CN116209435A - 用于治疗冠状病毒感染和呼吸功能损伤的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

治疗冠状病毒感染的方法包括施用Neu1唾液酸酶‑G蛋白偶联受体‑基质金属蛋白酶9(Neu1‑GPCR‑MMP9)信号转导平台的抑制剂，具体地向感染COVID‑19及其变体的患者静脉内或通过吸入法施用治疗有效量的奥塞米韦磷酸酯，优选地与阿司匹林的口服施用结合施用，以减少呼吸功能损伤的症状和/或预防急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

Description

用于治疗冠状病毒感染和呼吸功能损伤的组合物和方法
相关申请
本发明申请主张2020年3月18日提交的美国临时专利申请62/991,387的优先权。
技术领域
本发明公开总体上涉及冠状病毒感染治疗领域。
背景技术
2019年12月，将包膜单链阳性RNA病毒鉴别为一组潜在致死性肺炎的病原。这种新型冠状病毒(COVID-19)被称为严重急性呼吸综合征(SARS)-CoV-2，并且发现类似于导致2002年发生的SARS传染病的冠状病毒(Zhu,N.等人,(2020).A Novel Coronavirus fromPatients with Pneumonia in China,2019.N Engl J Med.382,727–733)。
COVID-19感染的表现可以在大范围的临床表现之间改变。患者可以是无症状的同时传播病毒，经历轻微上呼吸道感染，或者具有急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多***器官衰竭的症状性和潜在危急生命的肺炎。
自2019年12月开始并且在全世界快速传播，COVID-19病毒已成为显著威胁人类生命的全球性传染病。感染该病毒所导致的死亡通常与急性呼吸衰竭，最值得注意地ARDS有关。具有发病前状况，包括心脏病、糖尿病和吸烟者的个体似乎因感染该病毒而死亡的风险更大。
被称为ARDS的病理生理学过程与最终导致在肺泡内产生流体的炎症反应有关，其导致呼吸衰竭。将ARDS定义为急性-发病、进行性、缺氧病况，其具有可以从几种不同疾病过程或损伤发展的而不是由静水压性肺水肿发展的放射照相双侧肺浸润(Fujishima,S.Pathophysiology and biomarkers of acute respiratory distress syndrome.jintensive care 2,32(2014))。
ARDS与最终导致呼吸衰竭和肺水肿的炎性级联有关。肺组织内血管通透性升高导致肺水肿，以及呼吸衰竭的临床结局。血管通透性升高可以是由于包括组织损伤和多种炎性级联的一些因素造成。不受控制的炎性级联对于ARDS的临床综合征的病理生理学是重要的。
急需冠状病毒感染的新的治疗，并且具体地，急需与冠状病毒感染，特别是COVID-19有关的ARDS的治疗和预防。
与不受控制的炎性级联以及频繁地ARDS有关的另一种病况是败血病。败血病是住院治疗和住院患者中死亡的常见原因。需要败血病患者，包括处于出现ARDS风险的那些患者的新型治疗。
发明内容
在一个实施方式中，提供了治疗冠状病毒感染或疑似冠状病毒感染的方法，其包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的Neu1唾液酸酶-G蛋白偶联受体-基质金属蛋白酶9(Neu1-GPCR-MMP9)信号转导平台的抑制剂以抑制通过激活的Neu1的去唾液酸化的ACE2激活。
在一些实施方式中，Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂是Neu1唾液酸酶抑制剂，优选地奥塞米韦磷酸酯(OP)或其类似物或者2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其类似物、MMP-9的抑制剂或者异源三聚体G蛋白复合物的抑制剂。
在一些实施方式中，施用Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂在24小时内降低了IL-6、TNFα和/或G-CSF促炎细胞因子中的一种或多种的血浆/血清水平，优选地在24小时内降低了≥5％、≥10％或≥25％，和/或施用Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂在24小时内降低病毒载量，优选地在24小时内降低了≥5％、≥10％或≥25％。
还提供了治疗冠状病毒感染或疑似冠状病毒感染的方法，其包括静脉内或通过吸入法向对其有需要的受试者施用治疗有效量的OP或其类似物。
还提供了治疗或预防ARDS的方法，其包括静脉内或通过吸入法向对其有需要的受试者施用治疗有效量的奥塞米韦磷酸酯或其类似物。所述受试者可以诊断患有冠状病毒感染和/或败血病。
在任何上述方法中，冠状病毒可以是COVID-19或其变体。
在一个实施方式中，方法包括静脉内或通过吸入法施用治疗有效量的OP。
在所公开的方法或用途中，受试者可以具有肺不张和/或低氧血。受试者可以患有呼吸功能损伤的一种或多种症状，其选自呼吸急促、呼吸促迫和皮肤发青，并且方法或用途可以改善或减轻这些症状中的一种或多种。
在一个实施方式中，方法包括以100mg和1000mg之间的日剂量施用OP或其类似物。
方法还可以包括向受试者施用治疗有效量的阿司匹林，在一个实施方式中，其可以与OP同时口服施用，在一个实施方式中，以100mg至1000mg之间的日剂量施用。
还提供了用途或在Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台抑制剂药剂的生产中的用途，所述药剂通过激活的Neu1抑制ACE2去唾液酸化过程以用于治疗冠状病毒感染或疑似冠状病毒感染。在一些实施方式中，Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台抑制剂是Neu1唾液酸酶抑制剂，优选地OP或其类似物或者DANA或其类似物、MMP-9的抑制剂或者异源三聚体G蛋白复合物的抑制剂。
在一些实施方式中，施用Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂在24小时内降低了IL-6、TNFα和/或G-CSF促炎细胞因子中的一种或多种的血浆/血清水平，优选地在24小时内降低了≥5％、≥10％或≥25％，和/或施用Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂在24小时内降低病毒载量，优选地在24小时内降低了≥5％、≥10％或≥25％。
另外，提供了用途或在静脉内或通过吸入法施用以用于治疗冠状病毒感染或疑似冠状病毒感染的治疗有效量的OP或其类似物的药剂生产中的用途。
还提供了用途，或在静脉内或通过吸入法施用以用于治疗或预防ARDS的治疗有效量的OP或其类似物的药剂生产中的用途。受试者可以诊断患有冠状病毒COVID-19或变体感染和/或败血病。
在任何上述用途中，冠状病毒可以是COVID-19或其变体。
Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂可以与阿司匹林组合使用。在一个实施方式中，阿司匹林与OP同时口服施用。可以以100mg至1000mg之间的日剂量使用阿司匹林。
在一个实施方式中，提供了治疗方案，其包括：通过静脉内注射向受试者施用150mg至250mg之间的冲击剂量的OP；随后，在24小时内通过连续输注施用150mg至250mg之间的另外剂量的OP；并且以450mg至550mg之间的剂量向受试者口服施用阿司匹林。
还提供了包含分散在抛射剂中的OP颗粒的药物气溶胶制剂。
附图说明
图1显示了图形ACE2模型。COVID-19S蛋白增强G蛋白偶联受体(GPCR)信号转导和基质金属蛋白酶9(MMP-9)激活以诱导Neu1唾液酸酶。激活的MMP-9除去作为含有β-半乳糖苷酶/Neu1和保护蛋白组织蛋白酶A(PPCA)的分子多酶促复合物的一部分的弹性蛋白-结合蛋白(EBP)。激活的Neu1在蛋白酶结构域(PD)水解ACE2的α-2,3唾液酰残基以除去空间位阻以辅助ACE2亚基结合以成为激活的。奥塞米韦磷酸酯(OP)特异性靶向Neu1并且在COVID-19S蛋白结合后防止ACE2亚基结合。缩写：Pi3K，磷脂酰肌醇3-激酶；GTP，鸟苷三磷酸。
图2A显示了根据实施例1的分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告分子测定结果。唾液酸酶活性与活的RAW-蓝色巨噬细胞的GPCR激动剂处理有关。细胞能够在37℃，在加湿培育箱中在12mm圆形载玻片上贴壁24h。在除去培养基后，将0.318mM 2'-(4-甲基伞形基)α-d-N-乙酰神经氨酸(4-MUNANA)底物在pH 7.4的Tris缓冲盐水中的溶液单独加入细胞(背景，Bkg))或者与S蛋白20μg/mL，20μg/mL内毒素LPS一起加入细胞。
