CN116162148A - 多特异性配体结合分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可结合包括VEGF‑A、VEGF‑B、VEGF‑C、VEGF‑D、PlGF、PDGF‑AA、PDGF‑AB、PDGF‑BB、PDGF‑CC在内的一种或多种生长因子的配体结合分子，其糖基化改造形式分子，包含这类配体结合分子的融合蛋白和组合物，以及其产生方法和用途。

Description

多特异性配体结合分子及其应用
技术领域
本发明涉及蛋白质领域，具体地，本发明涉及配体结合分子，以及此类配体结合分子的糖基化改造形式、融合蛋白和缀合物，编码这类分子的核酸序列，以及其产生方法和用途。
背景技术
血管内皮生长因子(又称为VEGF)相关基因家族包括多种分泌型的糖蛋白，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E。VEGF-A是一个45000Da的具有广泛血管生成活性的糖蛋白，其基因由8个外显子和7个内含子组成，根据不同的剪切方式形成分为5种单体，即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206，其中VEGF165是VEGF-A最重要的同源单体之一。
VEGF-A在血管早期的形成中发挥重要作用，所有血管化组织均可表达VEGF-A。除此之外，许多其它细胞在缺氧应激条件下也可表达VEGF-A，如巨噬细胞、血小板、树突状细胞(DC)、活化的T细胞、视网膜色素上皮细胞、视网膜中的Muller细胞、星形胶质细胞、成骨细胞、支气管与肺泡上皮细胞、周细胞、血管平滑肌细胞、肌成纤维细胞、角质形成细胞、肾系膜细胞和肿瘤细胞等。
VEGF-C和VEGF-D在胚胎和出生后的***生成方面发挥着关键作用。纯合子缺乏VEGF-C基因小鼠在胚胎期是致命的，杂合子缺乏导致生后小鼠***发展缺陷。VEGF-C和VEGF-D可能在新生血管方面也发挥着重要作用，特别在病理期时，如肿瘤生长。VEGF-E是从羊口疮病毒感染组分离出来的，有刺激内皮细胞的增殖、迁移，还具有增强血管的通透性的作用(Vladimir Joukov等人The EMBO Journal 15(2):290-98，1996年2月)。
VEGF配体通过多种不同受体(即通过配体-受体相互作用)介导血管生成作用。两个受体最初在内皮细胞证实，它们为特殊的酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinase，RTK)VEGFR-1(FIt-1)和VEGFR-2(FiK-1)。后来证实在成人多种生血细胞谱上也是表达的。这两种受体由具有7个免疫球蛋白样结构的胞外区、膜区及酪氨酸激酶区组成，均是跨膜受体，属于RTK III型，其共同特点是催化域内有酪氨酸激酶***区，该酪氨酸激酶的活性通过受体和配体结合而激活，受体磷酸化可引起细胞内许多酶和其他反应，在细胞的生长和分化中起重要作用。最近，一种另外的RTK，VEGFR3(Fit-4)被证实，并且发现与***生成密切相关。不同的VEGF家族成员具有不同的受体结合位点。
在肿瘤生长、眼科血管增生等与血管新生相关的疾病中，抑制血管新生是一种有效的治疗手段。在过去几十年中，对VEGF相关信号进行了大量的研究，并且有许多药物用于治疗，例如Lucentis(Ranibizumab雷珠单抗)、Eylea(Aflibercept阿柏西普)、Avastin(bevacizumab贝伐珠单抗)、Cyramza(Ramucirumab雷莫芦单抗)、Inlyta(Axitinib阿西替尼)、Stivarga(regorafenib瑞戈非尼)、Cometriq(cabozantinib卡博替尼)、OFEV(Nintedanib尼达尼布)、Lenvim(envatinib乐伐替尼)。
年龄相关湿性黄斑病变(wAMD)与糖尿病黄斑水肿(DME)病患广，病程进展快，发病后果严重(视力丧失)，是导致失明的最大诱因。目前的主要治疗方式是靶向VEGF-A，其比传统治疗手段(激光光凝等)具有明显进步的疗效，相应的靶向药(如雷珠单抗、阿柏西普等)也取得了巨大的市场成功。但单一靶向VEGF-A仍无法彻底攻克这些疾病，例如在AMD治疗后，仅三分之一的病人能够完全受益，其余病人的视力无明显增加，三分之一的病人视力仍接近失明(Rofagha S,Bhisitkul RB,Boyer DS,Sadda SR,Zhang K.Seven-Year Outcomesin Ranibizumab-Treated Patients in ANCHOR,MARINA,and HORIZON：A multicentercohort study(SEVEN UP)[J].Ophthalmology,2013,120(11):2292-2299)。目前已知的上市及在临床中的多个靶向VEGF-A的药品，亲和力(KD)从皮摩尔到纳摩尔水平不等，在临床治疗中均展现出接近的效果，这表明了单一靶向VEGF-A疗法或已经到达了其疗效上限。
综上所述，过去几十年中，对VEGF相关信号进行了大量的研究，在新生血管及肿瘤等相关疾病，还有明显的未被满足的临床需求。本发明针对这一需求提出了新的解决办法。本发明提供了能够靶向VEGF、PlGF和PDGF家族的新分子，这对于治疗新生血管相关的疾病有重要的临床意义。
发明内容
本发明涉及可结合包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C在内的一种或多种生长因子的配体结合分子(即多特异性配体结合分子)，其糖基化改造形式分子，包含这类配体结合分子的组合物，及其产生方法和使用用途。本发明进一步验证了所述配体结合分子在体内和体外的效果，尤其是用于抗血管新生方面的效果。
在一些方面，本公开提供一种分离的配体结合分子，其包含VEGFR2衍生序列，并且其相比于天然VEGFR2(例如天然全VEGFR2胞外结构域，例如胞外序列Met 1-Glu 764)具有增强的对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC中的至少一种，更优选两种，更优选三种，更优选四种，更优选五种，更优选六种，最优选七种的结合能力。所述VEGFR2衍生序列是与以下任一种氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:2的位置117-218限定的氨基酸序列(例如LFV-A)；
(b)SEQ ID NO:2的位置117-327限定的氨基酸序列(例如LFV-B)；
(c)SEQ ID NO:2的位置123-327限定的氨基酸序列(例如LFV-C、LFV-G、LFV-H、LFV-I、LFV-J、LFV-K、LFV-L)；
(d)SEQ ID NO:2的位置117-421限定的氨基酸序列(例如LFV-D)；
(e)SEQ ID NO:2的位置23-327限定的氨基酸序列(例如LFV-E)；和
(f)SEQ ID NO:2的位置23-421限定的氨基酸序列(例如LFV-F)。
在一些实施方案中，所述VEGFR2衍生序列是(a)-(f)中任一种的N末端和/或C末端截短后的片段，例如截短20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸或由其组成。
在一些实施方案中，所述VEGFR2衍生序列相比于天然VEGFR2胞外域中相应位置处的序列包含一个或多个氨基酸的***、取代或缺失，例如在糖基化位点处的***、缺失或取代。
在一些实施方案中，可在糖基化位点处进行多种修饰以去除糖基化，特别是消除“NXT”和/或“NXS”三氨基酸等已知的糖基化作用位点，例如通过将N突变为Q或A。具体的糖基化位点可选自例如，对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置46、66、96、143、158、245和318处。在一些实施方案中，将上述位点处的Asn取代为Gln或Ala或其他合适的氨基酸。具体地，糖基化位点的取代可选自以下：N143A、N143Q、N158A、N158Q、N245Q和N318Q。
在一些实施方案中，所述VEGFR2衍生序列包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID No:4-15和18。
在一些实施方案中，所述配体结合分子除了包含VEGFR2衍生序列以外，还包含VEGFR1衍生序列。所述VEGFR1衍生序列可选自下组：
(i)与SEQ ID NO:1的位置132-230所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；和
(ii)(i)的氨基酸序列的N末端和/或C末端截短后的氨基酸序列，例如截短20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸。
在一些实施方案中，所述配体结合分子包含与SEQ ID NO:2的位置117-327或123-327所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列可操作地连接于所述VEGFR1衍生序列。例如，所述配体结合分子包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID No:16-17和19-21。
在一些另外的实施方案中，所述配体结合分子除了包含VEGFR2衍生序列以外，还包含VEGFR3衍生序列。所述VEGFR3衍生序列可选自下组：
(i)与SEQ ID NO:3的位置25-216、25-115、47-115、154-210、248-314或25-329所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；和
(ii)(i)的氨基酸序列的N末端和/或C末端截短后的氨基酸序列，例如截短20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸。
在一些另外的实施方案中，所述配体结合分子包含与SEQ ID NO:2的位置117-327、123-327或221-312所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列可操作地连接于所述VEGFR3衍生序列。例如，所述配体结合分子包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID No:22-30。
在一些实施方案中，所述配体结合分子还包含免疫球蛋白的Fc区，所述免疫球蛋白选自IgA、IgM、IgE、IgD和IgG，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，优选为人IgG1的Fc区或其变体，任选地还包含铰链区。所述免疫球蛋白的铰链区和Fc区可以通过接头(例如GPG)或不通过接头可操作性地连接于所述VEGFR2衍生序列、VEGFR1衍生序列或VEGFR3衍生序列的C末端。在一些实施方案中，所述Fc区或其变体是包含磷脂等大分子化合物的聚合形式。
在一些实施方案中，Fc区如SEQ ID No:31的第104-330位氨基酸序列所示。
在一些具体的实施方案中，本文公开的配体结合分子包含SEQ ID No:32-59中的任一种序列或由其组成。
在一些实施方案中，所述配体结合分子还包含信号肽。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能结合VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC蛋白中的至少一种，优选至少两种，更优选至少三种，更优选至少四种，更优选至少五种，更优选至少六种，更优选至少七种，更优选至少八种，更优选全部九种。优选地，所述配体结合分子能结合多种靶标，即是一种多特异性配体结合分子。所述VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC蛋白可以来自或衍生自人、小鼠、大鼠或食蟹猴。例如，上述蛋白可以是人源的，包括其加工或未加工形式，以及磷酸化激活或未磷酸化激活形式。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能以5nM或更低的KD结合VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-AB中的至少一种，优选至少两种，更优选至少三种，最优选全部四种，如通过SPR测定的。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能以50pM或更低，优选40pM或更低，更优选30pM或更低，更优选20pM或更低，更优选10pM，更优选5pM，更优选4pM，更优选3pM，更优选1pM，或更低的KD结合VEGF-A和VEGF-C中的至少一种，如通过SPR测定的。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能以20nM或更低，优选15nM或更低，更优选10nM或更低，更优选5nM或更低，更优选3nM或更低的KD结合VEGF-D，如通过SPR测定的。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能以50nM或更低，优选40nM或更低，更优选30nM或更低，更优选28nM或更低，更优选26nM或更低，更优选24nM或更低，更优选22nM或更低，更优选20nM或更低，更优选18nM或更低，更优选15nM或更低，更优选10nM或更低的KD结合PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC中的至少一种，优选至少两种，优选至少三种，更优选全部四种，如通过SPR测定的。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能抑制或阻断VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC蛋白中的至少一种与该蛋白的相应受体的结合。
在一些实施方案中，所述受体选自VEGFR-1受体、VEGFR-2受体、VEGFR-3受体、PDGFR-α受体和PDGFR-β受体。所述受体根据其在生理、病理中发挥作用时的结合形式，可以为单体形式、同源二聚体形式或相互间形成任意异二聚体的形式。
在一些方面，本发明还提供了一种融合蛋白，其包含上文公开的配体结合分子可操作地连接于异源性肽。所述异源性肽可以选自以下：另外的配体结合分子，如常见的人源受体蛋白胞外结构域(ECD)或其截短及重组多肽；抗体可变区片段及其组合，如抗体Fab、单链抗体(scFv)、纳米抗体(nanobody)、人重链可变区单域抗体(VH)；活性多肽及蛋白适配体。
在一些实施方案中，所述异源性肽为靶向VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD、Ang-2、TGF-β、CTGF(***生长因子)、EGF(表皮生长因子)、S1P、Galectin、Decorin、或前述蛋白的受体的异源性肽。
在一些实施方案中，所述可操作地连接为直接连接或经由连接子连接。
在一些实施方案中，所述配体结合分子直接连接或通过连接子连接于所述异源性肽的N末端或C末端。例如，在C末端通过肽键直接连接于异源性肽的N末端，或在N末端通过肽键直接连接于异源性肽的C末端。在一些实施方案中，所述连接子为多肽或化学基团。
在一些方面，本发明还提供了一种缀合物，其包含如上文所述的配体结合分子或融合蛋白缀合于至少一个选自以下的模块：修饰模块、毒素(例如化学治疗剂)、可检测标记(例如放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记或酶-底物标记)或纯化模块。例如，所述修饰模块是聚乙二醇模块，任选地所述聚乙二醇模块附接于所述配体结合分子的氨基末端。
在一些方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码所述配体结合分子或融合蛋白的多核苷酸序列。所述核酸分子可以进一步包含连接至所述多核苷酸序列的启动子序列或其他调控序列。
在一些方面，本发明还提供了一种载体，其包含所述核酸分子。所述载体可以包括但不限于，慢病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、脂质体载体及其任意组合。在一些实施方案中，所述载体为复制缺陷型腺病毒载体，其中所述核酸分子可操作地连接至启动子并且两侧具有腺病毒多核苷酸序列。
在一些方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其经过上文所述的多核苷酸或载体转化或转染。所述宿主细胞优选为真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人细胞。
在一些方面，本发明还提供了一种制备配体结合分子的方法，其包括以下步骤：
在适宜的条件下培养如上文所述的宿主细胞以表达所述配体结合分子；并从宿主细胞的培养上清液分离所述配体结合分子。
在一些方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含如上文公开的所述配体结合分子或融合蛋白或编码所述配体结合分子的核酸分子，以及药学上可接受的佐剂或载剂，例如稀释剂或赋形剂。所述组合物可以被制成用于局部施用或玻璃体内注射或植入施用。所述组合物可以为固体、糊剂、软膏、凝胶、液体、气雾剂、喷雾剂、聚合物、薄膜、乳液或混悬液形式。
在一些方面，本发明还提供了一种抑制受试者中的新生血管形成以及由新生血管形成引起的疾病或病况的方法，所述方法包括以有效抑制所述受试者中的新生血管形成的量向所述受试者施用如本文公开的配体结合分子或药物组合物。
在一些实施方案中，所述新生血管形成为视网膜新生血管形成和/或脉络膜新生血管形成。
在一些实施方案中，所述疾病或病况选自脉络膜血管病变或新生、视网膜血管新生、黄斑血管新生和与眼底渗漏有关的眼部病症。
在一些实施方案中，所述组合物被局部施用于所述受试者的眼睛，或者通过玻璃体内注射施用、通过玻璃体内植入物施用、或通过局部施用来施用所述组合物。
在一些方面，本发明还提供了所述的配体结合分子或融合蛋白在制备用于治疗受试者中新生血管形成以及由新生血管形成引起的疾病或病况的药物中的用途。
在一些方面，本发明还提供了所述的配体结合分子或融合蛋白用于治疗受试者中新生血管形成以及由新生血管形成引起的疾病或病况。
在一些方面，本发明提供了一种试剂盒，其包含如本文所述的配体结合分子或融合蛋白或药物组合物。
以上内容是一个概述，因此必要时包含细节的简化、概括和省略；因此，本领域技术人员将认识到，该概述仅是举例说明性的，并不意图以任何方式进行限制。本文所述的方法、组合物和用途和/或其他主题的其它方面、特征和优势将在本文所示的教导中变得明显。
附图说明
图1显示衍生于VEGFR2和VEGFR3的各种融合蛋白配体结合分子与VEGF-A165(图1a)、VEGF-C(图1b)或VEGF-D(图1c)结合的ELISA结果。
图2显示衍生于VEGFR2的各种配体结合分子与VEGF-C结合的ELISA结果。
图3-4分别显示各种配体结合分子对VEGFR2-VEGF C(图3a)、VEGFR2-VEGF D(图3b)、VEGFR3-VEGF C(图4a)和VEGFR3-VEGF D(图4b)之间结合的阻断ELISA结果。
图5显示衍生于VEGFR2的各种配体结合分子对VEGF-A 165(图5a)和VEGF-A 121(图5b)的结合ELISA结果。
图6分别显示各种配体结合分子对VEGFR2-VEGF A165(图6a)和VEGFR2-VEGF-A121(图6b)之间结合的阻断ELISA结果。
图7显示配体结合分子在小鼠体内的药代动力学结果。
图8显示配体结合分子在大鼠CNV模型中的治疗效果。
图9显示经糖基化修饰去除的配体结合分子对VEGF-A 165-VEGFR2(图9a)、VEGFC-VEGFR2(图9b)、VEGF D-VEGFR2(图9c)、VEGF D-VEGFR3(图9d)的阻断ELISA结果。
图10显示衍生于VEGFR1和VEGFR2的配体结合分子对VEGF-A 165-VEGFR2(图10a)、VEGF-A 165-VEGFR1(图10b)、VEGF C-VEGFR2(图10c)、VEGF D-VEGFR2(图10d)、VEGF D-VEGFR3(图10e)的阻断ELISA结果。
图11显示衍生于VEGFR1和VEGFR2的配体结合分子对VEGF-B(图11a)、PlGF(图11b)的结合ELISA结果。
图12显示经融合和糖基化改造后的配体结合分子对VEGF-A 165-VEGFR2(图12a)、VEGF C-VEGFR2(图12b)、VEGF D-VEGFR2(图12c)的阻断ELISA结果。
图13显示LFV-Q对VEGF-B(图13a)、PlGF(图13b)的结合ELISA结果。
图14显示LFV-M糖基化位点去除前后的一步纯化后的SEC单峰纯度检测结果。
图15显示LFV-Q、LFV-S、LFV-M、LFV-R分子对VEGF-A 165-VEGFR2(图15a)、VEGF-A165-VEGFR1(图15b)、VEGF C-VEGFR2(图15c)、VEGF D-VEGFR2(图15d)的阻断ELISA结果。
图16显示LFV-Q、LFV-S、LFV-M、LFV-R对VEGF-B(图16a)、PlGF(图16b)的结合ELISA结果。
图17显示LFV-Q、LFV-B、LFV-R、LFV-C对VEGF-A(图17a)、VEGF-C(图17b)、VEGF-D(图17c)的与VEGFR2-Fc相对比的ELISA结合效力。
图18a-18b显示LFV-R、LFV-Q对HUVEC细胞的增殖抑制实验结果。
图19a-19b显示LFV-R、LFV-Q对激光诱导大鼠脉络膜新生血管的治疗实验结果。
发明详述
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文引用的所有专利、专利申请和其他出版物均通过引用全文并入。如果本文中提出的定义与通过引用并入本文的专利、专利申请和其他出版物中提出的定义相冲突，则以本文中提出的定义为准。
如本文所用的，术语“VEGF”是指VEGF家族，其由VEGF糖蛋白(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和VEGF-E)。VEGF-A涵盖VEGF-A的任何形式，包括VEGF-A的天然蛋白(加工或未加工形式)、全长VEGF-A、其片段(例如截短形式、胞外/跨膜结构域)或变体(例如剪接变体、等位变体或人工改造的变体)以及其修饰形式(例如糖基化)。人体中根据不同的剪切方式存在5种VEGF-A同等型，即VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206，其中VEGF165是VEGF-A最重要的同源单体。类似地，VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D也涵盖其天然蛋白(包括加工或未加工形式)、全长或片段(例如截短形式、胞外/跨膜结构域)或变体(例如剪接变体、等位变体或人工改造的变体)以及其修饰形式(例如糖基化)。
如本文所用的，术语“血管内皮生长因子受体”或“VEGF受体”包括VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3，它们是受体酪氨酸激酶家族的成员。这三种受体的蛋白质包含由6或7个免疫球蛋白(Ig)样结构域(分别称为D1-D7)组成的大的细胞外区域、单一的跨膜(TM)螺旋和具有酪氨酸激酶活性的胞质区域以及另外的调控序列。在提及“VEGFR2”、“VEGFR1”、“VEGFR3”时，根据上下文，本文中可以指的是全长或其全部或部分细胞外结构域。人VEGFR2和VEGFR3的天然蛋白的全长氨基酸序列的示例分别是SEQ ID No:2和SEQ ID No:3。所有的VEGF-A亚型可同时结合VEGFR1和VEGFR2，VEGF-B与VEGFR-1特异性结合和激活，VEGF-E的特异性与VEGFR-2有关。VEGF-C和VEGF-D主要经由结合VEGFR3发挥作用，但也可以结合VEGFR2，不过这种结合要弱于对VEGFR3的结合。VEGF-A也可以结合VEGFR2，但同样这种结合要弱于对VEGFR1的结合。之前，由于VEGFR2可以结合多种VEGF分子，其特异性被认为不如VEGFR1，所以阿柏西普的研发主要是基于VEGFR1，而VEGFR2，尤其是其与VEGF-C和VEGF-D的结合特性至今未引起足够的重视和探究。
如本文所用的，术语“血小板衍生生长因子”或“PDGF”属于血管内皮生长因子家族，是含有糖链，相对分子量为30kD左右的多肽生长因子。PDGF基本是由A、B、C、D 4条多肽链通过二硫键形成的同源或异源二聚体分子，有PDGF-AA、BB、AB、CC、DD 5种亚型。PDGF最先发现于血小板的α颗粒中，目前已经证明二倍体细胞，如单核细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞、胚胎细胞、系膜细胞(MC)和集合管细胞等均可产生PDGF。PDGF促进周细胞迁移、募集分布，PDGF-B是机体发育过程中血管成熟和稳定极其重要的调节基因，PDGF-A、B、C有一定的促***新生的作用，尤其是PDGF-B被认为有很强的促***新生的作用，且与血管生成有一定的关系。此外，PDGF是最早被发现的***生长因子，其能促进内皮细胞、胶质细胞、成纤维细胞和血管平滑肌细胞的生长及分化，已在临床上被应用于创伤的修复治疗。
