CN116178375A - 一种***并嘧啶化合物及其合成方法和应用 - Google Patents
一种***并嘧啶化合物及其合成方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种***并嘧啶化合物及其合成方法和应用,本发明涉及化合物合成技术领域。该方法包括以下步骤:将3‑氨基‑1,2,4‑三氮唑和丙酰乙酸乙酯混合于冰乙酸中,反应,制得白色固体;溶于三氯氧磷中,搅拌反应,制得红棕色固体粗品;溶于N,N‑二甲基甲酰胺中,加入4‑硝基苯硫酚和碳酸钾,搅拌反应,制得淡黄色固体;溶于乙酸乙酯中,加入钯碳,反应,制得淡黄色固体粗品;溶于N,N‑二甲基甲酰胺中,加入对氯苯氧乙酸、HATU和DIPEA,搅拌反应,制得***并嘧啶化合物。本发明提供的方法简单便捷,只需要五个步骤即可合成出目标产物,该产物具有抗***癌效果,可应用于相关的生物医学领域药物研发。
Description
技术领域
本发明涉及化合物合成技术领域,具体涉及一种***并嘧啶化合物及其合成方法和应用。
背景技术
***并嘧啶类化合物由于分子结构中具有***和嘧啶这两类重要的活性单元,因而具有广泛的生物活性,受到人们的长期关注,***并嘧啶类化合物主要应用于农业领域,通常被作为除草剂,抗菌剂使用;此外,***并嘧啶类化合物还具有治疗心血管疾病的作用。然而,现有的***并嘧啶类化合物合成方法步骤繁琐,经济性不高,没有在抗肿瘤方面的应用,因此,迫切需要开发一种新的***并嘧啶类化合物合成方法。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明的目的是提供一种***并嘧啶化合物的合成方法,以解决现有***并嘧啶类化合物合成方法步骤繁琐,经济性不高的问题;并将其应用到抗***癌药物制备中。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:提供一种***并嘧啶化合物的合成方法,包括以下步骤:
(1)将3-氨基-1,2,4-三氮唑和丙酰乙酸乙酯混合于冰乙酸中,于110-130℃条件下搅拌反应5-7h,然后冷却至室温,再析晶、减压抽滤、洗涤和真空干燥,制得白色固体,即5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮;
(2)将步骤(1)制得的白色固体溶于三氯氧磷中,于80-100℃条件下搅拌反应3-5h,然后冷却至室温,倒入冰水中搅拌,再进行萃取、洗涤、干燥和减压浓缩,制得红棕色固体粗品,即7-氯-5-乙基-[1,2,4]***[1,5-a]嘧啶;
(3)将步骤(2)制得的红棕色固体粗品溶于N,N-二甲基甲酰胺中,加入4-硝基苯硫酚和碳酸钾,于50-70℃条件下搅拌反应1.5-2.5h,然后冷却至室温,加水稀释,再进行萃取、洗涤、干燥、减压浓缩和纯化,制得淡黄色固体,即5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶;
(4)将步骤(3)制得的淡黄色固体溶于乙酸乙酯中,加入钯碳,于室温条件下反应,然后过滤和减压浓缩,制得淡黄色固体粗品,即4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺;
(5)将步骤(4)制得的淡黄色固体粗品溶于N,N-二甲基甲酰胺中,加入对氯苯氧乙酸、HATU和DIPEA,于室温条件下搅拌反应8-12h,然后减压浓缩,加水稀释溶解,再进行萃取、洗涤、干燥、减压浓缩和纯化,制得***并嘧啶化合物,即2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺。
本发明的有益效果为:本发明发现了一种化合物(2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺)(#46-4)的新的合成方法,该方法具有合成步骤少,经济高效的优点;本发明制得的化合物具有较好的抗肿瘤活性,在体外培养肿瘤细胞中,能抑制肿瘤细胞增殖,导致肿瘤细胞内活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)上升,进而导致细胞死亡,此外,该化合物对正常细胞毒性较小,具有开发成抗肿瘤药物的潜力。
进一步,***并嘧啶化合物的合成方法如下:
在上述技术方案的基础上,本发明还可以做如下改进:
进一步,步骤(1)中,3-氨基-1,2,4-三氮唑、丙酰乙酸乙酯和冰乙酸的质量体积比为400-450mg:700-750mg:4-6mL。
