CN116179680B - miRNA-142-5p检测试剂在制备慢性疼痛伴发认知障碍诊断试剂盒中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了miRNA‑142‑5p检测试剂在制备慢性疼痛伴发认知障碍诊断试剂盒中的用途，属于生物诊断技术领域。本发明通过研究发现人血浆细胞外囊泡中miRNA‑142‑5p表达水平与慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍紧密相关。与认知正常的人相比，人血浆细胞外囊泡中miRNA‑142‑5p表达水平越高，患慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍风险越大。因此，人血浆细胞外囊泡中miRNA‑142‑5p表达水平高低可以用于筛查、诊断慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍，为慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍的研究与治疗提供保障，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物诊断技术领域，具体涉及miRNA-142-5p检测试剂在制备慢性疼痛伴发认知障碍诊断试剂盒中的用途。
背景技术
认知障碍是慢性疼痛应激背景下最常见的并发症之一，主要表现为注意力、学习记忆、信息处理速度和执行能力等维度的损害，其持续发展增加了患者发生风险。全球范围内，70％的慢性疼痛患者伴有工作记忆缺陷。国外一项大样本的纵向队列研究报道了25％～33％的老年人患有慢性疼痛伴发的认知障碍。慢性神经病理性疼痛(Chronicneuropathic pain,CNPP)是一种发病率高、危害性大的常见慢性疼痛，是导致认知障碍发生的高风险因素，严重影响了患者的生活质量，是造成全球疾病负担的主要因素之一，影响着全球6.9％～10％的人群，一直是众多科学家关注的热点。目前对慢性神经病理性疼痛并发的认知障碍尚缺乏有效预防和治疗措施。临床常用的止痛药物对缓解疼痛起到了积极的作用，但很多药物可能导致或加重疼痛伴发的认知功能障碍。因此，探究慢性神经病理性疼痛并发认知障碍的作用机制和防治靶点具有重要的临床意义。
想要研究慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍，首先需要对慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍进行诊断。既往临床诊断慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍的方法为通过神经认知功能评估量表，评估慢性神经病理性疼痛患者的脑神经认知功能，对是否发生认知障碍做出诊断。这种方法工作量大，繁琐，且根据患者主观意识进行判断缺乏统一标准。
近来年，细胞外囊泡miRNA研究较为广泛，人外周血液中miRNA的主要信号来源就是细胞外囊泡。细胞外囊泡(Extracellular vesicles)是一种脂质双分子层囊泡，可携带包括DNA，mRNA，miRNA和蛋白质等多种生物分子，进入受体细胞并调控受体细胞的功能，介导细胞间通讯，发挥生物学作用。最新研究表明细胞外囊泡miRNA参与神经营养信号传导、癌症相关信号传导和应激反应等信号通路的调节，调控着老年认知功能障碍的发生发展，是认知障碍诊断和治疗的潜在生物标志物。分离慢性神经病理性疼痛患者外周血中细胞外囊泡miRNA，识别认知障碍易感患者标志性miRNA，及早进行认知症状的治疗，将改善慢性神经病理性疼痛的治疗疗效，也有助于减轻临床诊断慢性神经病理性疼痛的负担。
发明内容
本发明的目的是提供miRNA-142-5p检测试剂在制备慢性疼痛伴发认知障碍诊断试剂盒中的用途。
本发明提供了检测miRNA-142-5p的试剂在制备诊断慢性疼痛伴发认知障碍的试剂盒中的用途。
本发明中miRNA-142-5p的核苷酸序列为 CAUAAAGUAGAAAGCACUACU(SEQ IDNO.1)，其中5p表示由miR-142 前体的5’端臂加工而来的。
进一步地，所述慢性疼痛伴发认知障碍为慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍。
进一步地，所述检测miRNA-142-5p的试剂为检测人外周血细胞外囊泡中miRNA-142-5p的试剂。
进一步地，所述检测miRNA-142-5p的试剂为检测人血浆细胞外囊泡中 miRNA-142-5p的试剂。
进一步地，所述检测miRNA-142-5p的试剂为PCR检测试剂。
本发明还提供了一种诊断慢性疼痛伴发认知障碍的试剂盒，它包括检测 miRNA-142-5p的试剂。
进一步地，所述慢性疼痛伴发认知障碍为慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍。
进一步地，所述检测miRNA-142-5p的试剂为检测人外周血浆细胞外囊泡中miRNA-142-5p的试剂。
