CN116179433A - 一种荧光假单胞菌Aw10及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Aw10及其应用，该菌株Aw10保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 20221544，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。通过对该菌株进行发酵培养基优化，在优化条件下菌株摇瓶发酵阿魏酸酯酶酶活为73.5U/L，与优化前菌株酶活相比提高了约2倍。该菌株具有阿魏酸酯酶产量高，耐高温等优点，可应用于白酒酿造生产中，尤其是大曲制作工艺的应用方面，有助于提高白酒中阿魏酸含量，对白酒的健康属性有积极影响，酒体及风味也得到了提升。

Description

一种荧光假单胞菌Aw10及应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)Aw10及其应用。
背景技术
酒曲酿酒是我国所发明的酿酒技术，曲是白酒酿造的糖化发酵剂，“曲为酒之骨”，优质的酒曲是生产出优质白酒的重要前提。高温曲、中温曲、低温曲分别指培菌温度大于60℃、在50-60℃之间、小于50℃的曲药。高温曲因为培菌的温度过高，所以细菌在成品曲微生物种类中占据优势地位，这些细菌多为芽孢杆菌属。低温曲的培菌温度相对较低，所以微生物种类较多，包含多种酵母菌、霉菌以及细菌。中温曲多呈砖形，因为大多原料为淀粉质原料，所以适合糖化菌生长。
阿魏酸是存在于植物中的一种重要的酚酸物质。在谷物中，除少数以游离形式存在外，大部分与***木聚糖以酯键连接，具有较强的抗氧化活性和防腐作用，被广泛应用于医药、农药、保健品、化妆品原料和食品添加剂等方面。阿魏酸不仅能猝灭自由基，而且能调节人体生理机能，抑制产生自由基的酶，促进清除自由基的酶的产生。阿魏酸及其衍生物具有抗血拴、降血脂、消炎、防癌等生物活性。阿魏酸安全无毒，易于为人体代谢，可作为抗氧化剂、机能促进物质和防腐保鲜剂应用在食品行业。日本等国家已经批准其作为食品添加剂。
阿魏酸酯酶又名肉桂酸酯酶，是羧酸酯酶的一个亚类，可以将阿魏酸与木质素、多糖、纤维素等之间的交联结构催化水解，获得游离的阿魏酸、阿魏酸二聚体等酚酸类物质。能催化水解植物细胞壁中阿魏酸与多糖之间的酯键而释放游离的阿魏酸、阿魏酸二聚体等酚酸类物质。阿魏酸酯酶导致植物细胞壁复杂网络结构的破坏，使得其他水解酶更容易接近底物的作用中心，从而提高了植物细胞壁的降解效率。阿魏酸酯酶在食品、饲料、医药、造纸、纺织等诸多领域中具有广泛的应用价值，其应用于白酒大曲生产中，可以使大曲中原料细胞壁的降解效率提高，从而使大曲中的微生物转化反应更彻底。
目前，对比文件(CN110066757B)的专利，公开了一株从麦曲中分离出一种可以产阿魏酸酯酶的假单胞菌，并通过制备强化麦曲应用于黄酒的酿造。另有对比文件(CN113308424A)公开了一种产阿魏酸酯酶的短小芽孢杆菌发酵产阿魏酸酯酶在45℃-60℃仍能保持80％以上的酶活力。然而上述现有技术未提及在白酒酿造过程中是否仍适于生长和产香，且均未提及在固态条件下菌株所产生的风味，在白酒酿造过程中未曾提及产阿魏酸酯酶的菌株及发酵优化与应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种荧光假单胞菌Aw10及应用。本发明是通过如下的技术方案来实现：
本发明的第一个目的是提供一种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Aw10，所述菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 20221544，保藏日期为2022年10月10日。
优选的，所述Aw10温度耐受性为30-65℃，在30-55℃生长良好，在35℃生长繁殖最快。
本发明的第二个目的是提供该荧光假单胞菌Aw10如下所述的分离和筛选步骤：
一)富集：利用五点取样法将成块的大曲装至搅碎机粉碎至粉末状，称取曲粉加入到装有玻璃珠的生理盐水的锥形瓶中，放置摇床中振荡1h，随后吸取悬浮液加入富集培养基中培养18h。