图2B显示了根据实施例1的SEAP报告分子测定结果。与S蛋白结合的活RAW-蓝色巨噬细胞中的唾液酸酶活性被OP、BIM-46174(BIM46，异源三聚体G蛋白复合物的选择性抑制剂)和MMP9特异性抑制剂(MMP9i)抑制。细胞能够在37℃，在加湿培育箱中在12mm圆形载玻片上贴壁24h。在除去培养基后，将0.318mM 4-MUNANA底物在pH 7.4的Tris缓冲盐水中的溶液单独加入细胞(背景，Bkg))或者与S蛋白和200μg/mL奥塞米韦磷酸酯(OP)、200μg/mLBIM-46174(BIM46，异源三聚体G蛋白复合物的选择性抑制剂)或200μg/mL的MMP9特异性抑制剂(MMP9i)一起加入细胞。
图2C显示了根据实施例1的SEAP报告分子测定结果。与S蛋白(UK变体)结合的活RAW-蓝色巨噬细胞中的唾液酸酶活性被OP、BIM-46174和MMP9i抑制。细胞能够在37℃，在加湿培育箱中在12mm圆形载玻片上贴壁24h。在除去培养基后，将0.318mM 4-MUNANA底物在pH7.4的Tris缓冲盐水中的溶液单独加入细胞(背景，Bkg))或者与S蛋白和200μg/mL OP、200μg/mL BIM-46174或200μg/mL MMP9i一起加入细胞。
图3A显示了根据实施例2，如通过SEAP报告分子测定所确定的，在多个浓度下，与LPS K-12结合的活RAW-蓝色巨噬细胞中的唾液酸酶活性。LPS K-12引发SEAP表达升高，其反映了核因子κB(NF-kB)表达和炎性分子的下游诱导。
图3B显示了根据实施例2，如通过SEAP报告分子测定所确定的，在多个浓度下，与缓激肽结合的活RAW-蓝色巨噬细胞中的唾液酸酶活性。缓激肽引发SEAP表达升高，其反映了NF-kB表达和炎性分子的下游诱导。
图3C显示了根据实施例2，如通过SEAP报告分子测定所确定的，在多个浓度下，与血管紧张素1-7结合的活RAW-蓝色巨噬细胞中的唾液酸酶活性。血管紧张素1-7引发SEAP表达升高，其反映了NF-kB表达和炎性分子的下游诱导。
图3D显示了根据实施例2，如通过SEAP报告分子测定所确定的，在多个浓度下，与神经肽FF结合的活RAW-蓝色巨噬细胞中的唾液酸酶活性。神经肽FF引发SEAP表达升高，其反映了NF-kB表达和炎性分子的下游诱导。
图4A显示了根据实施例2，如通过SEAP报告分子测定所确定的，在所指明的浓度下，与LPS和S蛋白结合的活RAW-蓝色巨噬细胞中的唾液酸酶活性。
图4B显示了根据实施例2，如通过SEAP报告分子测定所确定的，在所指明的浓度下，与LPS和S蛋白UK结合的活RAW-蓝色巨噬细胞中的唾液酸酶活性。
图4C显示了暴露于10ug/mL浓度的S蛋白和所指明浓度的OP的活的RAW-蓝色巨噬细胞中的唾液酸酶活性。根据实施例2，如通过SEAP报告分子测定所确定的，OP以剂量依赖性方式抑制唾液酸酶活性。
图5显示了阿司匹林抑制人胰腺癌细胞系中神经氨酸酶1的能力。用逐渐升高的浓度的阿司匹林(1.6mM-6.4mM)预处理活的PANC-1细胞，然后用30ng/mL的EGF刺激以引起Neu-1活性。加入0.318mM 4-MUNANA底物以定量Neu-1活性。图显示了通过所列阿司匹林浓度，Neu-1活性显著降低。
具体实施方式
在一个实施方式中，提供了用于治疗或预防冠状病毒感染的新型治疗策略，其包括向患者施用以下进一步描述的新型Neu1唾液酸酶-G蛋白偶联受体-基质金属蛋白酶9(Neu1-GPCR-MMP9)信号转导平台的抑制剂。
在一个实施方式中，用静脉内或通过吸入法施用的奥塞米韦磷酸酯(OP)治疗患者。在一个实施方式中，与阿司匹林组合施用OP。
可以将本文所提供的新型治疗策略施用于诊断患有或者怀疑患有COVID-19病毒感染的患者，并且具体地，显示出指示呼吸功能损伤的临床征象的患者。
在一个实施方式中，提供了治疗具有ARDS风险的患者的方法。在一个实施方式中，提供了治疗患有具有ARDS风险的败血病的患者的方法。
如本文所使用的“受试者”是指要治疗的生物，在一个实施方式中，哺乳动物，优选地人患者。
如本文所使用的，“治疗有效量”是指以所必需的剂量和具体时间段，对于实现所期望的治疗结果有效的量。药理学试剂的治疗有效量可以根据以下因素而不同，如疾病状态、个体年龄、性别和体重以及所述药理学试剂在个体中引起所期望的反应的能力。
如本文所使用的，“治疗”表示用于获得有益或所期望的结果，包括临床结果的医学干预。有益或所期望的结果可以包括减轻或改善一种或多种症状或病况、降低疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状况，或者延迟或减缓疾病发展。治疗还可以是预防性的。治疗可能需要定期或者在疾病或病况发病之前施用多个剂量以改变疾病或病况的过程。
冠状病毒
冠状病毒，包括COVID-19，使用SARSCoV-2突刺(S)糖蛋白感染人细胞。2个突刺(S)糖蛋白结合至细胞膜蛋白血管紧张素-转换酶2(ACE2)以进入人细胞(Li,W等人Angiotensin-converting enzyme 2is a functional receptor for the SARScoronavirus.Nature 426,450–454(2003))。COVID-19已显示通过其表面上的S糖蛋白结合至ACE2以进入人细胞。在感染期间，将S糖蛋白切割成亚基S1和S2。S1含有受体结合结构域(RBD)，其允许冠状病毒直接结合至ACE2的肽酶结构域(PD)。S2在膜融合中起作用。ACE2需要二聚化为活性的。所得的同型二聚体具有两个PD，能够同时结合两个COVID-19S蛋白三聚体。COVID-19S蛋白与两个RBD形成三聚体，一个RBD面向一个方向(向下)并且另一个面向相反方向(向上)。
继续研究了ACE 2受体的二聚化的配体引发剂以及后续通过S蛋白结合允许病毒进入细胞的允许状态。认为细胞表面ACE 2受体的不依赖于配体的二聚化也是可能的(Julia Leonhardt等人,Evidence for Heterodimerization and FunctionalInteraction of the Angiotensin Type 2Receptor and the Receptor MASHypertension.2017；69:1128–1135)。来自糖基化残基的空间位阻防碍ACE 2表面受体二聚化。
ACE2主要在心脏和肾的血管内皮细胞中表达。然而，ACE将血管紧张素I转化为血管紧张素II，其具有8个氨基酸，ACE2将血管紧张素I转化为血管紧张素1-9，其具有9个氨基酸。然而血管紧张素II是有效的血管收缩剂，血管紧张素1-9对血管无作用，但是可以通过ACE被转化为较短的肽，血管紧张素1-7，它是血管舒张剂。
冠状病毒，包括导致严重急性呼吸综合征(SARS)的冠状病毒的突刺(S)蛋白与细胞受体结合以介导它们的靶细胞的感染。Li等人,Nature.2003Nov 27；426(6965):450-4识别了分离自SARS冠状病毒-易感Vero E6细胞的ACE2，其有效结合SARS冠状病毒S蛋白的S1结构域。Li等人(2003)发现ACE2，而不是相关酶ACE1的可溶性形式阻断S1结构域与Vero E6细胞的结合。ACE2转染的293T细胞，而不是HIV-1受体转染的那些，与表达S蛋白的细胞形成多核合胞体。此外，SARS冠状病毒在ACE2转染的293T细胞上有效复制，但是在空转染的293T细胞上不行。最终，抗ACE2，而不是抗ACE1抗体阻断Vero E6细胞上的病毒复制。Li等人(2003)推断ACE2是SARS冠状病毒的功能性受体。
SARS-CoV-2和SARS-CoV为了细胞进入使用ACE2受体的发现对于理解SARS-CoV-2的传播性和病理发生具有重要意义。SARS-CoV和假定地，SARS-CoV-2通过突刺蛋白与ACE2的结合导致ACE2受体下调，但是不能导致ACE受体下调。这导致病毒进入和复制，以及严重的肺损伤。
多种SARS-CoV-2变体在全世界传播，包括在UK(被称为20I/501Y.V1，VOC 202012/01或B.1.1.7)、在南非(被称为20H/501Y.V2或B.1.351)和巴西(被称为P.1)出现的变体。变体不仅可以与疾病传播性和严重程度提高有关，而且还与疫苗有效性降低有关，从而增强了对新型冠状病毒治疗的需要。
在2021年1月，来自UK的科学家报告了表明与其他变体相比，B.1.1.7变体可能与死亡风险提高有关的证据。这种变体在位置501处，在突刺蛋白(S蛋白)的受体结合结构域(RBD)中具有突变，其中氨基酸天冬酰胺(N)被酪氨酸(Y)替换。该突变简写为N501Y。该变体还具有几种其他突变，包括69/70缺失，其多次自发发生并且可能导致突刺蛋白中的构象变化；和S1/S2弗林蛋白酶切割位点附近的P681H，它是冠状病毒中具有高可变性的位点，并且它的突变也多次自发出现；和SARS2-S D614G(突刺天冬氨酸-614替换为甘氨酸)。SARS2-SD614G变体在天然S变体中显示出最高的进入效率。据信D614G变体提高了病毒传播的能力，并且是目前在UK传播的最常见的类型。D614G突变赋予S蛋白结构灵活性，并且D614G蛋白对ACE2结合比WT蛋白更有效。SARS-CoV-2D614G突刺突变提高了进入效率，且ACE2-结合亲和力增强。如实施例中进一步详细说明的，本发明人提供了本发明所述的组合物和方法将在治疗由最初鉴定的SARV-Cov-2及其变体两者，包括在突刺蛋白中具有导致构象变化的突变的那些，如B.1.1.7所引起的感染中有效。