进一步地，所述检测miRNA-142-5p的试剂为检测人血浆细胞外囊泡中 miRNA-142-5p的试剂。
进一步地，所述检测miRNA-142-5p的试剂为PCR检测试剂。
本发明实施例具体采用实时荧光定量PCR检测人血浆细胞外囊泡中 miRNA-142-5p表达水平，但不仅仅限于该手段，可以采用现有miRNA分析技术公开的各种手段，即任何能够检测miRNA-142-5p表达水平的方法均可用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明通过研究发现人血浆细胞外囊泡中miRNA-142-5p表达水平与慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍紧密相关。与认知正常的人相比，人血浆细胞外囊泡中miRNA-142-5p表达水平越高，患慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍风险越大。因此，人血浆细胞外囊泡中miRNA-142-5p表达水平高低可以用于筛查、诊断慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍，为慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍的研究与治疗提供保障，具有良好的临床应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为认知正常组及慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍组大鼠Y迷宫试验的柱状图，**P<0.05，有统计学意义。
图2为认知正常组及慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍组大鼠的差异 miRNA的火山图，深红色表示上调显著差异的miRNA，深蓝色表示下调显著差异的miRNA。
图3为miRNA-142-5p在认知正常组及慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍组大鼠血浆细胞外囊泡中表达量差异柱状，n＝4，**P<0.05，有统计学意义。
图4为miRNA-142-5p在认知正常组及慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍组患者血浆细胞外囊泡中表达量差异柱状，n＝11，**P<0.05，有统计学意义。
图5为通过无差别聚类分析慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍患者血浆细胞外囊泡miRNA数据，使用建立的miRNA-142-5p诊断模型，AUC＝0.83。
具体实施方式
除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍与miRNA-142-5p表达水平的关系
通过血浆超速离心及高通量测序等技术，在前期建立的坐骨神经慢性压迫损伤(chronic constriction injury，CCI)慢性疼痛模型的认知障碍组与认知正常组大鼠中筛选出差异表达的miRNAs，其中miRNA-142-5p在认知障碍组的表达水平相比于认知正常组明显升高。提示miRNA-142-5p可能与CCI慢性疼痛模型中认知障碍的发生有关，有望成为该共病的早期诊断指标之一。
一、实验方法
实验动物：成年SD大鼠(5-8周)
慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍组：建模方法为：充分暴露左侧坐骨神经及其分支，用4-0含铬羊肠线结扎坐骨神经干近端分叉处上方4道，以神经鞘膜微下陷、左后肢轻微颤抖为准，形成一个区段性的慢性压迫，最终得到慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍模型。
认知正常组：仅暴露坐骨神经，不做任何压迫处理，然后缝合皮肤。得到认知正常的大鼠模型。
Y迷宫试验：按照常规方法对SD大鼠进行Y迷宫试验。
筛选miRNAs：通过试剂盒(miDETECT A Track miRNA qRT-PCR Starter Kit，C10712-1，锐博生物,中国)分别检测认知正常组和认知障碍组大鼠血浆细胞外囊泡中各miRNA的变化。检测大鼠血浆细胞外囊泡中miR-142-5p 表达水平的引物为购买所得(MIMAT0000847，锐博生物,中国)。
二、实验结果
实验结果如图1～3所示：
图1为认知正常组及慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍组大鼠的Y迷宫试验的结果，认知障碍组大鼠自发交替次数显著减少，说明本发明造模成功。
图2显示通过血浆细胞外囊泡测序发现，与认知正常组相比，慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍会引起血浆细胞外囊泡中4个miRNA的表达量变化。
