CN116178463B - 一种蒽酮糖苷类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种蒽酮糖苷类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蒽酮糖苷类化合物及其制备方法和应用。本发明提供的化合物是从马杜拉放线菌Actinomadurasp.KCC248的发酵液中分离得到，经鉴定后将其命名为oxanthromicinA。该放线菌已于2021年1月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.21710。本发明提供的化合物oxanthromicin A能显著抑制人急性早幼粒白血病细胞、人非小细胞肺癌细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞和人结肠癌细胞，利用该化合物制备的药物可用于治疗相关肿瘤疾病。

Description

一种蒽酮糖苷类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种蒽酮糖苷类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是影响人类健康的重要疾病，其发病率和致死率长期以来呈持续上升的趋势，现已成为全球第二大死亡原因，严重危害人类的身心健康。
微生物是重要的天然产物资源。微生物品种极其繁多、代谢多样化，其代谢物的化学复杂性和多样性是研制新药取之不尽的宝库。微生物来源的药物在医疗保健中占有重要地位。从微生物中寻找具有抗肿瘤活性的先导化合物已成为医药领域研究的热点之一。有大量文献报道，从微生物代谢物中筛选、分离抗肿瘤活性成分具有广阔前景。针对肿瘤形成机制，通过药理筛选或作用机制、生物活性筛选，从天然产物中寻找抗癌活性成分，是当今从天然产物中寻找新型天然药物先进、快速、有效的筛选途径，也是抗肿瘤药物以创新药物为主的战略性转变策略之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种蒽酮糖苷类化合物及其制备方法和应用。本发明提供的化合物为oxanthromicinA，其具有抑制多种肿瘤细胞的特性，通过本化合物制备的药剂可被广泛用于多种肿瘤疾病的治疗。
为了达到上述目的，本发明提供了一种蒽酮糖苷类化合物，该化合物命名为oxanthromicinA，其是从放线菌Actinomadurasp.KCC248的发酵液中分离得到，该化合物其结构式如式(Α)所示：
本发明提供的蒽酮糖苷类化合物oxanthromicinA对人急性早幼粒白血病细胞、人非小细胞肺癌细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞和人结肠癌细胞均具有抑制作用，其IC50分别为8.7、17.5、15.0、17.8和14.6μM。
本发明还提供了一种放线菌Actinomadurasp.KCC248，该菌已于2021年1月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.21710。
本发明提供了一种上述蒽酮糖苷类化合物的制备方法，包含：
对上述的放线菌Actinomadurasp.KCC248进行发酵；
将所得发酵液浓缩后，采用乙酸乙酯萃取，得浸膏；
将所得浸膏通过常压大孔树脂分离和硅胶柱色谱分离，即得蒽酮糖苷类化合物。
优选地，上述的制备方法，其条件包含如下：
上述的发酵，其培养基为：200g/L的土豆，20g/L的葡萄糖，自来水1000mL；其发酵条件为温度28℃、转速180转/分钟、无菌发酵8天；
上述的常压大孔树脂分离，其分离参数包括柱子信号：填充物为：MCIGelCHP20P；洗脱过程为：分别通过10、20、30、40、50、60、70、80、90和100％的甲醇水梯度洗脱，每个梯度洗脱1000mL，收集梯度为80％、90％和100％洗脱液成分，待进行硅胶柱色谱分离；
上述的硅胶柱色谱分离，其分离参数包括柱子型号：填充物为：200-300目的硅胶粉；流动相为：10份氯仿和3份甲醇的混合液，流速为1mL/min；
收集保留体积100-150mL的过柱后的洗脱液，既得化合物oxanthromicinA。
本发明还提供了一种含有上述化合物oxanthromicinA的药物制剂。
优选地，该制剂的剂型可为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、膏剂、注射剂、栓剂或贴剂。
本发明提供的药物制剂可被用于制备肿瘤疾病类药物，尤其可用于白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌或结肠癌等疾病。
本发明的蒽酮糖苷类化合物oxanthromicinA，具备多种肿瘤细胞的抑制活性，在多种肿瘤疾病的治疗中具有现在的应用性，具有以下优点：