如本文所用的，术语“PDGF-AA”、“PDGF-AB”、“PDGF-BB”和“PDGF-CC”是指PDGF的二聚体形式AA、AB、BB、CC以及其片段或变体。它们一般以由二硫键固定的同型或异型二聚体与PDGF受体结合并发挥作用。PDGF A与B链既可形成同型二聚体，又可形成异型二聚体。PDGF C链主要以同二聚体形式发挥作用。实验证明PDGF是一种重要的促有丝***因子，具有刺激特定细胞群***增殖的能力，在组织的病理纤维化中具有重要作用。
PDGF受体由两种亚基α及β构成，有αα、αβ、ββ三种二聚体形式，都可以结合PDGF分子。α单位主要识别PDGF A链、B链与C链，因而αα受体可结合PDGF-AA、AB、BB与CC。β单位主要识别PDGF B链，从而ββ受体主要结合PDGF-BB。αβ受体可结合PDGF-AB、BB。PDGF分子与PDGF受体结合以后，会促进受体的二聚化，进而向下游传导信号，以自分泌、旁分泌的方式发挥促进细胞增殖与刺激细胞趋化等作用，主要在血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶质细胞等细胞中发挥作用。
如本文所用的，术语“可操作地连接”是指两个或更多个感兴趣的生物序列的并置(带有或不带有间隔区或接头或***序列)以使得它们处于允许以意图方式起作用的关系。当就多肽使用时，是指以允许连接的产物具有意图的生物学功能的方式连接多肽序列。例如，配体结合分子可以可操作地连接于免疫球蛋白恒定区，以便提供具有配体结合活性的稳定产物。又例如，配体结合分子可以与免疫球蛋白恒定区通过其间的***序列可操作地连接，并且该类***序列可以是间隔区或可以包含更长的序列。
如本文所用的，当就氨基酸序列(例如肽、多肽或蛋白质)使用时，术语“融合”或“融合的”是指两个或更多个氨基酸序列的组合，例如通过化学键合或重组的方式，形成天然不存在的单个氨基酸序列。融合氨基酸序列可以通过两个编码多核苷酸序列的遗传重组产生，并且可以通过将包含重组多核苷酸的构建体引入宿主细胞的方法来表达。
如本文所用，术语“分离的”是指通过人工方式从天然状态获得的状态。如果某种“分离的”物质或组分天然存在，则可能是因为其天然环境发生变化，或者物质与天然环境分离，或者两者兼而有之。例如，某种未分离的多核苷酸或多肽天然存在于某个活动物体内，从该天然状态分离的相同的高纯度多核苷酸或多肽被称为分离的多核苷酸或多肽。术语“分离的”既不排除混合的人造或合成物质，也不排除不影响分离的物质的活性的其他不纯物质。
如本文所用，术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽或多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。对于这些计算，比对中的缺口(如果有的话)优选通过特定的数学模型或计算机程序(即“算法”)来寻址。可以用于计算比对的核酸或多肽的同一性的方法包括在Computational MolecularBiology,(Lesk,A.M.编),1988,New York:Oxford University Press；BiocomputingInformatics and Genome Projects,(Smith,D.W.编),1993,New York:Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编),1994,New Jersey:Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis inMolecular Biology,New York:Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.和Devereux,J.编),1991,New York:M.Stockton Press；和Carillo等人,1988,SIAMJ.Applied Math.48:1073中描述的那些。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指两个分子之间，例如配体和配体结合分子之间的非随机结合反应。在某些实施方案中，本文提供的配体结合分子以≤10-6M(例如，≤5x10-7M、≤2x10-7M、≤10-7M、≤5x10-8M、≤2x10-8M、≤10-8M、≤5x10-9M、≤4x10-9M、≤3x10-9M、≤2x10-9 M、或≤10-9M)的结合亲和力(KD或写为KD)特异性结合人VEGF-A和/或人PDGF。如本文中在SPR实验中所提供的，Kd是解离常数，Ka是缔合常数，而KD是平衡解离常数(Kd/Ka)。KD可通过使用本领域已知的任何常规方法来确定，包括但不限于表面等离子体共振方法、微量热泳动法、HPLC-MS方法和流式细胞术(例如FACS)方法。
如本文所用，“阻断结合”的能力是指本发明的配体结合分子抑制两个分子(例如VEGF-A、C、D和VEGFR2，VEGF-C、D和VEGFR3)之间的结合相互作用至任何可检测程度的能力。在某些实施方案中，阻断两个分子之间的结合的配体结合分子抑制两个分子之间的结合相互作用至少85％或至少90％。在某些实施方案中，抑制可以大于85％，或大于90％。
如本文所用，术语“有效量”涉及活性化合物的量或包含活性化合物的材料、组合物或剂量的量，其在按照所需的治疗方案施用时有效用于产生与合理的益处/风险比相称的某些所需的治疗效果，例如，有效量在本文中可以指有效抑制受试者中的新生血管形成的量，有效抑制受试者中(例如眼部)VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC中的至少一种所需的量，或刺激在眼部细胞或眼睛血管中表达的VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3和PDGF受体家族的至少一种的量。
I.包含衍生于VEGFR2的氨基酸序列的配体结合分子
在一些方面，本发明提供了一种分离的配体结合分子，其能够特异性结合一种或多种VEGF/PDGF分子。所述VEGF/PDGF分子可以选自下组：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC。
优选地，所述配体结合分子能够特异性地结合VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC中的至少两种，更优选至少三种，更优选地至少四种，更优选地至少五种，更优选地至少六种，更优选地至少七种，更优选地至少八种。最优选地，所述配体结合分子对VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC都具有特异性结合亲和力。
如本文所用，表述“特异性结合…”或“对…具有特异性结合亲和力”在指生长因子时，不仅包括特异性结合该生长因子的游离、活性形式，还包括结合该生长因子的其他形式。例如，VEGF-A有多种同工型，其中一些处于循环中而另一些与细胞表面上的肝素硫酸蛋白聚糖缔合。特异性结合VEGF-A的配体结合分子结合至少一种循环中的同工型，优选所有循环中的同工型，更优选结合其他的同工型。因此，在提到配体结合分子特异性结合VEGF-A时，涵盖其能够特异性结合VEGF-A121、VEGF-A145、VEGF-A165、VEGF-A189和VEGF-A206。再比如，VEGF-C在翻译时被翻译成具有延展的氨基末端和羧基末端原肽的前体分子，其被切割而产生VEGF-C的“完全加工”形式。特异性结合VEGF-C的配体结合分子涵盖结合VEGF-C的完全加工形式，优选还涵盖结合其部分加工形式和未加工形式。
在一些实施方案中，所述配体结合分子包含一个或多个衍生于天然VEGFR2，且相比于天然VEGFR2全胞外结构域或对照配体结合分子，对VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC中一种或多种的结合亲和力显著提高。例如，所述配体结合分子相比于天然VEGFR2全胞外结构区或对照配体结合分子，对VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D中一种或多种的结合亲和力显著提高。
优选地，所述VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC是来自或衍生自哺乳动物例如人、鼠、猴的，更优选地，分别是人的天然VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC，包括其各种同工型、部分加工或未加工的前体形式。
在一些实施方案中，所述VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC中的一种或多种呈现为游离的可溶性蛋白质，或者是在细胞表面表达的锚定形式。
本发明还涵盖所述配体结合分子能够结合VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC的异常高表达形式，从而可经由结合这些异常高表达的生长因子而促进机体恢复正常机能。如本领域已知的，部分在病理状态中VEGF/PDGF/PlGF生长因子过量表达，使这些生长因子在机体组织中呈现异常功能。
在一些实施方案中，所述配体结合分子优选以约1nM或更小(例如，500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM、10pM、5pM、1pM或更小)的KD结合人VEGF-A，和/或人VEGF-C。所述配体结合分子优选以约10nM或更小(例如，5nM、1nM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM、10pM或更小)的KD结合人VEGF-D、人PDGF-AB和人PDGF-BB的至少一种。所述配体结合分子优选以约50nM或更小(例如，30nM、10nM、5nM、1nM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM、10pM或更小)的KD结合人PDGF-AA和/或人PDGF-CC。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能以50pM或更低，优选40pM或更低，更优选30pM或更低，更优选20pM或更低，更优选10pM或更低的KD结合VEGF-A和VEGF-C中的至少一种，如通过SPR测定的。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能以20nM或更低，优选15nM或更低，更优选10nM或更低，更优选5nM或更低，更优选3nM或更低的KD结合VEGF-D，如通过SPR测定的。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能以1nM或更低，优选0.5nM或更低，更优选0.4nM或更低，更优选0.3nM或更低，更优选0.2nM或更低的EC50结合VEGF-C；能以1nM或更低，优选0.5nM或更低，更优选0.4nM或更低，更优选0.3nM或更低，更优选0.2nM或更低，更优选0.1nM或更低的EC50结合VEGF-A(例如VEGF-A165)，如通过ELISA测定的。
在一些实施方案中，所述配体结合分子能以50nM或更低，优选40nM或更低，更优选30nM或更低，更优选28nM或更低，更优选26nM或更低，更优选24nM或更低，更优选22nM或更低，更优选20nM或更低，更优选18nM或更低，更优选15nM或更低，更优选10nM或更低的KD结合PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC中的至少一种，优选至少两种，优选至少三种，更优选全部四种，如通过SPR测定的。
在一些实施方案中，本文所公开的配体结合分子能够阻断选自以下的一种或多种生长因子与受体之间的结合：
(a)VEGF-A与VEGFR-1、VEGFR-2或PDGFR-α；
(b)VEGF-B、PlGF与VEGFR-1
(c)VEGF-C与VEGFR-2或VEGFR-3；
(d)VEGF-D与VEGFR-2或VEGFR-3；
(e)PDGF-A与PDGFR-α；
(f)PDGF-B与PDGFR-α或PDGFR-β；
(g)PDGF-C与PDGFR-α；
(h)PDGF-D与PDGFR-β。
任选地，所述配体结合分子能够阻断选自以下的一种或多种生长因子与受体之间的结合：
(a)VEGF-A、B、C、D中的任一种与PDGFR-α或人PDGFR-β；
(b)PDGF-A、B、C、D中的任一种与VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-α和PDGFR-β中的任一种。
如实施例所验证的，本文公开的配体结合分子能以相比于天然VEGFR2分子或对照配体结合分子更低的EC50(例如低于1nM、低于0.5nM、低于0.4nM)阻断VEGF-C或VEGF-D与VEGFR-2或VEGFR-3的结合。
如本领域已知的，VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-α和PDGFR-β中的任一种或多种可以是以同源二聚化形式与VEGF/PDGF生长因子结合而被激活，也可以是以任意异源二聚化形式与VEGF/PDGF生长因子结合而被激活。以人VEGFR-2为例，其相应形成的二聚化形式包括但不限于，人VEGFR2-人VEGFR2、人VEGFR2-人VEGFR1、人VEGFR2-人VEGFR3、人VEGFR2-人PDGFRα、人VEGFR2-人PDGFRβ二聚体。因此，在本文中提及阻断生长因子与受体之间的结合时，涵盖阻断生长因子与处于各种形式(例如单体、同源二聚体或异源二聚体等)的受体之间的结合。
在一些实施方案中，所述配体结合分子包含一个或多个衍生于VEGFR2(特别是VEGFR2的胞外区)的氨基酸序列，所述衍生于VEGFR2的氨基酸序列是VEGFR2的片段或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。具体地，所述VEGFR2的片段可选自以下：
(a)SEQ ID NO:2的位置20-116限定的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2的位置46-110限定的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:2的位置117-218限定的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2的位置141-207限定的氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:2的位置219-327限定的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2的位置224-320限定的氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:2的位置328-421限定的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2的位置328-414限定的氨基酸序列；和
(e)(a)、(b)、(c)或(d)的N末端或C末端截短或延长片段(例如截短或延长不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸)。
所述配体结合分子可以包含两个或更多个衍生于VEGFR2胞外区的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衍生于VEGFR2胞外区的氨基酸序列是VEGFR2(优选人VEGFR2)胞外区的片段。两个或更多个衍生于VEGFR2胞外区的氨基酸序列彼此之间可以直接连接或经由间隔区连接，或者，在所述配体结合分子为双链二聚体的情况下，可以在两条分别的链上。
在一些实施方案中，所述配体结合分子包含(b)的N末端截短片段，例如SEQ IDNO:2的位置123-218限定的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述配体分子包含(b)和(c)的氨基酸序列两者，例如(b)的氨基酸序列直接连接于(c)的氨基酸序列，即SEQ ID NO:2的位置117-327限定的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述配体分子包含(b)的N末端截短片段和(c)的氨基酸序列两者，例如(b)的N末端截短的片段直接连接于(c)的氨基酸序列，即SEQID NO:2的位置123-327限定的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的配体结合分子包含如SEQ ID NO:2的位置20-116所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置117-218所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置219-327所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置328-421所示的氨基酸序列、或与上述序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的配体结合分子包含如SEQ ID NO:2的位置117-327所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置23-327所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置117-421所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置23-421所示的氨基酸序列、或与上述序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有同一性的氨基酸序列是如SEQ ID NO:2的位置20-116所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置117-218所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置219-327所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置328-421所示的氨基酸序列、如SEQ IDNO:2的位置117-327所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置23-327所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置117-421所示的氨基酸序列、或如SEQ ID NO:2的位置23-421所示的氨基酸序列的N末端和/或C末端截短和/或延伸后的片段。优选地，所述截短或延伸不多于40个氨基酸，例如不多于30个氨基酸，不多于20个氨基酸，不多于15个氨基酸、不多于10个氨基酸、不多于8个氨基酸、不多于6个氨基酸、不多于5个氨基酸、不多于4个氨基酸、不多于3个氨基酸、不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸。在一些特定的实施方案中，本文所述的配体结合分子包含如SEQ ID NO:2的位置123-218所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:2的位置123-327所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有同一性的氨基酸序列相比于如SEQ ID NO:2的位置20-116所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置117-218所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置219-327所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置328-421所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置117-327所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置23-327所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2的位置117-421所示的氨基酸序列、或如SEQ ID NO:2的位置23-421所示的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸修饰，例如氨基酸的取代、***、缺失等。所述氨基酸修饰可以是在糖基化位点的突变以消除糖基化位点，例如消除N糖基化位点或O糖基化位点。在一些实施方案中，所述修饰是在SEQ ID NO:2的位置Asn46、Asn66、Asn96、Asn143、Asn158、Asn245和Asn318中一处或多处的突变。
II.包含衍生于VEGFR2以及衍生于其他受体的氨基酸序列的配体结合分子
在一些方面，本发明的配体结合分子除了包含衍生于VEGFR2的氨基酸序列以外，还包含衍生于其他受体的氨基酸序列，用于改进对VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PlGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC中至少一种的结合或阻断。其他受体可以是其他受体酪氨酸激酶，如VEGFR-1、VEGFR-3、PDGFR-α和/或人PDGFR-β。
在一些实施方案中，本公开的配体结合分子包含一个或多个衍生于VEGFR2的氨基酸序列以及一个或多个衍生于VEGFR3(例如人VEGFR3，特别是VEGFR3的胞外区)的氨基酸序列。具体地，所述衍生于VEGFR2的氨基酸序列可操作地连接于衍生于VEGFR3的氨基酸序列。所述可操作地连接可以是彼此直接连接或经由间隔区相连接。
在一些实施方案中，所述衍生于VEGFR3的氨基酸序列是VEGFR3的片段或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。具体地，所述VEGFR3的片段可选自以下：SEQ ID NO:3的位置25-115限定的氨基酸序列；SEQ ID NO:3的位置154-210限定的氨基酸序列；SEQ ID NO:3的位置248-314限定的氨基酸序列；SEQ ID NO:3的位置25-210限定的氨基酸序列；SEQ IDNO:3的位置154-314限定的氨基酸序列；SEQ ID NO:3的位置25-314限定的氨基酸序列；和上述任一项的N末端或C末端截短和/或延长片段(例如截短或延长不超过40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸)。
所述配体结合分子可以包含两个或更多个衍生于VEGFR3(优选人VEGFR3)胞外区的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述衍生于VEGFR3胞外区的氨基酸序列是人VEGFR3胞外区的片段。在包含两个或更多个衍生于VEGFR3胞外区的氨基酸序列的情况下，所述彼此之间可以直接连接或经由间隔区连接，或者，在所述配体结合分子为双链二聚体的情况下，可以在两条分别的链上。
在一些实施方案中，本文所述的配体结合分子包含如SEQ ID NO:3的位置25-210所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3的位置25-314所示的氨基酸序列、或与上述序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有同一性的氨基酸序列是如SEQ ID NO:3的位置25-210所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:3的位置25-314所示的氨基酸序列的N末端或C末端截短后的片段。例如，所述截短不多于40个氨基酸，例如不多于30个氨基酸，不多于20个氨基酸，不多于15个氨基酸、不多于10个氨基酸、不多于8个氨基酸、不多于6个氨基酸、不多于5个氨基酸、不多于4个氨基酸、不多于3个氨基酸、不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸。在一些特定的实施方案中，本文所述的配体结合分子包含如SEQ ID NO:3的位置47-210所示的氨基酸序列所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，具有同一性的氨基酸序列相比于如SEQ ID NO:3的位置25-210所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO:3的位置25-314所示的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸修饰，例如氨基酸的取代、***、缺失等。