其中，富集培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，硫酸铵1.5g/L，七水硫酸镁1g/L。
二)高产阿魏酸酯酶菌株的分离和筛选
1)分离及初筛：在经过紫外杀菌的超净工作台中，将富集的菌液摇匀，吸取菌悬液于无菌的离心管中，加入无菌生理盐水进行梯度稀释，可得到梯度稀释的菌液。取3个不同梯度稀释菌液涂布于分离培养基上进行培养，并观察平板上的菌落情况以及菌落透明圈的大小。
其中，分离培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g，冷却至70℃添加15mL的(15％W/V溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液)阿魏酸乙酯。
2)复筛：a、将步骤1)中初筛获得的荧光假单胞菌株接种于装有种子培养基的离心管中培养22h，b、接种于发酵培养基中，培养72h，结束发酵，离心取上清液，过滤膜到进样瓶中，用高效液相色谱法测定发酵液，获得产阿魏酸酯酶的菌株，将该菌株保藏于甘油管中。
其中，种子培养基：硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，冷却至70℃添加15mL(15％W/V溶于N，N-二甲基甲酰胺)阿魏酸乙酯；
发酵培养基：麦麸10g/L，酵母提取物1g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.1g/L。
本发明的第三个目的是提供该荧光假单胞菌Aw10在发酵生产阿魏酸中的应用。
本发明的第四个目的是提供该荧光假单胞菌Aw10在发酵生产阿魏酸酯酶中的应用。
其中，所述荧光假单胞菌Aw10发酵生产阿魏酸酯酶的发酵条件为：pH4.0-9.0，温度24-40℃，接种量4-12％，转速140-220r/min，发酵培养基中以10-50g/L的葡萄糖作为碳源，以30-70g/L的酵母提取物作为氮源，以10-40g/L的粉碎的麦麸作为诱导物，KCl 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.05g/L，K2HPO40.1g/L。
优选的，所述荧光假单胞菌Aw10发酵生产阿魏酸酯酶的发酵条件：pH6.0，温度30℃，接种量6％，转速200r/min，发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母提取物60g/L，粉碎的麦麸30g/L，KCl 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.05g/L，K2HPO40.1g/L。
本发明的第五个目的是提供该荧光假单胞菌Aw10在固态发酵中的应用，该菌株在固态发酵中还产生了环丁醇、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-丁二酮、异丁酸丁酯、己酸、苯酚等风味物质。
保藏说明：
保藏地址：中国.武汉.武汉大学
保藏日期：2022年10月10日
菌种名称：荧光假单胞菌
拉丁名：Pseudomonas fluorescens
菌株编号：Aw10
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO.M 20221554
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1)本发明从大曲中筛选获得一株Aw10，由于生长环境长期驯化，具有耐高温的特性，非常有利于后期进行高产阿魏酸代谢工程改造；
2)Aw10在发酵温度50℃时仍能生长，可用于白酒酿造中，大曲制作工艺的应用，提高白酒中阿魏酸含量，增加白酒健康性；
3)Aw10在大曲制作工艺的应用，提高白酒中环丁醇、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-丁二酮、异丁酸丁酯、己酸、苯酚等风味物质的含量，改善口感和风味；
4)该菌株具有产阿魏酸酯酶酶活高，耐高温等优点，可用于大曲的制备，提升白酒品质；