进一步,步骤(1)中,搅拌条件下加入乙酸乙酯和石油醚的混合溶液进行析晶。
进一步,步骤(1)中,冰乙酸和混合溶液的体积比为1:2.8-3.2。
进一步,混合溶液中乙酸乙酯和石油醚的体积比为1:1.8-2.2。
进一步,步骤(1)中,采用体积比为1:1.8-2.2乙酸乙酯和石油醚的混合溶液进行洗涤。
进一步,步骤(2)中,白色固体和三氯氧磷的质量体积比为500-550mg:8-12mL。
进一步,步骤(2)中,氮气保护下,于80-100℃条件下搅拌反应3-5h。
进一步,步骤(2)中,倒入冰水中搅拌5-15min。
进一步,步骤(2)中,冰水体积为反应液体积的9-11倍。
进一步,步骤(2)中,采用二氯甲烷萃取2-3次。
进一步,步骤(2)中,将萃取后的有机相合并,依次采用水和饱和食盐水进行洗涤。
进一步,步骤(2)中,采用无水硫酸钠干燥。
进一步,步骤(2)中,干燥后去除干燥剂,再减压浓缩。
进一步,步骤(3)中,红棕色固体粗品、4-硝基苯硫酚、碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔体积比为0.8-1.2mmol:1-1.5mmol:1.8-2.2mmol:4-6mL。
进一步,步骤(3)中,加水稀释为原体积的5-6倍。
进一步,步骤(3)中,采用乙酸乙酯萃取2-3次。
进一步,步骤(3)中,将萃取后的有机相合并,依次采用氢氧化钠溶液、水和饱和食盐水进行洗涤。
进一步,氢氧化钠溶液的浓度为0.8-1.2mol/L。
进一步,步骤(3)中,采用无水硫酸钠干燥。
进一步,步骤(3)中,干燥后去除干燥剂再减压浓缩。
进一步,步骤(3)中,采用柱层析进行纯化。
进一步,步骤(4)中,淡黄色固体、钯碳和乙酸乙酯的质量体积比为150-200mg:40-60mg:5-10mL。
进一步,步骤(4)中,在氢气气氛中进行反应。
进一步,步骤(4)中,采用硅藻土过滤。
进一步,步骤(5)中,淡黄色固体粗品、对氯苯氧乙酸、HATU和DIPEA和N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为120-150mg:100-110mg:200-250mg:100-150mg:3-6mL。
进一步,步骤(5)中,采用二氯甲烷萃取2-3次。
进一步,步骤(5)中,将萃取后的有机相合并,采用饱和食盐水进行洗涤。
进一步,步骤(5)中,采用无水硫酸钠干燥。
进一步,步骤(5)中,干燥后去除干燥剂再减压浓缩。
进一步,步骤(5)中,采用柱层析进行纯化。
本发明还提供上述***并嘧啶化合物的合成方法合成的***并嘧啶化合物。
本发明还提供上述***并嘧啶化合物在抗***癌药物制备方面的应用。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明提供的方法简单便捷,只需要五个步骤即可合成出目标产物,具有简单高效的特点,经济高效的合成(2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺)(#46-4)。
2、本发明中提及的化合物具有抗***癌效果,可应用与相关的生物医学领域药物研发,用于***癌的治疗,或作为前体分子开发抗***癌药物。
附图说明
图1为实施例1制得的#46-4抑制***癌细胞PC3增殖图;
图2为实施例1制得的#46-4对***癌细胞PC3的半数抑制浓度;
图3为实施例1制得的#46-4抑制***癌细胞PC3克隆形成图;
图4为实施例1制得的#46-4对正常***细胞PNT1A细胞毒性实验图;
图5为实施例1制得的#46-4抑制***癌细胞PC3增殖图;
图6为实施例1制得的#46-4抑制细胞增殖信号通路图;
图7为实施例1制得的#46-4诱导细胞产生活性氧图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1:
一种***并嘧啶化合物,其合成方法包括以下步骤:
(1)制备5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮(3)