TLR的激活
Toll-样受体(TLR)家族成员在先天性和适应性免疫反应中起重要作用并且在COVID-19感染中被激活。这些受体通过核因子κB(NF-kB)的激活上调促炎介体，如IL-6。炎性刺激，如内毒素LPS或病毒，可以通过直接结合至TLR或者通过配体结合至G蛋白偶联受体的反式激活过程引发TLR二聚化和下游信号转导。当病毒或炎性刺激结合至TLR时，它引起TLR中的构象变化，其引发G蛋白偶联受体(GPCR)的激活。然后，这种GPCR激活将引发MMP-9的激活，其切割系链至Neu-1的弹性蛋白结合蛋白(EBP)。该过程包括作为含有β-半乳糖苷酶/Neu1和保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)的分子多酶促复合物部分的EBP。EBP通过激活的MMP-9从所述复合物的直接去除可以激活Neu1。作为另外一种选择，弹性蛋白片段与EBP的结合可以通过EBP解离诱导Neu1的激活。激活的Neu1在胞外域水解糖基化TLR受体的α-2,3-唾液酸残基以除去空间位阻并有助于受体结合和激活。该过程对于理解Neu-1在SARS病毒的病理生理学中的预测作用是重要的。提供了Neu-1参与通过Neu 1诱导的Toll-样受体二聚化和激活以及ACE-2受体二聚化和激活两者，从而允许病毒进入细胞的证据。
尽管NEU-1通过其在允许TLR二聚化和下游信号转导中的作用在炎症反应中起关键作用，但是本发明人还提供了几乎相同的信号转导级联参与COVID-19感染并且通过ACE-2受体向宿主细胞的进入的证据。
具体地，参考图1，COVID-19S蛋白加强GPCR-信号转导和MMP-9激活以诱导Neu1唾液酸酶。激活的MMP-9除去作为含有β-半乳糖苷酶/Neu1和PPCA的分子多酶促复合物的一部分的EBP。激活的Neu1在蛋白酶结构域(PD)处水解ACE2的α-2,3唾液酰残基以除去空间位阻，从而辅助ACE2亚基结合以变得激活。
ACE2是SARS-CoV2的特异性功能性受体。ACE2受体必须二聚化以使得对于病毒向细胞的内化易感。存在以下迹象：通过NEU-1起始的必要的去唾液酸化过程在允许受体二聚化，并因此病毒向细胞的进入中起关键作用，从而提供了如以下进一步详细描述的新型治疗选择。
如实施例中详细描述的，使用分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)报告分子测定，确定该信号转导通路被多种G蛋白受体激动剂以及对炎性刺激，如内毒素脂多糖(LPS)响应的SEAP表达水平激活，研究了重组和S蛋白——COVID-19病毒用于通过ACE-2受体内化至细胞的分子。在该背景下，SEAP反映了NF-kB的表达水平，其导致诱导IL-6并因此反映了受体激活。
因此，本文所提供的冠状病毒治疗可以与病毒载量降低(由于病毒向细胞的内化的抑制)和炎症标志物减少两者有关。不限制上述内容的普遍性，以下进一步鉴定了与冠状病毒，并且具体地，COVID-19感染和炎性级联有关的细胞因子，并且在具体的实施方式中，细胞因子可以是IL-6、TNFα和/或G-CSF中的一种或多种。测量患者血浆/血清中冠状病毒感染病毒载量和细胞因子水平的方法是本领域技术人员已知的。在一些实施方式中，本文所提供的治疗的施用与病毒载量和炎症标志物在24小时内的可观察的减少，在多个实施方式中，≥5％、≥10％或者≥25％的减少有关。
考虑到感染结构和机制中的共同性，与Neu1唾液酸酶-G蛋白偶联受体-基质金属蛋白酶9(Neu1-GPCR-MMP9)信号转导平台有关的所公开的治疗不仅将适用于COVID-19及其变体，而且还适用于其他冠状病毒。
抑制通过Neu1唾液酸酶-G蛋白偶联受体-基质金属蛋白酶9(Neu1-GPCR-MMP9)信号转导通路的病毒进入
因此，在一个实施方式中，提供了抑制冠状病毒，并且具体地COVID-19的细胞内化，借此降低感染性和病毒载量的方法，其包括向患者施用以上所描述的Neu1唾液酸酶-G蛋白偶联受体-基质金属蛋白酶9(Neu1-GPCR-MMP9)信号转导平台的抑制剂。
在一个实施方式中，所述抑制剂是MMP9抑制剂。在一些实施方式中，所述MMP9抑制剂可以选自以下列表：
·加拉定(GM6001；Calbiochem-EMD Chemicals Inc.,Darmstadt,Germany)是基质金属蛋白酶(MMP)的有效、细胞-可渗透、广谱氧肟酸抑制剂(对于MMP1的IC50＝400pM；对于MMP2的IC50＝500pM；对于MMP3的IC50＝27nM；对于MMP8的
IC50＝100pM；并且对于MMP9的IC50＝200pM)。
·哌嗪(PIPZ；MMPII抑制剂；Calbiochem-EMD Chemicals Inc.,)是
有效、可逆、广泛的基质金属蛋白酶抑制剂。PIPZ抑制MMP1
(IC50＝24nM)、MMP3(IC50＝18.4nM)、MMP7(IC50＝30nM)和MMP9(IC50＝2.7nM)。
·MMP3抑制剂(MMP3i；基质降解酶-1抑制剂；Calbiochem-EMD Chemicals Inc.)抑制MMP3(IC50＝5nM)。
·MMP9抑制剂(MMP9i；Calbiochem-EMD Chemicals Inc.,)是细胞-可渗透、有效、选择性且可逆的MMP9抑制剂(IC50＝5nM)。它抑制MMP1(IC50＝1.05μM)，并且仅在高得多的浓度下抑制MMP13
(IC50＝113nM)。
在一个实施方式中，所述抑制剂是异源三聚体G蛋白复合物的抑制剂。在一些实施方式中，这种抑制剂可以选自以下列表：
·百日咳毒素(PTX)，来自百日咳杆菌，处于缓冲甘油水溶液中，催
化异源三聚体G蛋白Gi、Go和Gt的α亚基的ADP-核糖基化。这防止G蛋白异三聚体与受体相互作用，因此阻断它们的偶联和激活。
·BIM-46174是IPSEN Innovation(91940Les Ulis,France)友好提供的G蛋白抑制剂。咪唑并吡嗪衍生物BIM-46174起到异源三聚体G蛋白复合物的选择性抑制剂的作用。BIM-46174防止连接至介导(a)环AMP产生(Gαs)、(b)钙释放(Gαq)和(c)通过Wnt-2卷曲受体和高亲和力神经降压素受体(Gαo/i和Gαq)的癌细胞侵袭的几种GPCR的异源三聚体G蛋白信号转导。
·BIM-23127是来自Tocris Bioscience(Tocris House,IO Centre MoorendFarm Avenue,Bristol,BS11 0QL,United Kingdom)的特异性神经调节肽B受体抑制剂。BIM-23127是D-胺酸取代的环生长抑素八肽类似物。本发明人已证实GPCR神经调节肽B特异性拮抗剂BIM-23127剂量依赖性地抑制与HTC-IR细胞和RawBlue细胞有关的Neu1活性。由于NMBR在诱导MMP9弹性酶活性以及后续Neu1酶活性中的作用，假设使用BIM-23127的NMBR抑制将在GPCR激动剂刺激的和胰岛素刺激的HTC-IR和HTC-WT细胞中抑制Neu1唾液酸酶活性。BIM-23127显著抑制HTC-IR和HTC-WT细胞中通过胰岛素、铃蟾肽、缓激肽、血管紧张素I和血管紧张素II诱导的Neu1唾液酸酶活性。以10μg/mL的浓度使用胰岛素和GPCR激动剂，并且以50μg/mL使用BIM-23127。
在一个实施方式中，抑制剂是Neu1唾液酸酶的抑制剂，适当地OP或其类似物。在一个实施方式中，抑制剂是静脉内或通过吸入法施用的OP。
在多个实施方式中，奥塞米韦的类似物是根据化学式A-F中任一项的化合物：
Figure GDA0004197228670000151
其中，
R1是卤代或COOR6；
R2是OH或OR7；
R3是OH、OR8或N3；
R4是H或C1-6酰基；
R5是OC1-6烷基、SC1-6烷基、OH、SH、卤代、N3、NH2、NHC1-6烷基或NHPG4，或者
R4和R5与它们所连接的原子一起连接以形成噁唑啉环；
R6是C1-6烷基；
R7和R8是相同或不同的并且独立地为C1-6烷基、C1-6酰基或PG5，或者R7和R8与它们所连接的氧原子一起连接以形成在所述氧原子之间的碳上被一个或两个C1-6烷基(优选地，二甲基或二乙基缩酮)取代的5-元环缩酮；
PG4和PG5独立地为保护基。
Figure GDA0004197228670000161
表示单键或双键，并且
C1-6烷基和/或C1-6酰基中的一个或多个氢可选地被F替换；
Figure GDA0004197228670000162
其中
R9是COOR14
R10是H、OH或OC1-6酰基；
R13是NHC1-6酰基；
或者R10中的O和R13中的N通过共价键连接；
R11和R12独立地为C1-6烷基；
