CN116178495A - 一种来源于植物乳杆菌的新型低分子量抗菌肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种来源于植物乳杆菌的新型低分子量抗菌肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来源于植物乳杆菌的新型低分子量抗菌肽及其制备方法和应用。本发明提供了多肽PNMGL2，如SEQ ID NO：1所示。本发明还保护多肽PNMGL2作为微生物抑制剂的应用。本发明还保护一种制备微生物抑制剂的方法，包括如下步骤：培养植物乳杆菌NMGL2。本发明提供的多肽PNMGL2可作为食品防腐剂和微生物抑制剂而应用于食品和医药领域。本发明提供的制备微生物抑制剂的方法，工艺过程操作简单，成本较低，对设备要求低，适于工业化生产。

Description

一种来源于植物乳杆菌的新型低分子量抗菌肽及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种来源于植物乳杆菌的新型低分子量抗菌肽及其制备方法和应用。
背景技术
根据世界卫生组织研究统计，每年约有42万人因食源性疾病而死亡。食品中的病原微生物，如沙门氏菌(Salmonella)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、诺如病毒(Norovirus)等，对食物安全造成威胁。为了抑制病原微生物而添加的防腐剂长期摄入对健康也存在一定危害。因此，寻找无毒、无公害、高效的食品抑菌方法已成为食品保鲜的当务之急。
抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是一种广泛存在于各种生物体内的低分子肽类的生物活性物质，其化学本质是蛋白质，具有高效抑菌、无毒无害、无抗药性、不易残留和稳定性强等特点，所以被认为是最具潜力的抗生素和食品防腐保鲜剂的替代品。
目前在动物、植物和微生物中已发现了多种抗菌肽。由于动物源和植物源抗菌肽来源有限，难以实现规模化生产，而微生物源抗菌肽具有发酵周期短、成本低、易于培养、易于实现工业化生产等优点，已成为抗菌肽研究的重要方向。目前研究最多的是乳酸菌来源的细菌素——Nisin，其已商业化使用，但乳酸菌来源的Nisin大多具有抗菌谱窄、稳定性差等问题，因此迫切需要寻找新的抗菌肽。
发明内容
本发明的目的是提供一种来源于植物乳杆菌的新型低分子量抗菌肽及其制备方法和应用。
本发明提供了一种多肽，命名为多肽PNMGL2，如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1：LNFLKK。
本发明还保护多肽PNMGL2作为微生物抑制剂的应用。
本发明还保护多肽PNMGL2在抑制微生物中的应用。
本发明还保护多肽PNMGL2在制备微生物抑制剂中的应用。
本发明还保护植物乳杆菌NMGL2在制备多肽PNMGL2中的应用。
本发明还保护一种制备多肽PNMGL2的方法，包括如下步骤：培养植物乳杆菌NMGL2。植物乳杆菌NMGL2生产多肽PNMGL2，因此完成培养的体系中含有多肽PNMGL2。
本发明还保护一种制备微生物抑制剂的方法，包括如下步骤：培养植物乳杆菌NMGL2。完成培养的体系中含有微生物抑制剂。
以上任一所述培养的方法具体包括如下步骤：将植物乳杆菌NMGL2接种至液体MRS培养基(具体的，完成接种时刻体系中的菌浓度为107cfu/mL)，静置培养。
具体的，培养温度可为35-39℃，更具体可为37℃。
具体的，培养时间可为26-30小时，更具体可为28小时。
以上任一所述方法还包括如下步骤：完成所述培养后，离心收集上清液，过滤并收集滤液。
所述离心的参数具体可为：4℃、8000g离心15分钟。
所述过滤具体采用孔径为0.22μm滤膜。
所述方法还包括如下步骤：取所述滤液，调pH值为5，然后加入过氧化氢酶溶液，孵育。
所述方法还包括如下步骤：取所述滤液，调pH值为5，然后加入等体积过氧化氢酶溶液，37℃孵育30min。
所述方法还包括如下步骤：采用乙酸乙酯进行萃取，收集萃取相。
所述萃取时，液体样本与乙酸乙酯的体积配比为1:1.5。
