CN116178454A - 化合物IR-FE-Fc、IR-FE-Fc自组装纳米材料及制备方法和抗肿瘤应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了化合物IR‑FE‑Fc、IR‑FE‑Fc自组装纳米材料及制备方法和抗肿瘤应用,属于药物化学技术领域。基于本发明提供的化合物IR‑FE‑Fc与磷脂‑二硫键‑聚乙二醇‑羧基经自组装可以得到IR‑FE‑Fc自组装纳米材料,其具有良好的生物相容性,Fenton化学反应效率高,可以作为NIR‑II分子光热平台用于制备治疗癌症药物。
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域,尤其涉及化合物IR-FE-Fc、IR-FE-Fc自组装纳米材料及制备方法和抗肿瘤应用。
背景技术
目前,化学动力疗法(CDT)已成为一种有前途的癌症治疗策略。基于经典的芬顿(Fenton)化学反应,过氧化氢(H2O2)在过渡金属离子(如Fe2+、Cu2+、Mn2+、Co2+或Mo2+)的催化下被分解成有害的羟基自由基(·OH)。肿瘤微环境中H2O2的过度表达为CDT治疗提供了途径,它可以通过Fenton化学反应将H2O2转化为剧毒的·OH,从而杀死肿瘤细胞。然而,目前CDT治疗效率不高,这主要是由于:ⅰ)基于单一疗法的纳米材料的催化效率不理想;ⅱ)中度酸性(pH=6.0~7.0)的肿瘤微环境(TME)条件、肿瘤微环境内的H2O2浓度有限(50~100μM)和肿瘤细胞中还原性谷胱甘肽(GSH)过度表达(约10mM),导致Fenton化学反应产生·OH受阻,削弱了CDT的治疗效果;ⅲ)不稳定的离子型自组装纳米材料具有很大的泄漏风险,影响了Fenton化学反应的效率。
为了克服CDT治疗的上述缺点,人们探索了各种策略来提高CDT的抗癌疗效,如开发具有足够稳定性、可再生和高催化性能的CDT制剂;调节肿瘤微环境,包括增加H2O2、降低GSH水平,或者调整酸度和温度。其中,将CDT疗法与其他治疗策略相结合是最有希望提高CDT效果的方案,如将光热疗法(PTT)、光动力疗法(PDT)以及化疗相结合。
目前,PTT协同CDT治疗策略能够从多种途径来提高Fenton反应效率。首先,PTT诱导的局部温度升高可以加速瘤内血流,改善·OH的产生,促进Fenton反应速率。第二,提高温度可以加速Fe2+释放到TME。第三,动力学研究证明,Fenton化学反应是一阶动力学模型,因此,当局部区域的温度从20℃加热到50℃时,反应速率可提高4倍,从而提高·OH的生成。另外,较高的温度可以加速细胞内生物物质的·OH氧化,对细胞造成不可逆的损伤,破坏和杀死癌细胞,显著提高CDT的整体抗癌疗效。此外,在联合治疗的进展中引入实时成像技术也是一个重要的技术手段,因为这可以从侧面反馈注射纳米材料的***和肿瘤的积累水平,使治疗效率可视化。因此,开发一种多功能的治疗策略,包括基于CDT的联合治疗策略和治疗进展的实时可视化,是治疗癌症的一种理想策略。
综上所述,CDT疗法虽具有很好的抗癌前景,但也存在单一治疗方法效率低的问题,且缺乏与实时高精度靶向肿瘤成像的结合。联合治疗是两种或两种以上治疗药物或方法联合使用治疗癌症的策略。目前临床常用的联合治疗是抗癌药物的联合使用或传统治疗方法(手术或放化疗)的联合使用。这些临床常用的联合治疗策略通过协同或相加效应,可以降低药物毒性和耐药性,在更短的周期内提高癌症的治疗效果,降低癌症复发的频次,延长患者生存期。在实时成像技术上大部分的荧光染料存在安全隐患,无机材料和尺寸较大的聚合物材料完全排除体外需要数天甚至几个月,期间可能会对肝脏、脾脏和胰脏等器官造成毒副作用,这个缺点阻碍了其在临床检测与手术中的应用。因此,设计合成具有高荧光亮度并能够实现在肿瘤部位高特异性聚集、同时能够协同CDT等多种治疗方式的纳米材料,对于肿瘤的临床治疗具有非常积极的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供化合物IR-FE-Fc、IR-FE-Fc自组装纳米材料及制备方法和抗肿瘤应用,基于本发明提供的化合物IR-FE-Fc与磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基经自组装可以得到IR-FE-Fc自组装纳米材料,其具有良好的生物相容性,Fenton化学反应效率高,可以作为NIR-II分子光热平台用于制备治疗癌症药物。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种化合物IR-FE-Fc,具有式I所示结构:
本发明提供了上述技术方案所述化合物IR-FE-Fc的制备方法,包括以下步骤:
将化合物1、叠氮化钠与有机溶剂混合进行叠氮化反应,得到化合物2;
将所述化合物2、铜基催化剂、乙炔基二茂铁、三[(1-苄基-1H-1,2,3-***-4-基)甲基]胺与有机溶剂混合进行叠加环化反应,得到化合物IR-FE-Fc;
所述化合物1具有式1所示结构,所述化合物2具有式2所示结构:
优选地,所述叠氮化反应的温度为65~75℃,时间为2.5~3.5h。
优选地,所述叠加环化反应的温度为室温15~35℃,时间为25~35min。
本发明提供了一种IR-FE-Fc自组装纳米材料,由上述技术方案所述化合物IR-FE-Fc与磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基经自组装得到。
优选地,所述化合物IR-FE-Fc与磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基的质量比为1:(4.5~5.5)。
本发明提供了上述技术方案所述IR-FE-Fc自组装纳米材料的制备方法,包括以下步骤:
将化合物IR-FE-Fc、磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基、有机溶剂与水混合,经自组装处理,得到IR-FE-Fc自组装纳米材料。
本发明提供了上述技术方案所述IR-FE-Fc自组装纳米材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的IR-FE-Fc自组装纳米材料在制备治疗癌症药物中的应用。
优选地,所述癌症包括肺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、***、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤。
本发明提供了一种治疗癌症的药物,活性成分为上述技术方案所述IR-FE-Fc自组装纳米材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的IR-FE-Fc自组装纳米材料。
本发明提供了一种化合物IR-FE-Fc,其中功能性二茂铁基团被化合物1(记为化合物IR-FE)的四臂屏蔽单元拴住,可以提高Fe2+负载的能力,增加Fenton化学反应中的分子水平接触点;本发明提供的化合物IR-FE-Fc在近红外-II区同时表现出吸收(700~1000nm)和发射(1000~1200nm),将其与磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基(DSPE-S-S-PEG)经自组装可以得到IR-FE-Fc自组装纳米材料(记为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG),其为一种水溶液好且可分解的近红外-II(NIR-II)分子光热平台,可以由肿瘤微环境中的高GSH水平引发分解释放具有催化能力的IR-FE-Fc,游离的IR-FE-Fc可以催化肿瘤内的H2O2分解为剧毒的·OH,这一协同过程加速了GSH的消耗,促进了铁死亡。与游离的Fe2+相比,二茂铁基团(Fc)中的Fe(II)更容易表现出可逆的氧化还原特性,因此二茂铁基团的有效再生可以进一步放大CDT的效率。而且IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在近红外激光(808nm)照射下显示出良好的光热效应,这加速了肿瘤内的血流,提升了氧气含量,进一步提升了CDT的转化效率。因此,本发明提供的IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG不仅可以作为PTT剂在808nm激光照射下产生杀伤癌细胞的热效应,还可以发挥CDT剂的作用,将内源性的H2O2转化为有害的·OH,同时消耗GSH,实现CDT的放大。值得注意的是,PTT诱导的高热可以进一步增强CDT效果,实现PTT与CDT的协同治疗,同时CDT-PTT疗法可以逆转免疫抑制,刺激免疫***,在治疗过程中发现炎症因子IFN-γ的升高,促使GPX4的减少。由于纳米粒子的尺寸效应以及肿瘤的高GSH微环境,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG表现出很高的肿瘤积累/选择性。更重要的是,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG能够在808nm激光照射下有效地损伤肿瘤组织,而不会对正常组织产生副作用。总的来说,本发明提供了一种CDT-PTT联合治疗策略,通过近红外二代荧光成像技术进行可视化的治疗信息反馈;IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG中通过引入四个二茂铁基团,可以促进CDT反应物的装载,从而提高了治疗效率;这些多重协同策略不仅显著提高了Fenton化学反应效率,而且还为今后的研究提供了一种免疫协同策略。
附图说明
图1为本发明中NIR-II荧光成像引导CDT-PTT联合治疗平台IR-FE-FC@DSPE-S-S-PEG通过激活免疫细胞和免疫细胞因子结合铁死亡来治疗癌症的示意图;
图2为化合物IR-FE-Fc的1H-NMR图;
图3为化合物IR-FE-Fc的13C NMR图;
图4为化合物IR-FE-Fc的HRMS图;
图5为IR-FE@DSPE-S-S-PEG的TEM图和IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在GSH的PBS缓冲液中孵化后的TEM图;
图6为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的基础化学性能图;
图7为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在双氧水和GSH环境中的纳米粒度变化图;
图8为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG与IR-FE@DSPE-S-S-PEG的光热性能图;
图9为细胞内·OH生成、脂质过氧化(LPO)以及活性氧(ROS)水平测试和肿瘤摄取能力评价结果图;
图10为不同处理方法中4T1细胞孵育后GSH含量测定结果图;
图11为图9中CLSM荧光值量化图;
图12为细胞毒性和细胞凋亡的评估结果图;
图13为测试例4中各个实验组的JC-1荧光CLSM图;
图14为4T1肿瘤携带小鼠的体内荧光和红外热成像结果图;
图15为体内抗肿瘤效率结果图;
图16为测试例5中IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的生物化学分析实验中各个实验组的血液生化指标和HE染色图;
图17为免疫效果评价结果图;
图18为测试例5中免疫效果评价实验中各个实验组肿瘤和脾脏的HMGB1和钙调蛋白(CRT)图;
