CN116178589B

CN116178589B - 一种两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物及其制备和应用

Info

Publication number: CN116178589B
Application number: CN202310486747.1A
Authority: CN
Inventors: 郭占勇; 袁玉婷; 谭文强; 林琮皓; 宓英其
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2023-05-04
Filing date: 2023-05-04
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2043-05-04
Also published as: CN116178589A

Abstract

本发明涉及纳米生物医学技术领域，具体是一种两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物及其制备方和应用。两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物结构式如式（1）所示，其中R为含硫辛酰胺的吡啶盐，平均聚合度n取值范围是20‑60，本发明制备两亲性化合物的步骤简单易行，以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备的纳米胶束具有良好的生物相容性，对抗肿瘤药物呈现较高的包载能力和氧化还原响应性释放行为，是一种应用价值良好的载体。

式（1）。

Description

一种两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物及其制备和应用

技术领域

本发明属于纳米生物医学技术领域，具体是一种两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物及其制备方法和在纳米载体中的应用。

背景技术

壳聚糖(Chitosan)是由甲壳素经过脱乙酰化得到的碱性多糖，作为一种可再生、无毒副作用，生物相容性和降解性良好的多糖，具有很多独特的生理、药理功能性质，因此，壳聚糖在自组装纳米给药***领域有极大的应用潜力。壳聚糖本身具有一定的亲水性，但是缺乏亲脂性结构无法形成核-壳结构的纳米胶束，壳聚糖本身含有可作为化学修饰位点的氨基和羟基基团，可通过高效化学修饰手段引入疏水基团得到两亲性化合物，进而制备成纳米载体。此外，纳米载体的稳定性和胶束所带电荷密切相关，壳聚糖分子中2位的氨基在酸性溶液中易发生质子化，在酸性条件壳聚糖带正电性，但是在中性和碱性条件下无法显正电性；同时壳聚糖2位的氨基比较活泼，易发生化学修饰，修饰后壳聚糖的正电性大大降低，因此需要引入稳定的正电荷来提高壳聚糖纳米胶束的稳定性。同时考虑二硫键对于肿瘤微环境的氧化还原响应性，本发明利用硫辛酸的亲脂性结构及二硫键氧化还原响应作用，通过吡啶阳离子将壳聚糖和硫辛酸连接形成硫辛酰基阳离子两亲性化合物，进一步制备成氧化还原响应性纳米胶束。

发明内容

本发明目的是提供一种可作为疏水性化疗药物载体的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物及其制备和应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

一种两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物，两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物结构式如式（1）所示，

式（1），其中/>

，其中聚合度n取值范围是20-60。

一种所述的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的制备方法：首先将壳聚糖烟酰化，而后与溴乙胺氢溴酸盐亲核反应得到胺乙基阳离子壳聚糖，所得胺乙基阳离子壳聚糖在N,N'-羰基二咪唑的催化作用下与α-硫辛酸反应，即得式（1）所示产物两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物；

所述N,N'-羰基二咪唑的摩尔量为壳聚糖摩尔量的3.0-6.0倍；烟酸的摩尔量为壳聚糖摩尔量的3.0-6.0倍；溴乙胺氢溴酸盐的摩尔量为烟酰化壳聚糖摩尔量的2.0-5.0倍；N,N'-羰基二咪唑的摩尔量为α-硫辛酸摩尔量的1.0-4.0倍；α-硫辛酸的摩尔量为胺乙基阳离子壳聚糖摩尔量的1.0-4.0倍。

将N,N'-羰基二咪唑加入到含烟酸的二甲亚砜溶液中，然后与壳聚糖在50-70℃反应12-24 h, 反应混合物用过量丙酮沉淀，洗涤冷却干燥后，即得到烟酰化壳聚糖；所得烟酰化壳聚糖与溴乙胺氢溴酸盐于50-70℃反应12-36 h，所得固体用乙醇沉淀、洗涤，冷冻干燥，即得胺乙基阳离子壳聚糖，待用。