如本领域已知的，间隔区可以采用多种形式。在一些实施方案中，间隔区为肽序列，其长度在1-100个氨基酸之间，优选1-50个氨基酸。在一些实施方案中，间隔区衍生于天然VEGFR-2或VEGFR-3中对应位置处的连接序列(即衍生片段的序列两端处的连接序列)。在一些实施方案中，间隔区包含与连接天然人VEGFR-2或人VEGFR-3中的片段的天然肽序列或其部分至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％相同的氨基酸序列。
备选地，所述间隔区可以使用或不被使用，可以是本领域中常用的接头序列，例如(G4S)n、AAA或其他天然短肽序列。如本领域技术人员将理解的，间隔区可以具有较广范围的氨基酸序列。
在一些具体的实施方案中，衍生于人VEGFR3的氨基酸序列与衍生于人VEGFR2的氨基酸序列经由间隔区相连接，其中衍生于人VEGFR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的位置25-210限定的氨基酸序列，衍生于人VEGFR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:2的位置219-327限定的氨基酸序列，间隔区包含与SEQ ID NO:3的位置211-231或SEQ ID NO:2的位置211-220限定的氨基酸序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性的氨基酸序列。所述衍生于人VEGFR3的氨基酸序列可以在衍生于人VEGFR2的氨基酸序列的N末端或C末端。
在一些实施方案中，本公开的所述配体结合分子包含一个或多个衍生于VEGFR2的氨基酸序列以及一个或多个衍生于VEGFR1(例如人VEGFR1，特别是VEGFR1的胞外区)的氨基酸序列。具体地，所述其中衍生于VEGFR2的氨基酸序列可操作地连接于衍生于VEGFR3的氨基酸序列。所述可操作地连接可以是为直接彼此直接连接或经由间隔区相连接。
在一些实施方案中，所述衍生于VEGFR1的氨基酸序列是VEGFR1的片段或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。具体地，所述VEGFR1的片段可选自以下：SEQ ID NO:1的位置132-230限定的氨基酸序列和其的N末端和/或C末端截短和/或延长后的片段(例如截短或延长不超过40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸)。
在一些实施方案中，具有同一性的氨基酸序列相比于如SEQ ID NO:1的位置132-230所示的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸修饰，例如氨基酸的取代、***、缺失等。
在一些方面，所述配体结合分子包含一个或多个衍生于VEGFR2的氨基酸序列以及一个或多个衍生于VEGFR1的氨基酸序列。具体地，所述衍生于VEGFR2的氨基酸序列可操作地连接于衍生于VEGFR1的氨基酸序列。所述可操作地连接可以是彼此直接连接或经由间隔区相连接。在一些实施方案中，所述衍生于VEGFR1的氨基酸序列是VEGFR1的片段或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述VEGFR1的片段选自如SEQ IDNO:1的位置132-230所示的氨基酸序列，或其N末端和/或C末端的截短和/或延长后的片段。
III.包含Fc区以及任选地信号肽的配体结合分子
本发明的配体结合分子可以是单体(即单链)，也可以是二聚体(即双链)或多聚体。在二聚体或多聚体结构中，配体结合分子的各个链彼此共价或非共价连接。在一些实施方案中，连接发生在配体结合分子的VEGFR-2衍生的序列之间。
在一些实施方案中，本发明提供的配体结合分子还包含免疫球蛋白恒定结构域序列，例如人IgG的恒定结构域序列，更具体地可包含铰链区和Fc区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc区序列。所述免疫球蛋白恒定结构域序列可以通过接头连接至衍生自VEGFR1和/或VEGFR2和/或VEGFR3的序列。如本领域已知的，Fc是指由抗体的第一重链的第二和第三恒定区经由二硫键合结合至第二重链的第二和第三恒定区组成的抗体的部分，任选地Fc区还包含全部或部分的铰链区。本文中的Fc区既包括野生型Fc区还包括其变体，具有用于多种目的的不同突变。所述变体可在Fc区中包含一个或多个氨基酸残基修饰，例如取代。
在某些实施方案中，Fc区变体包含一个或多个氨基酸取代，其改善对新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合。这样的变体可以具有延长的药代动力学半衰期，因为它在酸性pH结合FcRn从而使其能够逃离溶酶体中的降解并然后被转运并释放出细胞。工程化抗体分子以改善与FcRn的结合亲和力的方法在本领域中是众所周知的，参见，例如，Vaughn，D.等人，Structure，6(1):63-73，1998；Kontermann，R.等人，Antibody Engineering，Volume 1,Chapter 27:Engineering of the Fc region for improved PK,Springer,2010；Yeung,Y.等人,Cancer Research,70:3269-3277(2010)；和Hinton,P.等人,J.Immunology,176:346-356(2006)。
在某些实施方案中，Fc区变体包含一个或多个改变抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，或者通过改善或减少C1q结合和/或CDC来改变补体依赖性细胞毒性(CDC)的氨基酸取代。
在某些实施方案中，本发明提供的配体结合分子包含人IgG4恒定区，其中第228个氨基酸残基被改变，例如Ser228Pro(S228P，其可以防止或减少链交换)，和/或第235个氨基酸残基被改变，例如Leu235Glu(L235E，其可以改变Fc受体相互作用。
在某些实施方案中，本发明提供的配体结合分子在Fc区的界面中包含一个或多个氨基酸取代，以协助和/或促进异二聚化。这些修饰包括将突起引入第一Fc多肽中和将腔引入第二Fc多肽中，其中突起可以位于腔中以促进第一和第二Fc多肽的相互作用而形成异二聚体或复合物。生成具有这些修饰的蛋白分子的方法在本领域中是已知的，例如，如在美国专利号5,731,168中所述。
在某些实施方案中，本发明提供的配体结合分子包含人IgG1的天然Fc序列，如SEQID NO:31的Asp104-Lys330所示。在一些实施方案中，本发明提供的配体结合分子包含与SEQ ID NO:31的位置104-330的氨基酸序列具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少92％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％同一性或具有100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述配体结合分子还在氨基末端包含信号肽，以便于在细胞中分泌和纯化。
IV.配体结合分子的性质
在本发明中，发现了包含衍生自VEGFR2的一个或多个氨基酸序列(和/或衍生于其他受体的氨基酸序列)的配体结合分子对VEGF-A、VEGF-C与VEGF-D，尤其是对VEGF-C、VEGF-D的结合与阻断能力。在一些实施方案中，所述配体结合分子具有明显改进的对VEGF-A、VEGF-C与VEGF-D的结合或阻断能力，其中对VEGF-A的结合或阻断能力优于贝伐单抗(Avastin)、接近或优于阿柏西普(Eylea)，对VEGF-C与VEGF-D的结合或阻断能力均明显优于对照品OPT。所述配体结合分子可经由阻断VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、PDGF家族分子从而有效的抑制血管新生，在多种疾病特别是眼科疾病或肿瘤疾病治疗中发挥作用。
本发明发现所述配体结合分子可阻断VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D三种分子与受体的结合，并且还可结合PDGF分子。如实施例中所验证的：
1)如通过Biacore测定的，LFV-B与VEGF-C结合的KD比对照品OPT强5.6倍，LFV-E的KD略优于OPT；在VEGF-C阻断实验中，LFV-B的EC50比OPT强1.4-2.2倍(分别为对VEGFR2与VEGFR3的与VEGF-C结合的阻断实验)，LFV-C的EC50比OPT强1.3-2.4倍，LFV-E的EC50比OPT强1.57-2.2倍，而作为对照的Avastin与Eylea无法阻断。
2)如通过Biacore测定的，LFV-B与VEGF-D结合的KD比OPT强7.8倍，LFV-E的KD略优于OPT；在VEGF-D阻断实验中，LFV-B的EC50比OPT强4.7-7.4倍(分别为对VEGFR2与VEGFR3的与VEGF-D结合的阻断实验)，LFV-C的EC50比OPT强4.6-5.9倍，LFV-E的EC50比OPT强4.8-3.8倍，而作为对照的Avastin与Eylea无法阻断。
3)如通过Biacore测定的，LFV-B与VEGF-A结合的KD为9.3pM，接近或类似于Eylea；在VEGF-A 165-VEGFR2阻断ELISA实验中，LFV-B的EC50为4.67nM，介于Avastin(6.68nM)与Eylea(3.2nM)之间，LFV-C的EC50为4.57nM，与LFV-B接近；在VEGF-A 121-VEGFR2阻断ELISA实验中，LFV-B的EC50为7.63nM，优于Avastin(22.37nM)与Eylea(9.55nM)，LFV-C的EC50为9.35nM，接近Eylea，优于Avastin。
4)在鼠AMD眼科体内实验中，相比对照药Eylea，LFV-B和LFV-C亦展现出更好的改善趋势。
进一步的，在本发明中，发现了包含衍生自VEGFR2的一个或多个氨基酸序列可操作地连接于衍生自VEGFR1的一个或多个氨基酸序列的新型配体结合分子(例如LFV-M、LFV-N、LFV-Q、LFV-R、LFV-S)，在一些实施方案中，所述配体结合分子具有进一步改进的对VEGF-A的结合或阻断能力，同时良好的保留了对VEGF-C与VEGF-D的结合或阻断能力，以及具有了对VEGF-B、PlGF的结合能力，如实施例中所验证的：
1)在VEGF-A 165-VEGFR2阻断ELISA实验中，LFV-M、LFV-N的EC50分别为1.60、1.87nM，优于未经与VEGFR1融合的原始分子LFV-C(3.18nM)，也优于对照药Eylea(2.23nM)与Avastin(4.58nM)；在VEGF-A 165-VEGFR1阻断ELISA实验中，LFV-M、LFV-N的EC50分别为3.14、3.30nM，优于Eylea(4.64nM)与Avastin(7.31nM)。
2)在VEGF-C-VEGFR2阻断ELISA实验中，LFV-M、LFV-N的EC50分别为27.6、27.3nM，接近LFV-C(26.2nM)，略优于对照品OPT(32.1nM)。
3)在VEGF-D-VEGFR2阻断ELISA实验中，LFV-M、LFV-N的EC50分别为2.17、1.79nM，接近LFV-C(2.30nM)，明显优于对照品OPT(24.59nM)；在VEGF-D-VEGFR3阻断ELISA实验中，LFV-M、LFV-N的EC50分别为2.74、2.31nM，接近LFV-C(2.62nM)，亦明显优于对照品OPT(25.22nM)。
4)同时在VEGF-B、PlGF的结合ELISA实验中，LFV-M、LFV-N亦展现出较好的结合能力，而LFV-C则呈现极弱的结合。
进一步的，本发明中发现在对LFV-M进行N糖基化去除以后，所得到的分子LFV-R具有更进一步优化的对VEGF家族分子的阻断效力，以及对VEGF-B、PlGF分子的结合效力，如实施例中所验证的：
(1)在VEGF A 165-VEGFR2的结合阻断ELISA实验中，LFV-R的EC50为1.901nM，优于LFV-M的2.645nM，也优于对照药Eylea(3.937nM)；在VEGF A 165-VEGFR1的结合阻断ELISA实验中，LFV-R的EC50为6.972nM，优于LFV-M的7.797nM，接近对照药Eylea(6.959nM)。
(2)在VEGF D-VEGFR2的结合阻断ELISA实验中，LFV-R的EC50为4.933nM，优于LFV-M的5.623nM。
(3)在对VEGF-B的结合实验中，LFV-R的EC50为125.6ng/ml，优于LFV-M的181.7ng/ml。
(4)在对PlGF的结合实验中，LFV-R的EC50为32.01ng/ml，优于LFV-M的43.85ng/ml。
V.多核苷酸、载体和宿主细胞
在一些方面，本发明还提供编码此类配体结合分子的多核苷酸。所述多核苷酸可用于表达配体结合分子。在一些实施方案中，所述多核苷酸还可以用作用于实现多肽配体结合分子的体内表达的呈活性形式的治疗剂。
在某些实施方案中，分离的多核苷酸包含编码以下氨基酸序列中至少一种的核苷酸序列和/或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列，和/或其仅具有简并取代的变体：
(a)SEQ ID NO:2的位置117-218所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:2的位置117-327或123-327所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:2的位置117-421所示的氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:2的位置23-327所示的氨基酸序列；和
(e)SEQ ID NO:2的位置23-421所示的氨基酸序列。
任选地，所述多核苷酸进一步包含编码以下氨基酸序列中至少一种的核苷酸序列和/或与其具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列，和/或其仅具有简并取代的变体：
(i)SEQ ID NO:3的位置25-115或47-115所示的氨基酸序列；
(ii)SEQ ID NO:3的位置154-210所示的氨基酸序列；
(iii)SEQ ID NO:3的位置248-314所示的氨基酸序列；和
(iv)SEQ ID NO:1的位置132-230所示的氨基酸序列。
编码所述配体结合分子的多核苷酸易于使用本领域已知的常规程序进行分离和测序。所述多核苷酸也可以通过合成方法获得。优选地，所述多核苷酸经过密码子优化以便在真核宿主细胞，特别是哺乳动物细胞中表达。
使用已知的重组技术，可以将编码配体结合分子的多核苷酸***载体中以进一步克隆(DNA的扩增)或表达。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标志物基因、增强子元件、启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)以及转录终止序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包含本文提供的编码配体结合分子的多核苷酸的载体(例如表达载体)，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个启动子(例如SV40、CMV、EF-1α)，和至少一个选择标志物。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)，腺病毒，腺伴随病毒，疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)，痘病毒，杆状病毒，***瘤病毒，乳多空病毒(例如SV40)，λ噬菌体，和M13噬菌体，脂质体，质粒pcDNA3.3，pMD18-T，pOptivec，pCMV，pEGFP，pIRES，pQD-Hyg-GSeu，pALTER，pBAD，pcDNA，pCal，pL，pET，pGEMEX，pGEX，pCI，pEGFT，pSV2，pFUSE，pVITRO，pVIVO，pMAL，pMONO，pSELECT，pUNO，pDUO，Psg5L，pBABE，pWPXL，pBI，p15TV-L，pPro18，pTD，pRS10，pLexA，pACT2.2，pCMV-SCRIPT.RTM，pCDM8，pCDNA1.1/amp，pcDNA3.1，pRc/RSV，PCR2.1，pEF-1，pFB，pSG5，pXT1，pCDEF3，pSVSPORT，pEF-Bos等。
可以将包含编码配体结合分子的多核苷酸序列的载体导入宿主细胞用于进行克隆或基因表达。用于在本文的载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是原核生物、酵母或更高等的真核细胞。为此目的合适的原核生物包括真细菌，例如革兰氏阴性或***，如大肠杆菌。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是用于提供的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母或普通的面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其他属、种和菌株在本文中是普遍可获得的和有用的。
用于表达本文提供的配体结合分子的合适宿主细胞也可以衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定出来自寄主的许多杆状病毒株和变体以及相应的允许的昆虫寄主细胞。然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，并且在培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(在悬浮培养中亚克隆生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人***细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人类肝癌细胞系(Hep G2)。在一些优选的实施方案中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一些另外的优选的实施方案中，宿主细胞是其他哺乳动物细胞系，例如人细胞系。
用上述表达或克隆载体转化宿主细胞用于产生配体结合分子并在经适当修饰的常规营养培养基中培养用于诱导启动子，选择转化子或扩增编码所需序列的基因。
用于产生本文提供的配体结合分子的宿主细胞可以在多种培养基中培养。诸如Ham的F10(Sigma)，基本必需培养基(MEM)，(Sigma)，RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良的Eagle's培养基(DMEM)，Sigma)的可商购获得的培养基都适合于培养宿主细胞。另外，Ham等人,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes等人,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或U.S.Pat.Re.30,985中描述的任何培养基可以用作宿主细胞的培养基。这些培养基中的任何一种可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)，缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷)，抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)，微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)，和葡萄糖或等效能量来源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其他必要的补充剂。培养条件，例如温度、pH等是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员而言是显而易见的。
当使用重组技术时，配体结合分子可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果配体结合分子在细胞内产生，则第一步，例如通过离心或超滤除去宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。可以通过离心去除细胞碎片。在配体结合分子分泌到培养基中的情况下，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器，例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元，浓缩来自这种表达***的上清液。蛋白酶抑制剂例如PMSF可以包括在上述任何步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止不定污染物的生长。
由细胞制备的配体结合分子可以使用例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱来纯化，其中亲和色谱是优选的纯化技术。
在某些实施方案中，固定化在固相上的蛋白A用于配体结合分子的免疫亲和纯化。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于在配体结合分子中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。亲和配体所附着的基质最通常是琼脂糖，但也可以使用其他基质。机械稳定的基质(例如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允许比琼脂糖所实现的更快的流速和更短的处理时间。其他蛋白质纯化技术，例如在离子交换柱上的分馏，乙醇沉淀，反相HPLC，在硅胶上的色谱，在肝素SEPHAROSETM色谱上在阴离子或阳离子交换树脂上的色谱(例如聚天冬氨酸柱)，色谱聚焦，SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也可用，取决于要回收的抗体。
VI.缀合物
在一些方面，本发明还提供包含配体结合分子和与其缀合的缀合物模块的缀合物。缀合物模块是可以附着至配体结合分子的部分。涵盖多种缀合物模块可以与本文提供的配体结合分子连接(参见，例如，“Conjugate Vaccines”,Contributions toMicrobiology and Immunology,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编),Carger Press,NewYork,(1989))。这些缀合物模块可以通过共价结合、亲和力结合、***(intercalation)、配位结合、络合、缔合、掺合或加入等方法与配体结合分子连接。
在某些实施方案中，可以将本文公开的配体结合分子工程化为在配体结合部分之外包含可以用于结合一种或多种缀合物模块的特异性位点。例如，这样的位点可以包括一个或多个反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸或组氨酸残基，以协助与缀合物模块的共价连接。
在某些实施方案中，所述缀合物包含将缀合物模块连接至所述配体结合分子的连接子。在一些其他实施方案中，本文所述的配体结合分子在C末端通过肽键直接附接到缀合物模块的N末端氨基酸，或在N末端通过肽键直接附接到缀合物模块的C末端氨基酸。亦可以通过化学键，包括但不限于酰胺键与缀合物模块连接形成多肽链。在某些实施方案中，配体结合分子可以间接地或通过第二缀合物模块与第一缀合物模块连接。例如，可以将配体结合分子与生物素缀合，然后间接地缀合至与抗生物素蛋白缀合的第二缀合物模块。缀合物模块可以是清除修饰(clearance modifying)模块、毒素(例如化学治疗剂)、可检测标记(例如放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记或酶-底物标记)或纯化模块。