5)通过对Aw10发酵条件进行优化，结果表明，最佳发酵条件为：pH 6.0，温度30℃，接种量6％，转速200r/min，发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母提取物60g/L，粉碎的麦麸30g/L，KCl 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.05g/L，K2HPO40.1g/L。在此条件下菌株摇瓶发酵阿魏酸酯酶的酶活为73.5U/L，与优化前菌株酶活25.5U/L相比提高了约2倍。
6)由于化学合成法制备成本高，不环保，植物富集法提取工艺复杂，产率低，本发明采用微生物发酵法来获得高产阿魏酸酯酶，具有安全、绿色、高效，可持续等特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中的Aw10的菌落初筛结果；
图2是本发明实施例中的Aw10的初始酶活对比图；
图3是本发明实施例中的Aw10的***发育树图；
图4是本发明实施例中的Aw10的生长曲线；
图5是本发明实施例中的Aw10的形态学特征实物图，a为菌株透明圈，b为革兰氏染色结果，c为扫描电镜图；
图6是本发明实施例中的Aw10的酒精耐受性效果图；
图7是本发明实施例中的Aw10的温度耐受性效果图；
图8是本发明实施例中的阿魏酸标准曲线；
图9是本发明实施例中的Aw10酶反应液色谱图(上)和阿魏酸标准品色谱图(下)；
图10是本发明实施例中的Aw10的发酵产酶的单因素实验结果效果图，a是pH，b是温度，c是接种量，d是转速，e是碳源种类，f是氮源种类，g是诱导物种类；
图11是本发明实施例中的Aw10的不同浓度葡萄糖对产酶的影响；
图12是本发明实施例中的Aw10的不同浓度酵母提取物对产酶的影响；
图13是本发明实施例中的Aw10的不同浓度粉碎的麦麸对产酶的影响；
图14是是本发明实施例中响应面分析因素间交互作用对阿魏酸酯酶酶活的影响效果图，a为葡萄糖和酵母提取物，b为葡萄糖和粉碎的麦麸，c为酵母提取物和粉碎的麦麸。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图1-14及实施例1-5，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
Aw10的分离与筛选
一)富集
利用五点取样法将成块的大曲装至搅碎机粉碎至粉末状，称取10.0g曲粉加入到装有玻璃珠的100mL无菌生理盐水的锥形瓶中，放置在37℃、180r/min摇床中振荡1h，随后吸取2mL悬浮液加入富集培养基中培养18h，得到菌悬液。
五点取样法：即先确定大曲块对角线的中点作为中心取样点，再在对角线上选择四个与中心样点距离相等的点作为样点；
1L富集培养基中：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，硫酸铵1.5g，七水硫酸镁1.0g。
二)高产阿魏酸酯酶菌株Aw10的分离和筛选
1)分离及初筛：在经过紫外杀菌的超净工作台中，将步骤一)中得到菌悬液摇匀，吸取0.1mL于无菌的1.5mL离心管中，加入0.9mL无菌生理盐水进行梯度稀释，可得到10-2、10-3、10-4、10-5倍的稀释菌液。取10-3、10-4、10-5等三个梯度的稀释菌液各0.2mL涂布于以阿魏酸乙酯为碳源的分离培养基上，挑取有透明圈的单菌落在筛选培养基上划线，并置于30℃隔水式恒温培养箱中培养至平板上有单菌落长出，耗时约1-3d。结果显示初筛获得了54株菌，其中，共5株产生透明圈的菌株如图1所示，分别是A4、A5、D7、W10和W11。
1L分离培养基中：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉20g，冷却至70℃后添加15mL的(15％W/V溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液)阿魏酸乙酯。