将商业购买的3-氨基-1,2,4-三氮唑(1,420mg,5mmol)和丙酰乙酸乙酯(2,720mg,5mmol)混合于5mL的冰乙酸中,于120℃条件下搅拌反应6h,反应完全后,将反应液冷却至室温,搅拌下缓慢加入乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比1:2,15mL),进行析晶,减压抽滤收集析出来的固体、并用少量乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比1:2)洗涤滤饼,滤饼经真空干燥,制得白色固体,即5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮(574mg,收率70%);1H-NMR(400Hz,DMSO-d6):δ13.18(s,1H),8.21(s,1H),5.85(s,1H),2.61(q,J=7.5Hz,2H),1.23(t,J=7.5Hz,3H);
(2)制备7-氯-5-乙基-[1,2,4]***[1,5-a]嘧啶(4)
将步骤(1)制得的白色固体(3,516mg,3.1mmol)溶于10mL三氯氧磷中,氮气保护下,于90℃条件下搅拌反应4h,反应完全后,将反应液冷却至室温,缓慢倒入10倍体积的冰水中并搅拌10min,然后用二氯甲烷萃取2次,合并萃取所得有机相,经水和饱和食盐水洗涤,用无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,滤液经减压浓缩,制得红棕色固体粗品(179mg,收率32%),即7-氯-5-乙基-[1,2,4]***[1,5-a]嘧啶;
(3)制备5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶(6)
将步骤(2)制得的红棕色固体粗品(4,1mmol)溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入4-硝基苯硫酚(5,182mg,1.2mmol)和碳酸钾(270mg,2mmol),于60℃条件下搅拌反应2h,反应完全后,将反应液冷却至室温,加水稀释为原体积的5倍,用乙酸乙酯萃取2次,合并萃取所得有机层,经1mol/L氢氧化钠水溶液、水和饱和食盐水洗涤后,用无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,减压浓缩滤液,残余物经柱层析纯化,制得淡黄色固体(186mg,收率62%),即5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶;1H-NMR(400Hz,DMSO-d6):δ8.67(s,1H),8.39(d,J=8.8Hz,2H),8.01(d,J=8.8Hz,2H),6.69(s,1H),2.78(q,J=7.5Hz,2H),1.19(t,J=7.5Hz,3H);
(4)制备4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺(7)
将步骤(3)制得的淡黄色固体(6,180mg,0.6mmol)溶于8mL的乙酸乙酯中,加入钯碳(50mg),于氢气气氛中,室温条件下反应反应完全后,垫硅藻土过滤,滤液经减压浓缩,制得淡黄色固体粗品(160mg,收率98%),即4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺;
(5)制备2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺(#46-4)
将步骤(4)制得的淡黄色固体粗品(140mg,0.5mmol)溶于4mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入对氯苯氧乙酸(107mg,0.6mmol)、HATU(237mg,0.6mmol)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺,130mg,1mmol),于室温条件下搅拌反应10h,反应完全后,减压浓缩除去溶剂N,N-二甲基甲酰胺,加水稀释溶解残余物,用二氯甲烷萃取2次,合并萃取所得有机层,经饱和食盐水洗涤后,用无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,减压浓缩滤液,残余物经柱层析纯化,制得淡黄色固体(69mg,收率31%),即***并嘧啶化合物2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺。
实施例2:
一种***并嘧啶化合物,其合成方法包括以下步骤:
(1)制备5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮(3)