所述方法还包括如下步骤：完成萃取后，收集萃取相，除去有机溶剂，然后用PBS缓冲液(pH6.5、20mol/L)复溶，得到萃取物复溶液。
所述方法还包括如下步骤：阴离子交换层析。
层析柱：内径16mm，长度30mm。
填充物质：DEAE-Sepharose Fast Flow。
纯化步骤：首先，用Tris-HCl缓冲液(pH7.20，0.05mol/L)平衡柱子；然后，上样萃取物复溶液(上样体积具体为3ml)；然后，用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液(pH7.2，0.05mol/L)进行洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱总时间为160min，从洗脱的初始时刻到洗脱的终止时刻氯化钠的浓度由0线性上升至0.2M。
收集第二个洗脱峰对应的过柱后溶液。
收集保留体积为160-200mL的过柱后溶液。
所述方法还包括如下步骤：将过柱后溶液进行冷冻干燥，然后溶于Tris-HCl缓冲液(pH7.2，0.05mol/L)，得到冻干品复溶液。
以上任一所述植物乳杆菌NMGL2，其保藏登记号为CGMCC No.18495。
以上任一所述方法制备得到的微生物抑制剂均属于本发明的保护范围。
具体的，所述微生物为致病微生物。
具体的，所述微生物为细菌。
具体的，所述细菌为肠杆菌科细菌或葡萄球菌科细菌或李斯特氏菌科细菌。
具体的，所述细菌为埃希氏菌属细菌或葡萄球菌属细菌或李斯特菌属细菌或志贺氏菌属细菌。
具体的，所述细菌为阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌或福氏志贺氏菌。
本发明提供的多肽PNMGL2可抑制食品中常见的食源性致病菌，对于温度以及pH具有广谱耐受性，对于多种蛋白酶具有广谱耐受性，可作为食品防腐剂和微生物抑制剂而应用于食品和医药领域。
本发明提供的制备微生物抑制剂的方法，工艺过程操作简单，成本较低，对设备要求低，适于工业化生产，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为植物乳杆菌NMGL2的生长曲线及抑菌活性曲线。
图2为阴离子交换层析法纯化抗菌肽的洗脱曲线。
图3为不同洗脱峰得到的冻干品复溶液的抑菌活性照片。
图4为抗菌肽溶液的Tricine-SDS-PAGE电泳图。
图5为多肽PNMGL2对食源性致病菌的抑菌活性照片。
图6为多肽PNMGL2的化学结构式。
图7为通过PEP-FOLD 3De-novo方法生成的多肽PNMGL2三维结构。
图8为抗菌肽的酸碱稳定性的结果。
图9为抗菌肽的热稳定性的结果。
图10为抗菌肽的酶敏感性的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中，检测蛋白浓度采用Bradford法。实施例中所用的牛津杯的型号：外径7.8mm，内径6.0mm，高度10.0mm。实施例中，使用全自动超高清抑菌圈分析仪Scan4000测量抑菌圈直径。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NMGL2，保藏登记号为CGMCC No.18495。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NMGL2简称植物乳杆菌NMGL2。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)NMGL2记载于专利号为ZL201910916373.6的专利中，该专利的授权公告号为CN 110591955 B，该专利的授权公告日为2021.06.15，该菌株为该专利授权保护的菌株。
用于实施例的阪崎肠杆菌：CICC 21546。用于实施例的大肠埃希氏菌：CMCC44825。用于实施例的金黄色葡萄球菌：CMCC 26071。用于实施例的单核细胞增生李斯特氏菌：CMCC 54002。用于实施例的福氏志贺氏菌：CICC 21534。CICC：中国工业微生物菌种保藏管理中心。CMCC：中国医学细菌保藏管理中心。
过氧化氢酶：索莱宝生物科技有限公司，货号C8071。过氧化氢酶溶液：将过氧化氢酶溶于PBS缓冲液(pH6.5、20mol/L)，并使其浓度为1mg/mL。