图19为测试例5中免疫效果评价实验中各个实验组肿瘤和脾脏的CD4+/Foxp3+图;
图20为测试例5中免疫效果评价实验中IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的溶血实验图。
具体实施方式
本发明提供了一种化合物IR-FE-Fc,具有式I所示结构:
本发明提供了上述技术方案所述化合物IR-FE-Fc的制备方法,包括以下步骤:
将化合物1、叠氮化钠与有机溶剂混合进行叠氮化反应,得到化合物2;
将所述化合物2、铜基催化剂、乙炔基二茂铁、三[(1-苄基-1H-1,2,3-***-4-基)甲基]胺与有机溶剂混合进行叠加环化反应,得到化合物IR-FE-Fc;
所述化合物1具有式1所示结构,所述化合物2具有式2所示结构:
在本发明中,若无特殊说明,所用原料均为本领域技术人员熟知的市售商品或采用本领域技术人员熟知的方法制备得到。
本发明将化合物1(记为化合物IR-FE)、叠氮化钠与有机溶剂混合进行叠氮化反应,得到化合物2。在本发明中,所述化合物1与叠氮化钠的摩尔比优选为1:(10~11),更优选为1:10.43;所述有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺(DMF),所述有机溶剂与化合物1的用量比优选为(8~12)mL:0.069mmol,更优选为10mL:0.069mmol。在本发明中,所述叠氮化反应的温度优选为65~75℃,更优选为70℃;时间优选为2.5~3.5h,更优选为3h。所述叠氮化反应后,本发明优选向所得产物体系中加入水并搅拌,直到所有固体溶解,然后用乙酸乙酯萃取,有机相用MgSO4干燥,过滤,将滤液进行真空蒸发以去除溶剂,所得粗产品经硅胶柱层析纯化,得到的深绿色固体即为化合物2;所述硅胶柱层析纯化所用洗脱剂优选为石油醚(PE)与乙酸乙酯(EA),所述PE与EA的体积比优选为2:1。
得到化合物2后,本发明将所述化合物2、铜基催化剂、乙炔基二茂铁、三[(1-苄基-1H-1,2,3-***-4-基)甲基]胺与有机溶剂混合进行叠加环化反应,得到化合物IR-FE-Fc。在本发明中,所述铜基催化剂优选包括噻吩-2-羧酸铜(CuTc)或碘化亚铜。在本发明中,所述化合物2、铜基催化剂、乙炔基二茂铁与三[(1-苄基-1H-1,2,3-***-4-基)甲基]胺(TBTA)的质量比优选为88:(8~12):(55~60):(4.5~5.5),更优选为88:10:57:5;所述TBTA与铜基催化剂复配共同起到催化作用。在本发明中,所述有机溶剂优选为四氢呋喃,所述有机溶剂与化合物2的用量比优选为(4~6)mL:88mg,更优选为5mL:88mg。在本发明中,所述叠加环化反应的温度优选为15~35℃,更优选为室温(25℃);时间优选为25~35min,更优选为30min。所述叠加环化反应后,本发明优选将所得产物体系用硅藻土过滤,将滤液进行真空蒸发以去除溶剂,所得粗产品经硅胶柱层析纯化,之后再采用甲基叔丁基醚进行重结晶,得到的深绿色固体即为化合物IR-FE-Fc;所述硅胶柱层析纯化所用洗脱剂优选为PE与EA,所述PE与EA的体积比优选为2:1。
本发明提供了一种IR-FE-Fc自组装纳米材料,由上述技术方案所述化合物IR-FE-Fc与磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基经自组装得到。在本发明中,所述化合物IR-FE-Fc与磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基(DSPE-S-S-PEG)的质量比优选为1:(4.5~5.5),更优选为1:5。在本发明中,所述DSPE-S-S-PEG中聚乙二醇的分子量优选为800~1500,更优选为1000;本发明通过将疏水性的化合物IR-FE-Fc与两亲性的共聚物DSPE-S-S-PEG自组装,得到IR-FE-Fc自组装纳米材料(记为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG),其在水中具有良好的溶解度。在本发明中,所述IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG整体呈纳米颗粒形式,平均直径优选为130nm;多分散指数(PDI)优选为0.12~0.8。
本发明提供了上述技术方案所述IR-FE-Fc自组装纳米材料的制备方法,包括以下步骤:
将化合物IR-FE-Fc、磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基、有机溶剂与水混合,经自组装处理,得到IR-FE-Fc自组装纳米材料。
在本发明中,所述有机溶剂优选为CH2Cl2,所述水优选为去离子水;所述有机溶剂、水与化合物IR-FE-Fc的用量比优选为(450~550)μL:(4.5~5.5)mL:2mg,更优选为500μL:5mL:2mg。本发明优选将所述化合物IR-FE-Fc和磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基加入到有机溶剂中,将所得混合物快速注入水中,进行自组装处理。在本发明中,所述自组装处理优选在搅拌条件下进行,所述自组装处理的温度优选为35~40℃,更优选为38℃;时间优选为2~4min,更优选为3min。所述自组装处理后,本发明优选将所得产物体系蒸发去除有机溶剂,剩余水溶液通过注射器驱动的过滤器(0.22μM,Millipore)过滤,将滤液在4℃条件下于3500rpm离心15min,上清液再采用30kDa离心过滤器洗涤3次,得到含IR-FE-Fc自组装纳米材料的水溶液。
本发明提供了上述技术方案所述IR-FE-Fc自组装纳米材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的IR-FE-Fc自组装纳米材料在制备治疗癌症药物中的应用。在本发明中,所述癌症优选包括肺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、***、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤。
本发明提供了一种治疗癌症的药物,活性成分为上述技术方案所述IR-FE-Fc自组装纳米材料或上述技术方案所述制备方法制备得到的IR-FE-Fc自组装纳米材料。在本发明中,所述治疗癌症的药物还包括药学上可接受的辅料。
图1为本发明中NIR-II荧光成像引导CDT-PTT联合治疗平台IR-FE-FC@DSPE-S-S-PEG通过激活免疫细胞和免疫细胞因子结合铁死亡来治疗癌症的示意图。具体的,本发明通过简单的炔基环化反应将四个二茂铁分子耦合到近红外二区荧光分子IR-FE的核心,得到新分子IR-FE-Fc。在这一策略中,不仅通过增加单分子铁负荷提高了芬顿反应的效率,而且二茂铁分子直接与发光核心的稳定偶联避免了分子泄漏,实现了治疗的精确可视化,耦合策略使材料精确显示CDT协同治疗的发生位置。本发明中CDT效果通过PTT和GSH的消耗得到加强;同时,通过光热疗法和谷胱甘肽消耗显示出协同增强的铁死亡机制,这就形成了一种多重增强ECDT策略。本发明基于生物相容性有机碳骨架材料的激光触发和多向协同方法,为荧光成像监测的协同增强型CDT癌症治疗提供了一个很好的策略。
下面将结合本发明中的实施例,对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明中所用材料和试剂来源如下:
氨基苯基荧光素(APF)、2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、Calcein-AM/PI双染色试剂盒、AnnexinV-FITC检测试剂盒、T细胞染色试剂盒、细胞计数试剂盒(CCK8)、IFN-γELISA试剂盒、IL-6ELISA试剂盒、IL-20ELISA试剂盒、线粒体染色试剂盒(JC-1)和还原谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒均购自SigmaAldrich有限公司。细胞脂质过氧化检测试剂盒(lipoflo)购自上海东仁化工科技有限公司。小鼠器官组织淋巴细胞分离液试剂盒购自北京索尔比奥有限公司。DSPE-S-S-PEG购自西安瑞希生物技术有限公司。有机合成的化学品从上海泰坦科学有限公司订购。用于反应的四氢呋喃(THF)、甲苯和二甲基甲酰胺(DMF)在使用前都经过溶剂净化***(创新科技公司)的净化。所有对空气和水分敏感的反应都在氮气环境下的火焰干燥的玻璃器皿中进行。
本发明中检测所用设备如下:
核磁共振谱在AVANCENEO 500光谱仪(Bruker,德国)上记录,使用CDCl3作为内部参考。高分辨率质谱(HRMS)是在Thermo Scientific Q Exactive Combined quadrupoleOrbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientific Co,USA)上以正离子模式获得。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像在Zeiss LSM880(Zeiss,德国)上收集。透射电子显微镜(TEM)图像通过HT7800透射电子显微镜(日立电子,加速电压80kV)获得。纳米颗粒(NPs)的尺寸分布通过Nano-ZS90(Malvern,中国)获得。X射线光电子能谱(XPS)分析在K-Alpha(Thermo FisherScientific Co,USA)上进行。电子自旋共振(ESR/EPR)光谱通过EMXnano光谱仪(德国布鲁克公司)获得。荧光光谱在Thermo Scientific Lumina荧光光谱仪(Thermo FisherScientific Co,USA)上测量。荧光成像(FI)在普林斯顿仪器公司的NIRvana-640(普林斯顿仪器公司,美国)上进行。流式细胞仪具体是BD LSRFortessa(BD,美国)。紫外-可见-近红外(UV-Vis-NIR)吸收光谱由UA-3200S光谱仪(MAPADA,中国)测量。在808nm近红外激光(1.0W/cm2,MDL-XF-808nm/10W,长春新产业光电技术有限公司)照射下,用红外热像仪(Fotric225s,中国)测试温度演变曲线。病理切片通过Pannoramic DESK,P-MIDI,P250,P1000(3D HISTECH,HUN)进行观察。
本发明中数据的统计分析采用两配对样本t检验,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;所有数据是重复三次或更多次的实验的平均值±SD(标准差)。
实施例1
制备化合物IR-FE-Fc,反应式具体如下:
将化合物IR-FE(100mg,0.069mmol)和叠氮化钠(47mg,0.72mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF,10mL),在70℃条件下加热反应3h;向所得产物体系中加入大量的水并搅拌,直到所有固体溶解,然后用乙酸乙酯萃取两次,合并有机相用MgSO4干燥,过滤,将滤液进行真空蒸发以去除溶剂,所得粗产品经硅胶柱层析纯化(所用洗脱剂为PE与EA,且PE与EA体积比为2:1),得到深绿色固体(88mg);