“毒素”可以是对细胞有害或可以损害或杀死细胞的任何试剂。毒素的实例包括但不限于紫杉醇，细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，依米丁，丝裂霉素，依托泊苷，替诺泊苷，长春新碱，MMAE，MMAF，DM1，长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟基蒽醌二酮，米托蒽醌，光辉霉素，放线菌素D，1-去氢睾酮，糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，***，嘌呤霉素及其类似物，抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶脱羧嗪)，烷基化剂(例如甲乙胺、噻菌灵苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)，蒽环类药物(例如柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如放线菌素(以前称为更生霉素)、博来霉素、光神霉素和蒽霉素(AMC))，抗有丝***剂(例如长春新碱和长春花碱)，拓扑异构酶抑制剂和微管蛋白结合剂。
可检测标记的实例可以包括荧光标记(例如荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红)，酶-底物标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、萤光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)，放射性同位素(例如123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其他镧系元素)，发光标记，发色团部分，洋地黄毒苷，生物素/亲和素，DNA分子或用于检测的金。
在某些实施方案中，缀合物模块可以是清除修饰剂，其帮助增加配体结合分子的半衰期。示例说明性实例包括水溶性聚合物，例如PEG、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支链的或非支链的。附着至配体结合分子的聚合物的数量可以变化，并且如果附着多于一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。在一些具体的实施方案中，本发明提供的配体结合分子缀合于至少一个聚乙二醇模块，所述聚乙二醇模块可以附接于配体结合分子的氨基末端。
在某些实施方案中，缀合物模块可以是纯化模块，例如磁珠。
VII.药物组合物
在一些方面，本发明提供包含与药学上可接受的载体一起配制的本发明的配体结合分子的组合物，例如药物组合物。这类组合物包含至少一种本发明的配体结合分子、融合蛋白或缀合物。在一些实施方案中，所述药物组合物为适合于玻璃体内注射的制剂。
如本文所使用的，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有药学上可接受的液体、凝胶或固体载体、水性媒介物、非水媒介物、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮液/分散剂、隔绝剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒的辅助物质，本领域已知的其他组分或其各种组合等等。所述载体可以适于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊髓、经表皮、玻璃体内注射或植入施用等。取决于给药途径，活性化合物，即本发明的成分，可以包被在材料中以防止所述化合物免受酸和其它可能灭活所述化合物的自然条件的作用。
本发明的药物组合物还可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等等。
可用于本发明的药物组合物中的适当的水性载体和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)和其适当的混合物、植物油如橄榄油及可注射的有机酯如油酸乙酯。例如，可以通过利用包衣材料(如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过维持所需要的颗粒大小和通过利用表面活性剂维持适当的流动性。
这些组合物还可包含辅助剂如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过灭菌方法和通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等等)可以确保防止微生物的存在。将等渗剂如糖、氯化钠等等包括入所述组合物也可能是期望的。此外，通过包含延迟吸收的物质如单硬脂酸铝和明胶，可以引起注射药物形式的吸收延长。
药物组合物可以是固体、糊剂、软膏、凝胶、液体、气雾剂、喷雾剂、聚合物、薄膜、乳液或混悬液形式。
在某些实施方案中，药物组合物配制成可注射的组合物。可以以任何常规形式制备可注射药物组合物，例如液体溶液，悬浮剂，乳剂或适于产生液体溶液、悬浮剂或乳剂的固体形式。用于注射的制备物可以包括准备注射的无菌和/或非热解溶液，无菌干燥可溶产品，如冻干粉，准备在使用前与溶剂混合，包括皮下注射片剂，准备注射的无菌悬浮液，准备在使用前与媒介物组合的无菌干燥的不溶性产品，以及无菌和/或非热解乳液。溶液可以是水性或非水性的。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。用于药学上活性物质的这类介质和试剂在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，可以考虑任何常规介质或试剂在本发明的药物组合物中的使用。补充活性化合物也可以被加入所述组合物中。
药物组合物通常必须是无菌的并且在制造和储存的条件下是稳定的。所述组合物可以被配制为溶液、微乳剂、脂质体或其它适于高药物浓度的有序结构。所述载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等等)及其适当的混合物。例如，通过利用包衣(如卵磷脂)、在分散剂的情况下通过维持所需要的颗粒大小和通过利用表面活性剂可以维持适当的流动性。在很多情况下，优选在所述组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨醇)或氯化钠。通过将延迟吸收的物质(例如单硬脂酸盐和明胶)包括在所述组合物内可以引起可注射组合物的吸收延长。
可以通过将活性化合物以需要的量与按照需要的上文列举的组分之一或其组合一起加入适当的溶剂中，然后无菌微过滤制备无菌注射溶液。通常，可以通过将所述活性化合物加入包含基本分散介质和来自上文列举的物质的其它需要的组分的无菌载体中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何附加的需要成分的粉末。
可以与载体物质结合以产生单一剂型的活性成分的量取决于所治疗的对象和特定施用模式。可以与载体结合以产生单一剂型的活性成分的量一般是产生治疗效应的组合物的量。通常，以100％算，该量的范围为约0.01％至约99％的活性成分，优选从约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％的活性成分与药学上可接受的载体组合。
调节给药方案以提供最佳的期望反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随着时间施用几个分开的剂量，或者可以根
据治疗情况的紧迫性而按比例减少或增加所述剂量。由于便于施用和剂量的均匀性，将药物组合物配制成单位剂型是特别有利的。如本文所使用，单位剂型是指适合作为用于待治疗对象的单一剂量的物理上分散的单位；各单元包含与需要的药物载体结合的适于产生期望治疗效应的预定量的活性化合物。本发明的单位剂型的规格由以下因素规定并直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特性质和待实现的特定治疗效应，和(b)在配制这类活性化合物用于治疗个体敏感性的领域中固有的限制。
对于所述配体结合分子的施用，剂量范围为宿主体重的约0.0001至100mg/kg，并更通常是0.01至5mg/kg。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性的治疗方案包括每周施用一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、一月一次、每3个月一次或每三至6个月一次。
可选地，所述配体结合分子可以作为缓释制剂进行施用，在这种情况下需要较低频度的施用。剂量和频率随所施用的物质在患者中的半衰期而变化。施用的剂量和频率可以取决于治疗是预防性或者是治疗性的。在预防性应用中，以相对不频繁的间隔在长时间内施用以相对低的剂量施用。一些患者在他们的余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时要求相对短的时间间隔和相对高的剂量，直到疾病的进展被减缓或终止，并优选直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善。其后，可以给予患者预防性方案。
活性成分和小分子在本发明的药物组合物中的实际剂量水平可以有所变化，以便获得对特定患者、组成和施用模式有效实现期望治疗响应而对所述患者无毒性的活性成分的量。所选择的剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括所使用的本发明的特定组合、或者其酯、盐或酰胺的活性、给药途径、施用时间、使用的特定化合物的***速率、治疗持续时间、与所使用的特定组合联合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗患者的年龄、性别、体重、病症、总体健康状况和在先病史、以及医学领域内熟知的类似因素。
VIII.配体结合分子的使用方法
在一些方面，本发明提供一种抑制、预防或治疗受试者中的新生血管形成以及由新生血管形成引起的疾病或病况的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的配体结合分子、其缀合物或药物组合物。所述新生血管形成包括视网膜新生血管形成和/或脉络膜新生血管形成；所述疾病或病况包括息肉状脉络膜血管病变、视网膜新生血管形成、与眼底渗漏有关的眼部病症。
在一些实施方案中，所述眼部病症选自老年黄斑变性、糖尿病性眼部病症、息肉状脉络膜血管病变、眼底纤维化病变、视网膜静脉阻塞相关病变、早产儿视网膜病变和黄斑毛细血管扩张。优选地，本文所述的包含配体结合分子的药物组合物通过滴眼、通过玻璃体注射、通过玻璃体内植入物从而被局部施用于受试者的眼睛。
在一些实施方案中，本文公开的配体结合分子、其缀合物或药物组合物可以以单次施用或多次施用的方式施用。优选地，通过单次施用即能实现期望的治疗效果，而无需与其他靶向治疗药物一起施用。
在一些实施方案中，本文公开的配体结合分子、其缀合物或药物组合物可以单独施用或者与一种或多种另外的治疗手段或试剂组合施用。例如，本文公开的配体结合分子、其缀合物或药物组合物可以与另外的治疗剂，例如化学治疗剂，或其他治疗方法联用实施。例如，在眼部疾病的治疗实施中，其他治疗方法包括激光光凝术、玻璃体切除术等。
在这些实施方案的某些中，与一种或多种另外的治疗剂组合施用的本文公开的配体结合分子、其缀合物或药物组合物可以与一种或多种另外的治疗剂同时或顺序地或交替地施用。与另一种治疗剂“组合”施用的配体结合分子不必与该试剂同时或在相同的组合物中施用。即使在配体结合分子和第二种试剂经由不同途径施用的情况下，在本文中使用的短语也认为在另一种试剂之前或之后施用的配体结合分子与该试剂“组合”施用。在可能的情况下，根据另外的治疗剂产品信息表中列出的时间表或根据Physicians's DeskReference 2003(Physicians'Desk Reference,57th Ed；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；57th edition(November 2002))或本领域众所周知的方案施用与本文公开的配体结合组合施用的另外的治疗剂。
在一些方面，本发明还提供试剂盒，其包含所述配体结合分子、其缀合物或药物组合物。
IX.本发明的有益效果
在肿瘤生长、眼科血管增生等与血管新生相关的疾病中，抑制血管新生是一种有效的治疗手段。在过去几十年中，对VEGF相关信号进行了大量的研究，并且有许多药物用于治疗。为了突破单一靶向疗法的局限，同时靶向PDGF-BB与VEGF-A曾被寄予厚望，抑制PDGF-BB可使周细胞凋亡，从而打破对抗VEGF-A治疗的抗药性，另外PDGF-BB与组织的纤维化病变密切相关，眼底纤维化是AMD的晚期发展形式和致盲原因所在，是VEGF-A疗法最终失效的一大原因(Rofagha S.等人(2013),J.Ophthalmology.120(11):2292-2299)(Rosenfeld P.J.等人(2011)，Ophthalmology.118(3):523-530)。在靶向PDGF疗法中比较引人注目的是诺华公司引入的PDGF-BB拮抗剂E10030以及艾伯维公司研发的双特异性抗体ABBV642，前者在对AMD的一二期临床试验中取得比单一使用雷珠单抗更有效的疗效，而且对眼底纤维化有较明显的改善效果，尽管在更大规模的三期临床试验中E10030相比单一靶向VEGF-A疗法并未展现出比较优势，但由于对纤维化的有效干预效果，仍在进行其对纤维化治疗方向的研究。
另一家Opthea公司则开发了可同时靶向VEGF-C、VEGF-D的产品OPT-302，与靶向VEGF-A的产品联合注射使用，在临床实验中则较明确的展现出了比单独靶向VEGF-A明显更优、应答更广的疗效，从而将nAMD等疾病的治疗引入第二世代。并且该疗法对亚洲人高发的息肉状脉络膜血管病变(Polypoidal Choroidal Vasculopathy，PCV)患者也有良好的疗效，息肉状脉络膜血管病变是湿性黄斑病变的一种亚型，与湿性黄斑病变又存在一定区别，其对靶向VEGF-A疗法无有效、广泛应答，而且在亚洲地区高发(Imamura Y等人(2010)，Surv.Ophthalmol.55(6):501-515)，我国初诊为AMD患者中PCV占比高至33％(LandeA.等人(2010),Prog Retin Eye Res.29(1):19-29)，日本达54.7％(Maruko I.等人(2007),Am JOphthalmol.144:15-22)，由于亚洲地区较大的人口基数，目前PCV存在巨大的治疗缺口。
但该疗法属于联合治疗，需要同时向玻璃体内注射两种药剂即靶向VEGF-A药与OPT-302，治疗成本较高，同时该疗法需要每月穿眼注射，不仅相应增加治疗成本，而且不便、病人依从性差、增加了注射引起的眼内感染等事故风险。此外，这种疗法需要同时靶向VEGF-A、VEGF-C与VEGF-D，对其均需具有较高的亲和力(至10pM及以下水平)，这也阻碍了使用目前热门的单克隆抗体技术(一个抗体一般只结合一个靶点，亲和力一般在100pM)开发其的替代品。
本发明人意外地发现，包含衍生于VEGFR2的特定氨基酸序列(例如SEQ ID NO:2的位置123-327或117-327)的配体结合分子，具有比OPT更好的对VEGF-C或VEGF-D的结合能力。为了进一步研究，构建表达了包含来自VEGFR2的不同片段的多种VEGF Trap分子，对其对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D等的结合与阻断能力进行了详细研究和表征。
结果发现，包含衍生于VEGFR2的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:2的位置123-327或117-327所示的氨基酸序列的配体结合分子展现出明显优于OPT或全VEGFR2胞外结构域的对VEGF-C或VEGF-D的结合与阻断能力，同时对VEGF-A也具有明显更优的结合与阻断能力。
同时，发明人还意外表征了包含衍生于VEGFR2的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:2的位置117-327或123-327所示的氨基酸序列的配体结合分子对PDGF-AA、AB、BB、CC等PDGF家族生长因子也具有一定的结合能力，是参与结合的主要结构域，并优于天然VEGFR2全胞外结构域重组分子对PDGF的结合。由于PDGF家族分子高表达被认为是对靶向VEGF-A疗法应答不充分、产生抗性以及产生治疗后眼底纤维化的原因之一，所以同时靶向PDGF家族或将能使更多的患者受益，特别是对糖尿病引起的眼底病变，有文献报告PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB在这种眼底病变中高表达，因而有治疗糖尿病引起的眼底病变的潜力。
此外，包含衍生于VEGFR2的氨基酸序列，特别是SEQ ID NO:2的位置117-327或123-327所示的氨基酸序列的配体结合分子相比OPT分子，在HEK293与CHO细胞的表达纯化过程中，初始的单体纯度及终产量均明显更优，这意味着可具有比其更低的生成成本及用药成本。
另外，还发明了包含衍生自VEGFR2的一个或多个氨基酸序列可操作地连接于衍生自VEGFR1的一个或多个氨基酸序列的新型配体结合分子及其糖基化改造形式(例如LFV-M、LFV-N、LFV-Q、LFV-R(LFV-R HPLC-SEC纯度高于LFV-M)、LFV-S)，其在良好的保留对VEGF-C、VEGF-D的结合与阻断能力的同时，具有了优化的对VEGF-A的结合与阻断能力，尤其是被发现具有了对VEGF A-VEGFR1的阻断能力，并且其对VEGF A-VEGFR1、VEGF A-VEGFR2的阻断能力均优于对照药Eylea与Avastin，此外其还具有了对VEGF-B、PlGF的结合能力。
这样，本发明中通过采用一种配体结合分子即可以阻断VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D，同时还能结合VEGF-B、PlGF以及PDGF家族分子，既有助于满足临床未被满足的需求，实现卓越的治疗效果，又解决了同时使用两种及多种药物的高成本问题；同时，对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D均具有较高的亲和力和阻断能力，如LFV-B，LFV-C对VEGF-C、VEGF-D的亲和力比OPT强，对VEGF-A的亲和与阻断能力也明显优于Avastin、接近或优于阿柏西普，这样有助于实现延长注射间隔、减少注射次数，从而进一步降低治疗成本，同时解决频繁注射所带来的多种不利。
采用本发明的配体结合分子或包含其的药物组合物，可以一药替代多药联用，满足对VEGF-A靶向无明显应答的治疗方法空缺，以及藉由高亲和力而减少注射次数，从而在得到最优疗效的同时明显降低患者负担，减少治疗不便，提高依从性，以及减少注射带来的眼内感染等危险。
本发明的序列汇总
Figure BDA0003371706710000411
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Figure BDA0003371706710000421
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Figure BDA0003371706710000431
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Figure BDA0003371706710000441
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Figure BDA0003371706710000451
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Figure BDA0003371706710000461
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Figure BDA0003371706710000471
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Figure BDA0003371706710000481
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Figure BDA0003371706710000491
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Figure BDA0003371706710000501
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Figure BDA0003371706710000511
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Figure BDA0003371706710000521
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Figure BDA0003371706710000531
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Figure BDA0003371706710000541
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
实施例1-重组受体分子的设计与表达
首先，构建了包含VEGFR2的不同衍生序列的各种Trap多肽，如下表1A所示。其中部分Trap多肽包含衍生于VEGFR1或VEGFR3的片段。这些片段之间可通过接头或连接子可操作地连接。本发明中使用的突变位点编号，例如N143A、N158Q、N318Q等，都是相对于SEQ IDNO:2的相应位置而言的。
表1A
Figure BDA0003371706710000551
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Figure BDA0003371706710000561
上述各设计的Trap多肽，可经由短的人造连接序列Gly-Pro-Gly(GPG)，与人免疫球蛋白IgG1恒定结构域序列(与Fc Hinge铰链区融合)连接构建在一起。上述各序列经基因合成、载体构建与抽提后瞬转HEK293或CHO细胞(购自Gibco Life)，用蛋白A亲和层析以及分子筛二次精纯进行纯化(其中LFV-D、LFV-F以及LFV-001/V0分子经蛋白A一步纯化后已满足纯度要求，未进行分子筛二次纯化)。所获得的截短VEGFR2-Fc融合多肽也称为重组受体分子或配体结合分子。
将Eylea、Avastin、R3A和OPT作为对照。Eylea按照WO0075319公开的序列。R3A采用VEGFR3采用位置25-329的氨基酸与人免疫球蛋白IgG1恒定结构域序列(与Fc Hinge铰链区融合))连接构建在一起。OPT如WO2015/123715A1中所述进行构建，其采用位置25-329的氨基酸，包括VEGFR3位置47-314的氨基酸，并按WO2015/123715A1中所述在第104-106位进行糖基化改造，将N-D-T序列改造为非Q-D-T序列，与人免疫球蛋白IgG1恒定结构域序列(与FcHinge铰链区融合)连接构建在一起构建成的分子在本文中称为OPT。
各种重组受体分子的表达纯化情况如下表1B所示。
表1B
Figure BDA0003371706710000571
实施例2-衍生于VEGFR2和VEGFR3的重组受体分子的构建、产生和结合测试
2.1重组受体分子的构建和表达
为了构建具有更优的人结合能力的新型受体相关trap蛋白，使用来自人VEGFR3的片段(SEQ ID NO:3的25-216)与来自人VEGFR2的片段(SEQ ID NO:2的221-327)作为构成元件，并在它们之间设计了一系列的连接子序列(如下面表2A中所示)。
具体地，LFV-001或V0使用了天然VEGFR3中的序列(SEQ ID NO:3的位置217-227)；LFV-010使用了将LFV-001中所述序列在VEGFR3中进一步向C端延长一些的序列；为了引入长度上的灵活性，LFV-002在基于LFV-001所述连接序列中去除了Thr；LFV-003将此Thr替换为Gly以引入主链结构扭转上更大的灵活性。另一方面，在LFV-004至008中，将LFV-001所用的源自VEGFR3的连接子序列进行了一系列的向VEGFR2相应区域的连接序列的突变(如下面表1中所示)，其中在LFV-008中，将一处源自VEGFR2的Ile突变为侧链更小的相同极性的Ala，以减小侧链间的空间位阻(steric clash)。作为对照trap蛋白，设计了仅包含如SEQID NO:2的117-327所示的VEGFR2片段的LFV-B以及仅包含如SEQ ID NO:3的25-329所示的VEGFR3片段的R3A。
表2A
Figure BDA0003371706710000581
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Figure BDA0003371706710000591
上述各trap多肽均，可由短的人造连接序列Gly-Pro-Gly(GPG)与人IgG1免疫球蛋白恒定结构域序列(与Fc Hinge铰链区融合)连接构建在一起，经基因合成、载体构建与抽提后瞬转HEK293细胞(购自Gibco Life)，再经过蛋白A一步亲和洗脱纯化后获得，在下文称为重组受体分子，其表达特征如下面表2B所示：
表2B.