将商业购买的3-氨基-1,2,4-三氮唑(1,400mg)和丙酰乙酸乙酯(2,700mg)混合于4mL的冰乙酸中,于110℃条件下搅拌反应7h,反应完全后,将反应液冷却至室温,搅拌下缓慢加入乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比1:1.8,11.2mL),进行析晶,减压抽滤收集析出来的固体、并用少量乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比1:1.8)洗涤滤饼,滤饼经真空干燥,制得白色固体,即5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮;1H-NMR(400Hz,DMSO-d6):δ13.18(s,1H),8.21(s,1H),5.85(s,1H),2.61(q,J=7.5Hz,2H),1.23(t,J=7.5Hz,3H);
(2)制备7-氯-5-乙基-[1,2,4]***[1,5-a]嘧啶(4)
将步骤(1)制得的白色固体(3,500mg)溶于8mL三氯氧磷中,氮气保护下,于80℃条件下搅拌反应5h,反应完全后,将反应液冷却至室温,缓慢倒入9倍体积冰水中并搅拌5min,然后用二氯甲烷萃取2次,合并萃取所得有机相,经水和饱和食盐水洗涤,用无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,滤液经减压浓缩,制得红棕色固体粗品,即7-氯-5-乙基-[1,2,4]***[1,5-a]嘧啶;
(3)制备5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶(6)
将步骤(2)制得的红棕色固体粗品(4,0.8mmol)溶于4mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入4-硝基苯硫酚(5,1mmol)和碳酸钾(1.8mmol),于50℃条件下搅拌反应2.5h,反应完全后,将反应液冷却至室温,加水稀释为原体积的6倍,用乙酸乙酯萃取2-3次,合并萃取所得有机层,经0.8mol/L氢氧化钠水溶液、水和饱和食盐水洗涤后,用无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,减压浓缩滤液,残余物经柱层析纯化,制得淡黄色固体,即5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶;1H-NMR(400Hz,DMSO-d6):δ8.67(s,1H),8.39(d,J=8.8Hz,2H),8.01(d,J=8.8Hz,2H),6.69(s,1H),2.78(q,J=7.5Hz,2H),1.19(t,J=7.5Hz,3H);
(4)制备4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺(7)
将步骤(3)制得的淡黄色固体(6,150mg)溶于5mL的乙酸乙酯中,加入钯碳(40mg),于氢气气氛中,室温条件下反应反应完全后,垫硅藻土过滤,滤液经减压浓缩,制得淡黄色固体粗品,即4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺;
(5)制备2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺(#46-4)
将步骤(4)制得的淡黄色固体粗品(120mg)溶于3mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入对氯苯氧乙酸(100mg)、HATU(200mg)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺,100mg),于室温条件下搅拌反应8h,反应完全后,减压浓缩除去溶剂N,N-二甲基甲酰胺,加水稀释溶解残余物,用二氯甲烷萃取2次,合并萃取所得有机层,经饱和食盐水洗涤后,用无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,减压浓缩滤液,残余物经柱层析纯化,制得淡黄色固体,即***并嘧啶化合物2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺。
实施例3:
一种***并嘧啶化合物,其合成方法包括以下步骤:
(1)制备5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮(3)
