CN116179638B - 一种鱼精蛋白多肽的制备方法及产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种鱼精蛋白多肽的制备方法及产品，属于生物技术领域。本发明通过优化鱼精蛋白的提取方法，一是考虑到***组织中的盐分优化去除RNP的条件，二是优化了提取时的酸条件，采用复合酸完成，最终制备得到的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽不仅保持了一定的产率，而且具有较好的抑菌效果，具有实际应用意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鱼精蛋白多肽的制备方法及产品。
背景技术
鱼精蛋白是一种多聚阳离子天然肽类，可以用作防腐剂。鱼精蛋白存在于鱼类***组织中，与DNA结合，以核精蛋白的形式存在。分离鱼精蛋白需要使其与DNA分离然后进行纯化。
目前对于鱼精蛋白的提取分离多以鲑科鱼类为对象，随着三文鱼养殖技术的逐渐提升，对三文鱼来源的鱼精蛋白的提取方法进行研究是一个很有应用价值的方向。
鱼精蛋白的提取无论是过去还是现代的方法，基本上都是以硫酸或盐酸为主要提取剂，以柠檬酸盐或有机溶剂为纯化剂。在最近几年中，鱼精蛋白的提取工艺有了较大的改进和简化，如制备鱼精蛋白盐类的方法中，有将鱼精蛋白在稀硫酸溶液中处理，抽取出鱼精蛋白和混杂蛋白，然后在抽出液中加入甲醇或乙醇等有机溶剂沉淀上述蛋白，分离干燥的固体溶于温水中，再冷却析出鱼精蛋白。也有在硫酸或盐酸抽出液中不用有机溶剂而用聚磷酸盐，使鱼精蛋白以磷酸盐形式沉淀出来，然后将沉淀溶解在高浓度的硫酸铵中，复分解为精蛋白硫酸盐。这些方法需中途取出再溶解，不利于操作的连续性。
申请号为CN201210281599.1的中国专利中公开了一种硫酸鱼精蛋白的制备方法。采用3%硫酸提取、50-79℃温水提取、乙醇沉淀、以及低温处理四种生化技术，以鲑鱼的鱼精为原料，制得硫酸鱼精蛋白，其比旋度达到-72.0°。但其收率较低，实际生产限制大。
申请号为CN201711131728 .8的中国专利中公开了一种鲟鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽的制备方法，除杂处理后的鲟鱼白切碎成浆状，加NaCl，NaEDTA和PMSF混合液均质匀浆搅拌，离心分离，沉淀物加硫酸提取，低温离心分离，滤液用NaOH调pH，透析除盐后用乙醇沉淀，用丙酮和***洗，真空冷冻干燥得鲟鱼粗蛋白；经过纯化，得鲟鱼精蛋白。鲟鱼精蛋白用磷酸盐缓冲液匀浆，加酶，γ射线辐照，酶解得酶解液；酶解液沸水灭酶，冷却，加三氯乙酸溶液，离心分离，真空冷冻干燥得鲟鱼精蛋白多肽。该发明针对的鲟鱼原材料丰富，天然无污染，制备的鱼精蛋白及鲟鱼精蛋白多肽具有高持水保水性和抑菌效果，可广泛用于食品、化妆品、药品领域；特别可作为抗肝素剂用于体外心脏手术中。但海水鱼和淡水鱼在鱼***中的成分有不同，简单的挪用该方法并不能达到理想效果，且该方法操作具有一定难度。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种鱼精蛋白多肽的制备方法。
所述的制备方法中包括以下步骤：
（1）三文鱼***按1：1m/V加入0.08-0.12M的HCl进行匀浆，之后按HCl：NaCl溶液为1：4V/V加入0.1-0.12M的NaCl溶液，离心取沉淀；
（2）沉淀物中加入1：4-6体积比的酸混合液进行反应，离心过滤取滤液；
（3）加入丙酮沉淀，离心取沉淀冻干得鱼精蛋白；
（4）鱼精蛋白加入蛋白酶酶解，灭酶后加入丙酮沉淀，离心冻干得鱼精蛋白多肽。
所述的酸混合液的组成为0.4-0.8M的HCl和0.2-0.4M的柠檬酸。
优选地，所述的步骤（2）可以重复提取，即第一次离心过滤取滤液后，滤渣重复提取3次，重复提取时加入的酸混合液为第一次加量的一半，合并滤液后再进行步骤（3）的操作。
优选地，所述的步骤（1）中HCl为0.1-0.12M，NaCl溶液为0.12M；所述的步骤（2）中体积比为1：5。
进一步优选地，所述的步骤（1）中HCl为0.1M。
优选地，所述的酸混合液的组成为0.5-0.8M的HCl和0.2-0.4M的柠檬酸。
进一步优选地，所述的酸混合液的组成为0.5-0.6M的HCl和0.2-0.3M的柠檬酸。
更进一步地，所述的酸混合液的组成为0.5M的HCl和0.2M的柠檬酸。
具体地，所述的步骤（1）中的离心条件为4℃、4000r/min。
具体地，所述的步骤（2）中的酸混合液作用条件为室温。
具体地，所述的步骤（3）中离心条件为5000 r/min 离心10min。
具体地，所述的步骤（4）中的酶为中性蛋白酶。
具体地，所述的中性蛋白酶用量为鱼精蛋白的0.1%m/m。
具体地，所述的步骤（4）中的离心条件为6500 r/min 离心20min。