2)复筛：a、将步骤1)中初筛获得的产生透明圈的5株菌株接种于装有8mL种子培养基的15mL离心管中放置于30℃，180r/min恒温摇床中培养20h得种子液，b、以4％接种量接种至100mL发酵培养基中，于30℃，180r/min培养72h后，结束发酵，每组三个平行，设置一个空白对照，取30mL发酵液于50mL离心管中12000r/min离心10min，再取1mL上清液，过0.22μm水系针头滤膜到进样瓶中，用高效液相色谱测定发酵液中的阿魏酸含量，通过摇瓶发酵复筛，如图2所示，W10号菌株的酶活性较高，并将其命名为Aw10，将该菌株保藏于甘油管中，在后续实验中均以Aw10作为出发菌株。
1L种子培养基中：硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，七水硫酸镁0.5g，七水硫酸亚铁0.01g，冷却至70℃添加阿魏酸乙酯15mL(15％W/V溶于N，N-二甲基甲酰胺)
1L发酵培养基中：麦麸10g，酵母提取物1g，氯化钾0.05g，七水硫酸镁0.05g，磷酸氢二钾0.10g。
实施例2
分子生物学鉴定
一)鉴定：经过形态学观察与鉴定初步判断为革兰氏阴性短杆状菌体，由16S rDNA分子生物学鉴定测序结果与NCBI数据库进行BLAST对比，并利用MEGA-X软件基于Neighbor-Joining算法最终构建***发育树，确定该菌株为荧光假单胞菌并命名为Pseudomonasfluorescens Aw10，见图3。
二)Aw10的生长曲线
在摇瓶培养的过程中，每隔2h取种子液测定OD600nm值。测定结果显示，在培养6h前生长缓慢，6h后进入对数生长期，18-24h处于稳定生长期，24h后进入衰亡期，见图4。
三)Aw10的形态学及生理生化鉴定
经过菌落形态观察，菌落呈黄色，表面湿润***、边缘不整齐，形状较规则，粘稠度较低，容易被挑起，菌落不透明，见5a。革兰氏染色后用光学显微镜观察呈现红色，为革兰氏阴性菌，见图5b。通过电镜照片可知此菌体为短杆状，见图5c。
菌株生理生化结果见表1，该菌吲哚实验和过氧化氢酶试验为阳性，甲基红试验、VP试验和淀粉水解试验为阴性，同时，该菌可以利用葡萄糖、蔗糖、山梨醇和木糖醇产酸产气，不能利用D-***糖、乳糖和纤维素二糖。
表1 菌株生理生化特征
Figure BSA0000293787850000061
Figure BSA0000293787850000071
注：“+”，表示反应结果为阳性；“-”表示反应结果为阴性。
四)温度耐受性
如图6所示，随着温度的升高OD600nm逐渐增大，在30-55℃时菌株正常生长，最适生长温度为35℃，说明该菌株能够在中高温的条件下正常生长，具有较好的耐高温特性。
五)酒精耐受性
如图7所示，随着酒精度的增加OD600nm逐渐降低，说明菌株生长情况也逐渐变差，当酒精度达到6％时OD600nm趋于0，可知该菌株的酒精度最大耐受性为6％。
实施例3
Aw10的发酵液中阿魏酸含量与阿魏酸酯酶酶活的测定
一)阿魏酸标准曲线绘制
称取1.0mg阿魏酸(色谱纯级)，用50％甲醇定容至10mL，得到0.1g/L的阿魏酸标准品溶液。然后取0.1g/L的阿魏酸标准溶液稀释得到0.04g/L、0.03g/L、0.02g/L、0.01g/L、0.007g/L、0.004g/L、0.001g/L的阿魏酸标准品溶液，利用高效液相色谱仪测定峰面积。以标准溶液浓度(g/L)为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并制作线性回归方程。如图8所示，其回归方程y＝37550x+19.534，相关系数R2＝0.9998，表明两者线性关系良好。
二)阿魏酸含量的测定
挑取一环分离培养基中Aw10的单菌落接入装有8mL种子培养基的15mL离心管中放置于30℃，180r/min恒温摇床中培养20h得种子液，以4％接种量接种于100mL发酵培养基于30℃，180r/min恒温摇床中培养72h后，结束发酵，得到发酵液，取30mL发酵液于50mL离心管中12000r/min离心10min，再取1mL上清液，过0.22μm水系针头滤膜后进行高效液相色谱检测分析，以不加菌的培养基作为空白对照，测得接种Aw10发酵培养基中阿魏酸含量为559.34±0.58ng/L。
三)阿魏酸酯酶酶活的测定