将N,N'-羰基二咪唑加入到含α-硫辛酸的二甲亚砜溶液中，并于氮气氛围中，50-70℃下反应12-36 h，反应所得溶液备用；将所得胺乙基阳离子壳聚糖溶于二甲亚砜并与上述所得的溶液在50-70℃条件下继续反应12-36 h，而后用丙酮沉淀洗涤，冷冻干燥后得到式（1）所示的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物。

一种所述的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的应用，所述式（1）所示两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备的纳米胶束在药物载体中的应用。

本发明所具有的优点：

（1）本发明以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备纳米胶束过程简单高效、所需设备及原料易得、成本较低，而且所制备的纳米胶束安全无毒、生物相容性良好，适合应用于生物医药领域。

（2）本发明以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备的氧化还原响应型纳米胶束表面净电荷为正，故可通过细胞内吞的方式透过细胞膜进入细胞内，从而使包载的化疗药物进入到细胞内发挥药效，在应用于药物传递方面具有先天优势。

（3）本发明以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备的氧化还原响应型纳米胶束具有良好的包载能力和氧化还原行为，可将疏水性化疗药物被动靶向肿瘤细胞，并在肿瘤细胞内高浓度谷胱甘肽（GSH）环境下解体，可实现化疗药物在肿瘤细胞内的快速释放，提高化疗药物的疗效，是一种应用价值良好的载体。

附图说明

图1为壳聚糖的红外光谱图。

图2为本发明实施例提供的烟酰化壳聚糖的红外光谱图，1726 cm^-1为酯键的吸收峰，1650 cm^-1为酰胺键的吸收峰，829、743、703和630 cm^-1为吡啶基团的吸收峰。

图3为本发明实施例提供的胺乙基阳离子壳聚糖的红外光谱图，与图2烟酰化壳聚糖相比较可知，1503 cm^-1为吡啶阳离子的吸收峰，证明胺乙基阳离子壳聚糖的成功合成。

图4为本发明实施例提供的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物红外光谱图，与图3胺乙基阳离子壳聚糖相比可知，2930 cm^-1和2863 cm^-1为硫辛酸烷基链的吸收峰，以上分析数据，证明两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的成功合成。

图5为以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备纳米胶束溶血实验结果图，图中实物图代表以蒸馏水为阳性对照，生理盐水为阴性对照下，以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备纳米胶束在不同浓度下溶血率的测定结果。

图6为以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备载药胶束体外释放实验结果图，图中**代表p<0.01 在pH=5.5 和pH=5.5+GSH两种不同条件下，阿霉素的累计释放量具有明显统计学差异。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的解释说明。

本发明通过引入吡啶阳离子和硫辛酸合成氧化还原响应型两亲性化合物，两亲性化合物同时含有亲水和疏水链，可自组装成氧化还原响应型纳米胶束；本发明制备的两亲性化合物步骤简单易行，以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备的纳米胶束具有良好的生物相容性，对抗肿瘤药物呈现较高的包载能力和氧化还原响应性释放行为，是一种应用价值良好的载体。

具体：首先用N,N'-羰基二咪唑活化烟酸分子上的羧基，而后通过酰化反应与壳聚糖反应得到烟酰化壳聚糖，然后通过亲核反应与溴乙胺氢溴酸反应得到胺乙基阳离子壳聚糖，所得的胺乙基阳离子壳聚糖在N,N'-羰基二咪唑的催化下与氧化还原响应基团硫辛酸反应得到了两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物。

以上所得的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备的纳米胶束是一种应用价值良好的药物载体，所制备的载药纳米胶束可被动靶向肿瘤细胞并在肿瘤细胞内快速释放药物，实现高效释药，提高了化疗药物的临床疗效。

两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物合成路线如下：

其中，R₁为烟酰基，R₂为溴乙胺吡啶阳离子，R为含硫辛酰胺的吡啶盐，平均聚合度n取值范围是20-60。

实施例1

本实施例按以上合成路线合成目标化合物两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物。

1）烟酰化壳聚糖的制备：称取7.38 g (60 mmol) 烟酸加入到10 mL的二甲基亚砜溶液中，而后加入9.72 g (60 mmol)N,N'-羰基二咪唑，搅拌30 min后，在氮气保护下，60℃下反应12 h，备用。称取3.22 g(20 mmol)壳聚糖（参见图1）溶于30 mL二甲基亚砜中，而后滴入上步中制备的溶液，在氮气保护下，60℃条件下搅拌反应12 h。而后用过量丙酮沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到烟酰化壳聚糖2.66 g（参见图2），备用。