胰蛋白酶：北京博奥拓达科技有限公司，货号T6150。胃蛋白酶：北京博奥拓达科技有限公司，货号P6390。蛋白酶K购自索莱宝生物科技有限公司，货号P9460。溶菌酶：上海源叶生物有限公司，货号S10038。脂肪酶：上海源叶生物有限公司，货号S10035。碱性蛋白酶：上海源叶生物有限公司，货号S10154。
用于实施例1、实施例2、实施例3和实施例6的含菌培养基的制备方法：制备100ml含0.75g/100ml琼脂的LB培养基，高温灭菌，室温冷却至45℃时加入1mL金黄色葡萄球菌菌液(1mL金黄色葡萄球菌菌液中，金黄色葡萄球菌的含量为1×108cfu/mL)，混匀后倒入培养皿。
实施例1、植物乳杆菌NMGL2的生长曲线及抑菌活性曲线
取-80℃甘油管中冻存的植物乳杆菌NMGL2，以1％接种量接种至液体MRS培养基(完成接种时刻体系中的菌浓度为107cfu/mL)，37℃静置培养48小时。培养过程中，每隔2小时取样一次。
分别取各个取样样本，测定OD600nm值和pH值。
分别取各个取样样本，预处理后检测抑菌活性，确定产抗菌物质的最适培养时间。
进行预处理的方法：①取样样本，4℃、8000rpm离心15min，收集上清液，用孔径0.22μm滤膜过滤并收集滤液，用HCl水溶液或者NaOH水溶液调pH值至5；②取1体积份完成步骤①的液相体系，加入1体积份过氧化氢酶溶液，37℃孵育30min，即为供试样本液。
检测抑菌活性的方法(采用双层琼脂扩散法并以金黄色葡萄球菌为指示菌)：①取直径为9cm的培养皿，倒入8mL 1.5g/100ml琼脂水溶液，室温静置至凝固，然后在平板表面均匀放置3个牛津杯；②将8mL含菌培养基倒入完成步骤①的培养皿中，凝固后拔出牛津杯，牛津杯的位置形成加样孔；③完成步骤②后，向加样孔中加入供试样本液(100μl/孔)，4℃静置培养2小时，然后37℃静置培养12小时，然后测量抑菌圈直径(mm)。
每个取样样本设置3个重复，结果取平均值。
结果见图1。植物乳杆菌NMGL2表现出常见的细菌生长模式。培养过程中，培养体系的pH值从6.2降低到3.91并保持稳定。植物乳杆菌NMGL2从培养8小时(此时处于对数生长期)开始能够检测到抗菌活性(培养8小时时的抑菌圈直径为9.83mm)，之后随着培养时间的增加抗菌活性持续增加并在培养28小时达到最大值(培养28小时时的抑菌圈直径为15.80mm)，之后随着培养时间的增加抗菌活性有所降低。因此，产抗菌物质的最适培养时间为28小时。
实施例2、从植物乳杆菌NMGL2培养液中粗提抗菌肽的方法的优化
一、植物乳杆菌NMGL2的培养
1、将活化的植物乳杆菌NMGL2以1％的接种量接种至液体MRS培养基(完成接种时刻体系中的菌浓度为107cfu/mL)，37℃静置培养28小时，然后4℃、8000g离心15分钟，收集上清液，用孔径为0.22μm滤膜过滤并收集滤液。
2、取步骤1获得的滤液，用NaOH水溶液调pH值为5。
3、取完成步骤2的液相体系，加入等体积过氧化氢酶溶液，37℃孵育30min。
二、利用不同饱和度的硫酸铵沉淀粗提抗菌肽
1、分别取8份完成步骤一的液相体系(每份30mL)，分别进行硫酸铵沉淀。硫酸铵沉淀分别采用如下硫酸铵饱和度：60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。硫酸铵沉淀的参数：4℃静置12小时。
2、完成步骤1后，4℃、12000g离心15min，分别收集上清液和沉淀，沉淀用1mL PBS缓冲液(pH6.5、20mol/L)复溶，得到沉淀复溶液。
3、检测步骤2得到的沉淀复溶液的蛋白浓度，结果见表1。
4、分别将步骤2得到的上清液和步骤2得到的沉淀复溶液作为供试样本液，检测抑菌活性(方法同实施例1中的相应方法)。
进行三次重复试验，结果取平均值。
结果见表1。结果表明，硫酸铵无法有效沉淀抑菌物质。
表1
Figure BDA0004164153100000051
Figure BDA0004164153100000061
三、利用不同有机溶剂进行萃取粗提抗菌肽
分别取5份完成步骤一的液相体系(每份30mL)。