另一方面，本发明提供了前述的制备方法制备得到的鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽。
再一方面，本发明提供了前述的鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽在抑菌中的应用。
所述的应用可以是制备抑菌剂。
所述的应用也可以是直接将前述的鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽直接用于抑菌。
又一方面，本发明提供了前述的鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽在防腐剂中的应用。
又一方面，本发明同时提供了包含前述鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽的防腐剂或抑菌剂产品。
本发明的有益效果：
本发明通过优化鱼精蛋白的提取方法，一是考虑到***组织中的盐分优化去除RNP的条件，二是优化了提取时的酸条件，采用复合酸完成，最终制备得到的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽不仅保持了一定的产率，而且具有较好的抑菌效果，具有实际应用意义。
附图说明
图1为实施例1-5制备的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽对大肠杆菌的抑菌率。
图2为实施例1-5制备的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌率。
图3为实施例1-5制备的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽对白色念珠菌的抑菌率。
图4为对比例1-8制备的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽对大肠杆菌的抑菌率。
图5为对比例1-8制备的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽对金黄色葡萄球菌的抑菌率。
图6为对比例1-8制备的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽对白色念珠菌的抑菌率。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
（1）取除杂处理后的三文鱼***50g切碎，加50mL浓度为 0.1M 的HCl，均质匀浆，匀浆完成后加入200mL浓度为 0.1M 的NaCl溶液，4℃、4000r/min低温离心，取沉淀；
（2）沉淀物按体积比1：5加入酸混合液，酸混合液中包括0.5M的HCl和0.2M的柠檬酸，室温提取1h，4℃低温离心10min，过滤，取滤液，滤渣重复提取3次，重复提取时加入的酸混合液为第一次加量的一半，合并滤液；
（3）取步骤（2）所得滤液加入丙酮静置30min后5000 r/min 离心10min取沉淀，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白，称重计数为A；
（4）步骤（3）所得鱼精蛋白以料液比1：10（m/V）加入磷酸盐缓冲液，缓冲液pH为7.0，加入重量A的0.1%用量的中性蛋白酶（Solarbio，型号T8021），45℃反应30min，沸水灭酶10min。冷却后加入丙酮静置30min后6500 r/min 离心20min，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白多肽，称重计数为B。
三文鱼鱼精蛋白得率=A/50×100%。
三文鱼鱼精蛋白多肽得率=B/50×100%。
本实施例最终计算得到：
三文鱼鱼精蛋白得率为17.9%；三文鱼鱼精蛋白多肽得率为12.4%。
实施例2
（1）取除杂处理后的三文鱼***50g切碎，加50mL浓度为 0.12M 的HCl，均质匀浆，匀浆完成后加入200mL浓度为 0.1M 的NaCl溶液，4℃、4000r/min低温离心，取沉淀；
（2）沉淀物按体积比1：5加入酸混合液，酸混合液中包括0.6M的HCl和0.3M的柠檬酸，室温提取1h，4℃低温离心10min，过滤，取滤液，滤渣重复提取3次，重复提取时加入的酸混合液为第一次加量的一半，合并滤液；
（3）取步骤（2）所得滤液加入丙酮静置30min后5000 r/min 离心10min，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白，称重计数为A；