2）胺乙基阳离子壳聚糖的制备:称取1.596 g (6 mmol) 烟酰化壳聚糖溶于20 mL二甲基亚砜溶液中，然后加入2.46 g(12 mmol)溴乙胺氢溴酸盐，在N₂保护下，60℃搅拌反应12 h。反应结束后，将反应液滴入乙醇中反复洗涤3遍，抽滤得到固体，将固体真空干燥得到胺乙基阳离子壳聚糖2.02 g（参见图3）。

3）两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的制备：称取0.83 g (4 mmol) α-硫辛酸溶于2 mL二甲基亚砜溶液中，缓慢加入0.65 g (4 mmol)N,N'-羰基二咪唑，60℃活化羧基12 h，得到溶液A；称取1.6 g (4 mmol) 氨乙基烟酰化壳聚糖溶于5 mL二甲基亚砜溶液得到溶液B；然后将溶液B加到溶液A, 在N₂保护下，60℃搅拌继续反应12 h，反应结束后，将反应液滴加到丙酮中洗涤沉淀3遍，抽滤得到固体，将固体真空干燥得到式（1）所示两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物1.278 g（参见图4），其中平均聚合度n取值范围是20-60。

实施例2

1）烟酰化壳聚糖的制备：称取9.84 g (80 mmol) 烟酸加入到15 mL的二甲基亚砜溶液中，而后加入12.96 g (80 mmol)N,N'-羰基二咪唑，搅拌40 min后，在氮气保护下，70℃下反应24 h，备用。称取3.22 g (20 mmol)壳聚糖（参见图1）溶于40 mL二甲基亚砜中，而后滴入上步中制备的溶液，在氮气保护下，70℃条件下搅拌反应24 h。而后用过量丙酮沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到烟酰化壳聚糖2.87 g（参见图2），备用。

2）胺乙基阳离子壳聚糖的制备:称取1.596 g (6 mmol) 烟酰化壳聚糖溶于20 mL二甲基亚砜溶液中，然后加入3.072 g(15 mmol)溴乙胺氢溴酸盐，在N₂保护下，65℃搅拌反应18 h。反应结束后，将反应液滴入乙醇中反复洗涤3遍，抽滤得到固体，将固体真空干燥得到胺乙基阳离子壳聚糖2.56 g（参见图3）。

3）两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的制备：称取1.24 g (6 mmol) α-硫辛酸溶于2 mL二甲基亚砜溶液中，缓慢加入0.97 g (6 mmol)N,N'-羰基二咪唑，65℃活化羧基18 h，得到溶液A；称取1.6 g (4 mmol) 氨乙基烟酰化壳聚糖溶于5 mL二甲基亚砜溶液得到溶液B；然后将溶液B加到溶液A,在N₂保护下，65℃搅拌继续反应18 h，反应结束后，将反应液滴加到丙酮中洗涤沉淀3遍，抽滤得到固体，将固体真空干燥得到式（1）所示两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物1.46g（参见图4）,其中平均聚合度n取值范围是20-60。

实施例3

1）烟酰化壳聚糖的制备：称取12.3 g (100 mmol) 烟酸加入到30 mL的二甲基亚砜溶液中，而后加入16.2 g (100 mmol)N,N'-羰基二咪唑，搅拌60 min后，在氮气保护下，80℃下反应36 h，备用。称取3.22 g (20 mmol)壳聚糖（参见图1）溶于60 mL二甲基亚砜中，而后滴入上步中制备的溶液，在氮气保护下，80℃条件下搅拌反应36 h。而后用丙酮沉淀、洗涤，冷冻干燥，得到烟酰化壳聚糖3.66 g（参见图2），备用。