1份液相体系不进行任何处理，直接45℃旋转蒸发浓缩到1mL，作为参比样本。将参比样本作为供试样本液，检测抑菌活性(方法同实施例1中的相应方法)。检测参比样本的蛋白浓度。参比样本的抑菌圈直径为30.40±0.40cmm，蛋白浓度为108.54±1.06Amg/mL。
剩余4份液相体系进行萃取。分别采用的有机溶剂为：乙酸乙酯、正丁醇、正己烷或三氯甲烷。萃取的条件为：加入等体积有机溶剂，室温、120rpm振荡萃取2h。完成萃取后，分别收集水相(萃余相)和有机相(萃取相)。萃取相45℃旋转蒸发除去有机溶剂，然后用1mLPBS缓冲液(pH6.5、20mol/L)复溶，得到萃取物复溶液。分别将萃余相和萃取物复溶液作为供试样本液，检测抑菌活性(方法同实施例1中的相应方法)。检测萃取物复溶液的蛋白浓度。
进行三次重复试验，结果取平均值。
结果见表2。采用正丁醇或乙酸乙酯萃取得到的萃取物复溶液的抑菌活性接近于参比样本的抑菌活性。考虑到正丁醇在旋转蒸发过程中沸点较高，耗时，所以最终选择乙酸乙酯作为萃取用的有机溶剂。
表2
Figure BDA0004164153100000062
四、利用不同体积的乙酸乙酯进行萃取粗提抗菌肽
分别取6份完成步骤一的液相体系(每份30mL)。
1份液相体系不进行任何处理，直接45℃旋转蒸发浓缩到1mL，作为参比样本。将参比样本作为供试样本液，检测抑菌活性(方法同实施例1中的相应方法)。参比样本的抑菌圈直径为30.40±0.40cmm。
剩余5份液相体系采用乙酸乙酯进行萃取。设置不同的体积配比。液相体系与乙酸乙酯的体积配比分别设置为1:0.5或者1:1或者1:1.5或者1:2或者1:2.5。萃取的条件为：室温、120rpm振荡萃取2h。完成萃取后，收集有机相(萃取相)。萃取相45℃旋转蒸发除去有机溶剂，然后用1mL PBS缓冲液(pH6.5、20mol/L)复溶，得到萃取物复溶液。将萃取物复溶液作为供试样本液，检测抑菌活性(方法同实施例1中的相应方法)。
进行三次重复试验，结果取平均值。
结果见表3。1:1.5的体积配比下，萃取物复溶液的抑菌活性最高。
表3
液相体系与乙酸乙酯的体积比 萃取物复溶液的抑菌圈直径(mm)
1：0.5 22.17±0.31c
1：1 28.25±0.35b
1：1.5 30.35±0.49a
1：2 30.07±0.40a
1：2.5 29.90±0.10a
实施例3、按照实施例2的优化方法粗提抗菌肽并进一步纯化
一、植物乳杆菌NMGL2的培养
1、将活化的植物乳杆菌NMGL2以1％的接种量接种至液体MRS培养基(完成接种时刻体系中的菌浓度为107cfu/mL)，37℃静置培养28小时，然后4℃、8000g离心15分钟，收集上清液，用孔径为0.22μm滤膜过滤并收集滤液。
2、取步骤1获得的滤液，用NaOH水溶液调pH值为5。
3、取完成步骤2的液相体系，加入等体积过氧化氢酶溶液，37℃孵育30min。
二、粗提抗菌肽
取30体积份完成步骤一的液相体系，采用乙酸乙酯进行萃取。
液相体系与乙酸乙酯的体积配比为1:1.5。
完成萃取后，收集有机相(萃取相)。萃取相45℃旋转蒸发除去有机溶剂，然后用1体积份PBS缓冲液(pH6.5、20mol/L)复溶，得到萃取物复溶液。
三、采用阴离子交换层析法纯化抗菌肽
层析柱：内径16mm，长度30mm。
填充物质：DEAE-Sepharose Fast Flow(上海源叶生物有限公司，LOT:D30GS172880，CAS#57407-08-6)。
纯化步骤：首先，用Tris-HCl缓冲液(pH7.20，0.05mol/L)平衡柱子；然后，上样步骤二得到的萃取物复溶液(上样体积为3ml)；然后，用含氯化钠的Tris-HCl缓冲液(pH7.2，0.05mol/L)进行洗脱，洗脱流速为1mL/min，洗脱总时间为160min，从洗脱的初始时刻到洗脱的终止时刻氯化钠的浓度由0线性上升至0.2M。
洗脱曲线见图2。图2的横坐标对应保留体积，保留体积是从平衡柱子开始计的，而图2显示的是洗脱步骤曲线，因此保留体积的横坐标为100mL-260mL。
分别收集4个洗脱峰的过柱后溶液。第一个洗脱峰对应的保留体积为100-160mL，第二个洗脱峰对应的保留体积为160-200mL，第三个洗脱峰对应的保留体积为200-220mL，第四个洗脱峰对应的保留体积为220-250mL。