Figure BDA0003371706710000592
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Figure BDA0003371706710000601
2.2与VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D的结合测试
VEGF-A165、VEGF-C、VEGF-D多肽分子购自ACROBiosystems公司。100-300ng/孔的VEGF分子配置在PBS中，4°过夜包被，第二天用PBS洗板，加入1％BSA液室温封闭2小时，PBS洗板，将实施例1中表达得到的重组受体分子从高浓度到低浓度使用PBT液(0.5％BSA溶于含0.05％吐温-20的PBS液中)梯度稀释后加入各孔，室温、300rpm孵育1.5小时，使用PBST液(含0.05％吐温-20的PBS)洗板三次，加入使用PBT稀释的偶联辣根过氧化物酶的羊抗人Fc二抗，室温、300rpm孵育1h，PBST液洗板三次，加入TMB进行显色，5％盐酸液终止，使用酶标仪读取450nm下的OD值。
结果如图1所示，其中各种重组配体结合分子均展现出与VEGF-A(以VEGF-A165为代表)、VEGF-C、和VEGF-D的结合能力，同时意外发现作为对照的LFV-B分子展现出比R3A还要强的对VEGF-C、VEGF-D的结合能力。
实施例3-重组受体分子对VEGF-C的结合
100ng/孔的VEGF-C分子配制在PBS中，4°过夜包被，第二天用PBS洗板，加入1％BSA液室温封闭2小时，PBS洗板，将实施例1中表达得到的重组受体分子从高浓度到低浓度梯度稀释后加入各孔，室温、300rpm孵育1.5小时，使用PBST液洗板三次，加入偶联辣根过氧化物酶的羊抗人Fc二抗，室温、300rpm孵育1h，PBST液洗板三次，加入TMB进行显色，5％盐酸液终止，使用酶标仪读取450nm下的OD值。
结果如图2所示，可见相关重组受体分子具有较好的VEGF-C的结合能力，其中LFV-B及其截短形式LFV-C具有最优的VEGF-C结合能力，其结合能力优于OPT，LFV-E也具有与OPT接近的结合能力。它们的结合EC50值如下表3所示：
表3.
R3A LFV-E LFV-D LFV-B LFV-C LFV-A OPT LFV-F V0
EC50(ng/ml) 161.6 85.19 191.7 16.24 24.16 / 54.59 916 398.5
EC50(nM) 1.35 0.71 1.6 0.16 0.24 / 0.45 6.5 3.3
实施例4-重组受体分子对VEGF-C、VEGF-D的VEGFR2结合阻断实验
500ng/孔的VEGFR2-Fc(Met 1-Glu 764)分子4°过夜包被，第二天用PBS洗板，加入BSA液室温封闭2小时，封闭期间，将各个重组受体分子从高浓度到低浓度梯度稀释，与100ng/孔的VEGF-C或VEGF-D(均带His标签)混匀，室温孵育30分钟，将VEGFR2-Fc板洗板，将重组受体分子与VEGF-C、VEGF-D的孵育液加入其中，室温孵育结合1小时，PBST洗板，加入偶联辣根过氧化物酶的抗多组氨酸二抗，室温孵育结合1小时，PBST洗板，加入TMB显色，5％盐酸液终止，使用酶标仪读取450nm下的OD值。
结果如图3所示，相关重组受体分子具有一定的阻断能力，其中LFV-B及其截短形式LFV-C以及LFV-E的阻断能力最好，而且均优于OPT。V0分子对VEGF-C也具有较好的阻断能力。各个重组受体分子对VEGF-C和VEGF-D与VEGFR2结合的阻断EC50值分别如下表4和表5所示。
表4.对VEGFR2-VEGFC结合的阻断EC50值
LFV-A LFV-D LFV-F LFV-B OPT LFV-C LFV-E V0 R3A Eylea Avastin
EC50(ng/ml) / 58280 24008 2085 3567 2252 2275 3593 7808 / /
EC50(nM) / 485.7 170.6 20.85 29.7 22.52 18.96 29.9 65.1 / /
表5.对VEGFR2-VEGFD结合的阻断EC50值
LFV-A LFV-D LFV-F LFV-B OPT LFV-C LFV-E V0 R3A Eylea Avastin
EC50(ng/ml) / 920.4 521.6 26.78 241.3 34.02 50.54 1542 532.2 / /
EC50(nM) / 7.7 3.7 0.27 2.01 0.34 0.42 12.85 4.4 / /
实施例5-重组受体分子对VEGF-C、VEGF-D的VEGFR3结合阻断实验
500ng/孔的VEGFR3-Fc(Tyr25-IIe776)分子4°过夜包被，第二天用PBS洗板，加入BSA液室温封闭2小时，封闭期间，将各个重组受体分子从高浓度到低浓度梯度稀释，与10ng/孔的VEGF-C或500ng/孔的VEGF-D(均带His标签)混匀，室温孵育30分钟，将VEGFR3-Fc板洗板，将孵育液加入其中，室温孵育结合1小时，PBST洗板，加入偶联辣根过氧化物酶的抗多组氨酸二抗，室温孵育结合1小时，PBST洗板，加入TMB显色，5％盐酸液终止，使用酶标仪读取450nm下的OD值。
结果如图4所示，可以发现阻断结果与对VEGFR2的阻断实验基本一致。各个分子对VEGF-C和VEGF-D与VEGFR3结合的阻断EC50值分别如下表6和表7所示。
表6.对VEGFR3-VEGFC的阻断EC50值
LFV-A LFV-D LFV--F LFV-B OPT LFV-C LFV-E V0 R3A Evlea Avastin
EC50(ng/ml) / 4323 2915 114.6 300.4 106.1 135.8 188.6 560.7 / /
EC50(nM) / 36.03 20.72 1.15 2.5 1.06 1.13 1.57 4.67 / /
表7.对VEGFR3-VEGFD的阻断EC50值
Figure BDA0003371706710000631
实施例6-重组受体分子对VEGF-A的结合
50ng/孔的VEGF-A 165或VEGF-A 121分子(购自ACROBiosystems公司)4°过夜包被，第二天用PBS洗板，室温封闭2小时，PBS洗板，将重组受体分子从高浓度到低浓度梯度稀释后加入各孔，室温孵育1.5小时，使用PBST液洗板三次，加入偶联辣根过氧化物酶的羊抗人Fc二抗，室温孵育1h，PBST液洗板三次，加入TMB进行显色，5％盐酸液终止，使用酶标仪读取450nm下的OD值。
结果如图5所示，可见各个VEGFR2相关的重组受体分子分子除了LFV-A、LFV-D、LFV-F以外均具有较好的VEGF-A的结合能力，其中LFV-B以及其截短形式LFV-C具有最优的VEGF-A结合能力，其结合能力优于Eylea，LFV-E则具有与Eylea接近的VEGF-A结合能力。对VEGF-A 165和VEGF-A 121的结合EC50值分别如下表8和表9所示。
表8.对VEGF-A 165的结合EC50值
LFV-C LFV-E LFV-B LFV-D LFV-F Eylea
EC50(ng/ml) 12.61 21.19 9.268 476.1 983.4 17.39
EC50(nM) 0.126 0.177 0.093 3.97 6.99 0.174
表9.对VEGF-A 121的结合EC50值
LFV-C LFV-E LFV-B LFV-D LFV-F Eylea
EC50(ng/ml) 47.59 72.1 31.14 / / 71.89
EC50(nM) 0.476 0.601 0.311 / / 0.719
实施例7-重组受体分子对VEGF-A的VEGFR2结合阻断实验
500ng/孔的VEGFR2-Fc分子4°过夜包被，第二天用PBS洗板，加入BSA液室温封闭2小时，封闭期间，将各个重组受体分子从高浓度到低浓度梯度稀释，然后与60ng/孔的VEGF-A 165或120ng/孔的VEGF-A 121(均带His标签)混匀，室温孵育30分钟，将VEGFR2-Fc板洗板，将孵育液加入其中，室温孵育结合1小时，PBST洗板，加入偶联辣根过氧化物酶的抗多组氨酸二抗，室温孵育结合1小时，PBST洗板，加入TMB显色，5％盐酸液终止，使用酶标仪读取450nm下的OD值。
结果如图6所示，LFV-B及其截短形式LFV-C具有较好的阻断能力，达到优于贝伐单抗、接近Eylea的水平。对VEGF-A 165和VEGF-A 121的VEGFR2结合的阻断EC50值分别如下表10和表11所示。
表10.对VEGF-A 165的阻断EC50值
Figure BDA0003371706710000641
表11.对VEGF-A 121的阻断EC50值
Figure BDA0003371706710000642
实施例8-对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D的结合亲和力检测实验
使用表面等离子共振方法对亲和力进行检测，仪器为Biacore T200，使用ProteinA chip抓取重组受体分子(包括LFV-B、LFV-E，以OPT作为对照)，运行缓冲液为1×HBS-EP，以30ul/min的流速流入各个浓度的抗原
检测结果如下表12所示，从中可见，LFV-B具有明显优于OPT的与VEGF-C、VEGF-D的亲和力，其与VEGF-A的亲和力也较强，达到了9.3pM。LFV-E具有略优于OPT的与VEGF-C、VEGF-D的亲和力，与LFV-B相比，由于相对低的Ka值，LFV-E在表观亲和力值上明显要弱，但它们的Kd值差别不大，因而在阻断实验中展现出接近的阻断效力，OPT相对低些的阻断效力，或可以在相对明显更弱的Kd值上得以解释。
表12A.
Figure BDA0003371706710000651
表12B.
Figure BDA0003371706710000652
实施例9-对PDGF家族分子的结合检测实验
在本实施例中，还测试了VEGFR2及其相关截短形式trap分子与PDGF家族分子之间的结合。简言之，使用表面等离子共振方法对LFV-B、LFV-E、VEGFR2-Fc(使用VEGFR2的全胞外结构域序列：Met 1-Glu 764)分子与PDGF家族分子的结合进行了检测，在初期的检测实验中发现PDGF家族分子(购自R&D Systems公司)容易在芯片内产生非特异性结合，带来测量值的假性升高，使检测无法完成，后改用CM5chip分别偶联装载PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC分子，然后流入重组受体分子，从而有效去除了非特异性结合对亲和力测定带来的影响。
相关检测结果如下表13所示，可见全VEGFR2胞外结构域同PDGF分子均具有一定的结合力，而LFV-C，LFV-B则具有明显更优的对PDGF家族分子的结合能力，这意外表征了其是负责与PDGF结合的主要区段，有可能经由结合阻断PDGF家族分子而发挥更有效的疗效以及令更多患者获益。LFV-E具有与LFV-B、LFV-C接近的对PDGF的结合能力。
表13.
Figure BDA0003371706710000661
/>
实施例10-鼠体内药代动力学实验
C57BL/6小鼠分为3组，每组6只，每组分别尾静脉注射LFV-B、LFV-E、对照品OPT4mg/Kg，于注射后的1h、2h、12h、24h、72h(3天)、168h(7天)、336h(14天)、504h(21天)采血，离心取血清，使用抗人Fc抗体捕获ELISA法对目的分子进行定量，使用WinNonlin(PhoenixTM，version 8.0)和其他相关软件进行药代动力学计算。得出的PK数据如图7及下表14所示：
表14.
Figure BDA0003371706710000662
Figure BDA0003371706710000671
可以看到三种分子具有接近的体内PK特征，LFV-E的血清浓度相对最高，LFV-B的半衰期相对较好。
实施例11-激光诱导大鼠脉络膜新生血管的治疗实验
Brown Norway大鼠经麻醉后，使用激光光凝仪围绕视盘进行光凝，可见到有气泡产生即提示Bruch氏膜被击破。光凝后12天后进行分组，于分组后第二天眼内注射给药，4ul、40ug/眼。给药后第10或14天进行荧光造影检查以及眼底照相，统计各组的4级荧光光斑个数。
结果如图8所示，可见相比PBS及Eylea对照组，LFV-B、LFV-C展现出四级光斑缓解趋势。
实施例12-糖基化改造设计与检测
将LFV-E中的N糖基化位点(Asn46、Asn66、Asn96)与LFV-B、LFV-C内的N糖基化位点(Asn143、Asn158、Asn245、Asn318)进行点突变以去除N糖基化，优先将Asn突变为Gln或Ala。
将点突变设计后的序列进行基因合成、载体构建抽提与细胞转染表达与纯化，使用ELISA方法检测对VEGFR2/R1-VEGFA、VEGFR2/R3-VEGFC、VEGFR2/R3-VEGFD结合的阻断能力，与未经突变的原始分子进行比较，结合表达量、单峰纯度综合进行评估，选出若干个变体。使用HEK 293细胞进行转染表达与纯化，进行鼠体内的PK实验检测，与未经突变的原始分子进行比较。还使用上述经糖基化改造的重组蛋白与异源肽进行重组，进行相关的ELISA实验、细胞实验及动物实验以进行进一步优选。
对LFV-C的四个N糖基化位点(Asn143、Asn158、Asn245、Asn318)进行点突变，它们的突变设计以及表达纯化情况如下表15所示：
表15.