2）胺乙基阳离子壳聚糖的制备:称取1.596 g (6 mmol) 烟酰化壳聚糖溶于20 mL二甲基亚砜溶液中，然后加入3.686 g(18 mmol) 溴乙胺氢溴酸盐，在N₂保护下，80℃搅拌反应24 h。反应结束后，将反应液滴入乙醇中反复洗涤3遍，抽滤得到固体，将固体真空干燥得到胺乙基阳离子壳聚糖3.01 g（参见图3）。

3）两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的制备：称取1.65 g (8 mmol) α-硫辛酸溶于2 mL二甲基亚砜溶液中，缓慢加入1.30 g (8 mmol)N,N'-羰基二咪唑，80℃活化羧基24 h，得到溶液A；称取1.6 g (4 mmol) 氨乙基烟酰化壳聚糖溶于5 mL二甲基亚砜溶液得到溶液B；然后将溶液B加到溶液A，在N₂保护下，80℃搅拌继续反应24 h，反应结束后，将反应液滴加到丙酮中洗涤沉淀3遍，抽滤得到固体，将固体真空干燥得到式（1）所示两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物1.83 g（参见图4）,其中平均聚合度n取值范围是20-60。

应用例1

以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备纳米胶束

（1）采用透析/超声法制备纳米胶束。将实施例1的产物溶于二甲基亚砜中，浓度为2 mg/mL，然后将溶液转入透析袋中(Mwco=100)，室温条件下在水中透析24 h，透析完毕，将透析液置于探头超声仪(135 W)超声(30 min),即得到氧化还原刺激响应型阳离子纳米胶束。

（2）对两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备阳离子纳米胶束进行表征

采用动态光散射法（DLS）对所得的氧化还原响应型胶束表征。取1 mL上述步骤（1）制备的氧化还原刺激响应型阳离子纳米胶束置于比色皿中，在Litesizer 500 纳米粒度测量仪中测量的粒径、电位和PDI值；

实验结果：本发明实施例1合成的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备阳离子纳米胶束的表征如表1所示，本发明以两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备纳米胶束的粒径为289.01±4.94 nm, 粒径小于500 nm 可避免血液***的清除，可更好地被病灶区细胞吞噬进而入胞发挥作用；PDI为25.54±1.52，小于30，说明所制备的纳米胶束分布均匀；电位在42.14±0.60 mV，均为正值，这与吡啶阳离子的存在密切相关，也进一步证明了烟酰化壳寡糖成功制备。

表1，实施例1所制备阳离子纳米胶束的粒径、PDI和电位测试结果

（3）对利用实施例1合成的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物按照步骤（1）制备阳离子纳米胶束进行安全性评价。

步骤如下：首先取健康家兔血液5 mL，2500 rpm离心10 min后弃去上清液血浆，加入生理盐水混匀，再次以相同的条件离心。该操作重复三遍,直至上清液无色，加入生理盐水获取浓度为2%的红细胞悬液。以生理盐水为溶剂，将实施例1配制成不同浓度的纳米胶束溶液（2，1.5，1，0.5mg/mL），同时设定蒸馏水和生理盐水分别作为阳性和阴性对照组，将所有加入试剂的试管置于37℃恒温水箱中进行水浴1h，然后样品经4000rpm转速离心10 min，离心结束后取上清液，利用紫外分光光度计于541 nm处测定吸光度，按以下公式计算：

溶血率＝(A_样品-A_阴)/(A_阳-A_阴)×100％

其中，A_样品，A_阳，A_阴分别表示待测样品，蒸溜水和生理盐水组的吸光度值。

实验结果：本发明实施例1合成的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备阳离子纳米胶束生物安全性评价如图5所示，利用实施例1合成的两亲性化合物所制备阳离子纳米胶束溶血率低于5%，说明该阳离子纳米胶束对红细胞无明显干扰，具有良好的体内应用的潜力。

（4）对利用实施例1合成的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备阳离子纳米胶束的包封率与载药量测定。

具体步骤：称取20 mg实施例1的产物溶于二甲基亚砜中，浓度为2 mg/mL，然后将溶液转入透析袋中(Mwco=100)，室温条件下在水中透析12 h，透析完后备用。