图3说明与认知正常组相比，慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍组大鼠血浆细胞外囊泡中miR-142-5p表达水平明显增加(n＝4)。
通过上述结果可知：血浆细胞外囊泡miR-142-5p可能是诊断慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍的生物标志物。
实施例2、慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍与人血浆细胞外囊泡中 miR-142-5p表达水平的关系
一、实验方法
来源：四川大学华西医院疼痛科。
例数：慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍11人，完全健康且认知正常 11人。
分别检测两组受试者血浆细胞外囊泡中miR-142-5p表达水平。检测人血浆细胞外囊泡中miR-142-5p表达水平的方法包括如下步骤：
①收集患者血浆；
②使用RNeasy Mini Kit试剂盒提取血浆细胞外囊泡；
③提取得到血浆细胞外囊泡内中的总RNA；
④从血浆细胞外囊泡总RNA中分离得到microRNA；
⑤实时荧光定量PCR测定miR-142-5p的扩增循环值。
具体方法如下：
(一)患者血浆细胞外囊泡内含物总RNA提取方法如下：
(1)将收集得到的血浆解冻后，取500μL在4℃下离心15min，转速为 2000×g，收集上清液。
(2)上一步收集的上清液在4℃下离心30min，转速为12000×g，收集上清液。
(3)加入1体积buffer XBP到1体积的上清液中(将样品和bufferXBP 以体积比1:1混合，轻摇晃管5次)。
(4)将buffer XBP和样品混合液加入exoEasyspin colum中，离心(1min, 500g)丢弃通过离心柱的液体，将柱放回相同的收集管中。如果还有液体留在膜上，再次离心5000g1min，确保所有液体通过膜。此步是将预过滤的血浆(不包含大于0.8μM的微粒)与BufferXBP混合，加至exoEasy亲和性膜离心柱上，使囊泡结合到柱上。
(5)加入10ml buffer XWP(maxi)或者3.5ml buffer XWP(midi)，离心 5min(maxi)或者1min(midi)，5000g，移除剩余的缓冲液。将收集管中的液体和收集管一起丢弃。5000g的离心力可以下降至最小3000g而不造成性能损失。此步是使用Buffer XWP洗涤结合在膜上的囊泡。
(6)将spin column放入新的collection tube中。
(7)加入700μl qiazol到膜上。离心5min，5000g。收集裂解液并立刻转移至试剂盒中的2ml tube中。此步用qiazol裂解囊泡。
(8)轻微涡旋2ml tube，在室温下孵育5min。
(9)加入90μl chloroform氯仿，确保盖上盖子。大力摇晃15s。此步是在 qiazol洗脱液中加入氯仿。
(10)室温孵育2-3min。
(11)离心15min，12000g，4℃。
(12)将上清液转移到新的管中，加入2体积的100％乙醇，用移液枪混匀。
(13)用移液枪吸取700μl样品(包括沉淀)，加入RNeasy minelute spin column(放置于2ml收集管内)。盖好盖子并离心大于8000g，15s，室温，移除流过柱子的液体。
(14)重复上一步，以处理完所有样品液体。(包括miRNA在内的总RNA 结合到离心柱上)
(15)向柱子上加入700μl buffer RWT，盖好盖子并离心大于8000g，15s，室温，移除流过柱子的液体。
(16)向柱子上加入500μl buffer RPE，盖好盖子并离心大于8000g，15s，室温，移除流过柱子的液体。
(17)向柱子上加入500μl buffer RPE，盖好盖子并离心大于8000g，15s，室温，移除流过柱子的液体。(缓冲液洗涤三次)。
(18)将柱子转移到新的收集管中，将spin column盖子打开，离心full speed5min以干燥膜。将流过柱子的液体和收集管一起丢弃。
(19)将柱子放在新的1.5ml收集管中，立刻向柱子的膜中心加入14μlRNAase-freewater。轻轻关闭盖子，1min后，full speed离心1min以收集 RNA。(用water洗脱RNA)。
(二)血浆细胞外囊泡总RNA中分离microRNA实验
(1)用不含RNase的水将样品调节至100μl或200μl的体积。添加350μl 或700μl缓冲液RLT，并充分混合。
(2)向稀释的RNA中添加250μl或500μl 96～100％乙醇，并通过移液管充分混合。不离心，并立即执行步骤3。
(3)将样品(700μl)转移至放置在2ml收集中的RNeasy MinElute旋转柱中。轻轻盖上盖子，然后离心15s≥8000x g，(≥10000rpm)。丢弃上清液。
(4)将RNeasy MinElute旋转柱放置在新的2ml收集管(提供)中。添加500μl缓冲液RPE至旋转柱。轻轻盖上盖子，然后离心15s，转速≥8000x g(或者≥10000rpm)，清洗旋转柱膜。丢弃上清液。步骤5重复使用收集管。