R14是C1-6烷基，并且
C1-6烷基和/或C1-6酰基中的一个或多个氢原子可选地被F替换；
Figure GDA0004197228670000171
其中，
R15是COOEt、COOMe、COOiPr、COOnPr、COOCH2C≡CH、C(O)H、C(O)OH、C(O)O-、CCl3、CN、C≡CH、CH2C≡CH或CH2OH；
R16和R17独立地为H、C1-6烷基、C1-6酰基或适合的保护基，或者R16和R17连接以形成适合的保护基，如可选地在所述氧原子之间的碳原子上被一个或两个C1-6烷基取代的环缩酮。
R18和R19独立地为H、C1-6烷基、C1-6酰基或者适合的保护基，或者R18和R19连接以形成适合的保护基；
其中R15、R16、R17、R18和/或R19中的一个或多个氢可选地被F替换；
Figure GDA0004197228670000181
其中，
R15是COOEt、COOMe、COOiPr、COOnPr、COOCH2C≡CH、C(O)H、C(O)OH、C(O)O-、CCl3、CN、C≡CH、CH2C≡CH或CH2OH；
R16和R17独立地为H、C1-6烷基、C1-6酰基或适合的保护基，或者R16和R17连接以形成适合的保护基，如可选地在所述氧原子之间的碳原子上被一个或两个C1-6烷基取代的环缩酮。
R18和R19独立地为H、C1-6烷基、C1-6酰基或者适合的保护基，或者R18和R19连接以形成适合的保护基；并且
R20是在还原或氢化反应条件下除去的基团，或者R20是适合的酸不稳定的保护基，例如，R20是OH、R、O-R、O(C)-R、Si(R)3、NO2、NH2、N(R)2、S(O)2R或S(O)2OR，其中每个R独立地为烷基、芳基或杂芳基及其多种取代的衍生物。
其中R15、R16、R17、R18、R19和/或R20中的一个或多个氢可选地被F替换；
Figure GDA0004197228670000191
其中，
X+是阳离子；
R21和R22独立地为H、C1-6烷基或C1-6酰基，或者R21和R22与它们所连接的原子连接在一起以形成未取代的或被一个或多个卤代或C1-6烷基取代的5-10-元环；
R23和R24独立地为H、C1-6烷基和C1-6酰基；
R25是OR26、NR27R28、＝O或＝NR29；
R26是H、C1-6烷基或C1-6酰基；
R23或R28独立地为H、C1-6烷基或C1-6酰基；
R29是H、OH、C1-6烷基、OC1-6烷基、C1-6酰基、OC1-6酰基、NH2、NHC1-6烷基、N(C1-6烷基)(C1-6酰基)或者NHC1-6酰基，或者
R29与R23和R24之一形成接头基团“-A-C(O)-”以提供以下化学式所示的化合物：
Figure GDA0004197228670000201
其中A是O或NH；并且
R21、R22、R23、R24、R25、R26、R27、R28和/或R29中的一个或多个可用的氢可选地被F替换；
或者
Figure GDA0004197228670000202
其中，
X+是阳离子
R30是H、C1-6烷基或C1-6酰基；
R31或R32独立地为F、C1-6烷基或C1-6酰基，或者
R31和R32与它们所连接的原子连接在一起以形成未取代的或被一个或多个卤代或C1-4烷基取代的5-10-元环；
R33或R34独立地为H、C1-6烷基或C1-6酰基；和
R30、R31、R32、R33和/或R34中的一个或多个可用的氢原子可选地被F替换
或其盐、溶剂化物、前体药物、立体异构体或同位素标记的形式或其混合物。
在其他实施方式中，化合物是化学式E所示的化合物并且R25是＝NR29。
在本发明的其他方面中，所述类似物是：
Figure GDA0004197228670000211
Figure GDA0004197228670000212
或者/>
Figure GDA0004197228670000213
在其他方面，以上结构的相应化学名为：
4-乙酰氨基-6-乙氧基-3,5-二羟基-环己-1-烯羧酸钠(A1)；
4-乙酰氨基-5-氨基-3-羟基-环己-1-烯羧酸钠(A2)；
7-乙酰氨基-4-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-4-羧酸钠(A3)；
7-乙酰氨基-6-羟基-2,2-二甲基-3a,4,7,7a-四氢-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-4-羧酸钠(A4)；
7-乙酰氨基-6-肟基-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-4-羧酸钠(A5)；和
7-乙酰氨基-6-(1-乙基-丙氧基)-2,2-二甲基-3a,6,7,7a-四氢-苯并[1,3]间二氧杂环戊烯-4-羧酸钠(A6)。
尽管以钠盐形式显示了以上所描述的类似物，但是本领域技术人员将理解其他盐形式是可能的并且包括在本发明的范围内。另外，低级烷基(C1-6烷基)形式的羧酸酯也包括在本发明的范围内。
无论单独使用还是作为另一基团的一部分使用，如本文所使用的“烷基”表示直链或支链的链饱和烷基。“C1-6烷基”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的烷基。
无论单独使用还是作为另一基团的一部分使用，如本文所使用的“酰基”表示直链或支链的链饱和酰基。“C1-6酰基”是指具有1、2、3、4、5或6个碳原子的酰基。
如本文所使用的“卤代”是指卤素原子并且包括F、Cl、Br和I。
波浪键，如“～～～”表示该键的立体化学是可变的。例如，当连接至双键时，该符号表示键合至双键的基团处于顺式或反式构型或者化合物包含这两种构型的混合物。
如本文所使用的“可选地取代的”表示所提及的基团是未取代的或者被一个或多个基团取代的，例如，可选的取代基可以包括C1-6烷氧基、硝基、氰基、羟基和氨基及其保护形式。
术语“药物可用的盐”表示中性化合物的酸加成盐或碱加成盐，其适合于受试者的治疗或者与受试者的治疗相容。
如本文所使用的术语“药物可用的酸加成盐”表示本发明的任何碱性化合物或者任何其中间体的任何无毒有机或无机盐。形成适合的盐的示例性无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸以及金属盐，如正磷酸氢二钠和硫酸氢钾。形成适合的盐的示例性有机酸包括单羧酸、二羧酸和三羧酸，如乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、反丁烯二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸和水杨酸，以及磺酸，如p-甲苯磺酸和甲磺酸。可以形成单-或二-酸盐，并且这些盐可以作为水合、溶剂化或基本无水的形式存在。通常，化学式I所示的化合物的酸加成盐更可溶于水和多种亲水性有机溶剂，并且一般地显示出比它们的游离碱形式更高的熔点。适当的盐的选择将是本领域技术人员已知的。可以(例如)在化学式I所示的化合物的分离中使用其他非药物可用的盐，例如，草酸盐，以用于实验室用途或者用于后续向药物可用的酸加成盐的转化。在本发明的实施方式中，所述药物可用的酸加成盐是盐酸盐。
如本文所使用的术语“药物可用的碱加成盐”表示任何酸性性化合物或任何其中间体的任何无毒有机或无机盐。如果化合物包含酸性基团，例如，羧酸，则通过添加适合的碱形成碱加成盐。形成适合的盐的示例性无机碱包括氢氧化锂、钠、钾、钙、镁或钡。形成适合的盐的示例性有机碱包括脂族、脂环族或芳族有机胺，如甲胺、三甲胺和甲基吡啶、烷基氨或氨。这些盐可以以水合、溶剂化或基本无水的形式存在。适当的盐的选择将是本领域技术人员已知的。在本发明的一个实施方式中，所述药物可用的碱加成盐是碱金属盐，如钠盐。
使用标准技术实现所期望的化合物盐的形成。例如，在适合的溶剂中用酸或碱处理中性化合物，并通过过滤、萃取或任何其他适合的方法分离所形成的盐。
还可以作为溶剂化物配制本发明的类似物。术语“溶剂化物”是指适当溶剂分子向化合物晶格中的掺入。适合的溶剂在所施用的剂量下是生理学耐受的。适合的溶剂的实例是乙醇、水等。当水为溶剂时，分子被称为“水合物”。本发明的类似物的溶剂化物的形成将基于化合物和溶剂化物而改变。通常，通过将化合物溶解在适当的溶剂中并通过冷却或使用抗溶剂分离溶剂化物来形成溶剂化物。溶剂化物通常在环境条件下干燥或共沸。
如以上所描述的奥塞米韦的类似物还可以包括前体药物形式。通常，这种前体药物将是化学式I所示的化合物的功能性衍生物，其在体内易于可转化为它理论上所衍生自的化合物。类似物的前体药物可以是与可获得的羟基或氨基所形成的常规酯。例如，可以在存在碱的情况下，并且可选地在惰性溶剂(例如，吡啶中的酸性氯化物)中使用激活的酸使化合物中可获得的OH或氮酰化。已用作前体药物的一些常见的酯是苯酯、脂族(C8-C24)酯、酰氧甲基酯、氨基甲酸酯和氨基酸酯。在某些情况下，类似物的前体药物是其中作为可以体内转化为羟基的基团掩蔽化合物中的一个或多个羟基的那些。用于适合的前体药物的选择和制备的常规程序描述于，例如，“Design of Prodrugs”H.Bundgaard主编,Elsevier,1985。