将所述深绿色固体溶解于5mL四氢呋喃(THF)中,加入噻吩-2-羧酸铜(CuTc,10mg)、乙炔基二茂铁(57mg)和三[(1-苄基-1H-1,2,3-***-4-基)甲基]胺(TBTA,5mg),在室温(25℃)搅拌条件下进行叠加环化反应0.5h;将所得产物体系用硅藻土过滤,滤液进行真空蒸发以去除溶剂,所得粗产品经硅胶柱层析纯化(所用洗脱剂为PE与EA,且PE与EA体积比为2:1),之后再采用甲基叔丁基醚进行重结晶,得到深绿色固体(75mg),即为化合物IR-FE-Fc,收率为51.80%。
图2为化合物IR-FE-Fc的1H-NMR图,图3为化合物IR-FE-Fc的13C NMR图,图4为化合物IR-FE-Fc的HRMS图,具体数据如下:
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.84(dd,J=7.9,1.7Hz,2H),7.69–7.62(m,6H),7.25(ddd,J=14.2,6.8,2.7Hz,10H),4.65(s,8H),4.42(dd,J=5.7,2.6Hz,4H),4.30–4.21(m,12H),4.12(tt,J=8.5,4.4Hz,8H),3.99(s,20H),1.96–1.89(m,8H),1.63(d,J=7.0Hz,8H),1.52(m,8H),1.04(m,J=10.9,7.1,5.3Hz,16H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ151.54,149.70,149.46,145.51,140.98,139.74,139.35,137.39,130.74,126.27,126.03,124.61,121.74,121.47,119.57,118.97,118.81,117.63,112.06,107.76,76.28,76.03,75.77,74.42,68.48,67.53,65.53,63.72,63.55,54.05,49.13,39.09,29.00,28.68,28.13,25.00,22.42.HRMS(ESI)calcd for C116H111Fe4N16O4S4 +,([M+H+])2144.5286,Found2144.5222。
实施例2
制备IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG,步骤如下:
将10mg化合物DSPE-S-S-PEG和2mg化合物IR-FE-Fc加入500μL的CH2Cl2中,将所得混合物快速注入5mL去离子水中,连续水浴(38℃)搅拌处理3min自组装成纳米颗粒;之后将所得产物体系蒸发去除CH2Cl2,剩余水溶液通过注射器驱动的过滤器(0.22μM,Millipore)过滤,滤液在4℃条件下于3500rpm离心15min,上清液再采用30kDa离心过滤器洗涤3次,得到含IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的水溶液;所述化合物DSPE-S-S-PEG的结构式如下所示,其中PEG的分子量为1000。
对比例1
按照实施例2的方法制备IR-FE-Fc@DSPE-PEG,不同之处仅在于将化合物DSPE-S-S-PEG替换为化合物DSPE-PEG,所述化合物DSPE-PEG中PEG的分子量为1000。
对比例2
按照实施例2的方法制备IR-FE@DSPE-S-S-PEG,不同之处仅在于将化合物IR-FE-Fc替换为化合物IR-FE。
测试例1体外降解
将IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(100μM)在GSH(10mM)的PBS缓冲液中孵化4h,采用TEM拍摄IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的形态变化。图5为IR-FE@DSPE-S-S-PEG的TEM图和IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在GSH的PBS缓冲液中孵化后的TEM图,其中,a为IR-FE@DSPE-S-S-PEG的TEM图,b为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在GSH的PBS缓冲液中孵化不同时间后的TEM图。
本发明通过化合物IR-FE和乙炔基二茂铁之间的叠加环化反应来制备化合物IR-FE-Fc,通过采用这种化学共价键的形式确保化合物IR-FE-Fc具有较好的稳定性;之后将疏水性的化合物IR-FE-Fc与两亲性的共聚物DSPE-S-S-PEG进行自组装,得到在水中具有良好溶解度的IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG。作为不含铁的对照,化合物IR-FE直接与共聚物DSPE-S-S-PEG进行自组装,得到IR-FE@DSPE-S-S-PEG。
本发明通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)来研究各化合物的尺寸分布和形态。图6为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的基础化学性能图,图6中的a为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的TEM图像;b为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG与IR-FE@DSPE-S-S-PEG的HD尺寸分布图;c为14天内IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的粒度变化以及PDI图(误差条为平均值±SD,n=3);d为不同测试浓度的IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液的归一化吸收光谱;e为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在水溶液中的归一化吸收和发射光谱图(在808nm处激发);f为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液(50μM)在近红外激光(808nm,1.0W/cm2)条件下的加热曲线和冷却曲线以及光热转换效率;g为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在五个激光“开关”周期(1.0W/cm2)照射下的温度变化曲线;h为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG粉末在环境条件下暴露5h的XPS光谱,i为纯Fe2+在环境条件下暴露5h的XPS光谱;j为不同处理下紫外-可见光谱图,其中I对应组别TMB-L,II对应组别TMB+H2O2-L,III对应组别TMB+H2O2+IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L,IV对应组别TMB+IR-FE-FC@DSPE-S-S-PEG-L,V对应组别TMB+H2O2+IR-FE-FC@DSPE-S-S-PEG-L,VI对应组别TMB+H2O2+GSH+IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L,VII对应组别TMB+H2O2+GSH+IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L;k为不同处理下A652 TMB的氧化强度变化图,插图为相关组别溶液颜色变化的照片(误差条为平均值±SD,n=3);l为不同环境下处理的H2O2的ESR光谱图,具体为对照组(DMPO)-L、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L、GSH+IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L、GSH+IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L,其中,+L和-L分别对应808nm激光照射和非激光照射。
图7为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在双氧水和GSH环境中的纳米粒度变化图,图7中的a为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在不同浓度的双氧水中粒度变化图,b为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在不同浓度的GSH中粒度变化图。
由图5中的a与图6中的a可知,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG和IR-FE@DSPE-S-S-PEG都表现出球状形态,二者平均直径≈130nm,这与DLS的结果基本一致,即IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的流体动力学直径(161nm)比IR-FE@DSPE-S-S-PEG的流体动力学直径(130nm)大(图6中的b)。图6中的c显示了在相同浓度下,两种化合物的平均HD和多分散指数(PDI)随时间的增加而变化,直到14天,平均HD和PDI都没有出现明显的波动。这些结果表明,本发明制备的IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG是具有良好水溶性以及稳定性的球形纳米颗粒。由图6中的d可知,浓度为50μM的IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液在≈405nm和≈808nm处出现了两个特征性的吸收峰。随后,荧光发射光谱在405nm或808nm处激发,相应的发射峰在500nm和1030nm处,验证了本发明制备的IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG具有作为生物成像多色剂的潜力(图6中的e,图7中的a和b)。
此外,由图5中的b可知,在GSH(10mM)的PBS缓冲液中孵化4h后,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的形态发生了明显变化,表明IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG可以在4h内被GSH(10mM)裂解并降解。
测试例2光热效应的评价以及化学动力学活性
1、光热效应的评价
将FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液(50μM,1.0mL)或1.0mL不同浓度的IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液(20μM、30μM、40μM、50μM和60μM)在不同激光强度(0.25W/cm2、0.5W/cm2、0.75W/cm2、1W/cm2、1.25W/cm2)条件下采用808nm激光照射10min,使用红外热成像仪记录溶液的温度。为了评估体外的光热(PTT)性能,将1.0mL不同浓度IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液(20μM、30μM、40μM、50μM和60μM)用808nm激光照射,功率为1.0W/cm2,通过连续测量IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液的温度(直到移除激光后10min的冷却期),来进一步研究光热稳定性。为了测量光热转换效率,将IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液(50μM)暴露在功率为1.0W/cm2的808nm激光下10min,然后移除激光使溶液温度冷却到室温,并通过红外热像仪测量溶液的实时温度。