(5)向RNeasy MinElute旋转柱中添加500μl 80％乙醇。轻轻盖上盖子，, 并在以下条件下离心2分钟≥8000x g(≥10000rpm)清洗旋转柱膜。丢弃上清液和收集管。
(6)将RNeasy MinElute旋转柱置于新的2ml收集管中。打开旋转柱盖子，全速离心5分钟。丢弃上清液和收集管。
(7)将RNeasy MinElute旋转柱置于新的1.5ml收集管中。将14μl RNase 游离水直接输送至旋转柱膜的中心。轻轻地盖上盖子，以全速离心1分钟以洗脱RNA。
(8)使用超微量分光光度计测定RNA浓度。先使用1μL DEPC水清洗样品台，之后用专用滤纸擦净样品台。选择程序为RNA测定，记录测出的RNA 浓度以及A260/A280、A260/230值。测定RNA浓度后，可将样品进行逆转录，或保存在-80℃冰箱备用。
(三)血浆细胞外囊泡实时荧光定量PCR实验
1、加尾(使用中国锐博生物公司的试剂盒)
1)冰上制备反应体系，按下表1的配制比例配制所需的反应体系：
表1.反应体系
2)混匀上述反应体系，37℃反应1h；
3)反应完成后置于冰上备用或者放于-80℃保存。
2、逆转录及PCR反应
逆转录及PCR反应检测试剂及引物均为购买所得。检测试剂 (miDETECT A TrackmiRNAqRT-PCR Starter Kit，C10712-1，锐博生物,中国)；引物(miDETECT A Track miRNAqRT-PCR Primer，miRA1000133-1-100，锐博生物,中国)，引物为加尾法miRNA引物，物种为人源性。
1)冰上制备逆转录反应体系，按下表2的配制比例配制所需的反应体系；
表2.反应体系
2)轻轻晃动PCR板使体系混匀，使用台式离心机4℃下离心PCR板 2min，转速为1000rpm，防止液体沾壁。
3)将PCR板放入双通道Real-Time PCR仪，选择程序开始扩增，扩增条件如表3所示。
表3.扩增条件
4)定量计算miR-142-5p表达水平。
二、实验结果
实验结果如图4和图5所示：
图4说明了与认知正常组相比，慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍患者血浆细胞外囊泡中miR-142-5p表达水平明显增加(n＝11)。
图5说明了，通过无差别聚类分析慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍患者血浆细胞外囊泡miRNA数据，使用建立的miRNA-142-5p诊断模型AUC 达到0.83，效能较好。
通过上述结果可知：与认知正常组相比，慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍患者血浆细胞外囊泡中miR-142-5p表达水平显著提高，血浆细胞外囊泡中miR-142-5p可作为诊断慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍的生物标志物，与认知正常组相比，miR-142-5p表达水平越高，患慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍的可能性越高。
综上，本发明通过研究发现人血浆细胞外囊泡中miRNA-142-5p表达水平与慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍紧密相关。与认知正常的人相比，人血浆细胞外囊泡中miRNA-142-5p表达水平越高，患慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍风险越大。因此，人血浆细胞外囊泡中miRNA-142-5p表达水平高低可以用于筛查、诊断慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍，为慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍的研究与治疗提供保障，具有良好的临床应用前景。
Claims (4)
1.检测miRNA-142-5p的试剂在制备诊断慢性疼痛伴发认知障碍的试剂盒中的用途；
所述慢性疼痛伴发认知障碍为慢性神经病理性疼痛伴发认知障碍。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测miRNA-142-5p的试剂为检测人外周血细胞外囊泡中miRNA-142-5p的试剂。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述检测miRNA-142-5p的试剂为检测人血浆细胞外囊泡中miRNA-142-5p的试剂。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测miRNA-142-5p的试剂为PCR检测试剂。
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