CN116173131A - 一种开口箭总皂苷的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种开口箭总皂苷的提取方法及其应用，包括如下步骤：(1)使用10～15倍量的乙醇浸泡开口箭，回流提取，过滤，得到开口箭提取液；(2)干燥得到开口箭提取物，以水或乙醇为溶剂溶解开口箭提取物，使用大孔树脂进行吸附，梯度洗脱，收集洗脱液即得。本发明中的方法工艺简单，能够高效环保的制得开口箭总皂苷类活性物质，收率高达14.31％，含量大于65％，且具有极好的抗炎、镇痛和咽炎预防及治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物提取技术领域，特别涉及一种开口箭总皂苷的提取方法及其应用。
背景技术
开口箭(Tupistra chinensis Baker)是百合科铃兰族开口箭属植物，广泛分布于中国中西部地区。开口箭根茎入药，味甘、苦，性微凉，具有清热解毒、散瘀止痛、祛风除湿等功效。现代药理活性研究表明开口箭还具有抗肿瘤、抗炎等功效。开口箭被誉为神农架四大名药之一，民间常用于治疗咽喉肿痛、白喉、风湿痹痛、跌打损伤、胃痛、痈肿疮毒、毒蛇咬伤等。开口箭在民间作为清咽利喉药已有悠久历史，具有良好的抗炎镇痛和祛痰作用。
现有技术中已有的开口箭有效物质提取方法大多采用甲醇或稀乙醇作溶剂，提取液浓缩后，再以不同极性的溶剂反复萃取，最后用大孔吸附树脂纯化，此法选用的化学试剂较多，步骤繁琐，且总皂苷类化合物得率不高，含量较低，使得开口箭中有效成分利用率低，无法实现大批量生产。此外，现有的开口箭总皂苷提取方案中含量测定主要采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法，此法专属性不高，对三萜、植物甾醇类均能显色，使得测定结果远大于实际含量。因此，开发出一种高效环保，简单便捷地从开口箭中提取活性成份总皂苷的方法具有非常实际的意义。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供一种开口箭总皂苷的提取方法及其应用。本发明中的提取方法，以开口箭为原料，采用醇液为提取溶剂，提取的浸膏经大孔树脂纯化，得到的开口箭总皂苷提取物的收率高达14.31％，提取效果好，没有或极少化学溶剂残留，所得开口箭提取物经对甾体皂苷显色专属性更高的对茴香醛-乙酸乙酯-浓硫酸显色法测得总皂苷的含量大于65％，用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得含量大于90％。
本发明的第一个方面，提供一种开口箭总皂苷的提取方法，包括如下步骤：
(1)使用10～15倍量的乙醇浸泡开口箭，回流提取，过滤，得到开口箭提取液；
(2)干燥得到开口箭提取物，以水或乙醇为溶剂溶解开口箭提取物，使用大孔树脂进行吸附，梯度洗脱，收集洗脱液即得。
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述乙醇为50～70％的乙醇水溶液。
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述回流提取重复多次进行。
在本发明的一些实施方式中，所述回流提取的重复次数大于等于3。
在本发明的一些实施方式中，每次回流提取的时间大于等于1h。
在本发明的一些实施方式中，每次回流提取的时间为1～2h。
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述溶解在加热条件下进行，并使用超声进行辅助。
在本发明的一些实施方式中，所述加热的温度为60-90℃，以所用提取溶剂开始回流为准。
在本发明的一些实施方式中，所述超声的功率为200W，频率为40KHz。