术语“同位素标记”是指除了自然界中该原子丰度最高的形式以外的原子的同位素形式。例如，2H、3H、13C、14C或放射性卤素，如125I。可以使用本领域中已知的标准方法制备本发明的标记化合物。例如，可以使用标准技术，例如，通过使用氚气体和催化剂，将适当前体向本发明的化合物的氢化，将氚引入化合物。作为另外一种选择，可以使用标准碘化条件，如在适当溶剂，如二甲基甲酰胺中在存在氯胺-T的情况下的[125I]碘化钠，从相应三烷基锡(适当地三甲基锡)衍生物制备含有放射性碘代的化合物。可以使用标准钯-催化的甲锡烷基化条件，例如，在惰性溶剂，如二恶烷中并且在高温，适当地50-100℃下，在存在四(三苯基膦)钯(0)的情况下的六甲基二锡，从相应非放射性卤代，适当地碘代化合物制备三烷基锡化合物。
本发明的类似物可以包括多个化学部分上的保护基，保护基的取代和那些化学部分的脱保护将是本领域技术人员已知的并且含有这些修饰的类似物也将包括在本发明的范围内。
术语“保护基(protecting groups)”或“保护基(protective groups)”或“PG”等表示通常出于在操纵或反应分子不同部分的同时，防止所述分子的那些反应性部分中的副反应的目的，保护或掩蔽分子的反应性部分的化学部分。在操纵或反应完成后，可以在不使分子其余部分降解或分解的情况下除去保护基。可以通过本领域技术人员制备适当保护基的选择。多种常规保护基在本领域中是已知的，例如，如“Protective Groups in OrganicChemistry”McOmie,J.F.W.主编,Plenum Press,1973,In Greene,T.W.and Wuts,P.G.M.,“Protective Groups in Organic Synthesis”John Wiley&Sons,第3版,1999和Kocienski,P.“Proteciting Groups”,第3版,2003,Georg Thieme Verlag(The Americas)中所描述的。
本发明的类似物可以包括不对称中心。当本发明的类似物具有不止一个不对称中心时，它们可以作为非对映体存在。应理解处于任何比例的所有这些异构体及其混合物涵盖在本发明的范围内。应理解尽管可以以本文所列的任何给定化合物提供本发明所述的化合物的立体化学，但是本发明的这些化合物还可以含有特定量(例如，小于20％，优选地小于10％，更优选地小于5％)的具有替代立体化学的本发明的化合物。
在其他实施方式中，Neu 1唾液酸酶抑制剂是2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)或者DANA的类似物。
在本发明的一个实施方式中，DANA的类似物具有化学式G
Figure GDA0004197228670000261
其中R50是C1-6烷基，其中所述烷基可以是直链或支链脂族，或者所述烷基可以是环烷基。
具体地，R50是甲基、丙基丁基、环丙基、环戊基、环己基、2丁基、i-丁基、t-丁基、3-戊基、异丙基。
在本发明的具体方面，R是甲基、丙基、丁基、2-丁基、环戊基、环己基。
在本发明的一个实施方式中，DANA类似物是：
Figure GDA0004197228670000262
/>
Figure GDA0004197228670000271
冠状病毒激活的促炎细胞因子和缓激肽风暴
多位感染COVID-19的患者出现ARDS。COVID-19感染的肺细胞引起引发肺泡巨噬细胞的损伤。ARDS是一类以肺中大面积炎症的快速发病为特征的呼吸衰竭。症状包括呼吸急促、呼吸促迫和皮肤发青。在那些存活者中，生活质量降低相对常见。ARDS是肺中流体积累的一种形式，它不由心力衰竭引起(非心原性肺水肿)。它通常由肺的急性损伤引起，其导致负责气体，如氧和二氧化碳与肺中毛细血管交换的肺微观肺泡的淹溺(flooding)。ARDS中的其他常见发现包括部分肺萎陷(肺不张)和血液中氧的低水平(低氧血)。临床综合征与病理学发现，包括肺炎、嗜酸细胞性肺炎、隐原性组织肺炎、急性纤维蛋白组织肺炎和弥漫性肺泡损伤(DAD)有关。其中，与ARDS有关的最常见的病理学是DAD，其特征在于肺组织的弥漫性炎症。对组织的引发损害通常导致局部上皮细胞和内皮细胞分泌的化学信号及其他炎症介质的初始释放。嗜中性白细胞和一些T-淋巴细胞快速迁移至发炎肺组织并且导致该现象扩大。典型的组织学表现包括弥漫性肺泡损伤和肺泡壁中透明膜的形成。
已报道了非常依赖于与TLR配体处理的活的原代巨噬细胞和巨噬细胞和树突状细胞系有关的Neu1唾液酸酶活性的病原体分子诱导的TOLL-样受体(TLR)激活和细胞功能的机制(Amith,Jayanth等人(2009)Glycoconj J 26p 1197-1212)。在活的原代骨髓(BM)巨噬细胞和巨噬细胞和树突状细胞系中显示了通过与TLR-2、-3和-4的配体结合起始的以在几分钟内诱导Neu1唾液酸酶活性的膜控制机制。
该过程的中心在于Neu1，而不是Neu2、-3和-4与TLR-2、-3和-4在未治疗过的
Figure GDA0004197228670000281
巨噬细胞的细胞表面上形成复合物。神经氨酸酶抑制剂BCX1827、2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)、扎那米韦和奥塞米韦羧酸酯对活BMC-2巨噬细胞中的LPS诱导的唾液酸酶活性具有有限的显著抑制，但是特敏福(OP)完全阻断该活性。与对于其水解代谢产物奥塞米韦羧酸酯的1015μM的IC50相比，OP在活BMC-2细胞中以1.2μM的IC50抑制LPS诱导的唾液酸酶活性。在用抗羧酸酯酶试剂氯吡格雷预处理的BMC-2细胞中，未影响LPS诱导的Neu1唾液酸酶活性的OP阻断。结合至TLR4的内毒素LPS在原代和巨噬细胞系中诱导Neu1，并且随后激活NFκB并产生一氧化氮和促炎IL-6和TNFα细胞因子。与野生型或亚等位基因组织蛋白酶A的正常Neu1小鼠系相比，具有继发性Neu1缺陷的亚等位基因组织蛋白酶A小鼠对LPS诱导的促炎细胞因子的应答较差(Amith,Jayanth等人(2009)Glycoconj J 26p1197-1212)。
GPCR激动剂铃蟾肽、缓激肽、溶血磷脂酸(LPA)、胆固醇、血管紧张素-1和-2，而不是凝血酶在来自野生型(WT)小鼠，而不是来自Neu1-缺陷型小鼠的活巨噬细胞系和原代骨髓巨噬细胞中诱导Neu1活性(Abdulkhalek,Guo等人,Cellular Signalling 24(2012)2035–2042)。GPCR在先天和获得免疫性中显示出重要调控功能。存在GPCR和TOLL-样受体(TLR)信号转导通路之间交流(crosstalk)的证据。在这种信号转导范式(signalingparadigm)下，与细胞表面上受体的配体结合引起受体构象变化以起始通过GPCR Gα亚基蛋白和MMP-9激活的GPCR-信号转导，从而诱导Neu1。系链至细胞表面上TLR的激活的Neu1靶向并水解TLR受体胞外域处的唾液酰α-2-3-连接的β-半乳糖残基。总体上，这些发现预测通过激活的Neu1所引起的TLR受体的必要去唾液酸化使得能够除去对受体结合的空间位阻，并随后激活TLR受体和细胞信号转导。这种分子组织的GPCR信号转导平台位于GPCR激动剂诱导的TLR的反式激活和后续下游NFκB信号转导的初始处理阶段。
因此，存在与巨噬细胞的细胞表面上的TLR-2、-3和-4受体复合的Neu1唾液酸酶的激活受神经氨酸酶抑制剂OP的抑制。另外，OP显著抑制原代或巨噬细胞系中内毒素LPS诱导的NFκB激活以及一氧化氮和促炎IL-6和TNFα细胞因子的产生。在Mas GPCR加强通过肺泡巨噬细胞的细胞表面上的NMBR-Neu1-MMP9交流的受体偏向诱导的TLR反式激活的基础上，OP将抑制肺中的促炎反应并降低炎性过程。
另外，对于COVID-19结合，RBD-ACE2-B0AT1复合物的去唾液酸化的抑制将抑制肺细胞的病毒感染性。
实施例表明通过COVID S蛋白及其变体起始以上所列的炎性机制。
对于已感染新冠病毒并显示出即将发生呼吸衰竭的体征和症状的患者，通过干扰已涉及ARDS的病理生理学的一些保守GPCR和toll-样受体信号转导级联，与阿司匹林组合的静脉内OP可以改善已参与造成肺泡损伤的细胞因子风暴以及最终的呼吸衰竭和由ARDS所引起的死亡。
不限制上述内容的普遍性，与COVID-19疾病严重程度有关的细胞因子谱的特征在于白介素(IL)-2、IL-7、粒性白细胞-集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ诱导蛋白-10(IP-10或CXCL10)、单核细胞化学引诱蛋白1(MCP-1/CCL2)、巨噬细胞炎性蛋白1-α(MIP-1α)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的升高，并且在多个实施方式中，施用如本文所描述的治疗可以导致患者血清/血浆中的这些细胞因子中的一种或多种的水平的可观察的降低。150例COVID-19确认病例的近期回顾性、多中心研究的死亡预测因子包括铁蛋白(p<0.001；测量体内的铁含量)和IL-6升高(p<0.0001)。在一些实施方式中，如本文所描述的治疗，并且具体地，用OP的治疗导致患者血清/血浆中IL-6、TNFα和/或G-CSF水平可观察的降低。