将商业购买的3-氨基-1,2,4-三氮唑(1,450mg)和丙酰乙酸乙酯(2,750mg)混合于6mL的冰乙酸中,于130℃条件下搅拌反应5h,反应完全后,将反应液冷却至室温,搅拌下缓慢加入乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比为1:2.2,19.2mL),进行析晶,减压抽滤收集析出来的固体、并用少量乙酸乙酯/石油醚混合溶液(体积比为1:2.2)洗涤滤饼,滤饼经真空干燥,制得白色固体,即5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮;1H-NMR(400Hz,DMSO-d6):δ13.18(s,1H),8.21(s,1H),5.85(s,1H),2.61(q,J=7.5Hz,2H),1.23(t,J=7.5Hz,3H);
(2)制备7-氯-5-乙基-[1,2,4]***[1,5-a]嘧啶(4)
将步骤(1)制得的白色固体(3,550mg)溶于12mL三氯氧磷中,氮气保护下,于100℃条件下搅拌反应3h,反应完全后,将反应液冷却至室温,缓慢倒入11倍体积冰水中并搅拌10min,然后用二氯甲烷萃取3次,合并萃取所得有机相,经水和饱和食盐水洗涤,用无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,滤液经减压浓缩,制得红棕色固体粗品,即7-氯-5-乙基-[1,2,4]***[1,5-a]嘧啶;
(3)制备5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶(6)
将步骤(2)制得的红棕色固体粗品(4,1.2mmol)溶于6mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入4-硝基苯硫酚(5,1.5mmol)和碳酸钾(2.2mmol),于70℃条件下搅拌反应1.5h,反应完全后,将反应液冷却至室温,加水稀释为原体积的6倍,用乙酸乙酯萃取3次,合并萃取所得有机层,经1.2mol/L氢氧化钠水溶液、水和饱和食盐水洗涤后,用无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,减压浓缩滤液,残余物经柱层析纯化,制得淡黄色固体,即5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶;1H-NMR(400Hz,DMSO-d6):δ8.67(s,1H),8.39(d,J=8.8Hz,2H),8.01(d,J=8.8Hz,2H),6.69(s,1H),2.78(q,J=7.5Hz,2H),1.19(t,J=7.5Hz,3H);
(4)制备4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺(7)
将步骤(3)制得的淡黄色固体(6,200mg)溶于10mL的乙酸乙酯中,加入钯碳(60mg),于氢气气氛中,室温条件下反应反应完全后,垫硅藻土过滤,滤液经减压浓缩,制得淡黄色固体粗品,即4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺;
(5)制备2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺(#46-4)
将步骤(4)制得的淡黄色固体粗品(150mg)溶于6mL的N,N-二甲基甲酰胺中,加入对氯苯氧乙酸(110mg)、HATU(250mg)和DIPEA(N,N-二异丙基乙胺,150mg),于室温条件下搅拌反应12h,反应完全后,减压浓缩除去溶剂N,N-二甲基甲酰胺,加水稀释溶解残余物,用二氯甲烷萃取3次,合并萃取所得有机层,经饱和食盐水洗涤后,用无水硫酸钠干燥,过滤除去干燥剂,减压浓缩滤液,残余物经柱层析纯化,制得淡黄色固体,即***并嘧啶化合物2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺。
试验例
将实施例1制得的***并嘧啶化合物2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺,即#46-4,按照如下方法进行性能检测。
一、抑制***癌细胞PC3增殖
将PC3细胞计数按3000个细胞/每孔,接种入96孔板中,接种24h后,分别加入1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L的小分子化合物#46-4和等体积的DMSO,采用高内涵分析***,对各孔细胞进行拍照;然后将培养板置于37℃、5%CO2培养箱中,培养24h,再次用高内涵分析***再次对同一位置进行拍照,结果见图1。