另取200 uL（15mg/mL）阿霉素/二甲基亚砜溶液，在强烈搅拌情况下缓慢滴加至上述透析后获得化合物水溶液，在135 W功率条件下用探头超声处理20 min,超声结束后，将所得溶液12000rpm离心30 min，取上清液用紫外分光光度法在484 nm处测定吸收度,按以下公式计算载药纳米胶束的包封率与载药量。

包封率＝(药物总量-游离药)/药物总量×100％

载药量＝(药物总量-游离药)/(载体+药物总量)×100％

表2，实施例1所制备阳离子纳米胶束包封率与载药量测定结果

实验结果：本发明实施例1合成的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备阳离子纳米胶束的包封能力如表2所示，可见实施例1合成的两亲性化合物制备阳离子纳米胶束对化疗药物有较好的包载能力。

（5）对利用实施例1合成的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备的载药纳米胶束体外释药性能的考察。

具体步骤：移取适量上述步骤4所制备的载药纳米粒溶液（约含0.7 mg阿霉素）于透析袋（Mwco=8000-12000 Da）,同时取等量阿霉素溶于PBS溶液作为对照组，透析袋两端夹紧后，对照组置于150 mL缓冲液（PH=5.5），载药纳米粒分别置于150 mL释放介质中（PH=5.5缓冲液和PH=5.0+10mmolGSH缓冲液），在37℃，100rpm水浴条件下振荡，定时取样3mL，并补充等体积释放介质，测定各样品在484 nm处的吸收度。

实验结果：本发明实施例1合成的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备的载药纳米胶束体外释药性能如图6所示，游离阿霉素在释放介质中呈现“突释”现象，24 h基本完全释放；与游离阿霉素相比，将阿霉素包载于实施例1制备的纳米胶束中释放速率明显减低，呈现“缓释”现象；而载药纳米胶束中的阿霉素在10 mM的GSH条件下释放速率明显提高，这说明实施例1制备的纳米胶束具有“氧化还原响应性”，因而在到达肿瘤组织后能快速释放阿霉素，以杀死肿瘤细胞。

Claims

1.一种两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物，其特征在于：两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物结构式如式（1）所示，

式（1），其中

，其中聚合度n取值范围是20-60。

2.一种权利要求1所述的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：首先将壳聚糖烟酰化，而后与溴乙胺氢溴酸盐亲核反应得到胺乙基阳离子壳聚糖，所得胺乙基阳离子壳聚糖在N,N'-羰基二咪唑的催化作用下与α-硫辛酸反应，即得式（1）所示两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物；

烟酸的摩尔量为壳聚糖摩尔量的3.0-6.0倍；溴乙胺氢溴酸盐的摩尔量为烟酰化壳聚糖摩尔量的2.0-5.0倍；N,N'-羰基二咪唑的摩尔量为α-硫辛酸摩尔量的1.0-4.0倍；α-硫辛酸的摩尔量为胺乙基阳离子壳聚糖摩尔量的1.0-4.0倍。

3.按权利要求2所述的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：将N,N'-羰基二咪唑加入到含烟酸的二甲亚砜溶液中，然后与壳聚糖在50-70℃ 反应12-24h,反应混合物用过量丙酮沉淀，洗涤冷却干燥后，即得到烟酰化壳聚糖；所得烟酰化壳聚糖与溴乙胺氢溴酸盐于50-70℃反应12-36 h，所得固体用乙醇沉淀、洗涤，冷冻干燥，即得胺乙基阳离子壳聚糖，待用。

4.按权利要求2所述的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的制备方法，其特征在于：将N,N'-羰基二咪唑加入到含α-硫辛酸的二甲亚砜溶液中，并于氮气氛围中，50-70℃下反应12-36 h，反应所得溶液备用；将所得胺乙基阳离子壳聚糖溶于二甲亚砜并与上述所得的溶液在50-70℃条件下继续反应12-36 h，而后用丙酮沉淀洗涤，冷冻干燥后得到式（1）所示的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物。

5.一种权利要求1所述的两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物的应用，其特征在于：所述式（1）所示两亲性硫辛酰基阳离子壳聚糖衍生物制备的纳米胶束在制备药物载体中的应用。