在本发明的一些实施方式中，步骤(1)中，所述大孔树脂包括D-101大孔树脂和AB-8大孔树脂。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述梯度洗脱使用水和乙醇中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述梯度洗脱中，使用不同浓度的乙醇进行洗脱。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，所述乙醇的体积百分数为10％～95％。
在本发明的一些具体实施方式中，所述乙醇的体积百分数为10％、70％、75％和95％。
在本发明的一些实施方式中，所述吸附的方式为静置吸附。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，使用大孔树脂进行吸附时，静置吸附时间≥2小时。
在本发明的一些实施方式中，步骤(2)中，保留的洗脱液为70％～80％乙醇的洗脱液。
在本发明的一些实施方式中，所述开口箭总皂苷的提取方法具体为：
将开口箭粉碎后使用10～15倍量的50～70％的乙醇水溶液浸泡，回流提取3次以上，每次1～2h，过滤，得到开口箭提取液，干燥得到开口箭提取物，以水或10％乙醇为溶剂在加热和超声条件下溶解开口箭提取物，使用大孔树脂进行吸附，用水和/或10％～30％(v/v)、70％～80％(v/v)、95％(v/v)的乙醇梯度溶液进行梯度洗脱分离，且每一浓度洗脱3～5个保留体积；收集70％～80％(v/v)的乙醇洗脱液，即得。
本发明的第二个方面，提供一种开口箭总皂苷的定量方法，包括如下步骤：
向样品中以此加入乙酸乙酯、对茴香醛-乙酸乙酯溶液和浓硫酸-乙酸乙酯溶液，50～70℃水浴15～25min，冷却后在420～440nm波长下测定吸光度，基于标准曲线，计算样品中的开口箭总皂苷含量。
在本发明中，采用对茴香醛-乙酸乙酯-浓硫酸显色法进行含量测定，此法专属性强，测定结果更准确。而且，区别于现有技术，本发明还指认和归属了开口箭总皂苷中的几个主要的皂苷类化合物，得到了开口箭总皂苷的指纹图谱。
在本发明的一些实施方式中，所述标准曲线是基于皂苷对照品在420～440nm波长测得的，所述皂苷对照品包括薯蓣皂苷对照品和开口箭皂苷对照品。
本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述提取方法提取得到的开口箭总皂苷在制备如下(1)～(3)中至少一种功能的产品中的应用
(1)抗炎；
(2)镇痛；
(3)预防和/或治疗咽炎。
在本发明的一些实施方式中，所述咽炎包括急性咽炎。
在本发明中，发明人验证发现了开口箭总皂苷能够有效预防和治疗咽炎，并通过急性咽炎小鼠模型验证了其高效优异的治疗效果，以及体内使用的安全性。
本发明的有益效果是：
1.本发明提出了一种开口箭总皂苷的提取方法及其应用，通过该方法得到的开口箭总皂苷提取物的收率高达14.31％，提取效果好，没有或极少化学溶剂残留，提取物经过发明人改进的对茴香醛-乙酸乙酯-浓硫酸显色法测得开口箭总皂苷的含量大于65％，实现了工艺简单、高品质且高效环保的开口箭总皂苷类活性成分的制备。
2.对本发明中得到的开口箭总皂苷中9个主要皂苷类化合物进行了指认和归属，产品总皂苷含量高，主要活性成分明确，且经过验证其能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO，具有较好的体外抗炎效果；经小鼠耳肿胀实验表明其能有效抑制角叉菜胶诱导的小鼠足肿胀程度，具有抗炎作用；经小鼠醋酸扭体实验表明其能显著延长小鼠扭体反应的潜伏期，减少扭体反应次数，具有镇痛作用；经急性咽炎大鼠实验表明其能改善急性咽炎大鼠的症状和体征，维持大鼠咽黏膜的完整性，具有治疗急性咽炎的作用。可广泛应用于医药、保健食品及化妆品等领域。
附图说明
图1为本发明实施例中的开口箭总皂苷的MTT实验结果。
图2为本发明实施例中的开口箭总皂苷的Griess实验结果。
图3为本发明中选择的开口箭皂苷类化合物单体结构示意图。
图4为本发明实施例中的开口箭总皂苷(A)和开口箭皂苷类化合物单体(B)的HPLC-ELSD图谱。