（4）步骤（3）所得鱼精蛋白以料液比1：10（m/V）加入磷酸盐缓冲液，缓冲液pH为7.0，加入重量A的0.1%用量的中性蛋白酶（Solarbio，T8021），45℃反应30min，沸水灭酶10min。冷却后加入丙酮静置30min后6500 r/min 离心20min，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白多肽。
三文鱼鱼精蛋白得率=A/50×100%。
三文鱼鱼精蛋白多肽得率=B/50×100%。
本实施例最终计算得到：
三文鱼鱼精蛋白得率为18.2%；三文鱼鱼精蛋白多肽得率为11.6%。
实施例3
（1）取除杂处理后的三文鱼***50g切碎，加50mL浓度为 0.1M 的HCl，均质匀浆，匀浆完成后加入200mL浓度为 0.12M 的NaCl溶液，4℃、4000r/min低温离心，取沉淀；
（2）沉淀物按体积比1：4加入酸混合液，酸混合液中包括0.8M的HCl和0.2M的柠檬酸，室温提取1h，4℃低温离心10min，过滤，取滤液，滤渣重复提取3次，重复提取时加入的酸混合液为第一次加量的一半，合并滤液；
（3）取步骤（2）所得滤液加入丙酮静置30min后5000 r/min 离心10min，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白，称重计数为A；
（4）步骤（3）所得鱼精蛋白以料液比1：10（m/V）加入磷酸盐缓冲液，缓冲液pH为7.0，加入重量A的0.1%用量的中性蛋白酶（Solarbio，T8021），45℃反应30min，沸水灭酶10min。冷却后加入丙酮静置30min后6500 r/min 离心20min，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白多肽。
三文鱼鱼精蛋白得率=A/50×100%。
三文鱼鱼精蛋白多肽得率=B/50×100%。
本实施例最终计算得到：
三文鱼鱼精蛋白得率为16.4%；三文鱼鱼精蛋白多肽得率为10.2%。
实施例4
（1）取除杂处理后的三文鱼***50g切碎，加50mL浓度为 0.1M 的HCl，均质匀浆，匀浆完成后加入200mL浓度为 0.12M 的NaCl溶液，4℃、4000r/min低温离心，取沉淀；
（2）沉淀物按体积比1：6加入酸混合液，酸混合液中包括0.6M的HCl和0.4M的柠檬酸，室温提取1h，4℃低温离心10min，过滤，取滤液，滤渣重复提取3次，重复提取时加入的酸混合液为第一次加量的一半，合并滤液；
（3）取步骤（2）所得滤液加入丙酮静置30min后5000 r/min 离心10min，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白，称重计数为A；
（4）步骤（3）所得鱼精蛋白以料液比1：10（m/V）加入磷酸盐缓冲液，缓冲液pH为7.0，加入重量A的0.1%用量的中性蛋白酶（Solarbio，T8021），45℃反应30min，沸水灭酶10min。冷却后加入丙酮静置30min后6500 r/min 离心20min，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白多肽。
三文鱼鱼精蛋白得率=A/50×100%。
三文鱼鱼精蛋白多肽得率=B/50×100%。
本实施例最终计算得到：
三文鱼鱼精蛋白得率为16.2%；三文鱼鱼精蛋白多肽得率为11.8%。
实施例5
（1）取除杂处理后的三文鱼***50g切碎，加50mL浓度为 0.08M 的HCl，均质匀浆，匀浆完成后加入200mL浓度为 0.12M 的NaCl溶液，4℃、4000r/min低温离心，取沉淀；
（2）沉淀物按体积比1：6加入酸混合液，酸混合液中包括0.4M的HCl和0.4M的柠檬酸，室温提取1h，4℃低温离心10min，过滤，取滤液，滤渣重复提取3次，重复提取时加入的酸混合液为第一次加量的一半，合并滤液；
（3）取步骤（2）所得滤液加入丙酮静置30min后5000 r/min 离心10min取沉淀，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白，称重计数为A；
（4）步骤（3）所得鱼精蛋白以料液比1：10（m/V）加入磷酸盐缓冲液，缓冲液pH为7.0，加入重量A的0.1%用量的中性蛋白酶（Solarbio，型号T8021），45℃反应30min，沸水灭酶10min。冷却后加入丙酮静置30min后6500 r/min 离心20min，真空冷冻干燥24h，得三文鱼鱼精蛋白多肽，称重计数为B。
三文鱼鱼精蛋白得率=A/50×100%。
三文鱼鱼精蛋白多肽得率=B/50×100%。
本实施例最终计算得到：
三文鱼鱼精蛋白得率为17.1%；三文鱼鱼精蛋白多肽得率为11.3%。
抑菌效果验证