光热转换效率(η)根据式(1)计算:η=(hS(Tmax-Tsurr)-Q0)/(I(1-10^(-A808)))式(1);
所述hS具体通过式(2)计算:hS=m/τs式(2);
所述τs具体通过式(3)计算:τs=t/(-lnθ)式(3);
所述θ具体通过式(4)计算:θ=(T-Tsurr)/(Tmax-Tsurr)式(4);
所述Q0具体通过式(5)计算:Q0=hS(Tmax-Tsurr)式(5);
其中h代表传热系数,S代表样品容器的表面积,Tmax代表稳态最高温度,Tsurr代表环境室温,T代表冷却过程中的瞬时温度,t代表冷却到室温所需的时间,θ代表水的比热容,m代表溶液的质量(g),Q0代表在同一石英比色皿中不含纳米颗粒的相同溶剂经过相同激光辐照所输入的能量,I为溶液温度变化,A808为材料在808nm激光照射下的紫外吸收强度。
2、化学动力学活性
将IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液(50μM)与GSH(10mM)混合,使所得混合溶液总体积为1.0mL,将所述混合溶液于37℃条件下在黑暗中摇晃4h,之后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB,1μL,0.1M)和过氧化氢(5μL,30wt%),将所得混合溶液在808nm激光(1.0W/cm2)下照射10min,使用紫外-可见分光光度计监测TMB在652nm处的吸收。同时对附加组进行处理,具体组别为:去离子水-L(不含H2O2)、去离子水-L(含H2O2)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG溶液-L(含H2O2)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG溶液-L(不含H2O2)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG溶液-L(含H2O2)以及IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG溶液-L(含H2O2和GSH),其中,+L和-L分别对应808nm激光照射和非激光照射。
为了进行ESR分析,将IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG溶液(50μM)与GSH(10mM)混合,使所得混合溶液总体积为1.0mL,将所述混合溶液于37℃条件下在黑暗中摇匀混合4h,然后加入过氧化氢(5μL,30wt%),将所得混合溶液在808nm激光(1.0W/cm2)下照射10min;其中,在试验前30min加入·OH捕集剂5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)。同时对附加组进行处理,具体组别为:去离子水-L(不含H2O2)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG溶液-L(含H2O2)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG溶液-L(含H2O2和GSH)。
图8为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG与IR-FE@DSPE-S-S-PEG的光热性能图,图8中的a为不同浓度的IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液(20μM、30μM、40μM、50μM和60μM)和IR-FE@DSPE-S-S-PEG水溶液(50μM)在808nm激光(1.0W/cm2)照射下的加热曲线;b为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液(50μM)在不同功率密度的808nm激光照射下的加热曲线;c为IR-FE@DSPE-S-S-PEG水溶液(50μM)在808nm激光(1.0W/cm2)照射下的加热曲线和冷却曲线以及光热转换效率;d为不同浓度的IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG水溶液(20μM、30μM、40μM、50μM和60μM)的红外热图像。
本测试例评估了IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的光热性能(图8中的a、b和d),IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的热图像和加热曲线表明,在808nm激光照射下功率密度依赖和浓度依赖的光热转换性能。在相同的50μM浓度下,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在808nm激光连续照射10min后,温度高于IR-FE@DSPE-S-S-PEG(图8中的a),且计算结果还显示,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的光热转换效率(40.29%,图6中的f)比IR-FE@DSPE-S-S-PEG(36.54%,图8中的c)更高。这是由于IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在金属离子存在下发生聚集,可能改善了荧光体的非辐射转变,从而产生了更好的光热效果。
本测试例研究了IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在五个激光开关循环中的光热稳定性(图6中的g),结果表明,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在近红外刺激下具有显著的光热稳定性。值得注意的是,在GSH(10mM)的PBS缓冲液中孵化4h后,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的形态发生了明显变化,表明IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG可以在4h内被GSH(10mM)裂解并降解(图5中的b)。IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的X射线光电子能谱(XPS)光谱显示,位于719.81eV和706.94eV的特征带分别归属于Fe2+的2p1/2和2p3/2(图6中的h);然而经过5h的反应,纯的Fe2+迅速被氧化成Fe3+,在XPS光谱中出现了两个新的特征带728.97eV和715.01eV,分别对应于Fe3+的2p1/2和2p3/2(图6中的i)。这些结果证实,铁复合物与有机染料的耦合策略可以确保Fe2+的稳定性。
此外,3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)被用来测量·OH的生成。在被·OH氧化后,混合溶液的颜色由无色变为蓝绿色,并在652nm处出现吸光峰。如本测试例结果所示,H2O2或IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG不能引发TMB在652nm处的吸光,IR-FE@DSPE-S-S-PEG在H2O2存在下也不能引发TMB在652nm的吸光。当IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG与H2O2混合时,TMB在652nm处出现了一个峰值(图6中的j),这表明有·OH生成。当IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在GSH(10mM)的PBS缓冲液中降解,然后与H2O2混合时,TMB的吸光度在652nm处增加。当与激光照射结合时,TMB的峰值在652nm处进一步增加。这些结果证实,在GSH降解后,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG可以随着IR-FE-Fc的释放增多而产生更多的·OH,而采用激光照射可以促进更多·OH的产生(图6中的j和k)。此外,利用5,5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物(DMPO)作为自由基诱捕剂,电子自旋共振(ESR)光谱证实了一致的结果(图6中的l)。
测试例3细胞内·OH生成、脂质过氧化(LPO)、活性氧(ROS)水平和肿瘤摄取能力评价
1、测定细胞内·OH、LPO和ROS
氨基苯基荧光素(APF)试验被用来评估细胞·OH生成能力。在12孔板中接种4T1细胞或HC11细胞(1×105/孔),并在补充有10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100g/mL)的RPMI1640培养基中培养。在37℃、5%的大气二氧化碳水平下培养过夜后,更换新鲜的培养基,并采用不同处理方法孵化,具体包括PBS、PBS(有激光)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM,有激光),孵化4h后,用PBS清洗细胞3次,以去除残留的样品。然后使用APF(Sigma-Aldrich Co)检测·OH水平,并通过流式细胞仪(BD LSRFortessa,USA)进行分析。另外,将4T1细胞或HC11细胞以每皿1×105个单位的密度接种在共聚焦盘上,并采用同样的程序对细胞内·OH的产生进行CLSM成像(Zeiss LSM880,德国)。
活性氧(ROS)水平通过2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)测定,具体是在12孔板中接种4T1细胞或HC11细胞(1×105/孔),并在补充有10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100g/mL)的RPMI1640培养基中培养。在37℃、5%的大气二氧化碳水平下培养过夜后,更换新鲜的培养基,并采用不同处理方法孵化,具体包括PBS、PBS(带激光)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光),孵化4h后,用PBS清洗细胞3次,以去除残留的样品。然后使用DCFH(Sigma-Aldrich Co)检测ROS水平,并通过流式细胞仪(BD LSRFortessa,USA)进行分析。另外,将4T1细胞或HC11细胞以每皿1×105个单位的密度接种在共聚焦盘上,并采用同样的程序对细胞内ROS水平进行CLSM成像(Zeiss LSM880,德国)。