1)Aw10发酵液制备：a、挑取一环分离培养基中Aw10的单菌落接入装有8mL种子培养基的15mL离心管中放置于30℃，180r/min恒温摇床中培养20h得种子液，b、以4％接种量接种于100mL发酵培养基于30℃，180r/min恒温摇床中培养72h后，结束发酵，得到发酵液；
2)粗酶液的制备：取步骤1)中的发酵液1mL于10000r/min离心15min，取上清液作为粗酶液；
3)酶反应试验：取步骤2)中粗酶液0.25mL于1.5mL离心管中，立即加入0.75mL0.003mol/L的阿魏酸甲酯溶液(溶解于0.05mol/L Tris-HCl溶液)，共同组成1mL酶反应体系。随后放入50℃恒温水浴锅中反应15min，反应结束后立即放入沸水浴中灭活10min，终止酶反应，得到酶反应液，并用等量的Tris-HCl缓冲液替换粗酶液作为空白组进行对照试验。煮沸后的酶反应液冷却至室温后，于12000r/min离心10min，经0.22μm的水系针头滤膜过滤后进行高效液相色谱检测分析。结果如图9所示，酶反应液色谱图(上)与阿魏酸标准品色谱图(下)中阿魏酸均在14min左右出峰，可证明酶反应液中含有阿魏酸酯酶，酶活测定为25.5U/L，并且能够代谢阿魏酸甲酯生成阿魏酸。
酶活定义：在30℃、pH自然条件下，水解阿魏酸甲酯每分钟生成1μmol阿魏酸所需的酶量为1个酶活力单位(1U)
实施例4
高产阿魏酸酯酶菌株发酵条件优化
一)单因素实验
选取pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，发酵温度分别为24、27、30、33、37、40℃，接种量分别为4、6、8、10、12％，转速分别为140、160、180、200、220r/min，以10g/L的蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、木聚糖、可溶性淀粉分别作为碳源，以10g/L的蛋白胨、酵母提取物、尿素、硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵、大豆作为氮源，以5g/L的小麦麸皮、粉碎的麦麸、去淀粉小麦麸皮、玉米粉作为诱导物等7个因素做单因素试验，每组做3个平行。
由图10a可知，发酵培养基的初始pH为6.0时阿魏酸酯酶的酶活达到最大值，随着pH的增加酶活下降，这可能与大曲酸性环境的驯化及菌株适应性有关，所以Aw10在pH 6.0时具有较强的生长繁殖与阿魏酸酯酶的积累能力。
由图10b可知，当发酵温度从24℃升至30℃时酶活随之增加，30℃时酶活达到最大值，可能是由于Aw10在30℃时最适合其生长繁殖且其关键酶活性亦随之提高。随后酶活又随温度升高而降低，推测高温下Aw10代谢酶受到抑制。
由图10c可知，阿魏酸酯酶酶活随接种量增大而增加，当接种量为6％时，阿魏酸酯酶酶活达到最大，随后降低，这是因为接种量过大引起发酵初期比较高的细胞浓度，进而底物大量消耗，造成产物合成阶段营养物质供应不足。
由图10d可知，阿魏酸酯酶酶活随转速增加而增大，当转速为200r/min时阿魏酸酯酶酶活达到最大值，随后开始下降。菌体的积累需要大量氧气，低转速条件下溶氧较低不利于菌体生长繁殖，但转速过高产会加速菌体衰亡。
由图10e-g可知，葡萄糖作为碳源时酶活达到较高值，其次是果糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖次之，可溶性淀粉与木聚糖酶活较低；不同的氮源中，酵母提取物的产酶效果较好，其次是蛋白胨、大豆和尿素，硝酸钠与硝酸铵效果较差；由于阿魏酸酯酶是一种诱导酶，小麦麸皮含有阿魏酸酯键可以诱导产生阿魏酸酯酶，从而可以提高酶活，在不同的诱导物种类中，粉碎的麦麸产酶效果较好，其次是去淀粉的麸皮与小麦麸皮，采用玉米粉时效果较差。
如图9a-g所示，单因素试验结果表明pH 6.0，温度30℃，接种量6％，转速200r/min，碳源为葡萄糖，氮源为酵母提取物，诱导物为粉碎的麦麸为发酵较优条件。
二)最陡爬坡实验
设置最适碳源浓度分别为10、20、30、40、50g/L、氮源浓度分别为30、40、50、60、70g/L、诱导物浓度分别为10、20、30、40g/L，研究不同浓度碳源、氮源和诱导物对发酵产酶的影响，如图11-13所示，产酶效果最好的含量为葡萄糖浓度30g/L，酵母提取物50g/L，粉碎的麦麸30g/L。