分别将各个过柱后溶液进行冷冻干燥，然后溶于Tris-HCl缓冲液(pH7.2，0.05mol/L)，得到冻干品复溶液。过柱后溶液与用于复溶的Tris-HCl缓冲液的体积配比为：50:2。
分别将各个冻干品复溶液作为供试样本液，检测抑菌活性。进行三次重复试验，结果取平均值。检测抑菌活性的方法：①取直径为9cm的培养皿，倒入8mL 1.5g/100ml琼脂水溶液，室温静置至凝固，然后在平板表面均匀放置5个牛津杯；②将8mL含菌培养基倒入完成步骤①的培养皿中，凝固后拔出牛津杯，牛津杯的位置形成加样孔；③完成步骤②后，向加样孔中加入供试样本液(50μl/孔)，4℃静置培养2小时，然后37℃静置培养12小时，然后测量抑菌圈直径(mm)。设置对照孔(Control)，用等体积Tris-HCl缓冲液代替供试样本液。示例性照片见图3。第二个洗脱峰得到的冻干品复溶液的抗菌活性最高。
将第二个洗脱峰得到的冻干品复溶液命名为抗菌肽溶液。
四、定量检测酶活并计算比活力和纯化倍数
供试品分别为：培养液(即完成步骤一的液相体系)，步骤二得到的萃取物复溶液、步骤三得到的抗菌肽溶液。
取供试品，采用Tris-HCl缓冲液(pH7.2，0.05mol/L)进行二倍梯度稀释，得到稀释液。分别将各个稀释液作为供试样本液，检测抑菌活性。
检测抑菌活性的方法：①将8mL含菌培养基倒入直径为9cm的培养皿中，室温放置至凝固；②完成步骤①后，在平板上均匀放置8个直径为6mm的无菌滤纸，然后在滤纸上滴加供试样本液(每片滤纸滴加10μl)；③完成步骤②后，4℃静置培养2小时，然后37℃静置培养12小时，然后测量抑菌圈直径(mm)。
将没有抑菌圈的最高稀释倍数的倒数定义为1AU。供试品的酶活计算式为:AU/ml＝2n×(1000/x),n表示最高稀释倍数；x表示加样体积毫升数。
取供试品，检测蛋白浓度。
比活力(AU/mg)即酶活(AU/ml)与蛋白浓度(mg/mL)的比值。
进行三次重复试验，结果取平均值。
结果见表4。
表4
Figure BDA0004164153100000081
Figure BDA0004164153100000091
五、抗菌肽的鉴定
取步骤三得到的抗菌肽溶液，进行Tricine-SDS-PAGE电泳。结果见图4，只显示一个条带，且分子量在1.7kDa以下。
切胶回收条带，经蛋白胶内酶解和肽段提取后进行MALDI-TOF-MS。获得了多肽的氨基酸序列，如SEQ ID NO：1所示，将其命名为多肽PNMGL2。
多肽PNMGL2由6个氨基酸残基组成(LNFLKK)，分子量为761.95Da。
实施例4、多肽PNMGL2对食源性致病菌的抑菌活性
供试菌：阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌和福氏志贺氏菌。供试菌均为食源性致病菌。
用于本实施例的含菌培养基的制备方法：制备100ml含0.75g/100ml琼脂的LB培养基，高温灭菌，室温冷却至45℃时加入1mL供试菌菌液(供试菌的含量为108cfu/mL)，混匀后倒入培养皿。
人工合成SEQ ID NO：1所示的多肽，即多肽PNMGL2。将多肽PNMGL2溶于无菌水并使其浓度为200mg/mL，即为供试样本液。检测供试样本液的抑菌活性。
检测抑菌活性的方法：①取直径为9cm的培养皿，倒入8mL 1.5g/100ml琼脂水溶液，室温静置至凝固，然后在平板表面均匀放置3个牛津杯；②将8mL含菌培养基倒入完成步骤①的培养皿中，凝固后拔出牛津杯，牛津杯的位置形成加样孔；③完成步骤②后，向加样孔中加入供试样本液(50μl/孔)，4℃静置培养2小时，然后37℃静置培养12小时，然后测量抑菌圈直径(mm)。设置对照孔Control，用等体积无菌水代替供试样本液。设置对照孔CFS，用等体积培养液(即实施例3中完成步骤一的液相体系)代替供试样本液。
进行三次重复试验，结果取平均值。
示例性照片结果见图5。
供试样本液对于坂崎肠杆菌的抑菌圈直径为18.9mm。供试样本液对于大肠埃希氏菌的抑菌圈直径为17.5mm。供试样本液对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为18.0mm。供试样本液对于单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌圈直径为19.1mm。供试样本液对于福氏志贺氏菌的抑菌圈直径为19.0mm。