Figure BDA0003371706710000681
然后使用上述实施例中的条件，使用ELISA方法检测不同浓度的LFV-H、LFV-J、LFV-K、LFV-L相比非突变的LFV-C对VEGF-A 165、VEGF-C、VEGF-D与受体结合的阻断能力。其中VEGF-A 165-VEGFR1阻断ELISA所用的实验条件为：200ng/孔的VEGFR1-Fc(Met1-Asn756)分子4°过夜包被，第二天用PBS洗板，加入BSA液室温封闭2小时，封闭期间，将各个重组受体分子从高浓度到低浓度梯度稀释，然后与40ng/孔的VEGF-A 165(带His标签)混匀，室温孵育30分钟，将VEGFR1-Fc板洗板，将孵育液加入其中，室温孵育结合1小时，PBST洗板，加入偶联辣根过氧化物酶的抗多组氨酸二抗，室温孵育结合1小时，PBST洗板，加入TMB显色，5％盐酸液终止，使用酶标仪读取450nm下的OD值。
检测结果如图9所示，可见与未经糖基化改造的形式相比，LFV-K分子对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D与受体的结合具有更优的阻断能力，开发潜力相对较大。
实施例13-新的VEGFR2-VEGFR1融合蛋白的设计
为了进一步增强重组受体分子对VEGF-A与受体结合的阻断能力，将VEGFR1的位置132-230区域，或将VEGFR1的位置132-230区域与VEGFR2的位置225-327区域的组合形式引入到LFV-B或LFV-C分子或其糖基化改造分子中，进行CHO细胞的瞬转及表达纯化。然后使用ELISA方法检测其对VEGFR2/R1-VEGFA、VEGFR2/R3-VEGFC、VEGFR2/R3-VEGFD的阻断能力，使用实施例8和9中所述***检测对VEGF、PDGF家族分子的阻断能力，以探究其是否具有增强的VEGF-A与受体结合的阻断能力、以及具有对VEGF-B、PlGF的结合能力、同时保留较好的对VEGF-C、VEGF-D及PDGF家族分子与受体结合的阻断能力，以及使用Biacore检测其对PDGF家族分子的结合能力，以及进行优选融合蛋白的细胞或动物实验。
在一个实验中，将VEGFR1的位置132-230区域分别连接在LFV-C分子的氮端及碳端，以及将VEGFR1的位置132-230区域与VEGFR2的位置225-327区域的组合形式构建入LFV-C分子内，使用GS连接子进行连接，所构建分子LFV-M、LFV-N、LFV-O的全序列如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:46所示，LFV-M为将VEGFR1的位置132-230区域构建在LFV-C的氮端形式，LFV-N为将VEGFR1的位置132-230区域构建在LFV-C的碳端形式，LFV-O为VEGFR1(132-230)-VEGFR2(225-327)与LFV-C的重组形式，它们在CHO细胞内的表达纯化情况如表16所示：
表16
Figure BDA0003371706710000691
然后使用上述实施例中的条件，使用ELISA方法检测它们对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D的阻断能力。结果如图10所示，可见LFV-M、LFV-N具有与LFV-C一致或略优的对VEGF-C、VEGF-D与受体结合的阻断能力，同时具有相比LFV-C明显改进的对VEGF-A与受体结合的阻断能力，尤其是在VEGF A-VEGFR1的阻断实验中，LFV-M、LFV-N展现出达到优于Eylea的阻断能力。
另外检测了它们对VEGF-B、PlGF的结合能力：200ng/孔的VEGF-B或PlGF分子(均购自ACROBiosystems公司)配置在PBS中，4°过夜包被，第二天用PBS洗板，加入1％BSA液室温封闭2小时，PBS洗板，将重组受体分子从高浓度到低浓度梯度稀释后加入各孔，室温、300rpm孵育1.5小时，使用PBST液洗板三次，加入偶联辣根过氧化物酶的羊抗人Fc二抗，室温、300rpm孵育1h，PBST液洗板三次，加入TMB进行显色，5％盐酸液终止，使用酶标仪读取450nm下的OD值。
结果如图11所示，LFV-M、LFV-N均展现出一定的对VEGF-B、PlGF的结合。
实施例14-糖基化改造的VEGFR2序列与VEGFR1序列的融合蛋白的设计与检验
对LFV-B分子或其截短或延长形式，引入LFV-K、LFV-L分子所使用的糖基化改造形式，并与VEGFR1的位置132-230区域进行重组，产生新的融合蛋白，进行表达纯化，进而进行分子、细胞水平的表征分析以及动物实验，以期能得到具有更加效力的治疗分子。
在一个实验中，将具有N245Q突变的LFV-B分子命名为LFV-P作为对照，并将LFV-P与VEGFR1的132-230区域进行组合产生新的融合蛋白，命名为LFV-Q。LFV-P的序列如SEQ IDNO:18所示，LFV-Q的序列如SEQ ID NO:19所示。将LFV-P、LFV-Q进行表达纯化，然后使用上述实施例中的条件，使用ELISA方法检测它们对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D与受体结合的阻断能力以及对VEGF-B、PlGF的结合能力。
对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D与VEGFR2的结合阻断结果如图12所示，可见经糖基化修饰后，LFV-P具有相比LFV-B更优的对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D与受体结合的阻断能力。LFV-Q经过与VEGFR1的132-230区域融合后，具有了最优的对VEGF-A与受体结合的阻断能力。对VEGF-B、PlGF的结合结果如图13所示，可见经与VEGFR1的132-230区域融合后，LFV-Q亦具有了较好的与VEGF-B、PlGF的结合能力。
实施例15-LFV-Q对PDGF家族分子的结合检测实验
使用表面等离子共振方法对LFV-Q分子与PDGF家族分子的结合进行了检测，具体实施步骤与上述实施例9一致，即采用先偶联装载PDGF，再流入待测融合蛋白分子的方法以去除PDGF分子与芯片的非特异性结合。
相关相关检测结果如下表17所示：
表17
Figure BDA0003371706710000711
可见LFV-Q对PDGF家族分子均具有确定的结合能力。
实施例16-LFV-M、LFV-Q的进一步糖基化变体研究
如上所述，LFV-Q使用了源自VEGFR2的序列117-327的N245位的去糖基化形式，即将N245突变为Q，为了进一步对糖基化进行研究，也将LFV-M内的N245位突变为Q进行糖基化去除，所产生的新分子命名为LFV-R，LFV-R的序列如SEQ ID NO:20所示，同时对LFV-Q的Q245位恢复突变为N以进行糖基化前后的功能比较，所产生的分子命名为LFV-S。
首先对LFV-R、LFV-S进行了瞬转表达纯化，在这个过程中，发现去除N245位糖基化后的LFV-R，相比未去除的LFV-M，在CHO细胞瞬转和蛋白A一步纯化后，意外发现SEC单峰纯度由52.1％提高到了78.7％(如图14所示)，另外LFV-R在分子筛二次纯化后进行了在PBS内的浓缩以方便后期的晶状体内注射，发现浓度达到19.2mg/ml时其仍展现出良好的溶解性，这反应了LFV-R较好的下游开发潜力。
另外使用ELISA法检测了这些分子对VEGFR2/VEGFR1与VEGF-A、VEGFR2与VEGF-C、VEGFR2与VEGF-D的结合阻断能力，结果如图15所示，可见LFV-R具有最优的对VEGFR2与VEGF-A的阻断能力，并且明显优于对照药Eylea，4个分子对VEGFR2与VEGF-C、VEGF-D的阻断能力比较接近，尤其是对VEGF-D的阻断能力均明显优于对照品OPT。
另外还检测了它们对PLGF、VEGF-B的结合能力，结果如图16所示，可见LFV-R相对具有最优的对PlGF、VEGF-B的结合能力。
实施例17-LFV-R、LFV-Q、LFV-B、LFV-C等对VEGF家族分子的ELISA结合实验
使用ELISA方法对LFV-R、LFV-Q、LFV-B、LFV-C分子与VEGF-A的结合进行了检测，同时使用全胞外结构域的VEGFR2-Fc和Eylea作为对照，实验结果如图17a所示，可见LFV-R具有明显最优的与VEGF-A的结合能力，高于对照药Eylea，LFV-R、LFV-Q、LFV-B、LFV-C四种分子对VEGF-A的结合力均明显高于全胞外结构域的VEGFR2-Fc。
使用ELISA方法对LFV-R、LFV-Q、LFV-B、LFV-C分子与VEGF-C的结合进行了检测，同时使用全胞外结构域的VEGFR2-Fc和OPT作为对照，实验结果如图17b所示，可见LFV-R、LFV-Q具有与LFV-B相似的结合能力，高于对照品OPT，LFV-R、LFV-Q、LFV-B、LFV-C四种分子对VEGF-C的结合力均明显高于全胞外结构域的VEGFR2-Fc。
使用ELISA方法对LFV-R、LFV-Q、LFV-B、LFV-C分子与VEGF-D的结合进行了检测，同时使用全胞外结构域的VEGFR2-Fc和OPT作为对照，实验结果如图17c所示，可见LFV-R、LFV-Q具有与LFV-B相似的结合能力，明显高于对照品OPT，LFV-R、LFV-Q、LFV-B、LFV-C四种分子对VEGF-D的结合力均明显高于全胞外结构域的VEGFR2-Fc。
实施例18-LFV-R对PDGF家族分子的结合检测实验
使用表面等离子共振方法对LFV-R分子与PDGF家族分子的结合进行了检测，具体实施步骤与上述实施例9一致，即采用先偶联装载PDGF，再流入待测融合蛋白分子的方法以去除PDGF分子与芯片的非特异性结合，相关检测结果如下表18所示：
表18.
Figure BDA0003371706710000731
可见LFV-R对PDGF-AA、AB、BB、CC均具有明确的结合能力。
实施例19-对HUVEC的细胞增殖抑制测实验
使用VEGF-A加VEGF-C分子的1:1混合物刺激HUVEC细胞增殖，同时加入不同浓度的LFV-R、Eylea、OPT分子，细胞培养72h后，使用MTS进行显色观察，以检测不同药物对细胞增殖的抑制效力。结果如图18a所示，可见仅有LFV-R呈现明显的抑制效力，在约3ug/ml浓度即达到完全抑制的效果，OPT无抑制效果呈现，Eylea仅在超高浓度(30ug/ml以上)才呈现出完全抑制的效力。
进一步的，作为目前有潜力的治疗手段，将Eylea与OPT混合在一起(1:1混合物)对HUVEC进行增殖抑制检测，加入LFV-R、LFV-Q与其对比，结果如图18b所示，可见相比单用，Eylea与OPT混合后可以完全抑制HUVEC细胞的增殖，进一步的，LFV-R不仅IC50比Eylea+OPT和LFV-Q更优，而且相比Eylea+OPT和LFV-Q，在低浓度即展示出明显高出的抑制效力，这将有利于在玻璃体给药后的浓度衰减期内仍维持持续的抑制疗效，从而提高治疗受益和延长注射间隔。
实施例20-激光诱导大鼠脉络膜新生血管的治疗实验
24只Brown-Norway大鼠，根据体重随机分为4个组，每组6只动物，雌雄各半，分别为模型对照组、LFV-R组、LFV-Q组、Eylea组，先进行双眼底激光造模，造模第3天分别双眼玻璃体单次注射给予0.9％氯化钠、LFV-R、LFV-Q及Eylea，给药体积4μL/眼，给药浓度均为10mg/mL、剂量40μg/眼，给药当天定义为试验第1天。试验期间，每天观察各组存活大鼠状态。造模前和给药后第18天行眼底照相和荧光造影检查观察各组新生血管生长和渗漏情况，比较各组药效。
结果如图19所示，LFV-R、LFV-Q、Eylea 3个治疗组均展现出相比模型对照组更低的四级光斑占比和荧光渗漏面积，LFV-R、LFV-Q治疗组的四级荧光光斑占比与对照组和Eylea组相比显示出明显统计差异。
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。
序列表
<110> 苏州光度生物科技有限公司
香港光度生物有限公司
<120> 多特异性配体结合分子及其应用
<130> IDC216038
<160> 59
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1338
<212> PRT
<213> 人
<400> 1
Met Val Ser Tyr Trp Asp Thr Gly Val Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ser
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Thr Gly Ser Ser Ser Gly Ser Lys Leu Lys Asp Pro
20 25 30
Glu Leu Ser Leu Lys Gly Thr Gln His Ile Met Gln Ala Gly Gln Thr
35 40 45
Leu His Leu Gln Cys Arg Gly Glu Ala Ala His Lys Trp Ser Leu Pro
50 55 60
Glu Met Val Ser Lys Glu Ser Glu Arg Leu Ser Ile Thr Lys Ser Ala
65 70 75 80
Cys Gly Arg Asn Gly Lys Gln Phe Cys Ser Thr Leu Thr Leu Asn Thr
85 90 95
Ala Gln Ala Asn His Thr Gly Phe Tyr Ser Cys Lys Tyr Leu Ala Val
100 105 110
Pro Thr Ser Lys Lys Lys Glu Thr Glu Ser Ala Ile Tyr Ile Phe Ile
115 120 125
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
130 135 140
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
145 150 155 160
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
165 170 175
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
180 185 190
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
195 200 205
Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg
210 215 220
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Gln Ile Ser Thr Pro Arg Pro Val
225 230 235 240
Lys Leu Leu Arg Gly His Thr Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Thr Thr
245 250 255
Pro Leu Asn Thr Arg Val Gln Met Thr Trp Ser Tyr Pro Asp Glu Lys
260 265 270
Asn Lys Arg Ala Ser Val Arg Arg Arg Ile Asp Gln Ser Asn Ser His
275 280 285
Ala Asn Ile Phe Tyr Ser Val Leu Thr Ile Asp Lys Met Gln Asn Lys
290 295 300
Asp Lys Gly Leu Tyr Thr Cys Arg Val Arg Ser Gly Pro Ser Phe Lys
305 310 315 320
Ser Val Asn Thr Ser Val His Ile Tyr Asp Lys Ala Phe Ile Thr Val
325 330 335
Lys His Arg Lys Gln Gln Val Leu Glu Thr Val Ala Gly Lys Arg Ser
340 345 350
Tyr Arg Leu Ser Met Lys Val Lys Ala Phe Pro Ser Pro Glu Val Val
355 360 365
Trp Leu Lys Asp Gly Leu Pro Ala Thr Glu Lys Ser Ala Arg Tyr Leu
370 375 380
Thr Arg Gly Tyr Ser Leu Ile Ile Lys Asp Val Thr Glu Glu Asp Ala
385 390 395 400
Gly Asn Tyr Thr Ile Leu Leu Ser Ile Lys Gln Ser Asn Val Phe Lys
405 410 415
Asn Leu Thr Ala Thr Leu Ile Val Asn Val Lys Pro Gln Ile Tyr Glu
420 425 430
Lys Ala Val Ser Ser Phe Pro Asp Pro Ala Leu Tyr Pro Leu Gly Ser
435 440 445
Arg Gln Ile Leu Thr Cys Thr Ala Tyr Gly Ile Pro Gln Pro Thr Ile
450 455 460
Lys Trp Phe Trp His Pro Cys Asn His Asn His Ser Glu Ala Arg Cys
465 470 475 480
Asp Phe Cys Ser Asn Asn Glu Glu Ser Phe Ile Leu Asp Ala Asp Ser
485 490 495
Asn Met Gly Asn Arg Ile Glu Ser Ile Thr Gln Arg Met Ala Ile Ile
500 505 510
Glu Gly Lys Asn Lys Met Ala Ser Thr Leu Val Val Ala Asp Ser Arg
515 520 525
Ile Ser Gly Ile Tyr Ile Cys Ile Ala Ser Asn Lys Val Gly Thr Val
530 535 540
Gly Arg Asn Ile Ser Phe Tyr Ile Thr Asp Val Pro Asn Gly Phe His
545 550 555 560
Val Asn Leu Glu Lys Met Pro Thr Glu Gly Glu Asp Leu Lys Leu Ser
565 570 575
Cys Thr Val Asn Lys Phe Leu Tyr Arg Asp Val Thr Trp Ile Leu Leu
580 585 590
Arg Thr Val Asn Asn Arg Thr Met His Tyr Ser Ile Ser Lys Gln Lys
595 600 605
Met Ala Ile Thr Lys Glu His Ser Ile Thr Leu Asn Leu Thr Ile Met
610 615 620
Asn Val Ser Leu Gln Asp Ser Gly Thr Tyr Ala Cys Arg Ala Arg Asn
625 630 635 640
Val Tyr Thr Gly Glu Glu Ile Leu Gln Lys Lys Glu Ile Thr Ile Arg
645 650 655
Asp Gln Glu Ala Pro Tyr Leu Leu Arg Asn Leu Ser Asp His Thr Val
660 665 670
Ala Ile Ser Ser Ser Thr Thr Leu Asp Cys His Ala Asn Gly Val Pro
675 680 685
Glu Pro Gln Ile Thr Trp Phe Lys Asn Asn His Lys Ile Gln Gln Glu
690 695 700
Pro Gly Ile Ile Leu Gly Pro Gly Ser Ser Thr Leu Phe Ile Glu Arg
705 710 715 720
Val Thr Glu Glu Asp Glu Gly Val Tyr His Cys Lys Ala Thr Asn Gln
725 730 735
Lys Gly Ser Val Glu Ser Ser Ala Tyr Leu Thr Val Gln Gly Thr Ser
740 745 750
Asp Lys Ser Asn Leu Glu Leu Ile Thr Leu Thr Cys Thr Cys Val Ala
755 760 765
Ala Thr Leu Phe Trp Leu Leu Leu Thr Leu Phe Ile Arg Lys Met Lys
770 775 780
Arg Ser Ser Ser Glu Ile Lys Thr Asp Tyr Leu Ser Ile Ile Met Asp
785 790 795 800
Pro Asp Glu Val Pro Leu Asp Glu Gln Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp
805 810 815
Ala Ser Lys Trp Glu Phe Ala Arg Glu Arg Leu Lys Leu Gly Lys Ser
820 825 830
Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Gln Ala Ser Ala Phe Gly
835 840 845
Ile Lys Lys Ser Pro Thr Cys Arg Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys
850 855 860
Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu Tyr Lys Ala Leu Met Thr Glu Leu Lys
865 870 875 880
Ile Leu Thr His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly
885 890 895
Ala Cys Thr Lys Gln Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Tyr Cys
900 905 910
Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Tyr Leu Lys Ser Lys Arg Asp Leu Phe
915 920 925
Phe Leu Asn Lys Asp Ala Ala Leu His Met Glu Pro Lys Lys Glu Lys
930 935 940
Met Glu Pro Gly Leu Glu Gln Gly Lys Lys Pro Arg Leu Asp Ser Val
945 950 955 960
Thr Ser Ser Glu Ser Phe Ala Ser Ser Gly Phe Gln Glu Asp Lys Ser
965 970 975
Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Asp Ser Asp Gly Phe Tyr Lys Glu
980 985 990
Pro Ile Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg
995 1000 1005
Gly Met Glu Phe Leu Ser Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Asn Asn Val Val Lys Ile
1025 1030 1035
Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asn Pro Asp Tyr
1040 1045 1050
Val Arg Lys Gly Asp Thr Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro
1055 1060 1065
Glu Ser Ile Phe Asp Lys Ile Tyr Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp
1070 1075 1080
Ser Tyr Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Ser
1085 1090 1095
Pro Tyr Pro Gly Val Gln Met Asp Glu Asp Phe Cys Ser Arg Leu
1100 1105 1110
Arg Glu Gly Met Arg Met Arg Ala Pro Glu Tyr Ser Thr Pro Glu
1115 1120 1125
Ile Tyr Gln Ile Met Leu Asp Cys Trp His Arg Asp Pro Lys Glu
1130 1135 1140
Arg Pro Arg Phe Ala Glu Leu Val Glu Lys Leu Gly Asp Leu Leu
1145 1150 1155
Gln Ala Asn Val Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Pro Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ile Leu Thr Gly Asn Ser Gly Phe Thr Tyr Ser Thr Pro Ala
1175 1180 1185
Phe Ser Glu Asp Phe Phe Lys Glu Ser Ile Ser Ala Pro Lys Phe
1190 1195 1200
Asn Ser Gly Ser Ser Asp Asp Val Arg Tyr Val Asn Ala Phe Lys
1205 1210 1215
Phe Met Ser Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe Glu Glu Leu Leu Pro
1220 1225 1230
Asn Ala Thr Ser Met Phe Asp Asp Tyr Gln Gly Asp Ser Ser Thr
1235 1240 1245
Leu Leu Ala Ser Pro Met Leu Lys Arg Phe Thr Trp Thr Asp Ser
1250 1255 1260
Lys Pro Lys Ala Ser Leu Lys Ile Asp Leu Arg Val Thr Ser Lys
1265 1270 1275
Ser Lys Glu Ser Gly Leu Ser Asp Val Ser Arg Pro Ser Phe Cys
1280 1285 1290
His Ser Ser Cys Gly His Val Ser Glu Gly Lys Arg Arg Phe Thr
1295 1300 1305
Tyr Asp His Ala Glu Leu Glu Arg Lys Ile Ala Cys Cys Ser Pro
1310 1315 1320
Pro Pro Asp Tyr Asn Ser Val Val Leu Tyr Ser Thr Pro Pro Ile
1325 1330 1335
<210> 2
<211> 1356
<212> PRT
<213> 人
<400> 2
Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu
1 5 10 15
Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro
20 25 30
Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr
35 40 45
Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro
50 55 60
Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser
65 70 75 80
Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn
85 90 95
Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser
100 105 110
Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser
115 120 125
Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys
130 135 140
Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser
145 150 155 160
Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg
165 170 175
Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile
180 185 190
Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser
195 200 205
Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr
210 215 220
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
225 230 235 240
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
245 250 255
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
260 265 270
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
275 280 285
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
290 295 300
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
305 310 315 320
Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met
325 330 335
Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala
340 345 350
Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly
355 360 365
Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr
370 375 380
Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu
385 390 395 400
Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser
530 535 540
Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr
595 600 605
Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile
610 615 620
Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr
625 630 635 640
Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn
690 695 700
Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg
705 710 715 720
Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr
725 730 735
Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe
740 745 750
Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Ile Ile Ile Leu
755 760 765
Val Gly Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile
770 775 780
Ile Leu Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly
785 790 795 800
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805 810 815
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820 825 830
Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val
835 840 845
Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Arg Thr
850 855 860
Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg
865 870 875 880
Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu
885 890 895
Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu
900 905 910
Met Val Ile Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu
915 920 925
Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe Val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg
930 935 940
Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr Val Gly Ala Ile Pro Val Asp Leu Lys
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Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly
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980 985 990
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1010 1015 1020
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1055 1060 1065
Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr
1070 1075 1080
Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile
1085 1090 1095
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1130 1135 1140
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1145 1150 1155
His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys
1160 1165 1170
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1190 1195 1200
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1205 1210 1215
Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro
1220 1225 1230
Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu
1235 1240 1245
Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val
1250 1255 1260
Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu
1265 1270 1275
Ser Pro Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser
1280 1285 1290
Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly
1295 1300 1305
Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu
1310 1315 1320
Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser
1325 1330 1335
Thr Ala Gln Ile Leu Gln Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser
1340 1345 1350
Pro Pro Val
1355
<210> 3
<211> 1363
<212> PRT
<213> 人
<400> 3
Met Gln Arg Gly Ala Ala Leu Cys Leu Arg Leu Trp Leu Cys Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Asp Gly Leu Val Ser Gly Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu
20 25 30
Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser
35 40 45
Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala
50 55 60
Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val
65 70 75 80
Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu
85 90 95
Leu Leu His Glu Val His Ala Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr
100 105 110
Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser
115 120 125
Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp
130 135 140
Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val
145 150 155 160
Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu
165 170 175
Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu
180 185 190
Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr
195 200 205
Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile
210 215 220
Thr Gly Asn Glu Leu Tyr Asp Ile Gln Leu Leu Pro Arg Lys Ser Leu
225 230 235 240
Glu Leu Leu Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Val Trp Ala
245 250 255
Glu Phe Asn Ser Gly Val Thr Phe Asp Trp Asp Tyr Pro Gly Lys Gln
260 265 270
Ala Glu Arg Gly Lys Trp Val Pro Glu Arg Arg Ser Gln Gln Thr His
275 280 285
Thr Glu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Ile His Asn Val Ser Gln His Asp
290 295 300
Leu Gly Ser Tyr Val Cys Lys Ala Asn Asn Gly Ile Gln Arg Phe Arg
305 310 315 320
Glu Ser Thr Glu Val Ile Val His Glu Asn Pro Phe Ile Ser Val Glu
325 330 335
Trp Leu Lys Gly Pro Ile Leu Glu Ala Thr Ala Gly Asp Glu Leu Val
340 345 350
Lys Leu Pro Val Lys Leu Ala Ala Tyr Pro Pro Pro Glu Phe Gln Trp
355 360 365
Tyr Lys Asp Gly Lys Ala Leu Ser Gly Arg His Ser Pro His Ala Leu
370 375 380
Val Leu Lys Glu Val Thr Glu Ala Ser Thr Gly Thr Tyr Thr Leu Ala
385 390 395 400
Leu Trp Asn Ser Ala Ala Gly Leu Arg Arg Asn Ile Ser Leu Glu Leu
405 410 415
Val Val Asn Val Pro Pro Gln Ile His Glu Lys Glu Ala Ser Ser Pro
420 425 430
Ser Ile Tyr Ser Arg His Ser Arg Gln Ala Leu Thr Cys Thr Ala Tyr
435 440 445
Gly Val Pro Leu Pro Leu Ser Ile Gln Trp His Trp Arg Pro Trp Thr
450 455 460
Pro Cys Lys Met Phe Ala Gln Arg Ser Leu Arg Arg Arg Gln Gln Gln
465 470 475 480
Asp Leu Met Pro Gln Cys Arg Asp Trp Arg Ala Val Thr Thr Gln Asp
485 490 495
Ala Val Asn Pro Ile Glu Ser Leu Asp Thr Trp Thr Glu Phe Val Glu
500 505 510
Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Lys Leu Val Ile Gln Asn Ala Asn Val
515 520 525
Ser Ala Met Tyr Lys Cys Val Val Ser Asn Lys Val Gly Gln Asp Glu
530 535 540
Arg Leu Ile Tyr Phe Tyr Val Thr Thr Ile Pro Asp Gly Phe Thr Ile
545 550 555 560
Glu Ser Lys Pro Ser Glu Glu Leu Leu Glu Gly Gln Pro Val Leu Leu
565 570 575
Ser Cys Gln Ala Asp Ser Tyr Lys Tyr Glu His Leu Arg Trp Tyr Arg
580 585 590
Leu Asn Leu Ser Thr Leu His Asp Ala His Gly Asn Pro Leu Leu Leu
595 600 605
Asp Cys Lys Asn Val His Leu Phe Ala Thr Pro Leu Ala Ala Ser Leu
610 615 620
Glu Glu Val Ala Pro Gly Ala Arg His Ala Thr Leu Ser Leu Ser Ile
625 630 635 640
Pro Arg Val Ala Pro Glu His Glu Gly His Tyr Val Cys Glu Val Gln
645 650 655
Asp Arg Arg Ser His Asp Lys His Cys His Lys Lys Tyr Leu Ser Val
660 665 670
Gln Ala Leu Glu Ala Pro Arg Leu Thr Gln Asn Leu Thr Asp Leu Leu
675 680 685
Val Asn Val Ser Asp Ser Leu Glu Met Gln Cys Leu Val Ala Gly Ala
690 695 700
His Ala Pro Ser Ile Val Trp Tyr Lys Asp Glu Arg Leu Leu Glu Glu
705 710 715 720
Lys Ser Gly Val Asp Leu Ala Asp Ser Asn Gln Lys Leu Ser Ile Gln
725 730 735
Arg Val Arg Glu Glu Asp Ala Gly Arg Tyr Leu Cys Ser Val Cys Asn
740 745 750
Ala Lys Gly Cys Val Asn Ser Ser Ala Ser Val Ala Val Glu Gly Ser
755 760 765
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770 775 780
Ile Ala Val Phe Phe Trp Val Leu Leu Leu Leu Ile Phe Cys Asn Met
785 790 795 800
Arg Arg Pro Ala His Ala Asp Ile Lys Thr Gly Tyr Leu Ser Ile Ile
805 810 815
Met Asp Pro Gly Glu Val Pro Leu Glu Glu Gln Cys Glu Tyr Leu Ser
820 825 830
Tyr Asp Ala Ser Gln Trp Glu Phe Pro Arg Glu Arg Leu His Leu Gly
835 840 845
Arg Val Leu Gly Tyr Gly Ala Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Ser Ala
850 855 860
Phe Gly Ile His Lys Gly Ser Ser Cys Asp Thr Val Ala Val Lys Met
865 870 875 880
Leu Lys Glu Gly Ala Thr Ala Ser Glu His Arg Ala Leu Met Ser Glu
885 890 895
Leu Lys Ile Leu Ile His Ile Gly Asn His Leu Asn Val Val Asn Leu
900 905 910
Leu Gly Ala Cys Thr Lys Pro Gln Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu
915 920 925
Phe Cys Lys Tyr Gly Asn Leu Ser Asn Phe Leu Arg Ala Lys Arg Asp
930 935 940
Ala Phe Ser Pro Cys Ala Glu Lys Ser Pro Glu Gln Arg Gly Arg Phe
945 950 955 960
Arg Ala Met Val Glu Leu Ala Arg Leu Asp Arg Arg Arg Pro Gly Ser
965 970 975
Ser Asp Arg Val Leu Phe Ala Arg Phe Ser Lys Thr Glu Gly Gly Ala
980 985 990
Arg Arg Ala Ser Pro Asp Gln Glu Ala Glu Asp Leu Trp Leu Ser Pro
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Leu Thr Met Glu Asp Leu Val Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala Arg
1010 1015 1020
Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu
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Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Ser Asp Val Val Lys Ile
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Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr
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Val Arg Lys Gly Ser Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro
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Glu Ser Ile Phe Asp Lys Val Tyr Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp
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Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser
1100 1105 1110
Pro Tyr Pro Gly Val Gln Ile Asn Glu Glu Phe Cys Gln Arg Leu
1115 1120 1125
Arg Asp Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Glu Leu Ala Thr Pro Ala
1130 1135 1140
Ile Arg Arg Ile Met Leu Asn Cys Trp Ser Gly Asp Pro Lys Ala
1145 1150 1155
Arg Pro Ala Phe Ser Glu Leu Val Glu Ile Leu Gly Asp Leu Leu
1160 1165 1170
Gln Gly Arg Gly Leu Gln Glu Glu Glu Glu Val Cys Met Ala Pro
1175 1180 1185
Arg Ser Ser Gln Ser Ser Glu Glu Gly Ser Phe Ser Gln Val Ser
1190 1195 1200
Thr Met Ala Leu His Ile Ala Gln Ala Asp Ala Glu Asp Ser Pro
1205 1210 1215
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1235 1240 1245
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1250 1255 1260
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1265 1270 1275
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1280 1285 1290
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1295 1300 1305
Thr Arg Ala His Pro Asp Ser Gln Gly Arg Arg Arg Arg Pro Glu
1310 1315 1320
Arg Gly Ala Arg Gly Gly Gln Val Phe Tyr Asn Ser Glu Tyr Gly
1325 1330 1335
Glu Leu Ser Glu Pro Ser Glu Glu Asp His Cys Ser Pro Ser Ala
1340 1345 1350
Arg Val Thr Phe Phe Thr Asp Asn Ser Tyr
1355 1360
<210> 4
<211> 102
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-A Trap多肽
<400> 4
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp
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Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val
100
<210> 5
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-B Trap多肽
<400> 5
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile
20 25 30
Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg
35 40 45
Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp
50 55 60
Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu
100 105 110
Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu
115 120 125
Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp
130 135 140
Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
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195 200 205
His Glu Lys
210
<210> 6
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-C Trap多肽
<400> 6
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 7
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-D Trap多肽
<400> 7
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile
20 25 30
Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg
35 40 45
Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp
50 55 60
Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu
100 105 110
Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu
115 120 125
Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp
130 135 140
Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val
195 200 205
His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val
210 215 220
Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly
225 230 235 240
Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu
245 250 255
Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val
260 265 270
Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile
275 280 285
Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val Pro
290 295 300
Pro
305
<210> 8
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-E Trap多肽
<400> 8
Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro Arg Leu Ser Ile Gln Lys
1 5 10 15
Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr Leu Gln Ile Thr Cys Arg
20 25 30
Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro Asn Asn Gln Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser Asp Gly Leu Phe Cys Lys
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys
65 70 75 80
Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser Val Ile Tyr Val Tyr Val
85 90 95
Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly
100 105 110
Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys
115 120 125
Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro
130 135 140
Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys
145 150 155 160
Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val
165 170 175
Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr
180 185 190
Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro
195 200 205
Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys
210 215 220
Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr
225 230 235 240
Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys
245 250 255
Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile
260 265 270
Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser
275 280 285
Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu
290 295 300
Lys
305
<210> 9
<211> 399
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-F Trap多肽
<400> 9
Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro Arg Leu Ser Ile Gln Lys
1 5 10 15
Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr Leu Gln Ile Thr Cys Arg
20 25 30
Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro Asn Asn Gln Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser Asp Gly Leu Phe Cys Lys
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys
65 70 75 80
Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser Val Ile Tyr Val Tyr Val
85 90 95
Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly
100 105 110
Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys
115 120 125
Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro
130 135 140
Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys
145 150 155 160
Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val
165 170 175
Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr
180 185 190
Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro
195 200 205
Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys
210 215 220
Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr
225 230 235 240
Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys
245 250 255
Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile
260 265 270
Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser
275 280 285
Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu
290 295 300
Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala
305 310 315 320
Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro
325 330 335
Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn
340 345 350
His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu
355 360 365
Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys
370 375 380
Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro
385 390 395
<210> 10
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-G Trap多肽
<400> 10
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Ala Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 11
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-H Trap多肽
<400> 11
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Gln Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 12
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-I Trap多肽
<400> 12
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Ala Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 13
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-J Trap多肽
<400> 13
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Gln Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 14
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-K Trap多肽
<400> 14
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Gln Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 15
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-L Trap多肽
<400> 15
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Gln Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
195 200 205
<210> 16
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-M Trap多肽
<400> 16
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
1 5 10 15
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
20 25 30
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
50 55 60
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
65 70 75 80
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
85 90 95
Thr Ile Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Phe Ile Ala Ser
100 105 110
Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys
115 120 125
Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser
130 135 140
Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg
145 150 155 160
Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile
165 170 175
Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser
180 185 190
Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr
195 200 205
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
210 215 220
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
225 230 235 240
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
245 250 255
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
260 265 270
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
275 280 285
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Val Arg Val His Glu Lys
305 310
<210> 17
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-N Trap多肽
<400> 17
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile
210 215 220
Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr
225 230 235 240
Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu
245 250 255
Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile
260 265 270
Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala
275 280 285
Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln
290 295 300
Thr Asn Thr Ile Ile
305
<210> 18
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-P Trap多肽
<400> 18
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile
20 25 30
Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg
35 40 45
Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp
50 55 60
Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu
100 105 110
Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu
115 120 125
Gln Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp
130 135 140
Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val
195 200 205
His Glu Lys
210
<210> 19
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-Q Trap多肽
<400> 19
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile
20 25 30
Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg
35 40 45
Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp
50 55 60
Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu
100 105 110
Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu
115 120 125
Gln Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp
130 135 140
Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val
195 200 205
His Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr
210 215 220
Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val
225 230 235 240
Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys
245 250 255
Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp
260 265 270
Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly
275 280 285
Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn
290 295 300
Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile
305 310 315
<210> 20
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-R Trap多肽
<400> 20
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
1 5 10 15
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
20 25 30
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
50 55 60
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
65 70 75 80
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
85 90 95
Thr Ile Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Phe Ile Ala Ser
100 105 110
Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys
115 120 125
Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser
130 135 140
Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg
145 150 155 160
Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile
165 170 175
Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser
180 185 190
Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr
195 200 205
Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
210 215 220
Lys Leu Val Leu Gln Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile
225 230 235 240
Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu
245 250 255
Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe
260 265 270
Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu
275 280 285
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Val Arg Val His Glu Lys
305 310
<210> 21
<211> 315
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-S Trap多肽
<400> 21
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile
20 25 30
Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg
35 40 45
Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp
50 55 60
Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu
100 105 110
Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu
115 120 125
Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp
130 135 140
Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val
195 200 205
His Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr
210 215 220
Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val
225 230 235 240
Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys
245 250 255
Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp
260 265 270
Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly
275 280 285
Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn
290 295 300
Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile
305 310 315
<210> 22
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-001 Trap多肽
<400> 22
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys
305
<210> 23
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-010 Trap多肽
<400> 23
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Gln
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Thr Gly Asn Glu Leu Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys
305
<210> 24
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-002 Trap多肽
<400> 24
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val
195 200 205
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
210 215 220
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
225 230 235 240
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg
245 250 255
Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr
260 265 270
Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys
275 280 285
Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg
290 295 300
Val His Glu Lys
305
<210> 25
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-003 Trap多肽
<400> 25
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Gly Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys
305
<210> 26
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-004 Trap多肽
<400> 26
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Ile Val His Val Thr Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys
305
<210> 27
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-005 Trap多肽
<400> 27
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys
305
<210> 28
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-006 Trap多肽
<400> 28
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys
305
<210> 29
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-007 Trap多肽
<400> 29
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys
305
<210> 30
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-008 Trap多肽
<400> 30
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Ala Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys
305
<210> 31
<211> 330
<212> PRT
<213> 人
<400> 31
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 32
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-A重组受体分子
<400> 32
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile
20 25 30
Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg
35 40 45
Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp
50 55 60
Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
115 120 125
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
130 135 140
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
145 150 155 160
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
165 170 175
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
180 185 190
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
195 200 205
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
210 215 220
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
225 230 235 240
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
245 250 255
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
260 265 270
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
275 280 285
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
290 295 300
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
305 310 315 320
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 33
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-B重组受体分子
<400> 33
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile
20 25 30
Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg
35 40 45
Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp
50 55 60
Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu
100 105 110
Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu
115 120 125
Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp
130 135 140
Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val
195 200 205
His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
260 265 270
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
305 310 315 320
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
325 330 335
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
340 345 350
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
355 360 365
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
370 375 380
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
405 410 415
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
420 425 430
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 34
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-C重组受体分子
<400> 34
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly
195 200 205
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
245 250 255
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
260 265 270
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
275 280 285
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
290 295 300
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
325 330 335
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
340 345 350
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
355 360 365
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
370 375 380
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
385 390 395 400
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
405 410 415
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
420 425 430
Pro Gly Lys
435
<210> 35
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-D重组受体分子
<400> 35
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile
20 25 30
Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg
35 40 45
Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp
50 55 60
Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu
100 105 110
Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu
115 120 125
Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp
130 135 140
Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val
195 200 205
His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val
210 215 220
Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly
225 230 235 240
Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu
245 250 255
Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val
260 265 270
Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile
275 280 285
Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val Pro
290 295 300
Pro Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
305 310 315 320
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
325 330 335
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
340 345 350
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
355 360 365
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
370 375 380
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
385 390 395 400
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
405 410 415
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
420 425 430
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
435 440 445
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
450 455 460
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
465 470 475 480
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
485 490 495
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
500 505 510
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
515 520 525
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535
<210> 36
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-E重组受体分子
<400> 36
Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro Arg Leu Ser Ile Gln Lys
1 5 10 15
Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr Leu Gln Ile Thr Cys Arg
20 25 30
Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro Asn Asn Gln Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser Asp Gly Leu Phe Cys Lys
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys
65 70 75 80
Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser Val Ile Tyr Val Tyr Val
85 90 95
Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly
100 105 110
Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys
115 120 125
Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro
130 135 140
Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys
145 150 155 160
Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val
165 170 175
Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr
180 185 190
Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro
195 200 205
Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys
210 215 220
Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr
225 230 235 240
Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys
245 250 255
Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile
260 265 270
Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser
275 280 285
Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu
290 295 300
Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
305 310 315 320
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
325 330 335
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
340 345 350
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
355 360 365
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
370 375 380
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
385 390 395 400
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
405 410 415
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
420 425 430
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
435 440 445
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
450 455 460
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
465 470 475 480
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
485 490 495
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
500 505 510
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
515 520 525
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535
<210> 37
<211> 629
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-F重组受体分子
<400> 37
Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro Arg Leu Ser Ile Gln Lys
1 5 10 15
Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr Leu Gln Ile Thr Cys Arg
20 25 30
Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro Asn Asn Gln Ser Gly Ser
35 40 45
Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser Asp Gly Leu Phe Cys Lys
50 55 60
Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys
65 70 75 80
Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser Val Ile Tyr Val Tyr Val
85 90 95
Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly
100 105 110
Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys
115 120 125
Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro
130 135 140
Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys
145 150 155 160
Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val
165 170 175
Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr
180 185 190
Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro
195 200 205
Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys
210 215 220
Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr
225 230 235 240
Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys
245 250 255
Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile
260 265 270
Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser
275 280 285
Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu
290 295 300
Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met Glu Ser Leu Val Glu Ala
305 310 315 320
Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro
325 330 335
Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly Ile Pro Leu Glu Ser Asn
340 345 350
His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr Ile Met Glu Val Ser Glu
355 360 365
Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Lys
370 375 380
Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val Val Tyr Val Pro Pro Gly
385 390 395 400
Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
405 410 415
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
420 425 430
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
435 440 445
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
450 455 460
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
465 470 475 480
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
485 490 495
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
500 505 510
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
515 520 525
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
530 535 540
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
545 550 555 560
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
565 570 575
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
580 585 590
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
595 600 605
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
610 615 620
Leu Ser Pro Gly Lys
625
<210> 38
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-G重组受体分子
<400> 38
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Ala Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly
195 200 205
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
245 250 255
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
260 265 270
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
275 280 285
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
290 295 300
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
325 330 335
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
340 345 350
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
355 360 365
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
370 375 380
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
385 390 395 400
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
405 410 415
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
420 425 430
Pro Gly Lys
435
<210> 39
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-H重组受体分子
<400> 39
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Gln Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly
195 200 205
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
245 250 255
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
260 265 270
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
275 280 285
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
290 295 300
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
325 330 335
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
