，第五次离心分离得到皮肤组织细胞外囊泡。
2.根据权利要求1所述的组织来源的细胞外囊泡制备方法，其特征在于，制备的Ⅰ型胶原酶溶液浓度为1mg/mL；皮肤组织块的大小为1mm3。
3.根据权利要求1所述的组织来源的细胞外囊泡制备方法，其特征在于，第一次离心条件为：350g离心力下离心5min。
4.根据权利要求1所述的组织来源的细胞外囊泡制备方法，其特征在于，重悬后置于37℃水浴锅中振荡孵育2h。
5.根据权利要求1所述的组织来源的细胞外囊泡制备方法，其特征在于，第二次离心条件为：300g离心力下离心10min。
6.根据权利要求1所述的组织来源的细胞外囊泡制备方法，其特征在于，第三次离心条件为：4℃，2000g离心力下离心30min。
7.根据权利要求1所述的组织来源的细胞外囊泡制备方法，其特征在于，第四次离心条件为：4℃，4000g离心力下离心60min。
8.根据权利要求1所述的组织来源的细胞外囊泡制备方法，其特征在于，第五次离心条件为：4℃，120000g离心力下离心70min；
将第五次离心分离得到的皮肤组织细胞外囊泡用PBS缓冲液洗涤，PBS缓冲液洗涤后进行第六次离心，第六次离心条件为：4℃，120000g离心力下离心70min，收集洗涤后的皮肤组织细胞外囊泡。
9.组织来源的细胞外囊泡注射剂，其特征在于，采用权利要求1至8任一项所述的组织来源的细胞外囊泡制备方法制得。
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