由图1可知,#46-4具有抑制***癌细胞增殖的能力,且具有剂量依赖性。
将***癌细胞PC3按3000个/孔接种于96孔板中,将细胞置于CO2细胞培养箱中(37℃,5%CO2)培养过夜。实验组分别加入0.08μmol/L、0.16μmol/L、0.32μmol/L、0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的小分子化合物#46-4,对照组加入等体积的DMSO,继续培养48h后,每孔加入20μL MTT溶液,放入细胞培养箱继续孵育4h,弃去培养液,加入200μL DMSO,将细胞培养板置于摇床上使结晶充分溶解(室温下180rpm振摇10min)。用酶标仪(BioTek Cytation5)读取570nm出OD值,然后按下列公式计算细胞抑制率, 再利用GraphpadPrism 8做出#46-4浓度与相应细胞抑制率的柱状图,并计算出半数抑制浓度(IC50),结果见图2。
由图2可知,#46-4对***癌细胞PC3的IC50为595±8mol/L。
二、抑制***癌细胞PC3克隆形成
将PC3细胞计数,按500个细胞/每孔接种入6孔板中,接种24h后,分别加入0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L的小分子化合物#46-4和等体积的DMSO,置于37℃、5%CO2培养箱中培养7d;弃掉上清,用4%多聚甲醛固定细胞,随后用结晶紫染色30min,PBS洗涤3次,每次2min,将细胞培养板在室温晾干后,用扫描仪扫描细胞培养板,结果见图3。
由图3可知,#46-4具有抑制***癌克隆形成的能力,且具有剂量依赖性。
三、对正常***细胞PNT1A细胞毒性实验
将正常***细胞PNT1A按3000个/孔接种于96孔板中,将细胞置于CO2细胞培养箱中(37℃,5%CO2)培养过夜。实验组分别加入0.625μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的小分子化合物#46-4,对照组加入等体积的DMSO,继续培养72h后,每孔加入20μL MTT溶液,放入细胞培养箱继续孵育4h,弃去培养液,加入200μL的DMSO,将细胞培养板置于摇床上使结晶充分溶解(室温下180rpm振摇10min),采用酶标仪(BioTekCytation5)读取570nm处OD值,然后按下列公式计算细胞存活率,再利用Graphpad Prism 8做出#46-4浓度与相应细胞存活率的柱状图,结果见图4。
由图4可知,各浓度#46-4处理的正常***细胞PNT1A,其细胞存活率均不受影响,表明小分子化合物#46-4对正常***细胞毒性较小,具有较高的安全性。
四、抑制***癌细胞PC3增殖
将***癌细胞PC3按10000个/每孔接种于96孔板中,置于细胞培养箱中(37℃,5%CO2)培养过夜,然后加入小分子化合物#46-4,使其终浓度为1μmol/L、2μmol/L和3μmol/L,对照组加入等体积的DMSO,继续培养24h,后续按照说明书,使用Edu细胞增殖检测试剂盒(碧云天,C0078S)检测PC3细胞增殖,简略步骤为:加入EdU使其终浓度为10μmol/L,将细胞放入培养箱继续培养2h,去除培养液,用4%多聚甲醛在室温下固定15min,用PBS清洗细胞3次,加入通透液(含0.3% Triton X-100的PBS),室温孵育15min,配置点击反应液,室温下避光进行30min点击反应,去除反应液,用PBS清洗细胞3次,加入Hoechst 33342溶液,室温避光反应10min,去除反应液,用PBS清洗细胞3次。采用倒置荧光显微镜(Olympus,IX73)对每个孔的细胞拍照,结果见图5。
由图5可知,#46-4抑制***癌细胞PC3增殖。且呈现剂量依赖性。
五、抑制细胞增殖信号通路
将***癌细胞PC3按500000个/每孔接种于6孔板中,将细胞置于细胞培养箱中(37℃,5% CO2)培养过夜,然后加入小分子化合物#46-4,使其终浓度为1μmol/L、2μmol/L和3μmol/L,对照组加入等体积的DMSO,继续培养24h,用细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白,后续进行蛋白质免疫印迹实验,分别用Ras、c-Raf、p-c-Raf、MEK、p-MEK、Erk1/2、p-Erk1/2、tubulin抗体检测对应蛋白的表达量,结果见图6。
