CN116162726A - 一种抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记及其应用 - Google Patents

一种抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记及其应用，参考玉米B73基因组序列，在第10染色体的热点区域设计分子标记，通过将抗病玉米自交系K22与来自不同种质类群的多个感病自交系(鲁自1509、鲁自1512、lx4201、鲁自1526)进行杂交与回交，通过田间抗锈性表型调查结合基因型鉴定，发现引物RppF1‑RppR1可有效检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记。本发明引物检测的分子标记与玉米南方锈病抗性基因紧密连锁，可用于鉴定植株中是否含有南方锈病抗性基因，检测结果可靠、简单易行，并且提高了玉米南方锈病的种质筛选效率，减少了田间选育的工作量，缩短了育种周期，节约了成本。

Description

一种抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记及其应用。
背景技术
玉米是我国第一大粮食作物，具有丰富的遗传资源，是重要的饲料和工业原料，玉米产量高、用途广，在作为粮食、饲料和工业、医药原料等方面都具有较高的经济价值。
玉米南方锈病是由多堆柄锈菌(P.polysoraUnderw.)引起的病害，主要发生在玉米叶片上，也能够侵染叶鞘、茎秆和苞叶，发病后，叶片被橘黄色的夏孢子堆和夏孢子所覆盖，导致叶片干枯死亡，轻者减产10-20％，重者达30％以上，严重地块甚至绝收，因此亟需发掘和选育高抗南方锈病的玉米品种，减少病害的发生，减少玉米减产的情况。
近年来，基因组学和生物信息学的发展为作物新品种的培育提供了极大的便利，其中分子标记辅助育种方法是开发与功能基因或目标性状紧密连锁的分子标记，通过检测分子标记，确定目的基因存在，进而预测作物植株的抗病性状，该育种方法通过分子标记手段与杂交育种手段相结合，大大缩短了传统杂交育种方法的时间。
目前，为了发掘和选育高抗南方锈病的玉米品种，国内多个课题组开展了玉米南方锈病的抗病基因鉴定工作，现虽有一些抗南方锈病的分子标记被开发出来，但多数标记存在离抗性基因/位点较远、效应值低等限制，且不具有广谱性，因此亟需开发一种具有广谱性、抗性效应值高的分子标记。
发明内容
为了解决现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记及其应用，参考玉米B73基因组序列后，在第10染色体的热点区域设计分子标记，通过并将抗病玉米自交系K22与来自不同种质类群的多个感病自交系(鲁自1509、鲁自1512、lx4201、鲁自1526)进行杂交与回交，通过田间抗锈性表型调查结合基因型鉴定，发现引物RppF1-RppR1可有效检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记。
为了达到上述效果，本发明采用了以下技术方案：
本发明一方面提供了一种用于检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记，分子标记核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
本发明另一方面提供了一种用于检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记的引物，引物为RppF1和RppR1，RppF1和RppR1核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
本发明另一方面提供了一种用于检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记的试剂，试剂包含RppF1和RppR1引物。
本发明另一方面提供了一种用于检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记的试剂盒，试剂盒包含上述引物、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂。
本发明另一方面提供了上述引物在制备用于检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记的基因芯片中的应用。
本发明另一方面提供了上述引物在检测抗南方锈病玉米的应用。
进一步的，上述引物在检测抗南方锈病玉米的应用，包括以下步骤：
1)提取待检样品中基因组DNA；
2)以步骤1)提取的基因组为模版，采用上述引物进行PCR扩增；
3)琼脂糖凝胶电泳，查看扩增结果。
进一步的，扩增结果为180bp单带、180/195bp双带、195bp单带。
进一步的，上述180bp单带为抗南方锈病玉米抗性基因纯合植株扩增条带；上述180/195bp双带为抗南方锈病玉米抗性基因杂合植株扩增条带；上述195bp单带为南方锈病感病玉米植株扩增条带。
有益效果：
1)本发明引物检测的分子标记与玉米南方锈病抗性基因紧密连锁，可用于鉴定植株中是否含有南方锈病抗性基因，检测结果可靠、简单易行。
2)本发明引物检测的分子标记对常规育种材料进行鉴定，提高了玉米南方锈病的种质筛选效率，减少了田间选育的工作量，缩短了育种周期，节约了成本。
附图说明
图1为RppF1、RppR1引物在抗病玉米自交系K22、感病自交系鲁自1509、感病自交系鲁自1512、感病自交系lx4201和感病自交系鲁自1526中的扩增电泳结果图。
图2为RppF1、RppR1引物在K22与鲁自1509、鲁自1512、lx4201和鲁自1526进行杂交与回交后的植株的扩增电泳结果图。图中1509、1512、4201、1526分别为鲁自1509、鲁自1512、lx4201、鲁自1526自交系的代称。
图3为田间南方锈病抗病植株和感病植株实物图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于这些实施例。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。
实施例中涉及如下生物材料：
抗病玉米自交系K22、鲁自1509、鲁自1512、lx4201和鲁自1526，其中抗病自交系由华中农业大学严建兵教授课题组提供，其他自交系由本单位提供并保存。
RppF1和RppR1引物合成由北京擎科生物科技有限公司(青岛)合成
PCR mix购自南京诺唯赞生物科技公司的2×Taq Plus Master Mix(Dye Plus)，其它试剂和仪器均为市售。