炎性免疫应答、败血病和ARDS
败血病是通过感染引发的炎性免疫应答，其可以是细菌、真菌、病毒或原生动物来源的。败血病是与多种症状有关的炎性免疫应答，包括发热、低体温和血压、呼吸促迫和意识模糊。严重的败血病与多器官功能障碍综合征，包括肺中的ARDS有关。因此，在一个实施方式中，本发明提供了用NEU-1抑制剂治疗，优选地在早期阶段治疗败血病患者以预防呼吸衰竭和ARDS的出现。
作为COVID-19感染的治疗，可选地与阿司匹林组合施用的OP避免向奥塞米韦羧酸酯转化的用途
奥塞米韦磷酸酯，(3R,4R,5S)-4-乙酰氨基-5-氨基-3-(1-乙基丙氧基)1-环己烯-1-羧酸乙酯，磷酸酯(1:1)是用于流感病毒治疗的活性代谢产物奥塞米韦羧酸酯的不吸湿的前体药物。奥塞米韦磷酸酯(OP)可溶于水。当口服时，OP通过首次通过肝脏酯酶被转化为奥塞米韦羧酸酯。奥塞米韦羧酸酯是在流感病毒治疗中有用的活性部分并且靶向神经氨酸酶。OP以商品名Tamiflu由Hoffman la Roche出售。
OP目前不治疗性用于任何批准的适应症。然而，它仅作为在口服时被转化为活性代谢产物奥塞米韦羧酸酯的前体药物使用。本发明人已鉴定前体药物OP对哺乳动物神经氨酸酶1具有活性，这使其适合独立作为抗病毒剂，并且具体地适合在感染COVID-19病毒并且显示即将发生呼吸衰竭的体征和症状的患者中预防ARDS。
基于哺乳动物神经氨酸酶1在调控一些细胞表面受体，包括GPCRS的二聚化中的高度保守的作用，以及它们在培育对病毒细胞进入至关重要的ACE-2细胞表面受体的二聚化中的相关作用，静脉内OP可以阻断二聚化过程并且干扰病毒细胞进入。
施用OP以抑制或避免向奥塞米韦羧酸酯的转化。在这方面，“抑制”转化可以表示在细胞吸收之前，>10％、>25％、>50％，优选地>75％并且更优选地>90％的OP被体内转化为奥塞米韦羧酸酯。可以将OP静脉内或通过喷雾法直接施用于肺，以抑制或避免向奥塞米韦羧酸酯的转化。
通过Neu1唾液酸酶激活控制TOLL-样受体(TLR)激活。研究已表明Neu1已与TOLL-样受体复合，并且当天然配体与它们各自受体配体结合时，诱导激活。另外，激活的Neu1特异性水解远离配体结合位点的与β-3-半乳糖苷连接的α-2,3-唾液酰残基。这除去了对受体二聚化的空间位阻，并且导致后续信号转导通路。
已发现神经氨酸酶抑制剂奥塞米韦磷酸酯特异性抑制巨噬细胞和树突状细胞的细胞表面上的TLR配体诱导的Neu1活性，并随后阻断TLR配体诱导的NFkB激活、一氧化氮(NO)产生和促炎细胞因子。另外，与LPS阳性对照相比，其他纯化的神经氨酸酶抑制剂，如BCX-1827、DANA(2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸)、扎那米韦(4-胍基-Neu5Ac2en)和奥塞米韦羧酸酯在1-2mM时对活BMC-2巨噬细胞中脂多糖(LPS)诱导的唾液酸酶活性的抑制作用有限。
使用重组可溶性人唾液酸酶的其他研究已表明即使在1mM奥塞米韦羧酸酯仅抑制4种人唾液酸酶的活性，而扎那米韦在微摩尔范围显著抑制人Neu2和Neu3唾液酸酶。此外，使用来自成熟树突状细胞的裂解液，其他人已发现扎那米韦在2mM完全抑制Neu1和Neu3唾液酸酶活性。
有趣地，已发现与其他神经氨酸酶抑制剂相比，OP在抑制与TLR配体处理的活巨噬细胞有关的唾液酸酶活性中最有效，而这种化合物已知作为体外抗病毒剂是无效的，因为其抗病毒活性是通过其水解代谢产物奥塞米韦羧酸酯实现的。
为了进一步阐明OP及其水解代谢产物奥塞米韦羧酸酯的抑制能力，通过将唾液酸酶活性降低对试剂浓度的log值作图，确定了每种化合物的50％抑制浓度(IC50)。已表明与奥塞米韦羧酸酯的1015μM的IC50相比，奥塞米韦磷酸酯具有1.175μM的IC50。这些数据清楚地显示奥塞米韦磷酸酯在抑制与TLR配体处理的活BMC-2巨噬细胞有关的唾液酸酶活性中比其水解代谢产物有效1000-倍。
有可能通过P-糖蛋白将OP转运通过细胞膜，在此通过羧酸酯酶催化水解激活。先前已确定抗血小板试剂氯吡格雷通过羧酸酯酶抑制高达90％的OP水解。为了确定在该活细胞测定***中OP是否在细胞中水解，以280μM和500μM用氯吡格雷硫酸氢盐对活BMA巨噬细胞预处理2min，然后在存在或不存在400μM纯OP的情况下，用5μg/ml内毒素脂多糖(LPS)处理。结果表明抗羧酸酯酶试剂氯吡格雷对OP抑制LPS诱导的唾液酸酶活性无作用。
总体上，这些结果表明OP是与TLR配体处理的活巨噬细胞有关的唾液酸酶的有效抑制剂。
在一些实施方式中，可以在本发明所述的组合物和方法中使用起到Neu1唾液酸酶抑制剂作用的OP类似物。
已在专利文献，例如，在PCT专利公开WO 2009/137916和WO 2011/047466中描述了制备奥塞米韦及其衍生物或类似物的方法，以上专利作为参考并入本文。WO 2009/137916和WO 2011/047466还描述了对于制备奥塞米韦及其衍生物的方法有用的中间体。制备奥塞米韦及其衍生物或类似物的方法还可见于PCT专利公开WO2013/063679，美国专利No.10,350,188B2；和欧洲专利No.2773340B。在多个实施方式中，所述类似物可以选自以上所鉴别的那些。
基于高于OP和DANA的效力，奥塞米韦和DANA的类似物可以是优选的。不限制以上内容的普遍性，在优选的实施方式中，奥塞米韦的类似物可以选自以上所鉴定的类似物A2和A5，仍不限制上述内容的普遍性，在优选的实施方式中，DANA的类似物可以选自B1和B3。
在一个实施方式中，将使用OP输注方案，优选地与阿司匹林组合的OP输注方案对预测在COVID-19病毒感染后将上调的信号转导级联的早期阻断用于在由于COVID-19感染而显示出急性呼吸衰竭的早期病征的患者中预防ARDS的出现。
已发现与阿司匹林组合的OP可以改善试剂效力并且可以改善通过COVID-19S蛋白和COVID-19变体S蛋白治疗刺激的细胞中的抗炎活性。
还已发现与阿司匹林组合的OP可以改善试剂效力并且可以改善结合至ACE-2受体的细胞中的抗COVID-19及其变体感染性。
本发明人已证实阿司匹林可以抑制Neu-1唾液酸酶并加强OP抑制哺乳动物神经氨酸酶1的能力。因此，与OP组合的阿司匹林可以以协同方式抑制哺乳动物神经氨酸酶1。在一个实施方式中，将阿司匹林，优选地口服施用的阿司匹林添加至OP的静脉内或吸入方案。
适合于静脉内制剂的制备的载体将是本领域技术人员已知的。例如，适合于注射的药物载体可以包括(但不限于)无菌液体，如水和油剂，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。水或水性盐溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也优选地用作载体，具体地用于可注射溶液。适合的药物载体描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。
适合于制备用于吸入的制剂的方法也将是本领域技术人员已知的，所述技术人员将熟悉用于药物雾化的吸入***，包括喷雾器、加压计量-剂量吸入器和干粉吸入器，以及载体***，包括聚合物颗粒和脂质基载体。
适当地，在无菌生理盐水中配制OP。可以将OP配制为用于存储和运输的冻干粉末。然后，可以用无菌生理盐水复原冻干OP以直接用作无菌静脉内注射剂。还可以配制用于通过本领域中已知的方法吸入的冻干粉末。
治疗规程
确认感染COVID-19及其变体病毒的患者或者显示出呼吸困难病征的怀疑感染的患者将适于所述治疗。理想地，一旦确认诊断并且在症状明显的呼吸衰竭出现前，应尽快开始治疗。理想地，由于症状明显的呼吸衰竭和ARDS的出现可以由于COVID-19及其变体感染而快速发生，因此应在呼吸功能损伤的第一病征立即开始治疗。
适当地，可以以100mg至1000mg之间，优选地300mg至500mg之间的日剂量施用OP。
在一个实施方式中，除用静脉内OP治疗外，适当地通过口服施用向患者施用阿司匹林。适当地，可以以100mg至1000mg每天，优选地400mg至600mg每天的剂量施用阿司匹林。
在示例性规程中，治疗包括在4小时内以通过IV输注施用的约200mg的剂量的OP施用，以及随后立即通过连续输注在24小时内提供的另外200mg的OP剂量。如果有临床改善和/或无临床恶化的迹象，则还可以通过治疗医师在24小时内以200mg剂量施用另外的静脉内OP剂量。在一个示例性规程中，还以每天500mg po剂量向患者施用阿司匹林。
在优选的实施方式中，提供初始冲击，随后连续输注，从而当出现ARDS的风险明显时，在从初始感染的预测炎症风暴的关键期期间，尽可能将NEU-1的抑制保持恒定。
适当地，可以以200mg剂量提供冻干OP以易于(例如)在无菌玻璃小瓶中复原。
