CN116179413A - 一种缓解或改善念珠菌性***炎的益生菌组合物及其应用 - Google Patents

一种缓解或改善念珠菌性***炎的益生菌组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种缓解或改善念珠菌性***炎的益生菌组合物及其应用，用于维护***菌群平衡，可为VVC感染人群及频繁复发患者提供有效的治疗方案。用该益生菌组合物制备的固体饮料等产品，功效口感俱佳，日常食用可以缓解或改善念珠菌性***炎，对于反复发作的VVC患者具有有益效果。本发明大大拓展了益生菌的应用领域。

Description

一种缓解或改善念珠菌性***炎的益生菌组合物及其应用
技术领域
本发明涉及一种益生菌组合物，具体涉及一种缓解或改善念珠菌性***炎的益生菌组合物及其应用。属于生物医药加工技术领域。
背景技术
***炎是一种常见的妇科疾病，每年逾千万人次就诊，***炎主要分为滴虫性***炎、细菌性***炎以及念珠菌性***炎等。念珠菌性***炎(VulvovaginalCandidiasis，VVC)被认为是仅次于细菌性***病的第二大最常见的炎症原因，据统计大约75％的育龄妇女至少发生过一次VVC。
VVC致病菌以白色念珠菌为主，是最常见的深部真菌之一。当机体免疫力下降或过度使用抗生素等原因引起***菌群失衡时，白色念珠菌可引起宿主感染。尽管对于VVC病因研究有所进展，但临床上VVC感染率仍居高不下且治疗后极易复发，严重威胁女性身心健康。
目前对于VVC的治疗主要是采用抗真菌药局部与全身用药相结合进行治疗，但存在疗程长、副作用大的缺点，并存在滥用抗生素的风险，随着白色念珠菌对抗真菌药物的耐药性不断提高，无抗治疗方案亟待提出。最新研究表明，益生菌可能是一种安全、自然的治疗方案来平衡和维持***微生物群的健康，益生菌组合物可为***菌群失衡、反复感染VVC的人群提供有效的治疗方案。
发明内容
本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种缓解或改善念珠菌性***炎的益生菌组合物及其应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种缓解或改善念珠菌性***炎的益生菌组合物，是由以下组分混合制成的：
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LP115，该菌株已于2022年8月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.25576；
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF26，该菌株已于2020年2月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.19431；
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LPC12，该菌株已于2022年3月11日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24512；
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH10，该菌株已于2022年3月11日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24513；
德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis)LDL114，该菌株已于2022年8月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.25575；
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)LA25，该菌株已于2022年8月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.25569。
优选的，植物乳植杆菌LP115、发酵乳杆菌LF26、副干酪乳杆菌LPC12、鼠李糖乳杆菌LRH10、德氏乳杆菌乳亚种LDL114以及瑞士乳杆菌LA25的活菌数比为3：3：3：6：1：3。
优选的，所述组合物的活菌量不低于2×1011cfu/mL。
上述益生菌组合物在制备缓解或改善念珠菌性***炎的药物、食品、保健品、膳食补充剂或固体饮料中的应用。
一种缓解或改善念珠菌性***炎的药物、食品、保健品、膳食补充剂或固体饮料，其有效成分为上述益生菌组合物。
一种缓解或改善念珠菌性***炎的固体饮料，是由以下重量份的原料混合制成的：蔓越莓粉15～30份，益生菌组合物5～8份。
上述一种缓解或改善念珠菌性***炎的固体饮料的制备方法，具体步骤如下：
(1)先将除益生菌组合物之外的其他原料按照配方量混合，得到混合物；
(2)然后将混合物与益生菌组合物混合均匀，灌装即可。
本发明的有益效果：
本发明采用一种益生菌组合物，用于维护***菌群平衡，可为VVC感染人群及频繁复发患者提供有效的治疗方案。用该益生菌组合物制备的固体饮料等产品，功效口感俱佳，日常食用可以缓解或改善念珠菌性***炎，对于反复发作的VVC患者具有有益效果。本发明大大拓展了益生菌的应用领域。
附图说明
图1益生菌组合物对生殖道上皮细胞的吸附作用；
图2益生菌组合物对白色念珠菌的聚集作用。
保藏信息
分类命名：植物乳植杆菌
拉丁文学名：Lactiplantibacillus plantarum