脂质过氧化(LPO)是通过细胞脂质过氧化检测试剂盒(Liperfluo)检测,具体是在12孔板中接种4T1细胞或HC11细胞(1×105/孔),并在补充有10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100g/mL)的RPMI1640培养基中培养。在37℃、5%的大气二氧化碳水平下培养过夜后,更换新鲜的培养基,并采用不同处理方法孵化,具体包括PBS、PBS(带激光)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光),孵化4h后,用PBS清洗细胞3次,以去除残留的样品。然后使用细胞脂质过氧化检测试剂盒(Liperfluo)(上海东仁化工技术有限公司)检测细胞内LPO水平,并通过流式细胞仪(BD LSRFortessa,美国)进行分析。另外,将4T1细胞或HC11细胞以每盘1×105个单位的密度接种在共聚焦盘上,并采用同样的程序对细胞内LPO水平进行CLSM成像(ZeissLSM880,德国)。
2、肿瘤摄取
在12孔板中接种4T1细胞或HC11细胞(1×105/孔),并在补充有10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100g/mL)的RPMI1640培养基中培养。在37℃、5%的大气二氧化碳水平下孵化过夜后,将IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG溶液(50μM)与细胞共同培养,分别培养0h(作为对照)、1h、2h、3h、4h和5h。最后去除培养基,用PBS清洗细胞。然后用流式细胞仪(BD LSRFortessa,USA)分析细胞吸收水平。另外,将4T1细胞或HC11细胞以每盘1×105个单位的密度接种在共聚焦盘上,并采用同样的程序进行CLSM成像(Zeiss LSM880,德国)分析细胞摄取水平。
3、细胞内GSH的定量
4T1细胞以1×106个细胞/孔的密度接种在6孔板中,在补充有10%胎牛血清(FBS,Gibco)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI1640培养基中,在37℃、5%的大气二氧化碳水平下培养24h,然后更换新鲜的培养基,并采用不同处理方法培养,具体包括PBS、PBS(带激光)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(50μM,带激光)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光),连续培养8h后收集细胞,然后在4℃条件下以1500rpm离心15min,去除上清液后,将细胞分散在培养基中,在PBS中用液氮冷冻,并在37℃条件下解冻,将获得的样品在4℃条件下以10000rpm离心10min,并用GSH检测试剂盒对GSH和GSSH进行定量测定。
图9为细胞内·OH生成、脂质过氧化(LPO)以及活性氧(ROS)水平测试和肿瘤摄取能力评价结果图,其中a为用IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG培养0h、1h、2h、3h、4h、5h的4T1细胞和HC11细胞的CLSM图像;b为用IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG培养0h、1h、2h、3h、4h、5h的4T1细胞和HC11细胞的流式细胞仪分析结果图;c为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG培养的4T1细胞总活性氧和脂质过氧化物荧光CLSM图,其中I对应组别PBS-L,II对应组别PBS+L,III对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L,IV对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L,V对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L,+L和-L分别为808nm激光照射和非激光照射,蓝、红、黄三色分别表示APF、DCFH、Liperfluo;d为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG培养的HC11细胞总活性氧和脂质过氧化物荧光CLSM图;e为流式细胞仪分析4T1细胞和HC11细胞在用I培养后的细胞·OH生成、ROS水平和LPO水平,其中I对应组别PBS-L,II对应组别PBS+L,III对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L,IV对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L,V对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L;f为GSH耗竭调节铁死亡细胞死亡示意图。
图10为不同处理方法中4T1细胞孵育后GSH含量测定结果图,其中I对应PBS-L组别,II对应PBS+L组别,III对应IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L组别,IV对应IR-FE@DSPE-S-S-PEG+L组别,V对应IR-FE-Fc@DSPE-PEG-L组别,VI对应IR-FE-Fc@DSPE-PEG+L组别,VII对应IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L组别,VIII对应IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L组别(误差条:平均值±SD,n=4)。
图11为图9中CLSM荧光值量化图,其中a为用IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG培养0h、1h、2h、3h、4h、5h的4T1细胞和HC11细胞的CLSM荧光值量化图,b为用IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG培养0h、1h、2h、3h、4h、5h的4T1细胞和HC11细胞的流式细胞术荧光值量化图,c为图9中·OH、总活性氧和脂质过氧化物的CLSM荧光值荧光值量化图。
本测试例结果显示,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在近红外-II区表现出明亮的荧光强度,在体外具有光热和化学动力性能,并有可能作为一种光热试剂用于成像引导的肿瘤治疗。为了证明IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的肿瘤细胞吸收水平,将4T1细胞或HC11细胞与IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG溶液孵育0h、1h、2h、3h、4h、5h,用共聚焦激光扫描显微镜(405nm激发)观察。如图9中的a所示,4T1细胞的荧光强度明显高于HC11细胞,并在4h内达到峰值。此外,平均荧光强度(MFI)的统计结果显示了同样的趋势(图11中的a),而且流式细胞仪的分析结果中也可以看到类似的趋势(图9中的b,图11中的b)。这些结果表明,4T1细胞可以高效率地内化IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG,但HC11细胞(作为正常细胞的类似物)的内化能力相对较低。
为了***地揭示分子光热学平台的生物交互作用,本测试例进行了CLSM和流式细胞仪检测三种重要的细胞内杀伤活性成分的水平,即·OH、总活性氧和脂质过氧化物。
首先,用氨基苯基荧光素(APF)检测(标记为红色荧光)来评估IR-FE-Fc@DSPE-PEG与4T1细胞孵化后的细胞·OH生成能力。由于芬顿反应有限,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L的红色荧光很弱。而IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L的荧光明显增强(图9中的c),其MFI是IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L的2.39倍(图11中的c)。在相同条件下,HC11细胞(作为正常细胞的类似物)没有显示明显的荧光(图9中的d,图11中的c),同时流式细胞仪分析结果也显示出类似的趋势(图9中的b)。这表明肿瘤细胞对IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的摄取伴随着·OH的产生,并且Fenton反应的效率在808nm激光照射下得到了提高。而正常细胞由于吸收率低和细胞内H2O2浓度低,显示出弱或几乎没有芬顿反应。这些结果验证了PTT可以提高芬顿反应的效率。
其次,通过2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)(标记为绿色荧光)检测细胞ROS水平。同样地,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L的绿色荧光也很弱,而IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L的荧光明显增强(图9中的c),其平均荧光强度(MFI)是IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L的2.24倍(图11中的c)。在相同的条件下,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L组别在HC11细胞(作为正常细胞的类似物)中显示出可忽略的荧光(图9中的d,图11中的c)。这一结果表明,肿瘤细胞对IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的摄取伴随着细胞内ROS的产生,在808nm激光照射下,其浓度增加。相比之下,由于HC11细胞的低吸收率,细胞内的ROS水平几乎没有明显增加。在相同的条件下,流式细胞仪的分析结果也可以显示类似的趋势(图9中的b)。这些结果进一步证实,CDT-PTT能协同提高肿瘤细胞的ROS水平,但对正常细胞的影响很小。
此外,细胞内脂质过氧化物(LPO)是通过细胞脂质过氧化物检测试剂盒(Liperfluo)(标记为黄色荧光)来检测,该试剂盒可以选择性地与脂质过氧化物发生作用并发出强烈的荧光。如图9中的c所示,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L表现出弱黄色荧光,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L的黄色荧光明显增强,其MFI是IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L组别的0.72倍(图11的c)。在相同的条件下,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L在HC11细胞(作为正常细胞的类似物)中表现出微弱的黄色荧光,由于低吸收和低过氧化物酶体环境而有增加的趋势(图9中的d,图11的c),同时类似的趋势也反映在流式细胞仪的分析结果中(图9中的b)。这一结果显示,肿瘤细胞对IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的摄取伴随着LPO的产生,并且通过协同CDT-PTT来加强。