在其他实施方式中，可以在预加载注射器中提供OP。还可以在预加载吸入器中提供OP。
在一个实施方式中，定期，适当地每天施用OP，直至患者对冠状病毒测试为阴性。在一个实施方式中，每天施用OP 1至14天，在一个实施方式中，1至7天，在一个实施方式中，1至3天。
在一个实施方式中，提供了在显示出指示呼吸功能损伤的临床征象的COVID-19及其变体病毒感染的患者中使用可选地与阿司匹林组合的静脉内OP的组合的新型治疗策略。
本文参考的所有文档作为参考并入，然而，应理解作为参考并入本文的任何专利、专利公开或其他专利公开材料仅以所并入的材料不与本发明公开中所述的定义、声明或其他发明公开材料冲突的程度全部或部分并入。照此，并且在所必需的程度，如本文明确说明的公开内容取代作为参考并入本文的任何冲突的材料。
本文所使用的小节标题仅是出于组织的目的，并且不应将其视为对所述主题的限制。以上所描述的和说明性的实施方式旨在仅是示例性的。通过所附权利要求表示范围。
实施例
实施例1
将来源于RAW 264.7巨噬细胞的RAW-BlueTM细胞(小鼠巨噬细胞报告细胞系，Invivogen,San Diego CA)在ZeocinTM选择下在培养基中生长。所述细胞稳定表达通过NF-kB和AP-1转录因子可诱导的分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)基因。一旦刺激，RAW-BlueTM细胞激活NF-kB和AP-1，从而导致SEAP分泌，其是使用SEAP检测培养基QUANTI-BlueTM(Invivogen)可检测和可测量的。在反应24hr后，将来自处理的RawBlue细胞的上清液(20μL)加入至QuantiBlue试剂(180uL)，并且在6小时后进行显色反应读数。QUANTI-BlueTM是显色以确定存在于生物样品(上清液)中的任何碱性磷酸酶活性并且根据生产商的说明制备的比色酶活性测定。RAW-BlueTM细胞耐受ZeocinTM和G418。
细胞能够在37℃，在加湿培育箱中在12mm圆形载玻片上贴壁24h。在除去培养基后，将0.318mM 4-MUNANA底物在pH 7.4的Tris缓冲盐水中的溶液单独加入细胞(背景，Bkg)或者与S蛋白20μg/mL、20μg/mL内毒素LPS、血管紧张素1-7(20ug/mL)或者与所指明的S蛋白组合的200μg/mL奥塞米韦磷酸酯(OP)、200μg/mL BIM-46174(BIM46，异源三聚体G蛋白复合物的选择性抑制剂)或者200μg/mL MMP9特异性抑制剂(MMP9i)一起加入至细胞。在添加底物后2min，使用表面荧光显微镜(40×物镜)采集荧光图像。使用Image J软件测量每幅图像的细胞周围的平均荧光。参考图2A-图2C，使用点表示得自具有类似结果的2个单独实验的一个代表性实验的荧光值(n＝50)，将结果绘制成数据点显象的散点图。以95％的置信度，使用未修正的Fisher LSD多重比较，通过ANOVA将每组的相对荧光值与未处理的Bkg对照相比较，用星号表示统计显著性。
参考图2A，唾液酸酶活性与活的RAW-蓝色巨噬细胞的GPCR激动剂处理有关。参考图2B和2C，唾液酸酶活性与COVID-19S蛋白和UK变体S蛋白有关，其活性受OP、BIM-46174和MMP9i抑制。
实施例2
在新鲜生长培养基中制备550,000个RAW-蓝色细胞/mL的细胞混悬液，并将180μL细胞混悬液(～100,000个细胞)加入至Falcon平底96-孔板(Becton Dickinson)的每个孔中。在不同培育时间后，将指明剂量的LPS、缓激肽、血管紧张素1-7、神经肽FF和S蛋白单独或与指明的剂量-依赖性的OP一起加入至每个孔中。将板在37℃，在5％ CO2培育箱中培育18-24h。将180μL QUANTI-BlueTM溶液加入至平底96-孔板的每个孔中，随后加入20μL来自刺激的RAW-蓝色细胞的上清液。将板在37℃培育30min至3h，并且使用分光光度计在620-655nm确定SEAP水平。每个实验重复三次。图3显示了结果。
重组S蛋白和LPS引发唾液酸酶活性。通过OP阻断该活性，从而提供了唾液酸酶活性来自NEU-1的证据，因为OP是Neu-1的特异性抑制剂。还通过异源三聚体G蛋白受体复合物抑制剂BIM-46714抑制该活性。发现这些G蛋白偶联受体与ACE-2结合存在，并且有可能辅助ACE-2受体二聚化并通过已对Toll-样受体发现的类似过程中的NEU-1激活。
内毒素LPS、缓激肽和Ang 1-7均引发SEAP表达升高，这种报告分子测定反映了NF-kB表达和炎性分子，如IL-6的下游诱导。缓激肽是参与COVID感染的细胞因子风暴的G蛋白受体激动剂。通过激活的ACE2产生Ang 1-7，其一旦激活，则催化血管紧张素II向血管紧张素-(1-7)的转化。Ang 1-7诱导唾液酸酶活性。
OP显著降低通过S蛋白引发的SEAP活性表达，从而证实NEU-1在通过COVID-19及其变体诱导的细胞因子风暴中起关键作用。
本发明的实施例提供了COVID及其变体S蛋白引发Neu-1唾液酸酶活性并且通过使用Neu-1特异性抑制剂OP并阻断复合至ACE-2受体的G蛋白偶联受体活性来阻断该活性的证据。这些受体还可以激活NEU-1，借此帮助ACE-2受体二聚化和病毒进入细胞的易感状态。
除NEU-1在辅助ACE-2受体二聚化和后续病毒向细胞进入中所起的作用外，NEU-1通过其在激活Toll-样受体中的关键作用在涉及COVID-19病理发生和ARDS的细胞因子风暴诱导中起关键作用。
图3A-图3D中存在的数据支持系链至TLR受体的新型组织GPCR信号转导平台作为这些受体的GPCR激动剂诱导的反式激活和后续下游细胞信号转导的初始处理阶段。具体地，GPCR受体与糖基化TLR受体在胞外域形成复合物。其次，Neu1可以是配体结合至受体后在调控TLR激活中的必要中间体。第三，通过配体结合至受体激活的Neu1预测连接至TLR胞外域上的β-半乳糖苷的α-2,3-唾液酰残基的快速除去以产生功能性受体。分类为细胞溶质(Neu2)、质膜结合的Neu3和Neu4的唾液酸酶不参与和配体-处理的活TLR-表达细胞以及原代骨髓巨噬细胞有关的唾液酸酶活性。第四，直接通过GPCR配体或间接与TLR受体联合，通过膜Gαi亚基蛋白的GPCR-信号转导增强诱导MMP-9激活，这种GPCR-信号转导与细胞表面上的MMP-9和TLR受体联合参与Neu1的激活。在本文中，鉴定了取决于结合至其TLR以诱导哺乳动物神经氨酸酶-1(Neu1)活性，以影响α-2,3-唾液酰残基的TLR受体去唾液酸化并且随后诱导TLR受体激活以及树突状细胞和巨噬细胞中一氧化氮和促炎细胞因子产生的配体(LPS)的新型膜唾液酸酶-控制机制。
这种研究模型支持通过激活的Neu1所引起的TLR受体的必要去唾液酸化使得能够去除对与后续TLR受体的激活和细胞信号转导有关的受体的空间位阻，其中这种分子组织GPCR信号转导平台是GPCR激动剂诱导的TLR反式激活和后续下游NFκB信号转导的初始加工阶段。已提议这种信号转导范式在ACE 2受体中也具有活性，其对于病毒向细胞的进入至关重要。
在图3A中，将RAW-BlueTM细胞用于测量LPS诱导的巨噬细胞激活。这些细胞来源于具有通过NF-κB和AP-1可诱导的SEAP报告子构建体的染色体整合的鼠科RAW 264.7巨噬细胞。RAW-BlueTM细胞表达多种模式-识别受体(PRR)，包括toll-样受体(TLR)、NOD-样受体(NLR)、RIG-I-样受体(RLR)和C-型凝集素受体(CLR)。一旦刺激，RAW-BlueTM细胞激活NF-kB和AP-1，从而导致SEAP分泌，其是使用SEAP检测培养基QUANTI-BlueTM时可检测和可测量的。图3A中的数据证实作为NF-κB和AP-1激活以及后续促炎细胞因子活性的量度，LPS结合TLR剂量依赖性地诱导SEAP分泌。
在图3B中，数据显示在RAW-BlueTM细胞中缓激肽剂量依赖性地诱导SEAP分泌。当COVID-19病毒与其受体ACE2相互作用时，它在缓激肽通路中引发异常反应。在COVID-19患者中，参与缓激肽分解的血管紧张素-转换酶的水平低于健康对照。这些COVID-19患者将出现涌向感染区以及肺中的高渗透血管流体，即“缓激肽风暴”。另外，患有COVID-19的患者出现负责合成透明质酸的失调基因，透明质酸是可以吸收其重量1000倍以上的水的聚合物。总体上，缓激肽风暴将使血管渗漏，并且透明质酸的调控异常将使大量胶状物质涌入肺泡。该结局与报道COVID-19患者肺部细节的尸体解剖一致。
本发明人已发现在未治疗过(未刺激)和刺激的巨噬细胞中，缓激肽(BR2)和I型血管紧张素II受体(AT2R)以与系链至TLR和Neu1的神经调节肽B(NMBR)GPCR复合的多聚受体存在。在本文中，调控细胞表面上这些分子之间的相互作用和信号转导机制的分子联系揭示了通过Neu1唾液酸酶和TLR受体糖基化修饰介导的偏好缓激肽B2 GPCR激动剂诱导的TLR反式激活信号转导轴。偏好G蛋白-偶联受体(GPCR)-信号转导平台加强了细胞表面上神经氨酸酶-1(Neu1)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的交流，这对于TLR受体激活是必须的。