图5为各实验组小鼠的咽部组织HE染色图，其中，A：空白组；B：模型组；C：阳性药组；D、E、F：总皂苷高、中、低剂量组。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。
实施例1
(1)开口箭总皂苷的提取和纯化：
取干燥的开口箭500g，粉碎后加入重量比为12倍量的60％(v/v)乙醇浸泡2小时，回流提取3次，每次提取2小时，纱布过滤得到提取液。合并3次提取得到的提取液，减压浓缩得开口箭提取物。将开口箭提取物用水在60℃下进行超声辅助(40KHz，200W)溶解，得到开口箭提取物溶液。将开口箭提取物溶液滴加在依次用95％(v/v)乙醇、75％(v/v)乙醇、50％(v/v)乙醇、30％(v/v)乙醇、水冲洗后过的D-101大孔树脂柱上，静止吸附2h，然后依次用水、10％(v/v)乙醇、75％(v/v)乙醇和95％(v/v)乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱5个保留体积，取75％(v/v)乙醇洗脱液进行浓缩干燥，得到开口箭总皂苷70.85g。
按照下述公式计算本实施例中的开口箭总皂苷收率：
计算得到本实施例中的开口箭总皂苷收率为14.17％。
(2)开口箭总皂苷的检测：
在本实施例中，开口箭总皂苷含量测定采用茴香醛-乙酸乙酯-浓硫酸显色法。
配制0.5％的对茴香醛-乙酸乙酯溶液：精密量取对茴香醛0.5mL，用适量乙酸乙酯溶解后转入容量瓶中，乙酸乙酯定容至100mL，摇匀，即得。需要注意的是，对茴香醛-乙酸乙酯溶液为即配即用，当日使用。
配制薯蓣皂苷对照品溶液：精密称取薯蓣皂苷3.0mg，使用甲醇定容于10mL容量瓶中，即得0.30mg/mL的薯蓣皂苷对照品溶液。
配制样品溶液：准确称取上述实施例中所得的开口箭总皂苷20.0mg，用甲醇定容于100mL容量瓶中，即得0.20mg/mL的样品溶液。
使用紫外-可见分光光度法测定样品中总皂苷含量：精密吸取薯蓣皂苷对照品溶液0，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.40和0.50mL，60℃恒温水浴加热，除去其中的溶剂(甲醇)。依次加入2mL乙酸乙酯，1mL上述0.5％对茴香醛-乙酸乙酯溶液和1mL 50％(v/v)的浓硫酸-乙酸乙酯溶液，在60℃恒温水浴下反应20min后，冰水冷却，以空白试剂为参比，在430nm波长下测定体系的吸光度，以薯蓣皂苷对照品的质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，作图得标准工作曲线，然后重复测定样品溶液中的吸光度值，得到样品中的总皂苷的含量。
结果发现，利用对茴香醛-乙酸乙酯-浓硫酸显色法测得开口箭提取物中总皂苷的含量为67.31％±0.73％。同一样品用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测得的皂苷含量为96.27±3.15％，远高于现有技术方案。本发明后续实施例含量测定均采用对甾体皂苷专属性更高的对茴香醛-乙酸乙酯-浓硫酸显色法测测定。
实施例2
(1)开口箭总皂苷的提取和纯化：
取干燥的开口箭1000g，粉碎后加入重量比为10倍量的65％(v/v)乙醇浸泡5小时，回流提取3次，每次提取1.5小时，纱布过滤得到提取液。合并3次提取得到的提取液，减压浓缩得开口箭提取物。将开口箭提取物用10％(v/v)乙醇在加热条件下进行超声辅助溶解，得到开口箭提取物溶液。将开口箭提取物溶液滴加在已装好的AB-8大孔树脂上，静止吸附2h，然后依次用10％(v/v)乙醇、75％(v/v)乙醇和95％(v/v)乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱3个保留体积，取75％(v/v)乙醇洗脱液进行浓缩干燥，得到开口箭总皂苷138.52g。按照实施例1中的计算公式计算本实施例中的开口箭总皂苷收率。