实施例：
(1)抗病玉米自交系K22与来自不同种质类群的多个感病自交系鲁自1509、鲁自1512、lx4201和鲁自1526进行杂交与回交，收获回交的植株种子。
(2)在Maizesequence网站下载玉米B73基因组序列，在第10染色体区域设计设计引物。
(3)碱煮法提取如下种子(胚乳)DNA：K22、鲁自1509、鲁自1512、lx4201、鲁自1526、K22分别与鲁自1509、鲁自1509、鲁自1512、lx4201、鲁自1526进行杂交与回交后得到的植株种子。
(4)配置反应体系：
以步骤(2)分别提取的DNA为模板，RppF1和RppR1所示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，RppF1和RppR1引物序列如表1所示。
表1RppF1和RppR1引物序列
引物 引物序列(5'-3') 序列编号
RppF1 CGAAATTCACGACTAGTGGGTTCATC SEQ ID NO.1
RppR1 GCGTAAACGGTCAGAACCACAT SEQ ID NO.2
PCR扩增体系用PCR mix进行扩增，PCR反应体系为20μl，包括如下组分：
Figure BDA0003971860210000031
Figure BDA0003971860210000041
将上述各成分依次加入到0.5ml的离心管中，PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；然后72℃过度延伸7min。
(3)琼脂糖凝胶(3％)电泳
①将电泳所用器具蒸馏水洗净，架好梳子；
②根据要分离的DNA片段大小制备合适浓度的琼脂糖凝胶，准确称取一定的琼脂糖加入到锥形瓶中，加入30ml左右的电泳缓冲液(TAE或TBE)；
③在微波炉中加热融化后冷却至40℃左右，充分混匀后倒入电泳槽中；
④室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样
⑤在电泳槽中加入电泳缓冲液，漫过凝胶表面即可，点样孔内不要有气泡
⑥样品点样前准备好，(在八连管中)加入5ul样品，1ul的6xLoding buffer和1ul的染料混合，用抢将混合后的样品缓缓注入到点样孔中，注意不要串孔
⑦按照正负极(红正黑负)，接通电源，电压40-60V，时间30-40min，可根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳
⑧电泳结束，关闭电源，凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小，扩增结果如图1、图2所示。
(4)结果分析
①通过图1所示，RppF1、RppR1引物在抗病玉米自交系K22中扩增条带为180bp,在感病自交系鲁自1509、鲁自1512、lx4201和鲁自1526扩增条带为195bp。
②通过图2所示，RppF1、RppR1引物在上述回交后得到的植株种子中的扩增条带分别为180bp单带、180/195bp双带、195bp单带。180bp序列和195bp序列如表2所示：
表2 180bp序列和195bp序列
Figure BDA0003971860210000042
对上述回交后得到的植株进行田间性状调查，田间南方锈病抗病植株和感病植株如图3所示，群体中南方锈病的抗性与基因型统计结果如表3所示。
表3分离群体中南方锈病的抗性与基因型统计结果
Figure BDA0003971860210000051
/>
Figure BDA0003971860210000061
注：无抗性位点无标注，有抗性位点标注为杂合(Heterozygote，Hetero-)或者纯合(Homozygote，Homo-)；抗锈病性状标注为“+”，不抗锈病标注为“-”。
结合基因型鉴定发现，若扩增产物为180bp单带，则待测玉米具有南方锈病抗性基因，为抗病植株；扩增产物为195bp单带，则待测玉米不具有南方锈病抗性基因，为感病植株；扩增产物为180/195bp双带，则待测玉米材料具有南方锈病抗性基因，属杂合子，为抗病植株。由此可见，该RppF1、RppR1扩增结果与南方锈病的抗感性状一致，能准确反映植株基因型，从而准确筛选出抗病植株。
以上实施例仅仅是对本发明的解释和具体实施方式和实施效果进行举例，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对发明做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (9)

1.一种用于检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记，其特征在于，所述分析标记核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.一种检测权利要求1所述辅助选择分子标记的引物，其特征在于，所述引物为RppF1和RppR1；所述RppF1和RppR1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.一种用于检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记的试剂，其特征在于，所述试剂包含权利要求2所述的引物。
4.一种用于检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的引物、PCR扩增试剂、PCR产物纯化试剂。
5.根据权利要求2所述的引物在制备用于检测抗南方锈病玉米的辅助选择分子标记的基因芯片中的应用。
6.权利要求2所述的引物在检测抗南方锈病玉米的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待检样品中基因组DNA；
2)以步骤1)提取的基因组为模版，采用权利要求2所述的引物进行PCR扩增；
3)琼脂糖凝胶电泳，查看扩增结果。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述扩增结果为180bp单带、180/195bp双带、195bp单带。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述180bp单带为抗南方锈病玉米抗性基因纯合植株扩增条带；所述180/195bp双带为抗南方锈病玉米抗性基因杂合植株扩增条带；所述195bp单带为南方锈病感病玉米植株扩增条带。
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