在图3C和图3D中，数据表明在RAW-BlueTM细胞中血管紧张素1-7(图3C)和神经肽FF(图3D)剂量依赖性地诱导SEAP分泌。在一些疾病状态中，ACE/血管紧张素II(Ang II)/I型血管紧张素II受体(AT2R)GPCR受体的激活可以引起不利影响，包括血管收缩、炎症、纤维化、细胞生长和迁移和体液潴留。除ACE/Ang II/AT2R受体轴外，肾素-血管紧张素***(RAS)具有由ACE2、血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]和Mas GPCR受体组成的反调控轴。
Ang-(1-7)主要通过ACE2的作用产生，其对Ang I比对Ang II的亲和力低约400-倍。因此，Ang II是Ang-(1-7)合成的主要底物。Ang-(1-7)/MAS介导其与Ang II/AT1的作用相反的影响。MAS GPCR可以与其他GPCR相互作用。
MAS激动剂，如神经肽FF，显示出MAS本身的偏好信号转导。已报道了MAS与AT1、AT2、缓激肽B2和内皮素B受体的异聚相互作用。因此，MAS GPCR可以在这些受体中不同地影响偏好信号转导，因此增强潜在变构位点在两个受体中不同的概念。我们假设MAS GPCR可以通过与脂质-受体界面或其他伴侣受体的相互作用影响其他GPCR(“越线(off-side)”)。
实施例证实了参与GPCR偏好激动剂诱导的TLR受体的MAS的新型调控作用。
假定所释放的GPCR和炎性分子通过这种机制在COVID-19患者中引发细胞因子风暴的激活。

Claims (37)

1.治疗冠状病毒感染或疑似冠状病毒感染的方法，其包括施用Neu1唾液酸酶-G蛋白偶联受体-基质金属蛋白酶9(Neu1-GPCR-MMP9)信号转导平台的抑制剂以抑制通过激活的Neu1的去唾液酸化的ACE2激活。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂选自Neu1唾液酸酶抑制剂，优选地奥塞米韦磷酸酯或其类似物或者2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其类似物、MMP-9的抑制剂或者异源三聚体G蛋白复合物的抑制剂。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中施用所述Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂在24小时内降低了IL-6、TNFα和/或G-CSF促炎细胞因子中的一种或多种的血浆/血清水平，优选地在24小时内降低≥5％、≥10％或≥25％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中施用所述Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂在24小时内降低病毒载量，优选地在24小时内降低≥5％、≥10％或≥25％。
5.治疗冠状病毒感染或疑似冠状病毒感染的方法，其包括静脉内或通过吸入法向对其有需要的患者施用治疗有效量的奥塞米韦磷酸酯或其类似物。
6.治疗或预防ARDS的方法，其包括静脉内或通过吸入法向对其有需要的患者施用治疗有效量的奥塞米韦磷酸酯或其类似物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述患者诊断患有冠状病毒感染。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述患者诊断患有败血病。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述冠状病毒是COVID-19或其变体。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其包括静脉内或通过吸入法施用治疗有效量的奥塞米韦磷酸酯。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述患者患有肺不张和/或低氧血。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述患者具有一种或多种呼吸功能损伤症状，其选自呼吸急促、呼吸促迫和皮肤发青。
13.根据权利要求12所述的方法，其中方法改善或减轻了选自呼吸急促、呼吸促迫和皮肤发青的一种或多种症状。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其包括以100mg和1000mg之间的日剂量施用奥塞米韦磷酸酯或其类似物。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，还包括向所述患者施用治疗有效量的阿司匹林。
16.根据权利要求15所述的方法，其中与奥塞米韦磷酸酯同时口服施用阿司匹林。
17.根据权利要求15所述的方法，其中以100mg至1000mg之间的日剂量施用阿司匹林。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其包括：
通过静脉内注射向患者施用150mg至250mg之间的冲击剂量的奥塞米韦磷酸酯；
随后在24小时内，通过连续输注，施用150mg至250mg之间的另外剂量的奥塞米韦磷酸酯；并向所述患者口服施用450mg至550mg之间的剂量的阿司匹林。
19.Neu1唾液酸酶-G蛋白偶联受体-基质金属蛋白酶9(Neu1-GPCR-MMP9)信号转导平台的抑制剂抑制通过激活的Neu1的ACE2去唾液酸化过程以用于治疗冠状病毒感染或疑似冠状病毒感染的用途。
20.根据权利要求19所述的用途，其中所述Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂选自Neu1唾液酸酶抑制剂，优选地奥塞米韦磷酸酯或其类似物或者2-脱氧-2,3-脱氢-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其类似物、MMP-9的抑制剂或者异源三聚体G蛋白复合物的抑制剂。
21.根据权利要求20或21所述的用途，其中施用所述Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂在24小时内降低了IL-6、TNFα和/或G-CSF促炎细胞因子中的一种或多种的血浆/血清水平，优选地在24小时内降低≥5％、≥10％或≥25％。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的用途，其中施用所述Neu1-GPCR-MMP9信号转导平台的抑制剂在24小时内降低了病毒载量，优选地在24小时内降低≥5％、≥10％或≥25％。
23.静脉内或通过吸入法施用的治疗有效量的奥塞米韦磷酸酯或其类似物用于治疗冠状病毒感染或疑似冠状病毒感染的用途。
24.静脉内或通过吸入法施用的治疗有效量的奥塞米韦磷酸酯或其类似物用于治疗或预防ARDS的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述患者诊断患有冠状病毒COVID-19或变体感染。
26.根据权利要求24所述的用途，其中所述患者诊断患有败血病。
27.根据权利要求19至23中任一项所述的用途，其中所述冠状病毒是COVID-19或其变体。
28.根据权利要求19至27中任一项所述的用途，其包括静脉内或通过吸入法施用治疗有效量的奥塞米韦磷酸酯。
29.根据权利要求19至28中任一项所述的用途，其中所述患者患有肺不张和/或低氧血。
30.根据权利要求19至28中任一项所述的用途，其中所述患者具有一种或多种呼吸功能损伤症状，其选自呼吸急促、呼吸促迫和皮肤发青。
31.根据权利要求30所述的用途，其中所述用途改善或减轻了选自呼吸急促、呼吸促迫和皮肤发青的一种或多种症状。
32.根据权利要求19至31中任一项所述的用途，其包括以100mg和1000mg之间的日剂量施用奥塞米韦磷酸酯或其类似物。
33.根据权利要求19至32中任一项所述的用途，还包括向所述患者施用治疗有效量的阿司匹林。
34.根据权利要求33所述的用途，其中与奥塞米韦磷酸酯同时口服施用阿司匹林。
35.根据权利要求33所述的用途，其中以100mg至1000mg之间的日剂量施用阿司匹林。
36.根据权利要求19至35中任一项所述的用途，其包括：
通过静脉内注射向患者施用150mg至250mg之间的冲击剂量的奥塞米韦磷酸酯；
随后在24小时内，通过连续输注，施用150mg至250mg之间的另外剂量的奥塞米韦磷酸酯；并向所述患者口服施用450mg至550mg之间的剂量的阿司匹林。
37.药物气溶胶制剂，其包含分散在抛射剂中的奥塞米韦磷酸酯颗粒。
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