本发明首次公开了一株放线菌Actinomadurasp.KCC248，从该菌的发酵液中可以获得一种具备抗肿瘤的成分oxanthromicinA。
本发明首次公开了从放线菌Actinomadurasp.KCC248的发酵液中提取分离化合物oxanthromicinA的方法。
本发明提供的新化合物oxanthromicinA为新型抗肿瘤药物的先导化合物的研发提供有效的资源，而且还可用于***相关的疾病。
附图说明
图1为本发明中的化合物oxanthromicinA的高分辨质谱图。
图2为本发明中的化合物oxanthromicinA的核磁共振1HNMR谱图。
图3为本发明中的化合物oxanthromicinA的核磁共振13CNMR谱图。
图4为本发明中的化合物oxanthromicinA的核磁共振HSQC谱图。
图5为本发明中的化合物oxanthromicinA的核磁共振HMBC谱图。
图6为本发明中的化合物oxanthromicinA对肝癌细胞SMMC-7721的基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶2、周期蛋白E1和周期蛋白D1影响的WB结果。
图7为本发明中的化合物oxanthromicinA对肝癌LM-3细胞CyclinD1和CyclinE1影响的WB和定量结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明欲提供一种从菌，而从该菌种筛选出的化合物能有效的抑制多种肿瘤细胞，通过该化合物制备的药物在肿瘤治疗中具备潜在的应用效果。
本发明提供的放线菌Actinomadurasp.KC C248属于一株新的马杜拉放线菌属的菌株，其代谢产生的醌类化合物的结构具有抗肿瘤活性。对所述放线菌KC C248的化学成分进行研究，发现1个新的蒽酮糖苷类化合物oxanthromicinA，并对该化合物进行了抗肿瘤活性筛选，结果显示所述蒽酮糖苷类化合物oxanthromicinA具有明显的抑制肿瘤细胞增殖活性。因此，该蒽酮糖苷类化合物可为新型抗肿瘤药物的先导化合物的研发提供有效的资源，同时还可用于***相关的疾病。
本发明中泳道的仪器设备以及材料等如下所示，未见具体说明的试剂均为本领域的常规试剂，未见说明的方法均为本领域常规方法。
Jasco-P-1020偏振仪；Horiba SEPA-300偏振仪；BrukerTensor27 FT-IR光谱仪；Bruker AV-600MHz核磁共振光谱仪；waters Autospec Primier P776光谱仪；API QSTARpulsar l光谱仪；硅胶(200-300目，中国青岛海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20凝胶(瑞典阿默森生物科学公司)，RP-18硅胶(40-75μm，富士西里西亚化工有限公司)。通过TLC监测馏分，并通过加热浸在香草醛-H2SO4中的硅胶板使斑点可视化。
实验例1菌株的分离与鉴定
通过来自中国内蒙古包头的白云鄂博稀土矿中的微生物进行高通量筛选，从中分离得到一株纯培养的菌株，通过形态学和16S rRNA鉴定，将其命名为马杜拉放线菌Actinomadura sp.KC C248。该放线菌已于2021年1月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.21710。其中，该菌的16S rRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体序列如下(5’→3’)：
TAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCCTTCGGGGGTACTCGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGAGCAACCTGCCCCTGACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACCGGGTCTAATACCGGATACGACTGCACCGGGCATGTGGTGTGGTGGAAAGATTTTTCGGTTGGGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAACCGGCCTGAGAGGGCGACCGGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGGAAGCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGGAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCTGTCGTGAAAGCCCACGGCTTAACCGTGGGTCTGCGGTGGATACGGGCAGACTGGAGGCAGGTAGGGGAGAACGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCGGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTTCTCTGGGCCTGTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGTTCTTCCACGGATTCCGCGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTTGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATCGCCGGAAAACTGTTGGAGACAGCAGGTCCTTTTTGGGCCGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTTCCATGTTGCCAGCACTTCGGGTGGGGACTCATGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCAAACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATATCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGAAGTCTGCAACTCGACTTCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGCAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACCTTTTTGGGGGGAGCGGTCGAAGGTGGGGCCGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTA。
实验例2KCC248的发酵及菌液中蒽酮糖苷类代谢物的提取分离一、放线菌Actinomadurasp.KCC248的发酵
将菌株接种到含有100mL种子培养基(溶剂为水，溶质由酵母提取物4g/L、葡萄糖4g/L、麦芽提取物5g/L和大豆蛋白胨1g/L组成)的500mL烧瓶中，并在28℃下以180转/分钟的转速培养2天，得到种子培养液。将5mL种子培养液接种至含100mL发酵培养基(含马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，pH7.2)的500mL烧瓶中，28℃下以180转/分钟的转速培养8天，得到发酵液。用纱布过滤发酵液，收集滤液，浓缩备用。
二、菌液中蒽酮糖苷类代谢物oxanthromicinA的提取分离
将放线菌Actinomadurasp.KCC248的发酵液进行浓缩，从30L浓缩至2L，然后对浓缩液进行萃取，加入3倍体积的乙酸乙酯，分别萃取3次，合并萃取液，浓缩得到乙酸乙酯萃取浸膏。
上述发酵液的具体培养方法为：采用土豆培养基(200g/L的土豆，20g/L的葡萄糖，自来水1000mL)，在温度28℃，转速180转/分钟，无菌发酵8天。
该方法还包括常压大孔树脂分离，硅胶柱色谱分离等。
其中，常压大孔树脂分离具体参数如下：
柱子型号：
填充物为：MCIGelCHP20P；
洗脱过程为：分别通过(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％)的甲醇水梯度洗脱，每个梯度洗脱1000mL，收集梯度为80％、90％和100％洗脱液成分，然后采用硅胶柱色谱分离。
硅胶柱色谱分离的参数具体如下：
柱子型号：
填充物为：200-300目硅胶粉。
流动相为：10份氯仿和3份甲醇的混合液，流速为1mL/min；
收集保留体积100-150mL的过柱后的洗脱液，既可以获得化合物oxanthromicinA。
实验例3化合物oxanthromicinA的结构鉴定
对该化合物进行质谱分析和核磁共振分析，化合物oxanthromicinA(1)，常规理化数据包括：无定型粉末，[α]20D+207.5(c0.0012,DMSO)；UV(MeOH)λmax(logε):256(4.40),314(4.34)；HR-ESI-MSm/z:977.2721[M–H]–(calcd.for C23H49O11,977.2716)。化合物oxanthromicinA的高分辨质谱图如图1所示；化合物oxanthromicinA的1H和13CNMR数据见下表1，其核磁共振1HNMR谱图如图2所示，其核磁共振13CNMR谱图如图3所示。可知，该化合物为蒽酮糖苷类化合物，含有3个甲基(δC20.9,15.7,34.5)，1个酮羰基(δC189.9)和1个羧基羰基(δC169.0)。其中蒽酮苷元上有3个为取代的H信号，δH7.01,6.75,7.35。其中还含有糖信号：δH5.06,3.95,3.61,3.49,3.14,3.37。其中，根据C-10信号(δC80.6)和结合HR-MS：977.2721[M–H]–推测该化合物为二聚体，且对称较好。通过采用三氟乙酸水解该化合物，采用HPLC检测糖信号确定该化合物含有D-甘露糖。