三)响应面试验设计
利用软件Design Expert 8.0.6进行Box-Behnken Design设计响应面试验，根据爬坡试验结果，以葡萄糖、酵母提取物和粉碎的麦麸为变量，以酶活产量为响应值，进行3因素3水平的响应面分析试验。
1)二次响应面回归模型的建立与分析
针对A(葡萄糖)、B(酵母提取物)和C(粉碎的麦麸)做3因素3水平共17个试验的响应面分析试验，响应面因素水平编码见表2，响应面结果分析见表3。经多元二次回归拟合，建立阿魏酸酯酶发酵条件优化模型，回归方程为：Y＝78.60+0.71A+2.78B+2.01C-0.80AB+0.075AC+1.65BC-6.61A2-13.59B2-6.06C2。由回归模型方差分析表4可知，模型p＜0.01，达到极显著水平，说明模型的预测值与实际值非常吻合。失拟项p为0.0845＞0.05，失拟项差异不显著，证明模型与实验拟合程度较好，具有统计学意义。模型中一次项A、B、C对酶活的影响极显著，一次项影响因子的主次顺序为C＞B＞A。A、B和C等3个因素在发酵过程中相互作用如图，可知3个因素两两之间相互影响的主次关系为：AB＞AC＞BC。
表2 响应面因素水平编码
Figure BSA0000293787850000101
表3 响应面实验结果分析
Figure BSA0000293787850000102
表4 回归模型方差分析
Figure BSA0000293787850000103
注：差异显著(P＜0.05)，差异极显著(P＜0.01)
2)各因子交互作用对阿魏酸酯酶酶活影响的分析
响应面图可以直观的反映出试验因素对阿魏酸酯酶酶活的影响，响应面坡度越陡峭，说明响应面值对操作条件的改变越敏感。葡萄糖、酵母提取物和粉碎的麦麸各因素在发酵过程中相互作用如图14，可知3个因素两两之间相互影响的主次关系为：AB＞BC＞AC。
根据响应面试验结果可知，Aw10发酵生产阿魏酸酯酶最优发酵条件下，碳源、氮源、诱导物的添加量分别为：葡萄糖30g/L，酵母提取物60g/L，粉碎的麦麸30g/L。
综上所述，Aw10发酵生产阿魏酸酯酶最优发酵条件为：接种量60mL/L，转速200r/min，pH 6.0，温度30℃，葡萄糖30g/L，酵母提取物60g/L，粉碎的麦麸30g/L，KCl 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.05g/L，K2HPO40.10g/L，在此条件下菌株摇瓶发酵阿魏酸酯酶酶活最大，其预测值为76.8U/L，在此条件下，重复3次发酵实验，得到阿魏酸酯酶平均产量为73.5U/L。综合分析，该发酵实验结果与响应面试验结果十分接近，与优化前菌株的酶活25.5U/L相比提高了约2倍。
实施例5
Aw10发酵对比试验
将Aw10进行小麦固态发酵，将不加菌的小麦固态发酵作为对照组。由表5可知，Aw10在固态发酵中对比对照组产生了2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-丁二酮、2-甲基丁酸丁酯、异丁酸丁酯等风味物质，2，3，5，6-四甲基吡嗪具有坚果、烤面包、熟花生、榛子和可可豆的香味；2，3-丁二酮具有强烈的奶油香味、发酵香味、乳脂香味等；2-甲基丁酸丁酯有苹果样的果香香气；异丁酸丁酯具有强烈的新鲜苹果和菠萝似水果香味等，表明该菌株在大曲制作中有改善白酒口感和风味方面的应用价值。
表5 Pseudomonas fluorescens Aw10固态发酵风味物质比较
Figure BSA0000293787850000111
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Figure BSA0000293787850000121
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Aw10，其特征在于，所述荧光假单胞菌Aw10保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 20221554，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