计算得到本实施例中的开口箭总皂苷收率为13.85％。
(2)开口箭总皂苷的检测：
按照上述实施例1中的茴香醛-乙酸乙酯-浓硫酸显色法测定本实施例中的开口箭总皂苷含量。
结果发现，本实施例中得到的开口箭提取物中总皂苷的含量为66.75％±1.25％。
实施例3
(1)开口箭总皂苷的提取和纯化：
取干燥的开口箭100g，粉碎后加入重量比为15倍量的65％(v/v)乙醇浸泡3小时，回流提取3次，每次提取1.5小时，纱布过滤得到提取液。合并3次提取得到的提取液，减压浓缩得开口箭提取物。将开口箭提取物用10％(v/v)乙醇在加热条件下进行超声辅助溶解，得到开口箭提取物溶液。将开口箭提取物溶液滴加在已装好的D-101大孔树脂上，静止吸附3h，然后依次用10％(v/v)乙醇、70％(v/v)乙醇和95％(v/v)乙醇进行梯度洗脱分离，每个比例洗脱5个保留体积，取70％(v/v)乙醇洗脱液进行浓缩干燥，得到开口箭总皂苷14.31g。按照实施例1中的计算公式计算本实施例中的开口箭总皂苷收率。
计算得到本实施例中的开口箭总皂苷收率为14.31％。
(2)开口箭总皂苷的检测：
按照上述实施例1中的茴香醛-乙酸乙酯-浓硫酸显色法测定本实施例中的开口箭总皂苷含量。
结果发现，本实施例中得到的开口箭提取物中总皂苷的含量为67.28％±1.15％。
测试例1开口箭总皂苷的体内抗炎活性测试(对角叉菜胶致小鼠足肿胀程度的影响)
取SPF级昆明小鼠50只作为实验动物，小鼠体重24-30g，雌雄各半，按照表1所示随机分为5组，每组10只。
表1实验动物分组
| 组别 | 灌胃样品及剂量 |
| 模型组 | 生理盐水(10mL/kg) |
| 阳性药组 | 阿司匹林(200mg/kg) |
| 总皂苷高剂量组 | 上述实施例1中的开口箭总皂苷(200mg/kg) |
| 总皂苷中剂量组 | 上述实施例1中的开口箭总皂苷(100mg/kg) |
| 总皂苷低剂量组 | 上述实施例1中的开口箭总皂苷(50mg/kg) |
按照表1剂量对各组灌胃给药0.5h后，于小鼠右侧足掌心皮下注射1％角叉菜胶25μL。注射后开始计时，4小时后沿跺关节剪下左右两侧后足，精密称重，以两侧足重量差为肿胀度，并按照下述公式计算肿胀抑制率。
结果如表2所示。
表2开口箭总皂苷对小鼠足肿胀的影响
| 组别 | 肿胀度(mg) | 肿胀抑制率(％) |
| 模型组 | 54.10±15.98 | / |
| 阳性药组 | 20.73±13.97** | 61.68 |
| 总皂苷高剂量组 | 18.11±9.33** | 66.52 |
| 总皂苷中剂量组 | 28.11±7.75** | 48.04 |
| 总皂苷低剂量组 | 34.38±6.32* | 36.45 |
其中，与模型组比较，P≤0.05；**：与模型组比较，P≤0.01。
可以发现，与模型组相比，上述实施例中提取得到开口箭总皂苷的能显著抑制角叉菜胶导致的小鼠足肿胀程度，说明上述实施例中提取得到开口箭总皂苷具有抗炎作用。
测试例2开口箭总皂苷的体外抗炎活性测试
在本实施例中，选取脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)建立体外炎症模型，通过MTT实验和Griess实验，对上述实施例中提取得到开口箭总皂苷的体外抗炎活性进行测试。
MTT实验的具体步骤为：将对数生长期RAW264.7细胞(2×104cells/well)接种于96孔板中，在5％CO2、37℃的培养箱中培养24h，然后加入终浓度为1μg/mL的LPS以及终浓度为6.25、12.5、25、50、100μg/mL的上述实施例中提取得到开口箭总皂苷，在5％CO2、37℃条件下培养24h后弃去上清，每孔加入100μL的MTT溶液(0.5mg/mL)继续培养4h，弃上清，加入100μL DMSO，在摇床上震荡10min，用酶标仪于490nm处测定OD值，计算待测样品对RAW264.7细胞增殖的抑制率。