表1化合物oxanthromicin A的1H和13CNMR数据(δin ppm，J in Hz)
其中，糖鉴定具体步骤为：精密称量10mg样品置于安瓿瓶中，加入3M TFA10mL，120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中，采用氮气吹干，加入10mL水涡旋混匀，吸取100μL加入900μL去离子水，12000rpm离心5min。取上清进IC分析。色谱柱：DionexCarbopacTMPA20(3*150)；流动相：A:H2O；B:15mM NaOH；C:15mMNaOH&100mM NaOAC；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。通过与标准糖对比，确定为D-甘露糖。
同时，通过测定该化合物oxanthromicinA的二维谱，其中，该化合物oxanthromicinA的核磁共振HSQC谱图如图4所示，核磁共振HMBC谱图如图5所示，可知，该化合物的所有碳原子和氢原子的信号归属及其化学结构，其中，该化合物oxanthromicinA的化学结构如式(A)所示：
说明：其中，δ化学位移单位为ppm，1H-NMR和13C-NMR测试溶剂为二甲基亚砜(DMSO)，通过HSQC、HMBC谱图对化合物的碳氢信号进行归属。
实验例4从KCC248中分离得到的化合物抗肿瘤活性测试
本实验中用到的药物：阳性对照：顺铂(cis-platinum)和紫杉醇(Taxol)。
待测样品：本发明的oxanthromicinA以及从放线菌Actinomadurasp.KC C248的发酵液中分离得到的其他9个化合物，其结构式分别如下：
本实验采用MTT来检测细胞毒活性，实验原理为：活细胞的线粒体中存在的脱氢酶可将黄色的噻唑蓝MTT还原为不溶性的蓝紫色甲臜，死细胞中此酶消失，MTT不被还原。用DMSO(二甲基亚砜)溶解甲臜，再用酶标仪在570nm处检测吸光度(OD)，OD值与活细胞数成正比。
本发明所用肿瘤细胞株：人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)、人非小细胞肺癌细胞(A-549)、人肝癌细胞(SMMC-7721)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和人结肠癌细胞(SW480)、人肝癌细胞LM-3。
实验方法：取对数生长期的肿瘤细胞，分别用胰酶消化后吹打成单细胞悬液，用培养基稀释成1×105cell/mL，接种于96孔板内(100μL/孔)，在37℃5％CO2饱和湿度培养箱中培养24小时。实验组加入不同浓度的待测样品oxanthromicinA，阳性对照组加入顺铂和紫杉醇溶液，阴性对照组加入用1640培养基稀释至1000倍DMSO代替待测溶液，空白对照组加入用1640培养基稀释至1000倍DMSO溶液至不含细胞的孔中，每组分别设置3个重复孔。在37℃、5％CO2条件下培养48小时，每孔加入现配的含5mg/mL的MTT溶液10μL，37℃培养4小时。弃去上清液，每孔加入150μLDMSO溶解甲臜，用酶标仪在570nm处测定吸收度值(OD570)，计算抑制率(％)。计算公式：抑制率(％))＝(1-ODSample/ODControl)×100％。IC50表示抑制率为50％时的药物浓度，通过SPSS26.0软件的Probit回归分析计算IC50值。
结果显示，本化合物oxanthromicinA对人急性早幼粒白血病细胞、人非小细胞肺癌细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞和人结肠癌细胞均具有明显的抑制作用，IC50分别为8.7、17.5、15.0、17.8和14.6μM，具体数据如下表2所示，其他化合物均无活性。
表2化合物的细胞毒活性
根据化合物的细胞毒性检测煎锅，发现其对肝癌细胞SMMC-7721的IC50为15μM，故本实验选择其IC50以下的浓度进行后续实验，包括三个浓度，分别为1μM、3μM和10μM。首先做了蛋白免疫印迹实验(WB)，发现该化合物对肝癌细胞SMMC-7721的基质金属蛋白酶9(MMP9)和基质金属蛋白酶2(MPP2)均表现出显著的抑制作用；此外又对周期蛋白进行了检测，发现该化合物对肝癌细胞SMMC-7721的周期蛋白E1(CyclinE1)和周期蛋白D1(Cyclin D1)均有显著抑制作用，WB结果如图6所示，其中，图中的A为不同浓度的oxanthromicinA对MMP9和MPP2的影响，图中的B为不同浓度的oxanthromicin A对CyclinD1和CyclinE1的影响。由此，可以推测该化合物可能影响癌细胞的转移和侵袭，进而抑制肿瘤细胞的增殖。