保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年8月22日
保藏编号：CGMCC NO.25576
分类命名：发酵乳杆菌
拉丁文学名：Lactobacillus fermentum
保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年2月24日
保藏编号：CGMCC NO.19431
分类命名：副干酪乳杆菌
拉丁文学名：Lactobacillus paracasei
保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年3月11日
保藏编号：CGMCC NO.24512
分类命名：鼠李糖乳杆菌
拉丁文学名：Lactobacillus rhamnosus
保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年3月11日
保藏编号：CGMCC NO.24513
分类命名：德氏乳杆菌乳亚种
拉丁文学名：Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis
保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年8月22日
保藏编号：CGMCC NO.25575
分类命名：瑞士乳杆菌
拉丁文学名：Lactobacillus helveticus
保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2022年8月22日
保藏编号：CGMCC NO.25569
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
1.培养基的制备
1.1SDA固体培养基的制备
成分：
Figure SMS_1
制备方法：将上述各成分按比例称取，加热至充分溶解，随后置于121℃条件下高压灭菌15min，冷却至室温后倾倒于无菌平皿(约12mL)，厚度约4mm，静置10min，待自然凝固后置于4℃冰箱冷藏备用。
1.2MRS培养基的制备
成分：
Figure SMS_2
制备方法：将上述各成分按比例称取，加热至充分溶解，随后置于121℃条件下高压灭菌15min，备用。
2.菌悬液的制备
2.1一种缓解或改善念珠菌性***炎的益生菌组合物，是由以下组分混合制成的：
植物乳植杆菌*(Lactiplantibacillus plantarum)LP115(曾用名：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP115)，该菌株已于2022年8月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.25576；
发酵乳杆菌*(Lactobacillus fermentum)LF26(又名：发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)LF26)，该菌株已于2020年2月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.19431；
副干酪乳杆菌*(Lactobacillus paracasei)LPC12(又名：副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillus paracasei)LPC12)，该菌株已于2022年3月11日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.24512；
鼠李糖乳杆菌*(Lactobacillus rhamnosus)LRH10(鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)LRH10)，该菌株已于2022年3月11日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO.24513；
德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis)LDL114，该菌株已于2022年8月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.25575；
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)LA25，该菌株已于2022年8月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.25569。
(注：“*”按照卫健委公告“关于《可用于食品的菌种名单》和《可用于婴幼儿食品的菌种名单》更新的公告(2022年 第4号)”的要求进行调整)
植物乳植杆菌LP115、发酵乳杆菌LF26、副干酪乳杆菌LPC12、鼠李糖乳杆菌LRH10、德氏乳杆菌乳亚种LDL114以及瑞士乳杆菌LA25的活菌数比为3：3：3：6：1：3。
组合物的活菌量不低于2×1011cfu/mL。
2.2白色念珠菌菌悬液的制备
将标准菌株白色念珠菌ATCC10231(购自中国食品药品检定研究院)接种于SDA培养基上，置于35℃恒温箱孵育培养48小时，将菌种转种2次，保证菌种活力。
用消毒接种环在已经转种活化的白色念珠菌培养基表面刮取直径＞1mm的独立菌落，将其加入装有质量浓度0.85％无菌生理盐水的离心管内，将离心管置于旋涡振荡器上震荡15s，含菌量不少于1*106CFU/mL。
2.3益生菌菌悬液的制备
2.3.1单株菌菌悬液的制备