2.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌Aw10，其特征在于，所述荧光假单胞菌Aw10温度耐受性为30-65℃，在30-55℃生长良好，在35℃生长繁殖最快。
3.根据权利要求1所述的一种荧光假单胞菌Aw10，其特征在于，所述荧光假单胞菌Aw10的分离与筛选包括以下步骤：
一)富集：利用五点取样法将成块的大曲装至搅碎机粉碎至粉末状，称取曲粉加入到装有玻璃珠的生理盐水的锥形瓶中，放置摇床中振荡1h，随后吸取悬浮液加入富集培养基中培养18h。
其中，富集培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，硫酸铵1.5g/L，七水硫酸镁1g/L。
二)高产阿魏酸酯酶菌株的分离和筛选
1)分离及初筛：在经过紫外杀菌的超净工作台中，将富集的菌液摇匀，吸取菌悬液于无菌的离心管中，加入无菌生理盐水进行梯度稀释，可得到梯度稀释的菌液。取3个不同梯度稀释菌液涂布于分离培养基上进行培养，并观察平板上的菌落情况以及菌落透明圈的大小。
其中，分离培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉20g，冷却至70℃添加15mL的(15％W/V溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液)阿魏酸乙酯。
2)复筛：a、将步骤1)中初筛获得的荧光假单胞菌株接种于装有种子培养基的离心管中培养22h，b、接种于发酵培养基中，培养72h，结束发酵，离心取上清液，过滤膜到进样瓶中，用高效液相色谱法测定发酵液，获得产阿魏酸酯酶的菌株，将该菌株保藏于甘油管中。
其中，种子培养基：硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，七水硫酸亚铁0.01g/L，冷却至70℃添加15mL(15％W/V溶于N，N-二甲基甲酰胺)阿魏酸乙酯；
发酵培养基：麦麸10g/L，酵母提取物1g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，磷酸氢二钾0.1g/L。
4.一种如权利要求1所述的一种荧光假单胞菌Aw10在发酵生产阿魏酸中的应用。
5.一种如权利要求1所述的一种荧光假单胞菌Aw10在发酵生产阿魏酸酯酶中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征是，所述荧光假单胞菌Aw10发酵生产阿魏酸酯酶的发酵条件为：pH4.0-9.0，温度24-40℃，接种量4-12％，转速140-220r/min，发酵培养基中以10-50g/L的葡萄糖作为碳源，以30-70g/L的酵母提取物作为氮源，以10-40g/L的粉碎的麦麸作为诱导物，KCl 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.05g/L，K2HPO40.1g/L。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征是，所述荧光假单胞菌Aw10发酵生产阿魏酸酯酶的发酵条件：pH6.0，温度30℃，接种量6％，转速200r/min，发酵培养基：葡萄糖30g/L，酵母提取物60g/L，粉碎的麦麸30g/L，KCl 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.05g/L，K2HPO40.1g/L。
8.一种如权利要求1所述的荧光假单胞菌Aw10在大曲制作中的应用，其特征是，所述荧光假单胞菌Aw10在固态发酵中还产生了环丁醇、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2，3-丁二酮、异丁酸丁酯、己酸、苯酚等风味物质。
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