对实施例1-5得到的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽进行抑菌效果验证：
鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽以25g/L和50g/L的浓度溶于纯水；
选用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌作为抑制对象，配制LB液体培养基，调节pH为7.0-7.5，培养基分装试管4mL，灭菌20 min，每管加菌约108个，加鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽溶液1 mL，混匀，在37℃条件下培养12h，检测OD值。设置空白对照加入纯水。
抑菌率=（OD对照-OD样品）/OD对照×100 %。
结果如图1-3所示。结果表明，实施例1-5制备的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽的实际作用浓度有5g/L和10g/L两种，对大肠杆菌CGMCC 1.1366、金黄色葡萄球菌CGMCC 14519和白色念珠菌 ATCC 10231均具有较好的抑菌效果，且鱼精蛋白多肽的抑菌效果更好。
对比例
参照实施例1的方法设置对比例，具体见表1。
表1.对比例的设置条件
统计对比例1-7制备得到的鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽得率，结果见表2。
表2 对比例鱼精蛋白和鱼精蛋白多肽得率
抑菌实验结果见图4-6。结果表明，本发明的方法制备的鱼精蛋白和鱼精蛋白肽抑菌效果更好。
Claims (13)
1.一种鱼精蛋白多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）三文鱼***按1：1m/V加入0.08-0.12M的HCl进行匀浆，之后按HCl：NaCl溶液为1：4V/V加入0.1-0.12M的NaCl溶液，离心取沉淀；
（2）沉淀物中加入1：4-6体积比的酸混合液进行反应，离心过滤取滤液；
（3）加入丙酮沉淀，离心取沉淀冻干得鱼精蛋白；
（4）鱼精蛋白加入蛋白酶酶解，灭酶后加入丙酮沉淀，离心冻干得鱼精蛋白多肽；
所述的步骤（2）中的酸混合液的组成为0.4-0.8M的HCl和0.2-0.4M的柠檬酸；
所述的步骤（4）中的酶为中性蛋白酶；
所述的中性蛋白酶用量为鱼精蛋白的0.1%m/m。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中HCl为0.1-0.12M，NaCl溶液为0.12M；所述的步骤（2）中体积比为1：5。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中HCl为0.1M。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酸混合液的组成为0.5-0.8M的HCl和0.2-0.4M的柠檬酸。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的酸混合液的组成为0.5-0.6M的HCl和0.2-0.3M的柠檬酸。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的酸混合液的组成为0.5M的HCl和0.2M的柠檬酸。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）中的离心条件为4℃、4000r/min。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（2）中的酸混合液作用条件为室温。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（3）中离心条件为5000 r/min 离心10min。
10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤（4）中的离心条件为6500r/min 离心20min。
11.权利要求1-10任一项所述的制备方法制备得到的鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽。
12.权利要求11所述的鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽在防腐剂中的应用。
13.一种防腐剂或抑菌剂，其特征在于，包括权利要求11所述的鱼精蛋白或鱼精蛋白多肽。
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