Griess实验的具体步骤为：将对数生长期RAW264.7细胞(2×104cells/well)接种于96孔板中，在5％CO2、37℃条件下培养24h后加入终浓度为1μg/mL的LPS以及终浓度为6.25、12.5、25、50、100μg/mL的上述实施例中提取得到开口箭总皂苷，在5％CO2、37℃条件下培养24h，吸取各孔上清液50μL，加入50μL Griess A试剂和50μL Griess B试剂混匀，室温下避光反应10min，用酶标仪于540nm处测定OD值，计算待测样品NO产生的抑制率，并使用软件计算样品的IC50值。
实验结果如图1和图2所示。
可以发现，LPS(1μg/mL)单独作用及联合TCS(开口箭总皂苷)在6.25-100μg/mL的浓度范围内对RAW264.7细胞的存活率无显著影响，说明TCS具有较好的安全性。而且，还发现TCS能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO，其中TCS的浓度为50μg/mL时，能抑制大约一半NO的产生，说明TCS具有较好的体外抗炎效果。
测试例3开口箭总皂苷的镇痛测试(对小鼠醋酸扭体反应的影响)
取SPF级昆明小鼠50只作为实验动物，小鼠体重24-30g，雌雄各半，按照表1所示随机分为5组，每组10只。
各组给药剂量同表1(开口箭总皂苷选择上述实施例2中的开口箭总皂苷)，灌胃给药0.5h后，各组小鼠按0.1mL/10g腹腔注射临用新配的0.6％冰醋酸-生理盐水。注射后开始计时，到出现第一次扭体反应的时间间隔即为潜伏期，记录15min内的扭体次数，按照下述公式计算扭体反应抑制率(％)。
其中，扭体反应的观察标准为：腹腔内凹，后肢伸展，臀部抬高，以上行为均出现时记为一次扭体反应。
实验结果如表3所示。
表3开口箭总皂苷对小鼠醋酸扭体反应的影响
| 组别 | 潜伏时间(s) | 扭体次数 | 抑制率(％) |
| 模型组 | 195.73±15.59 | 82.00±4.94 | / |
| 阳性药组 | 285.81±57.85** | 34.91±12.68** | 57.43 |
| 总皂苷高剂量组 | 233.73±38.80** | 47.45±13.54** | 42.13 |
| 总皂苷中剂量组 | 236.36±36.96** | 56.64±8.93** | 30.93 |
| 总皂苷低剂量组 | 240.80±38.57* | 55.10±8.83** | 32.80 |
其中，与模型组比较，P≤0.05；**：与模型组比较，P≤0.01。
可以发现，与模型组相比，上述实施例中的开口箭总皂苷能显著延长小鼠扭体反应的潜伏期，减少扭体反应次数，说明其具有镇痛作用。
测试例4开口箭总皂苷指纹图谱分析
取开口箭皂苷类化合物单体(结构示意图如图3所示)作为标准品，使用高效液相色谱仪对上述实施例3中的开口箭总皂进行色谱分析。
其中，样品的指纹图谱分析条件为色谱柱：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱanalysis column(4.6ID×250mm)；流动相：Acetonitrile(A)和Water(B)；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；梯度洗脱程序为：0-10min，17～19％A；10-30min，19～23％A；30-40min，23～27％A；40-45min，27～40％A；45-55min，40～100％A；55-60min，100％A；检测器：蒸发光散射检测器；漂移管温度：95℃。
得到的开口箭总皂苷的指纹图谱如图4所示。
测试例5开口箭总皂苷对急性咽炎大鼠的治疗作用
取SPF级雌性Wistar大鼠60只作为实验动物，体重180～220g，按照表4所示随机分为6组，每组10只。
表4实验动物分组