340 345 350
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
355 360 365
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
370 375 380
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
385 390 395 400
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
405 410 415
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
420 425 430
Pro Gly Lys
435
<210> 40
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-I重组受体分子
<400> 40
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Ala Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly
195 200 205
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
245 250 255
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
260 265 270
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
275 280 285
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
290 295 300
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
325 330 335
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
340 345 350
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
355 360 365
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
370 375 380
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
385 390 395 400
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
405 410 415
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
420 425 430
Pro Gly Lys
435
<210> 41
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-J重组受体分子
<400> 41
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
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20 25 30
Ser Asn Leu Gln Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly
195 200 205
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
245 250 255
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
260 265 270
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
275 280 285
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
290 295 300
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
325 330 335
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
340 345 350
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
355 360 365
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
370 375 380
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
385 390 395 400
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
405 410 415
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
420 425 430
Pro Gly Lys
435
<210> 42
<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-K重组受体分子
<400> 42
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
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20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
Val Pro Asp Gly Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr
50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Gln Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly
195 200 205
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
245 250 255
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
260 265 270
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
275 280 285
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
290 295 300
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
325 330 335
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
385 390 395 400
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
405 410 415
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
420 425 430
Pro Gly Lys
435
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<211> 435
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-L重组受体分子
<400> 43
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Gln Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
290 295 300
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
325 330 335
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340 345 350
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Pro Gly Lys
435
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<211> 541
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<220>
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<400> 44
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195 200 205
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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370 375 380
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-N重组受体分子
<400> 45
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275 280 285
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370 375 380
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435 440 445
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500 505 510
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515 520 525
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535
<210> 46
<211> 652
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-O重组受体分子
<400> 46
Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile
20 25 30
Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe
35 40 45
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50 55 60
Ile Pro Ser Tyr Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala
65 70 75 80
Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val
85 90 95
Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr
115 120 125
Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys
130 135 140
His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly
145 150 155 160
Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr
165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
180 185 190
Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly
195 200 205
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
210 215 220
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225 230 235 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
245 250 255
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
260 265 270
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
275 280 285
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
290 295 300
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
305 310 315 320
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
325 330 335
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
340 345 350
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
355 360 365
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
370 375 380
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
405 410 415
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile
450 455 460
Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr
465 470 475 480
Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu
485 490 495
Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile
500 505 510
Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala
515 520 525
Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln
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Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu
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Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
645 650
<210> 47
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-P重组受体分子
<400> 47
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
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180 185 190
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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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<210> 48
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-Q重组受体分子
<400> 48
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Gln Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp
130 135 140
Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp
145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val
195 200 205
His Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr
210 215 220
Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val
225 230 235 240
Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys
245 250 255
Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp
260 265 270
Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly
275 280 285
Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn
290 295 300
Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Gly Pro Gly Asp Lys
305 310 315 320
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
325 330 335
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
340 345 350
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
355 360 365
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
370 375 380
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
385 390 395 400
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
405 410 415
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
420 425 430
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
435 440 445
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
450 455 460
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
465 470 475 480
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
485 490 495
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
500 505 510
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
515 520 525
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
530 535 540
Lys
545
<210> 49
<211> 541
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-R重组受体分子
<400> 49
Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His
1 5 10 15
Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro
20 25 30
Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro
35 40 45
Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser
50 55 60
Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val
65 70 75 80
Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn
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Thr Ile Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Pro Phe Ile Ala Ser
100 105 110
Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys
115 120 125
Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser
130 135 140
Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg
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Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile
165 170 175
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Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu
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260 265 270
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275 280 285
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
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355 360 365
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370 375 380
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
500 505 510
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515 520 525
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535 540
<210> 50
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-S重组受体分子
<400> 50
Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser Val Ser Asp Gln
1 5 10 15
His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys Thr Val Val Ile
20 25 30
Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser Leu Cys Ala Arg
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser Tyr Gln Ser Ile
85 90 95
Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val Leu
100 105 110
Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu
115 120 125
Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp
130 135 140
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145 150 155 160
Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu
165 170 175
Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val
195 200 205
His Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr
210 215 220
Ser Glu Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val
225 230 235 240
Ile Pro Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys
245 250 255
Phe Pro Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp
260 265 270
Ser Arg Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly
275 280 285
Leu Leu Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn
290 295 300
Tyr Leu Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Gly Pro Gly Asp Lys
305 310 315 320
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
325 330 335
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
340 345 350
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370 375 380
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
435 440 445
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
515 520 525
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
530 535 540
Lys
545
<210> 51
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-001重组受体分子
<400> 51
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
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Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Thr Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
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Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
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Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
385 390 395 400
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
405 410 415
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420 425 430
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
435 440 445
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
450 455 460
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
465 470 475 480
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
485 490 495
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
500 505 510
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
515 520 525
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535
<210> 52
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-010重组受体分子
<400> 52
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
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20 25 30
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165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
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Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Thr Gly Asn Glu Leu Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
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225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
305 310 315 320
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
325 330 335
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
340 345 350
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
355 360 365
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370 375 380
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
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405 410 415
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
420 425 430
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
435 440 445
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
450 455 460
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<210> 53
<211> 538
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-002重组受体分子
<400> 53
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1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
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Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val Val
195 200 205
Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val
210 215 220
Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn
225 230 235 240
Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg
245 250 255
Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr
260 265 270
Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys
275 280 285
Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg
290 295 300
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340 345 350
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535
<210> 54
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-003重组受体分子
<400> 54
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Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
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225 230 235 240
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245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
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370 375 380
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
385 390 395 400
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
405 410 415
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
420 425 430
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
435 440 445
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
450 455 460
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
465 470 475 480
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
485 490 495
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
500 505 510
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
515 520 525
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535
<210> 55
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-004重组受体分子
<400> 55
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Ile Val His Val Thr Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
305 310 315 320
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
325 330 335
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
340 345 350
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
355 360 365
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
370 375 380
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
385 390 395 400
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
405 410 415
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
420 425 430
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
435 440 445
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
450 455 460
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
465 470 475 480
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
485 490 495
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
500 505 510
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
515 520 525
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535
<210> 56
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-005重组受体分子
<400> 56
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Asn Pro Phe Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
305 310 315 320
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
325 330 335
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
340 345 350
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
515 520 525
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535
<210> 57
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-006重组受体分子
<400> 57
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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340 345 350
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370 375 380
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435 440 445
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Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
500 505 510
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515 520 525
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530 535
<210> 58
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-007重组受体分子
<400> 58
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1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
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145 150 155 160
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165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
305 310 315 320
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
325 330 335
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
340 345 350
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
355 360 365
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
370 375 380
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
385 390 395 400
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
405 410 415
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
420 425 430
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
435 440 445
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
450 455 460
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
465 470 475 480
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
485 490 495
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
500 505 510
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
515 520 525
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535
<210> 59
<211> 539
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LFV-008重组受体分子
<400> 59
Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val
1 5 10 15
Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln His Pro
20 25 30
Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly Thr Asp
50 55 60
Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala Arg Ile
85 90 95
Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp Phe Glu
100 105 110
Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg Lys Asp
115 120 125
Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn Val Thr
130 135 140
Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu Val Val
145 150 155 160
Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu His Asp
165 170 175
Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp Phe Leu
180 185 190
Ser Ala Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr Asp Val
195 200 205
Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu
210 215 220
Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe
225 230 235 240
Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn
245 250 255
Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser
260 265 270
Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val
290 295 300
Arg Val His Glu Lys Gly Pro Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
305 310 315 320
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
325 330 335
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
340 345 350
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
355 360 365
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
370 375 380
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
385 390 395 400
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
405 410 415
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
420 425 430
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
435 440 445
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
465 470 475 480
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
485 490 495
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
500 505 510
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
515 520 525
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
530 535

Claims (29)

1.一种分离的配体结合分子，其包含VEGFR2衍生序列，所述VEGFR2衍生序列是与以下任一种氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:2的位置123-327所示的氨基酸序列；
(b)SEQ ID NO:2的位置117-327所示的氨基酸序列；
(c)SEQ ID NO:2的位置117-421所示的氨基酸序列；
(d)SEQ ID NO:2的位置23-327所示的氨基酸序列；和
(e)SEQ ID NO:2的位置23-421所示的氨基酸序列；
其中所述配体结合分子能结合VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC。
2.权利要求1所述的配体结合分子，其相比于天然VEGFR2具有增强的对VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB和PDGF-CC中的至少三种的结合能力。
3.权利要求1或2所述的配体结合分子，其中所述VEGFR2衍生序列是(a)-(e)中任一种的N末端和/或C末端截短后的片段，例如截短20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸。
4.权利要求1-3中任一项所述的配体结合分子，其中所述VEGFR2衍生序列相比于天然VEGFR2中相应位置处的序列包含一个或多个氨基酸的***、取代或缺失，任选地为在糖基化位点的***、缺失或取代以消除NXT或NXS三氨基酸，例如N被突变为Q或A。
5.权利要求4所述的配体结合分子，其中所述糖基化位点选自对应于SEQ ID NO:2的氨基酸位置46、66、96、143，158、245和318处。
6.权利要求5所述的配体结合分子，其中所述糖基化位点的取代选自以下：N143A、N143Q、N158A、N158Q、N245Q和N318Q。
7.前述权利要求中任一项所述的配体结合分子，其中所述VEGFR2衍生序列包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQ ID No:4-15和18。
8.前述权利要求中任一项所述的配体结合分子，其还包含VEGFR1衍生序列或VEGFR3衍生序列。
9.权利要求8所述的配体结合分子，其中所述VEGFR1衍生序列选自下组：
(i)与SEQ ID NO:1的位置132-230所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；和
(ii)(i)的氨基酸序列的N末端和/或C末端截短后的氨基酸序列，例如截短20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸。
10.权利要求8或9所述的配体结合分子，其包含与SEQ ID NO:2的位置117-327或123-327所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列可操作地连接于所述VEGFR1衍生序列。
11.权利要求10所述的配体结合分子，其包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQID No:16-17和19-21。
12.权利要求8所述的配体结合分子，其中VEGFR3衍生序列选自下组：
(i)与SEQ ID NO:3的位置25-216所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列；和
(ii)(i)的氨基酸序列的N末端和/或C末端截短后的氨基酸序列，例如截短20个、15个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸。
13.权利要求8或12所述的配体结合分子，其包含与SEQ ID NO:2的位置117-327、123-327或221-327所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列可操作地连接于所述VEGFR3衍生序列。
14.权利要求13所述的配体结合分子，其包含选自下组的氨基酸序列或由其组成：SEQID No:22-30。
15.前述权利要求中任一项所述的配体结合分子，其还包含免疫球蛋白的Fc区，优选为人IgG1的Fc区或其变体，任选地所述配体结合分子还包含铰链区。
16.权利要求15所述的配体结合分子，其中所述免疫球蛋白的Fc区通过接头连接至所述VEGFR2衍生序列、VEGFR1衍生序列或VEGFR3衍生序列的C末端。
17.权利要求15或16所述的配体结合分子，其中Fc区如SEQ ID No:31的第104-330位氨基酸序列所示。
18.权利要求15-17中任一项所述的配体结合分子，其包含SEQ ID No:32-59中的任一种序列或由其组成。
19.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1-18中任一项所述的配体结合分子的多核苷酸序列。
20.一种载体，其包含权利要求19所述的核酸分子。
21.一种宿主细胞，其经过权利要求19所述的核酸分子或权利要求20所述的载体转化或转染。
22.一种制备配体结合分子的方法，其包括以下步骤：
-在适宜的条件下培养权利要求21所述的宿主细胞以表达所述配体结合分子；并
-从宿主细胞的培养上清液中分离所述配体结合分子。
23.一种药物组合物，其包含权利要求1-18中任一项所述的配体结合分子以及药学上可接受的载剂。
24.权利要求23所述的药物组合物，其被配制成用于局部施用、玻璃体内注射或玻璃体内植入施用。
25.权利要求1-18中任一项所述的配体结合分子在制备用于治疗受试者中新生血管形成以及由新生血管形成引起的疾病或病况的药物中的用途。
26.权利要求25所述的用途，其中新生血管形成引起的眼部疾病包括视网膜新生血管形成和脉络膜新生血管形成引起的眼部疾病。
27.权利要求25所述的用途，其中所述疾病或病况选自脉络膜血管病变或新生、视网膜血管新生、黄斑血管新生和与眼底渗漏有关的眼部病症。
28.权利要求25-27中任一项所述的用途，其中通过玻璃体内注射或通过玻璃体内植入物施用来施用所述药物。
29.一种试剂盒，其包含在容器中的权利要求1-18中任一项所述的配体结合分子或权利要求23或24所述的药物组合物。
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