为了证实细胞内GSH水平的耗竭,本测试例将4T1细胞在不同条件下连续培养8h,用GSH检测试剂盒对上清液中的GSH和GSSH水平进行量化,结果显示IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L组别具有最高的耗损能力。然而,无论是否有激光照射,含有IR-FE-Fc的两组都表现出一定程度的细胞内GSH耗竭,这意味着IR-FE-Fc贡献的PTT和CDT效应在细胞治疗中具有重要作用(图10)。
综上所述,4T1细胞的APF、DCFH和LPO的荧光强度在IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG培养和808nm激光照射后达到最高水平,表明细胞内三种重要的杀伤活性成分(·OH、总活性氧和脂质过氧化物)的水平确实明显升高,说明PTT和CDT之间有明显的协同作用。而用IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG培养的HC11细胞没有显示出明显的效果,这可能是由于HC11细胞内GSH和H2O2比肿瘤细胞低得多。作为细胞内的主要抗氧化物,GSH将通过类似芬顿的反应来对抗Fe2 +产生的·OH,以试图维持氧化还原状态,导致GSH二硫化物(GSSG)的积累增加,并伴随着GSH的耗尽。这一过程随着激光照射而加速,并改善了·OH、总活性氧和脂质过氧化物的生成(图9中的c、d和e,图11的c)。同时,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的二硫键分解进一步加速了GSH的耗竭。而细胞内GSH的减少可以通过调节GSH/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)轴增加肿瘤细胞的铁死亡的敏感性。这一途径也被肿瘤切片中GPX4下调的结果所证明(图15中的f,后续会详细说明)。然而,GPX4的下调和LPO的积累是参与铁死亡的基本因素,其分子机制见图9中的f。
测试例4细胞毒性和细胞凋亡的评估
1、细胞存活率测定
IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的细胞毒性通过CCK8试验进行评估。具体是将4T1细胞或HC11细胞以1×104个细胞/孔的密度接种到96孔板中,在补充有10%胎牛血清(FBS,Gibco)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI1640培养基中,于37℃、5%的大气二氧化碳水平下培养48h。然后更换新鲜的培养基,并采用不同处理方法培养,具体包括PBS、PBS(带激光)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(50μM,带激光)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光),培养4h后,将细胞加入CCK8溶液再培养1h,在Biotek/800TS(Berten,美国)上测量450nm处的吸光度。
将4T1细胞接种(1×105/孔)在12孔板中,在补充有10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100g/mL)的RPMI1640培养基中,于37℃、5%的大气二氧化碳水平下孵化过夜。然后更换新鲜的培养基,并采用不同处理方法孵化,具体包括PBS、PBS(带激光)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(50μM,带激光)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光),孵化4h后,用PBS清洗细胞3次,以去除残留的样品。收集细胞,用Annexin V/PI细胞检测试剂盒(Invitrogen)染色,进行流式细胞分析(BD LSRFortessa,USA)。
将4T1细胞接种(1×105/孔)在12孔板中,在补充有10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100g/mL)的RPMI1640培养基中,于37℃、5%的大气二氧化碳水平下孵化过夜。然后更换新鲜的培养基,并采用不同处理方法孵化,具体包括PBS、PBS(带激光)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(50μM,带激光)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM,带激光),孵化4h后,用PBS清洗细胞3次,以去除残留的样品。用Calcein-AM/PI对细胞进行染色,以获得细胞活/死的图像,并通过CLSM(Zeiss LSM880,德国)进行观察。
2、测定线粒体膜电位的变化
在12孔板中接种4T1细胞(1×105/孔),并在补充有10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100g/mL)的RPMI1640培养基中,于37℃、5%的大气二氧化碳水平下培养过夜,然后更换新鲜的培养基,并采用不同处理方法孵化,具体包括PBS、PBS(有激光)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(50μM,有激光),孵化4h后,采用JC-1染料对肿瘤线粒体进行染色,然后用CLSM(德国蔡司LSM880)观察。
图12为细胞毒性和细胞凋亡的评估结果图,其中a为经不同浓度IR-FE@DSPE-S-S-PEG、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG和IR-FE-Fc@DSPE-PEG在有或无激光照射条件下处理的4T1细胞的细胞活力图(有激光照射时条件为808nm,1.0W/cm2;误差条:平均值±SD,n=4);b为用不同浓度IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在有或无激光照射条件下处理的4T1细胞的细胞活力图(有激光照射时条件为808nm,1.0W/cm2;误差条:平均值±SD,n=4);c为4T1细胞和HC11细胞经不同处理后Calcein-AM(绿色荧光)/PI(红色荧光)的染色结果图,其中I对应组别PBS-L,II对应组别PBS+L,III对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L,IV对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG+L,V对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG-L,VI对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG+L,VII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L,VIII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L,每组样品的浓度为50μΜ;d为流式细胞仪分析4T1细胞和HC11细胞的凋亡水平图,其中I对应组别PBS-L,II对应组别PBS+L,III对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L,IV对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG+L,V对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG-L,VI对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG+L,VII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L,VIII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L,每组样品的浓度为50μΜ。
本实施例测试结果显示,无论是否有激光照射,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG组和IR-FE-Fc@DSPE-PEG组处理的4T1细胞的活力呈梯度下降,而且IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG组破坏肿瘤细胞的效率比IR-FE-Fc@DSPE-PEG组高。尽管IR-FE-Fc@DSPE-PEG也表现出较高的肿瘤杀伤能力,这可能是由于肿瘤细胞在体外的封闭环境中对纳米颗粒具有较高的吸收。然而,在所有测试浓度下,IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L组的生存能力超过80.09%。在激光照射下,IR-FE@DSPE-S-S-PEG组仍显示出31.34%的肿瘤细胞存活率。上述观察结果共同表明,CDT和PTT的协同功效优于PTT单独使用。
与4T1细胞相比,在没有激光照射的情况下,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG组的HC11细胞在所有测试浓度下的存活率均超过90%。然而,在有激光照射的情况下,杀伤能力在40μM的浓度下暴露无遗,40μM时细胞存活率为80.29%,50μM时细胞存活率为39.32%。这一结果可能是由于正常细胞系在体外封闭环境中对IR-FE-Fc@DSPE-PEG的吸收率也很低,以及IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG在激光照射区的光热效应(图12中的b)。如图12中的c和d所示,在流式细胞仪分析和活/死细胞双重染色实验的结果中也可以看出类似的趋势。这些结果与CCK8实验一致,表明IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG具有精确的肿瘤细胞损伤能力,而且CDT和PTT联合治疗的疗效优于PTT单独治疗。
图13为各个实验组的JC-1荧光CLSM图,结果显示,通过染色进一步对线粒体膜电位的变化进行成像可知,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L组的线粒体膜电位急剧下降,这是铁诱导的线粒体功能障碍的特征。
总之,上述结果证明,与正常细胞相比,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG通过两性共聚物DSPE-S-S-PEG的负载运输效应具有肿瘤细胞的选择性。同时,通过加强协同处理,明显提高了ROS、·OH和脂质过氧化物的生成效率。这些特点导致了肿瘤细胞的极端死亡。
测试例5动物肿瘤模型
所有实验动物均从南华大学实验动物中心获得,并遵循《机构动物使用和护理条例》。特定的无病原体雌性BALB/c小鼠(6~8周大,约20克)在正常条件下喂养。在BALB/c小鼠的选定位置皮下注射4T1细胞(1.0×107细胞/mL),建立肿瘤模型。当肿瘤体积达到130mm3时,进行体内治疗。
1、肿瘤小鼠在NIR-II窗口的体内荧光成像和温度变化的成像