为进一步验证该合物对周期相关因子的调控作用，采用Westernblot检测化合物处理肝癌LM-3细胞后，周期调控因子蛋白表达量的变化。WB结果如图7所示，其中，图中的A为oxanthromicinA对肝癌LM-3细胞CyclinD1和Cyclin E1的影响，图中的B和C分别为CyclinD1和CyclinE1的定量结果。可知，化合物oxanthromicinA处理的LM-3细胞中cyclinD1和cyclinE1的蛋白水平显著降低。以上结果表明，化合物可通过下调G0/G1期相关cyclins和CDKs的表达量。
通过深入活性研究表明说明oxanthromicinA具有较强的抗肿瘤活性，可用于研发***药物。
实验例5含有oxanthromicinA的药物制剂
一、片剂
制剂处方：5份的oxanthromicinA、24份的糖粉、35份的淀粉、6份的糊精、9份的30％乙醇。将糖粉与淀粉糊精混合，再将oxanthromicinA溶解至30％乙醇溶液倒入糖粉中，制备颗粒，过16号筛，然后干燥，干燥温度60℃，干燥3小时。将全部颗粒混合21份的硬脂酸镁，然后进行压片，制得片剂，每片重100mg。其中，所有的份数为重量份。
二、冻干制剂
将oxanthromicinA的盐类衍生物(钠盐或者钾盐)采用无菌水溶解，其浓度为5mg/mL，然后采用间歇式热压法灭菌，灭菌后采用布氏漏斗及3.0μm微孔滤膜过滤除去热源，最后采用0.22μm的微孔滤膜过滤。过滤后灌注于西林瓶中，每瓶2mL。将西林瓶在-50℃下进行冷冻，等待全部冷冻后再放置冷冻干燥器内进行冷冻干燥至粉末。
三、其他剂型
本发明提供的oxanthromicinA，还可采用常规制备方法制备成其他剂型，包括颗粒剂、丸剂、胶囊剂、膏剂、注射剂、栓剂和贴剂等，且均具有相同的抗肿瘤活性，适用范围更宽，均可作为良好的抗肿瘤药物，对多种肿瘤有治疗作用，具备显著的应用效果和前景。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (8)

1.一种蒽酮糖苷类化合物，其特征在于，该化合物为oxanthromicin A，其是从放线菌Actinomadura sp. KC C248的发酵液中分离得到，该化合物其结构式如式（A）所示：
。
2.根据权利要求1所述蒽酮糖苷类化合物，其特征在于，该化合物对人急性早幼粒白血病细胞、人非小细胞肺癌细胞、人肝癌细胞、人乳腺癌细胞和人结肠癌细胞均具有抑制作用，IC50分别为8.7、17.5、15.0、17.8和14.6 μM。
3.如权利要求1所述的蒽酮糖苷类化合物，其特征在于，所述的放线菌Actinomadura sp. KC C248已于2021年1月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21710。
4.一种如权利要求1所述蒽酮糖苷类化合物的制备方法，其特征在于，包含：
对如权利要求3中所述的放线菌Actinomadura sp. KC C248进行发酵；
将所得发酵液浓缩后，采用乙酸乙酯萃取，得浸膏；
将所得浸膏通过常压大孔树脂分离和硅胶柱色谱分离，即得如权利要求1所述的蒽酮糖苷类化合物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包含如下：
所述的发酵，其培养基为：200 g/L的土豆，20 g/L的葡萄糖，自来水1000 mL；其发酵条件为温度28 ℃、转速180转/分钟、无菌发酵8天；
所述的常压大孔树脂分离，其分离参数包括柱子型号：10×50cm；
填充物为：MCI Gel CHP 20P；
洗脱过程为：分别通过10、20、30、40、50、60、70、80、90和100%的甲醇水梯度洗脱，每个梯度洗脱1000mL，收集梯度为80%、90%和100%洗脱液成分，待进行硅胶柱色谱分离；
所述的硅胶柱色谱分离，其分离参数包括柱子型号：5×50cm；
填充物为：200-300目的硅胶粉；
流动相为：10份氯仿和3份甲醇的混合液，流速为1mL/min；
收集保留体积100-150mL的过柱后的洗脱液，既得化合物oxanthromicin A。
6.含有如权利要求1所述蒽酮糖苷类化合物的药物制剂。
7.根据权利要求6所述的药物制剂，其特征在于，该制剂的剂型为片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、膏剂、注射剂、栓剂或贴剂。
8.如权利要求6所述的药物制剂在制备肿瘤疾病药物中的应用，其特征在于，所述的肿瘤疾病为白血病、肺癌、肝癌、乳腺癌和结肠癌中的一种或两种以上。
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CN103288889A (zh) * 2013-02-22 2013-09-11 中国科学院昆明植物研究所 蒽醌衍生物及其药物组合物与其在制药中的应用

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