结果表明，多肽PNMGL2在食品生物防腐领域具有广阔的应用前景。
实施例5、多肽PNMGL2结构分析
人工合成SEQ ID NO：1所示的多肽，即多肽PNMGL2。
将多肽PNMGL2进行理化分析。
化学结构式见图6。
通过PepDrw和ProtParam工具分析的物理化学特性见表5。
通过PEP-FOLD 3De-novo方法生成三维(3D)结构，见图7。为螺旋结构。
表5
Figure BDA0004164153100000101
实施例6、抗菌肽的稳定性分析
供试品为：实施例3的步骤三得到的抗菌肽溶液。
一、抗菌肽的酸碱稳定性
将供试品分装于离心管(0.5mL/管)，共8个离心管。然后，取所述离心管，分别用HCl水溶液或者NaOH水溶液调pH值至2、3、4、5、6、7、8或9。然后，37℃水浴3h。然后，用HCl水溶液或者NaOH水溶液将pH调回供试品的原始pH值。然后，作为供试样本液，检测抑菌活性(方法同实施例1中的相应方法)。
进行三次重复试验，结果取平均值。
结果见图8。
二、抗菌肽的热稳定性
将供试品分装于离心管(0.5mL/管)，共8个离心管。然后，取所述离心管，分别置于不同温度条件下处理30min，然后室温冷却。然后，作为供试样本液，检测抑菌活性(方法同实施例1中的相应方法)。
不同温度条件分别为：-80℃、-20℃、37℃、65℃、80℃、100℃或121℃。其中，-80℃、-20℃通过放置于冰箱实现，121℃通过0.4Mpa蒸汽实现，剩余温度通过水浴实现。将4℃放置作为对照处理。
进行三次重复试验，结果取平均值。
结果见图9。
三、抗菌肽的酶敏感性
将供试品分装于离心管(0.5mL/管)，共8个离心管。然后，取所述离心管，分别加入酶溶液(0.5mL/管)。然后，37℃水浴3h。然后，沸水浴5min灭活酶。然后，作为供试样本液，检测抑菌活性(方法同实施例1中的相应方法)。
酶溶液分别如下：
胰蛋白酶溶液：将胰蛋白酶溶于无菌水(pH7.8)，并使其浓度为5mg/mL。
胃蛋白酶溶液：将胃蛋白酶溶于无菌水(pH2.0)，并使其浓度为5mg/mL。
蛋白酶K溶液：将蛋白酶K溶于无菌水(pH7.5)，并使其浓度为5mg/mL。
溶菌酶溶液：将溶菌酶溶于无菌水(pH5.0)，并使其浓度为5mg/mL。
过氧化氢酶溶液：将过氧化氢酶溶于无菌水(pH6.0)，并使其浓度为5mg/mL。
脂肪酶溶液：将脂肪酶溶于无菌水(pH7.0)，并使其浓度为5mg/mL。
碱性蛋白酶溶液：将碱性蛋白酶溶于pH的无菌水(pH8.9)，并使其浓度为5mg/mL。
制备酶溶液时，先用HCl水溶液或者NaOH水溶液调无菌水的pH值，然后溶解酶。
用等体积无菌水代替酶溶液，作为对照处理。
进行三次重复试验，结果取平均值。
结果见图10。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.多肽，如SEQ ID NO：1所示。
2.权利要求1所述多肽作为微生物抑制剂的应用。
3.权利要求1所述多肽在抑制微生物中的应用。
4.权利要求1所述多肽在制备微生物抑制剂中的应用。
5.植物乳杆菌NMGL2在制备权利要求1所述多肽中的应用；植物乳杆菌NMGL2，其保藏登记号为CGMCC No.18495。
6.植物乳杆菌NMGL2在制备微生物抑制剂中的应用；植物乳杆菌NMGL2，其保藏登记号为CGMCC No.18495。
7.一种制备权利要求1所述多肽的方法，包括如下步骤：培养植物乳杆菌NMGL2；植物乳杆菌NMGL2，其保藏登记号为CGMCC No.18495。
8.一种制备微生物抑制剂的方法，包括如下步骤：培养植物乳杆菌NMGL2；植物乳杆菌NMGL2，其保藏登记号为CGMCC No.18495。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：采用乙酸乙酯进行萃取，收集萃取相。
10.权利要求8或9所述方法制备得到的微生物抑制剂。
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