采用静脉注射方式对4T1肿瘤小鼠注射IR-FE-Fc@DSPE-PEG和IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(10mg/kg)。在注射后的不同时间点(0h、2h、4h、8h、12h、24h和48h),分别用普林斯顿仪器公司的NIRvana-640获得小鼠的荧光成像。激发光由光纤耦合的808nm二极管激光器(RMPC)提供,功率密度为140mW/cm2;发射光使用900nm和1100nm的长通滤波器(Thorlabs)进行过滤,并聚焦到探测器上。注射24h后,收集主要器官并进行成像。在注射后24h,还在肿瘤生长的位置用808nm的激光照射小鼠10min,用红外热成像设备测量肿瘤温度。以PBS处理的小鼠的肿瘤温度作为对照组。
图14为4T1肿瘤携带小鼠的体内荧光和红外热成像结果图,其中a为注射IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG和IR-FE-Fc@DSPE-PEG后不同时间的4T1肿瘤携带小鼠的NIR-II荧光图像以及24h收集的小鼠肿瘤和主要器官的代表性荧光图像(808nm激发下发射滤光片;b为肿瘤的相应FL强度图(误差条:平均值±SD,n=3);c为静脉注射IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG和IR-FE-Fc@DSPE-PEG 24h后,用808nm照射(1.0W/cm2,10min)处理4T1肿瘤的小鼠的光热图像(误差条:平均值±SD,n=3);d为小鼠脏器荧光值图,e为小鼠光热数值图。
本测试例中基于体外肿瘤细胞的选择性和明亮的NIR-II荧光,将IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG注射到4T1肿瘤小鼠的血液循环***中,结果显示,尾静脉注射IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG后,肿瘤区域的荧光信号随着时间的推移明显增加(图14中的a和b),最终在24h达到平稳。由于循环时间长,高渗透长滞留(EPR)效应增强,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG可以有效地在肿瘤组织中积累,通过体外器官成像可以评估注射的荧光剂的生物分布情况。如图14中的b所示,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG显示出比IR-FE-Fc@DSPE-PEG高约1倍的肿瘤积累,表明IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG可以实现选择性的GSH降解并富集在肿瘤区域。这一体内成像结果与体外肿瘤细胞摄取实验一致。然而,小鼠全身的荧光成像数据也显示,一部分IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG被夹在肝脏和肾脏中(图14中的a和d),这可以归因于单核吞噬细胞***(MPS)对纳米颗粒的清除。
为了研究NIR-II分子光热平台介导的光热效应在体内的影响,根据体内成像数据,在IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG注射后24h进行808nm激光(1.0W/cm2)照射10min,结果显示PBS处理的小鼠的肿瘤温度上升到37.9℃左右,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG处理的小鼠的肿瘤温度上升到52.3℃左右,IR-FE-Fc@DSPE-PEG处理的小鼠的温度上升到50.0℃(图14中的c和e),说明这些分子光热剂在体内具有良好的光热效应,这意味着有效的局部温度升高加速了血流,提高了肿瘤部位的含氧量,较高的温度通过热辐射效应增加了能量。由于活体组织的散热,与体外光热试验相比,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG组的最高光热温度维持在52.3℃左右。
2、体内抗肿瘤治疗以及生物化学分析
2.1体内抗肿瘤治疗
肿瘤小鼠随机分为8组,具体为静脉注射PBS、PBS(含激光)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(10mg/kg)、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(含激光,10mg/kg)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(10mg/kg)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(含激光,10mg/kg)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(10mg/kg)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(含激光,10mg/kg),其中辐照组在肿瘤生长位置接受功率为1.0W/cm2的808nm激光照射10min。用游标卡尺测量肿瘤,体积计算公式为V=(L×W2)/2,其中L和W分别为肿瘤的长度和宽度。此外,对每组小鼠的体重进行14天的跟踪。治疗14天后,所有小鼠被处死,收集肿瘤,用多聚甲醛固定,嵌入石蜡,切片,用苏木精-伊红(H&E)、TUNEL、caspase-3、GPX4、HSP70、γ-H2AX和Ki-67染色,并通过Pannoramic DESK、P-MIDI、P250、P1000(3D HISTECH,HUN)观察。正常器官(肝脏、肺脏、脾脏、心脏和肾脏)的组织也在14天时按照上述相同的程序分别进行病理学分析。
图15为体内抗肿瘤效率结果图,其中a为基于IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的PTT-CDT联合疗法抑制4T1皮下模型的肿瘤进展的示意图;b为治疗后各组肿瘤大小图,其中I对应组别PBS-L,II对应组别PBS+L,III对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L,IV对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG+L,V对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG-L,VI对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG+L,VII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L,VIII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L;c为治疗期间的相对肿瘤体积(误差条:平均值±SD,n=4);c为治疗期间相应的肿瘤生长曲线;d为治疗期间体重变化;e为治疗14天后的平均肿瘤重量;f为治疗14天后解剖肿瘤组织的H&E、Ki-67、Caspase-3、TUNEL、γ-H2AX、GPX4和HSP70染色图像,其中I对应组别PBS-L,II对应组别PBS+L,III对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L,IV对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG+L,V对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG-L,VI对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG+L,VII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L,VIII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L。
2.2IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的生物化学分析
健康BALB/c小鼠分别静脉注射PBS、IR-FE@DSPE-S-S-PEG(10mg/kg)、IR-FE-Fc@DSPE-PEG(10mg/kg)、IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(10mg/kg),注射14天后收集小鼠的血液进行生化分析,并对切除的主要器官(心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏)进行H&E染色,观察其形态变化。
本测试例对携带4T1肿瘤的小鼠进行体内治疗,具体是在第0天,注射光热剂并进行治疗,每隔一天测量体重和肿瘤体积,直到第14天(图15中的a),同时生成肿瘤生长曲线(图15中的c)。根据图15中的b、c和e可知,IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L组的肿瘤生长很快,其大小几乎与PBS组相当,这意味着IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L组几乎没有治疗效果。然而,由于缺乏近红外相关的治疗优势,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L和IR-FE-Fc@DSPE-PEG-L组的最终肿瘤抑制效果仍不如激光组,这表明光热触发的治疗过程在体内具有较好的适用性;而IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L组显示了明显的抗肿瘤效果,完全抑制了肿瘤的生长;IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L组比IR-FE-Fc@DSPE-PEG-L组和IR-FE@DSPE-S-S-PEG+L组表现出更优越的肿瘤抑制效果。这些体内实验结果也证实了DSPE-S-S-PEG在体内实验中改善了肿瘤的积累,取得了良好的治疗效果(图14中的d,图15中的e)。同时,CDT和PTT的协同作用比单一PTT或单一CDT的效率更高。在肿瘤重量分析中也进一步发现了类似的趋势(图15中的e)。所有小鼠的相对体重在治疗期间都没有受到影响,这表明这些分子光热剂没有毒性(图15中的d)。
为了进一步研究分子光热剂的治疗活性,本测试例提取了肿瘤组织进行组织学检查。如图15中的f所示,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG、IR-FE-Fc@DSPE-PEG和IR-FE@DSPE-S-S-PEG+L组,根据H&E染色组织中死细胞腔的增加情况,显示出比其他制剂更有效的治疗效果,同时在TUNEL(绿色荧光信号)和casepase-3(红色荧光信号)染色的肿瘤切片中,有更强的凋亡标记。此外,Ki-67(棕色和黄色信号)的表达呈下降趋势,这表明明显的严重凋亡和明显抑制了肿瘤细胞的增殖能力。同时,与对照组相比,激光照射组的HSP70(红色荧光信号)和γ-H2AX(绿色荧光信号)的表达水平已经上升了。这表明近红外激活的光热效应可以增加HSP70的表达,而光热激活的铁还原作用可以通过严重的DNA损伤来破坏肿瘤细胞。同时,GPX4(红色荧光信号)的表达在不同的组别中被下调,证明了光热激活铁死亡的治疗机制。