参照《急性咽炎动物模型制备规范》中急性咽炎大鼠模型的建立方法，采用15％氨水喷雾刺激咽部黏膜制备大鼠急性咽炎模型。除空白组外，用喉头喷雾器向其余五组大鼠咽部喷洒15％氨水，每天2次，上、下午各1次，每次喷3下，连续喷3天。空白组大鼠照同法喷洒生理盐水。第四天起，各组大鼠按表4所示剂量灌胃给药，连续5天。末次给药6小时后，处死，摘取咽部黏膜及黏膜下组织，放入新配制的4％多聚甲醛溶液固定，24小时后进行石蜡包埋，切片。经HE染色后，于光镜下观察咽部组织。
结果如图5所示。
从一般状态的角度进行观察，可以发现造模后大鼠出现唾液分泌增多，频频搔抓口部，精神状态欠佳、毛发失去光泽，咽部黏膜充血、肿胀呈鲜红色等现象。与模型组相比，各给药组大鼠的症状均得到了不同程度的改善。
从咽部组织病理学角度观察，发现与空白对照组相比，模型组咽部黏膜组织分层不清晰，黏膜上皮脱落，固有层内有大量炎性细胞浸润，唾液腺萎缩。与模型组相比，阳性药及总皂苷高、中剂量组咽部组织结构改变有明显的减轻，黏膜上皮脱落得到不同程度的修复，炎性细胞浸润减少，腺体结构恢复正常。从咽部组织病理学角度观察，结果说明上述实施例中所得的总皂苷能减轻炎性细胞浸润，促进黏膜、腺体修复。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种开口箭总皂苷的提取方法，包括如下步骤：
(1)使用10～15倍量的乙醇浸泡开口箭，回流提取，过滤，得到开口箭提取液；
(2)干燥得到开口箭提取物，以水或乙醇为溶剂溶解开口箭提取物，使用大孔树脂进行吸附，梯度洗脱，收集洗脱液即得。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)中，所述溶解在加热条件下进行，并使用超声进行辅助。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述梯度洗脱使用水和乙醇中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙醇的体积百分数为10％～95％。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，使用大孔树脂进行吸附时，静置吸附时间≥2小时。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中，洗脱液为70％～80％乙醇的洗脱液。
7.一种开口箭总皂苷的定量方法，包括如下步骤：
向样品中以此加入乙酸乙酯、对茴香醛-乙酸乙酯溶液和浓硫酸-乙酸乙酯溶液，50～70℃水浴15～25min，冷却后在420～440nm波长下测定吸光度，基于标准曲线，计算样品中的开口箭总皂苷含量。
8.根据权利要求7所述的定量方法，其特征在于，所述标准曲线是基于皂苷对照品在420～440nm波长测得的，所述皂苷对照品包括薯蓣皂苷对照品和开口箭皂苷对照品。
9.权利要求1～6任一项所述提取方法提取得到的开口箭总皂苷在制备如下(1)～(3)中至少一种功能的产品中的应用；
(1)抗炎；
(2)镇痛；
(3)预防和/或治疗咽炎。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述咽炎包括急性咽炎。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 李园: "开口箭提取物对慢性支气管炎治疗作用的探索", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑, no. 5, pages 057 - 50 * |
| 王哲: "开口箭总皂苷抗胃癌细胞增殖及其机制研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑, no. 2, pages 057 - 326 * |
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