由图6可知,#46-4抑制细胞增殖信号通路相关蛋白质Ras、p-C-Raf、p-MEK和p-Erk1/2表达,且呈现剂量依赖性,表明#46-4在***癌细胞中抑制细胞增殖信号通路。
六、诱导细胞产生活性氧(ROS)
将***癌细胞PC3按10000个/每孔,接种于96孔板中,将细胞置于细胞培养箱中(37℃,5%CO2)培养过夜,然后加入小分子化合物#46-4,使其终浓度为1μmol/L、2μmol/L和3μmol/L,对照组加入等体积的DMSO,继续培养6h,再使用活性氧检测试剂盒(碧云天,S0033S)检测细胞中的ROS,后续按照说明书步骤操作,结果见图7。
由图7可知,#46-4诱导细胞中产生ROS,且产生ROS的细胞数量与#46-4浓度成正比。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种***并嘧啶化合物的合成方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将3-氨基-1,2,4-三氮唑和丙酰乙酸乙酯混合于冰乙酸中,于110-130℃条件下搅拌反应5-7h,然后冷却至室温,再析晶、减压抽滤、洗涤和真空干燥,制得白色固体,即5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7(4H)-酮;
(2)将步骤(1)制得的白色固体溶于三氯氧磷中,于80-100℃条件下搅拌反应3-5h,然后冷却至室温,倒入冰水中搅拌,再进行萃取、洗涤、干燥和减压浓缩,制得红棕色固体粗品,即7-氯-5-乙基-[1,2,4]***[1,5-a]嘧啶;
(3)将步骤(2)制得的红棕色固体粗品溶于N,N-二甲基甲酰胺中,加入4-硝基苯硫酚和碳酸钾,于50-70℃条件下搅拌反应1.5-2.5h,然后冷却至室温,加水稀释,再进行萃取、洗涤、干燥、减压浓缩和纯化,制得淡黄色固体,即5-乙基-7-((4-硝基苯基)硫代)-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶;
(4)将步骤(3)制得的淡黄色固体溶于乙酸乙酯中,加入钯碳,于室温条件下反应,然后过滤和减压浓缩,制得淡黄色固体粗品,即4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯胺;
(5)将步骤(4)制得的淡黄色固体粗品溶于N,N-二甲基甲酰胺中,加入对氯苯氧乙酸、HATU和DIPEA,于室温条件下搅拌反应8-12h,然后减压浓缩,加水稀释溶解,再进行萃取、洗涤、干燥、减压浓缩和纯化,制得***并嘧啶化合物,即2-(4-氯苯氧基)-N-(4-((5-乙基-[1,2,4]***并[1,5-a]嘧啶-7-基)硫代)苯基)乙酰胺。
2.根据权利要求1所述的***并嘧啶化合物的合成方法,其特征在于,步骤(1)中,3-氨基-1,2,4-三氮唑、丙酰乙酸乙酯和冰乙酸的质量体积比为400-450mg:700-750mg:4-6mL。
3.根据权利要求1所述的***并嘧啶化合物的合成方法,其特征在于,步骤(1)中,搅拌条件下加入乙酸乙酯和石油醚的混合溶液进行析晶。
4.根据权利要求1所述的***并嘧啶化合物的合成方法,其特征在于,步骤(2)中,白色固体和三氯氧磷的质量体积比为500-550mg:8-12mL。
5.根据权利要求1所述的***并嘧啶化合物的合成方法,其特征在于,步骤(3)中,红棕色固体粗品、4-硝基苯硫酚、碳酸钾和N,N-二甲基甲酰胺的摩尔体积比为0.8-1.2mmol:1-1.5mmol:1.8-2.2mmol:4-6mL。
6.根据权利要求1所述的***并嘧啶化合物的合成方法,其特征在于,步骤(4)中,淡黄色固体、钯碳和乙酸乙酯的质量体积比为150-200mg:40-60mg:5-10mL。
7.根据权利要求1所述的***并嘧啶化合物的合成方法,其特征在于,步骤(4)中,在氢气气氛中进行反应。
8.根据权利要求1所述的***并嘧啶化合物的合成方法,其特征在于,步骤(5)中,淡黄色固体粗品、对氯苯氧乙酸、HATU和DIPEA和N,N-二甲基甲酰胺的质量体积比为120-150mg:100-110mg:200-250mg:100-150mg:3-6mL。
9.权利要求1-8任一项所述的***并嘧啶化合物的合成方法合成的***并嘧啶化合物。
10.权利要求9所述的***并嘧啶化合物在抗***癌药物制备方面的应用。
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