图16为各个实验组的血液生化指标和HE染色图,其中a为各个实验组的血液生化指标,b为HE染色图。由图16可知,所有组别在血液和H&E染色图像的生化分析中没有发现明显的改变。
综上所述,本测试例中组织学分析结果与之前的细胞毒性和细胞凋亡结果一致,充分证明分子光疗平台IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG可以通过局部近红外照射在体内有效激活,从而使PTT-CDT联合治疗产生强大的肿瘤抑制作用并提高生存效益。值得注意的是,所有组别在血液和H&E染色图像的生化分析中没有发现明显的改变(图16)。这些结果表明,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG可以作为一种优异的生物相容性光热剂,用于成像引导的PTT-CDT联合治疗。
3、免疫效果的评价
采用不同治疗方法对小鼠进行处理,然后处死小鼠并分离出脾脏以制作单细胞悬液。然后用小鼠器官组织淋巴细胞分离液试剂盒分离淋巴细胞,接着用APC-CD3、PE-CD8和FITC-CD4抗体进行染色,用流式细胞仪(BD LSRFortessa,美国)测定实验组中CD8+和CD4+T细胞的比例。同时,使用APC-Foxp3和FITC-CD4抗体,通过流式细胞仪(BD LSRFortessa,美国)确定实验组中Foxp3的比例,程序相同。为了在治疗结束后测量IL-6、IL-10和IFN-γ,小鼠被处死后收集血液,使用ELISA试剂盒检测IL-6、IL-10和IFN-γ。治疗14天后,处死所有小鼠,收集肿瘤和脾脏,用多聚甲醛固定,嵌入石蜡,切片,用Treg、CD4和CD8抗体染色,通过Pannoramic DESK、P-MIDI、P250、P1000(3D HISTECH,HUN)观察。此处相关操作严格按照商业购买的提取和检测试剂进行。
图17为免疫效果评价结果图,其中,a为流式细胞仪检测4T1肿瘤小鼠脾脏中的T细胞(CD3+/CD4+或CD3+/CD8+,n=3)结果图,其中I对应组别PBS-L,II对应组别PBS+L,III对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG-L,IV对应组别IR-FE@DSPE-S-S-PEG+L,V对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG-L,VI对应组别IR-FE-Fc@DSPE-PEG+L,VII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG-L,VIII对应组别IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L;b为a中相对应的定量测试结果图(误差条:平均值±SD,n=3);c为不同处理后用ELISA试剂盒分析4T1肿瘤携带的BALB/c小鼠(n=3)血液中的IFN-γ、IL-6和IL-10水平检测结果图;d为肿瘤组织样本在CD4和CD8染色后的代表图像;e为脾脏样本在CD4和CD8染色后的代表图像。
大量的报道表明,肿瘤逃避免疫识别和肿瘤介导的抗肿瘤免疫的抑制会对癌症治疗造成巨大障碍。因此,探索先进的抗肿瘤免疫疗法是目前亟需解决的问题。增强的化学动力学疗法与高热疗法协同,可以通过诱导免疫原性细胞死亡(ICD)来激活抗肿瘤免疫反应,然后经过DCs的成熟和表达过程,可以刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的增殖,杀死肿瘤细胞。该过程中会分泌较多的INF-γ,可以抑制细胞GSH的产生。
为了深入研究分子光热平台IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG诱导的免疫效应,本测试例首先测量高迁移率族蛋白1(HMGB1)和钙调蛋白(CRT),以评估IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG诱导的ICD效果。图18为各个实验组肿瘤和脾脏的HMGB1和钙调蛋白(CRT)图。如图18所示,ICD相关的分子在所有激光组中都有明显的释放,显示出强大的ICD效应,这将通过刺激免疫***来抑制肿瘤的生长。此外,本测试例评估了IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG对4T1肿瘤携带的BALB/c小鼠的脾脏和肿瘤组织中辅助性CD4+T、细胞毒性CD8+T和Tregs(Foxp3+)水平的调节能力。脾脏是最大的免疫器官,占人体总淋巴组织的25%。它含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞,是细胞免疫和体液免疫的中心,通过各种机制发挥抗肿瘤作用。因此,用流式细胞仪测定各组小鼠脾脏提取物中CD4+和CD8+T细胞的比例,如图17中的a和b所示,与PBS组相比,注射IR-FE@DSPE-S-S-PEG、IR-FE-Fc@DSPE-PEG和IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG(有激光组)的小鼠脾脏,都观察到辅助性CD4+T细胞和细胞毒性CD8+T细胞水平升高,特别是IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L组表现得最高。此外,本测试例还通过免疫荧光染色测量肿瘤和脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞的表达。如图17中的d和e所示,IR-FE@DSPE-S-S-PEG、IR-FE-Fc@DSPE-PEG和IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG组的CD4+T细胞(绿色荧光信号)和CD8+T细胞(红色荧光信号)瘤内浸润均高于PBS组。这些结果表明,协同的CDT-PTT疗法增强了抗肿瘤免疫反应。
图19为各个实验组肿瘤和脾脏的CD4+/Foxp3+图;图20为IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的溶血实验图。
本测试例中,与PBS组相比,注射IR-FE@DSPE-S-S-PEG、IR-FE-Fc@DSPE-PEG和IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG的小鼠(含激光组)的Tregs(CD4+/Foxp3+)数量相比其他小鼠有所减少,尤其是IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L组的减少幅度最大(图17中的b,图19)。肿瘤和脾脏中Tregs的表达(棕色和黄色信号)也通过免疫组化染色进行测量。如图20所示,IR-FE@DSPE-S-S-PEG、IR-FE-Fc@DSPE-PEG和IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG组的Tregs数量与PBS组相比有所减少。这些结果表明,免疫抑制的微环境可以通过协同CDT-PTT治疗得到改善。
随着DCs的成熟,一些炎症细胞因子标志物会发生改变,如IFN-γ、IL-6和IL-10,它们可以诱导T细胞进行免疫介导的肿瘤杀伤。IFN-γ在T细胞激活和适应性免疫反应的建立中起着关键作用。此外,INF-γ已被证明可抑制细胞GSH的产生,这有利于铁蛋白的产生。在轻度热疗期间,肿瘤细胞将对铁蛋白的产生更加敏感,这对化学动力疗法是有利的。化学动力疗法与高热疗法协同作用,可以促进肿瘤免疫微环境的激活,导致更高的INF-γ产生,形成“闭环”治疗策略。白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10)是重要的多态性免疫调节细胞因子,在宿主防御中发挥着重要作用。因此,通过ELISA分析,测量促炎性细胞因子(IFN-γ、IL-6)和抗炎因子(IL-10)的表达水平(图17中的c),结果显示,与其他组相比,激光照射组趋向于增强IFN-γ和IL-6的分泌,IL-10的分泌在所有的激光照射组中都显示出下降的趋势,其中,具体是在IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG+L组中出现了最大的上升和下降。综上所述,这些结果与上述免疫激活结果一致,干扰素γ(IFN-γ)和促炎性IL-6通过协同CDT-PTT治疗得到改善,相反,抗炎因子(IL-10)在协同CDT-PTT治疗后下降。
由以上实施例以及测试例可知,本发明提供了一种生物相容的NIR-II分子光疗平台(IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG),可以用于荧光成像引导的CDT-PTT联合癌症治疗,其中,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG不仅在肿瘤区域表现出明显的摄取作用,并通过分解在肿瘤区域释放IR-FE-Fc,而且使IR-FE-Fc催化分解肿瘤微环境中的内源性H2O2并形成·OH;更重要的是,在激光照射下,IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG表现出良好的光热特性,可以进一步增强GSH耗竭和·OH生成;同时,协同CDT-PTT治疗可以激活免疫***。体外和体内实验都证实了IR-FE-Fc@DSPE-S-S-PEG对4T1细胞和4T1肿瘤携带小鼠具有显著治疗效果,这为癌症治疗的荧光成像监测协同增强CDT提供了一个很好的策略。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述叠氮化反应的温度为65~75℃,时间为2.5~3.5h。
4.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述叠加环化反应的温度为15~35℃,时间为25~35min。
5.一种IR-FE-Fc自组装纳米材料,由权利要求1所述化合物IR-FE-Fc与磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基经自组装得到。
6.根据权利要求5所述的IR-FE-Fc自组装纳米材料,其特征在于,所述化合物IR-FE-Fc与磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基的质量比为1:(4.5~5.5)。
7.权利要求5或6所述IR-FE-Fc自组装纳米材料的制备方法,包括以下步骤:
将化合物IR-FE-Fc、磷脂-二硫键-聚乙二醇-羧基、有机溶剂与水混合,经自组装处理,得到IR-FE-Fc自组装纳米材料。
8.权利要求5~6任一项所述IR-FE-Fc自组装纳米材料或权利要求7所述制备方法制备得到的IR-FE-Fc自组装纳米材料在制备治疗癌症药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述癌症包括肺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、食管癌、胃癌、***、卵巢癌、乳腺癌或黑色素瘤。
10.一种治疗癌症的药物,活性成分为权利要求5~6任一项所述IR-FE-Fc自组装纳米材料或权利要求7所述制备方法制备得到的IR-FE-Fc自组装纳米材料。
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