将植物乳植杆菌LP115、发酵乳杆菌LF26、副干酪乳杆菌LPC12、鼠李糖乳杆菌LRH10、德氏乳杆菌乳亚种LDL114、瑞士乳杆菌LA25菌株分别于37℃在MRS培养基上活化培养24h，再以1％的体积接种量接种于MRS培养基(购自北京陆桥技术股份有限公司)，37℃静置培养12h。
取培养12h的培养液，10000r/min离心10min收集菌体，并用PBS缓冲液(pH＝7.4)洗涤后于10000r/min离心10min，清洗残留培养基，重复洗涤3次。再将菌体装有质量浓度0.85％无菌生理盐水的离心管内，将离心管置于旋涡振荡器上震荡15s，含菌量不少于1*109CFU/mL。
2.3.2益生菌组合物菌悬液的制备
将按比例配好的益生菌组合物于37℃在MRS培养基上活化培养24h，再以1％的体积接种量接种于MRS培养基，37℃静置培养12h。
取培养12h的培养液，10000r/min离心10min收集菌体，并用PBS缓冲液(pH＝7.4)洗涤后于10000r/min离心10min，清洗残留培养基，重复洗涤3次。再将菌体装有质量浓0.85％无菌生理盐水的离心管内，将试离心管于旋涡振荡器上震荡15s，含菌量不少于1*109CFU/mL。
2.3.3蔓越莓粉溶液的制备
将原料蔓越莓粉溶解于去离子水，配制成100mg/mL的水溶液，待用。
2.3.4蔓越莓粉溶液的制备：在2.3.2的菌液基础上溶入蔓越莓粉，使其浓度达到100mg/L，待用。
3.体外抑菌实验
于超净工作台上，用直径10mm无菌打孔器在已制备的SDA培养基上打孔，用无菌棉拭子蘸取白色念珠菌菌悬液，按“Z”字型均匀涂布在培养皿上，动作需要快速连贯，避免划破琼脂表面。将制备好的单株菌菌悬液、益生菌组合物菌悬液、蔓越莓粉水溶液、蔓越莓粉+益生菌组合物的水溶液分别加入打好的孔中，每孔约200μL。将白色念珠菌琼脂平板置于35℃恒温箱中培养48h后，用游标卡尺准确测量抑菌圈直径，以上操作平行重复3次，取平均值。具体实验数据见表1：
表1益生菌的抑菌性结果
菌种/原料 抑菌圈大小(mm)
空白 0
植物乳植杆菌LP115 20.32±1.22
发酵乳杆菌LF26 7.77±0.73
副干酪乳杆菌LPC12 32.27±2.05
鼠李糖乳杆菌LRH10 18.00±0.17
德氏乳杆菌乳亚种LDL114 17.43±1.28
瑞士乳杆菌LA25 21.37±0.59
益生菌组合物 38.83±2.15
蔓越莓粉 5.32±1.54
蔓越莓粉+益生菌组合物 39.4±0.81
由上表可知，单株菌、益生菌组合物及原料蔓越莓粉均对白色念珠菌具有抑制作用，且益生菌组合物的抑菌效果明显优于单株菌，根据单株菌的抑菌效果组成益生菌组合物，复配比例为植物乳植杆菌LP115：瑞士乳杆菌LA25：鼠李糖乳杆菌LRH10：副干酪乳杆菌LPC12：发酵乳杆菌LF26：德氏乳杆菌乳亚种LDL114＝3：3：3：6：1：3。
4.生殖道上皮细胞吸附能力实验
4.1生殖道上皮细胞环境模拟
以人类子***细胞株Hela细胞模拟生殖道上皮细胞，将Hela细胞培养稳定后，控制浓度为1*105/mL，将Hela细胞接种于24孔板内，置于二氧化碳培养箱37℃，培养24h，备用。
4.2生殖道上皮细胞吸附实验
将制备好的菌悬液分别取100μL加入接种了Hela细胞的24孔板内，置于二氧化碳培养箱37℃，培养2h，用PBS缓冲溶液去除未吸附于生殖道上皮细胞的菌液后镜检，随机数5个细胞上吸附菌数，取平均值。具体实验数据见表2。
表2益生菌对生殖道上皮细胞吸附结果
菌种 吸附菌数(CFU/Hela cell)
益生菌组合物 350
瑞士乳杆菌LA25 85
植物乳植杆菌LP115 82
鼠李糖乳杆菌LRH10 18
发酵乳杆菌LF26 56
副干酪乳杆菌LPC12 93
德氏乳杆菌乳亚种LDL114 112
由表2可知，益生菌组合物相比较其他单株菌，对生殖道上皮细胞具有很强的吸附能力，能够长时间定植于女性生殖道，可以通过“占位效应”抑制白色念珠菌等其他病菌吸附于生殖道上皮细胞，说明该益生菌组合物可有效缓解或改善念珠菌性***炎。
4.3益生菌组合物吸附生殖道上皮细胞
将制备好的益生菌组合物菌悬液分别取100μL加入接种了Hela细胞的24孔板内，置于二氧化碳培养箱37℃培养2h，设置6个复孔，其中未加益生菌组合物菌悬液的为空白对照组。培养时间到后弃上清液，用PBS缓冲溶液去除未吸附于生殖道上皮细胞的菌液后进行结晶紫染色，于显微镜下观察，详情见图1。由图1可见，益生菌组合物可以大量吸附于生殖道上皮细胞。
5.人群实验
5.1患者选择
共招募了141名受试者，由妇科医生确诊为VVC，并愿意在整个实验过程中进行承诺。排除标准包括I型糖尿病、长期用药6个月或以上、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，以及研究者认为无论出于任何原因都不太可能完成的患者。选择这些排除标准是因为患有这些健康疾病的患者可能会服用可能干扰肠道中乳酸菌生存能力的药物，例如益生菌和华法林之间的相互作用。
在招募的141名受试者中，24名受试者在8周期间退出，原因是不遵守问卷或出行限制，无法进行抽样，8周研究后产生78名受试者(益生菌组合物组1，n＝39；益生菌组合物组2，n＝39；安慰剂组，n＝39)。在整个研究中没有不良反应报告，也没有患者因任何并发症退出。
5.2实验设计
所有受试者均采用***栓剂CandioV3(每片含200mg)治疗3天，持续3天。实验设计选择口服胶囊干预，每天早晚于饭后1小时各服用一粒胶囊(益生菌组合物/安慰剂)，持续8周。
益生菌1组合物组服用的胶囊由益生菌组成，其中菌粉为LP115：LA25：LRH10：LPC12：LF26：LDL114＝3：3：3：6：1：3比例混合，以麦芽糊精为辅料(质量占比70％)；安慰剂组服用的胶囊含有100％麦芽糊精。两种胶囊中的粉末均呈淡黄色，味道无异。两种胶囊均储存低于30℃、远离阳光直射的环境中。
益生菌2组合物组服用的胶囊由益生菌组成，其中菌粉为LP115：LPC12：LF26：＝3：6：1比例混合，以麦芽糊精为辅料(质量占比70％)；安慰剂组服用的胶囊含有100％麦芽糊精。两种胶囊中的粉末均呈淡黄色，味道无异。两种胶囊均储存低于30℃、远离阳光直射的环境中。
符合所有要求的受试者首先由妇科医生进行筛查并进行VC确认。评估包括三种类型的问卷；1)基本信息问卷；2)基于第周0、4、8的外阴***症状问卷；3)作为辅助改善肠道健康的益生菌产品，肠道健康问卷(在第0、4、8周收集)也得到了验证。
5.3实验结果
5.3.1受试者基本信息调查
表3基本信息统计表
基本信息 安慰剂组(n＝39) 益生菌组1(n＝39) 益生菌组2(n＝39)
年龄 28.38±0.96 23.51±0.89 24.51±0.84
体重(kg) 62.10±1.81 66.31±2.59 64.33±2.35
身高(cm) 155.32±0.88 156.45±0.94 157.23±0.87
BMI 25.89±0.88 26.94±0.91 26.32±0.81
由表3可知，益生菌组合物组及安慰剂组受试者所有一般性特征均无显著性差异。
5.3.2外阴症状调查
表4外阴症状信息统计表
Figure SMS_3
由表4可知，服用安慰剂产品的患者在4周后外阴症状无明显变化，而服用益生菌组1合物产品和益生菌组2合物产品的患者在4周后出现明显的症状减轻，在第8周后持续观察，各症状同样有所缓解。两组益生菌组合物相比，组合物1效果更加明显。
根据外阴***症状调查问卷中报告零症状的患者数量来跟踪评估复发情况，主要统计服用胶囊后的第12-20周，详情见表5。
表5外阴***症状复发患者数量统计表
Figure SMS_4
由表5可知，与安慰剂组相比，服用益生菌1组合物和益生菌2组合物的患者复发率减少，服用益生菌组合物可在改善VVC的情况下，有效减少复发。两组益生菌组合物相比，组合物1复发的相对更少。
上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (7)

1.一种缓解或改善念珠菌性***炎的益生菌组合物，其特征在于，是由以下组分混合制成的：
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)LP115，该菌株已于2022年8月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.25576；
发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)LF26，该菌株已于2020年2月24日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.19431；
副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)LPC12，该菌株已于2022年3月11日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24512；
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LRH10，该菌株已于2022年3月11日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.24513；
德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.Lactis)LDL114，该菌株已于2022年8月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.25575；
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)LA25，该菌株已于2022年8月22日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.25569。
2.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，植物乳植杆菌LP115、发酵乳杆菌LF26、副干酪乳杆菌LPC12、鼠李糖乳杆菌LRH10、德氏乳杆菌乳亚种LDL114以及瑞士乳杆菌LA25的活菌数比为3：3：3：6：1：3。
3.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于，所述组合物的活菌量不低于2×1011cfu/mL。
4.权利要求1～3中任一项所述益生菌组合物在制备缓解或改善念珠菌性***炎的药物、食品、保健品、膳食补充剂或固体饮料中的应用。
5.一种缓解或改善念珠菌性***炎的药物、食品、保健品、膳食补充剂或固体饮料，其特征在于，其有效成分为权利要求1～3中任一项所述益生菌组合物。
6.一种缓解或改善念珠菌性***炎的固体饮料，其特征在于，是由以下重量份的原料混合制成的：蔓越莓粉15～30份，益生菌组合物5～8份。
7.权利要求6所述一种缓解或改善念珠菌性***炎的固体饮料的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)先将除益生菌组合物之外的其他原料按照配方量混合，得到混合物；
(2)然后将混合物与益生菌组合物混合均匀，灌装即可。
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