CN116157116A - 用于产生病毒融合体的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本公开至少部分提供了用于产生融合体的方法和组合物。在一些实施方案中，用于产生融合体的生产细胞包含外源性或过表达的组织蛋白酶分子。在一些实施方案中，这些细胞产生水平增加的活性融合剂，从而导致融合活性融合体的比例更高。

Description

用于产生病毒融合体的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年7月6日提交的美国临时申请63/048,524的优先权，该临时申请的内容通过引用整体并入本文用于所有目的。
通过引用并入序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以标题为18615_2003540_SeqList.TXT的文件形式提供，所述文件创建于2020年7月1日，大小为97,896字节。序列表电子格式中的信息通过引用整体并入。
发明背景
复杂的生物制剂是用于多种疾病的有前途的治疗候选物。然而，很难将大的生物制剂递送到细胞中，因为质膜充当细胞与细胞外空间之间的屏障。本领域需要将复杂生物制剂递送到受试者细胞中的新方法。
发明内容
本公开至少部分提供了制备可用于体内递送的融合体(fusosome)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括在生产细胞中表达组织蛋白酶分子，以便增加由所述细胞产生的功能性融合体的水平。
列举的实施方案
所提供的实施方案是：
1.一种产生多个融合体的方法，其包括：
(a)提供经修饰的哺乳动物生产细胞，例如人细胞，其包含：
(i)与相应的未经修饰的细胞相比，水平或活性升高的成熟组织蛋白酶分子(例如组织蛋白酶L或组织蛋白酶B)，
(ii)任选的外源性货物分子，例如蛋白质或核酸，和
(iii)亨尼帕病毒(henipavirus)F蛋白分子；和
(iv)亨尼帕病毒G蛋白分子；
(b)在允许产生多个包含所述亨尼帕病毒F蛋白分子和所述亨尼帕病毒G蛋白分子的融合体的条件下，维持(例如，培养)所述经修饰的哺乳动物细胞。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述货物分子包括病毒核酸(例如，慢病毒核酸)。
3.如实施方案1所述的方法，其中已向所述经修饰的细胞中引入所述外源货物分子(例如，其中已将编码外源货物分子的核酸引入经修饰的细胞)。
4.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中例如在将组织蛋白酶分子加工为成熟组织蛋白酶形式的条件下，已向所述经修饰的细胞中引入所述组织蛋白酶分子或编码所述组织蛋白酶分子的核酸。
5.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中在适用于组织蛋白酶分子表达的条件下，已向所述经修饰的细胞中引入所述组织蛋白酶分子或编码所述组织蛋白酶分子的核酸。
6.一种产生经修饰的哺乳动物生产细胞的方法，所述方法包括：
(i)在增加哺乳动物细胞中组织蛋白酶分子的成熟形式的表达的条件下，向所述哺乳动物细胞中引入编码所述组织蛋白酶分子的核酸分子；
(ii)任选地向所述哺乳动物细胞中引入外源货物分子，例如蛋白质或核酸；
(iii)向所述哺乳动物细胞中引入亨尼帕病毒F蛋白分子(例如，在适用于表达所述亨尼帕病毒F蛋白分子的条件下引入编码所述亨尼帕病毒F蛋白分子的核酸)；和
(iv)向所述哺乳动物细胞中引入亨尼帕病毒G蛋白分子(例如，在适用于表达所述亨尼帕病毒G蛋白分子的条件下引入编码所述亨尼帕病毒G蛋白分子的核酸)，
其中步骤(i)-(iv)可以以任何顺序进行，或者步骤(i)-(iv)中的一个或多个可以同时进行。
7.一种产生多个融合体的方法，所述方法包括在允许产生多个包含亨尼帕病毒F蛋白分子和亨尼帕病毒G蛋白分子的融合体的条件下，维持(例如，培养)实施方案3a中产生的经修饰的哺乳动物细胞。
8.如前述实施方案中任一项所述的方法，其还包括从经修饰的细胞中分离多个融合体中的至少一个。
9.如前述实施方案中任一项所述的方法，其还包括：
a)测定来自所产生的多个融合体的一个或多个融合体，以确定是否满足一个或多个(例如，2个、3个或更多个)标准，其中所述标准选自：
i)所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；或1:2、3:5、7:10、4:5、9:10或1:11:1；
ii)所述融合体在例如293LX细胞上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测293LX细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量；
iii)所述融合体例如在活化T细胞(例如原代T细胞，例如Pan-T细胞)上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测活化T细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例3的测定所测量；
iv)其中所产生的多个融合体的在靶细胞上的滴度与在非靶细胞上的滴度的比率为至少2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、500:1、1000:1、5000:1、10,000:1、50,000:1或100,000:1，例如其中靶细胞过表达亨尼帕病毒G蛋白分子所结合的蛋白质，并且非靶细胞为野生型，例如其中例如在实施例1的测定中靶细胞过表达CD8并且非靶细胞为野生型；
v)所述融合体包含的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平比从组织蛋白酶分子的水平或活性没有升高的细胞中产生的其它方面类似的融合体中的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平高至少10％、20％、30％、40％或50％；
b)(任选地)如果满足一个或多个标准，则批准所产生的多个融合体或融合体组合物用于释放。
10.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述多个融合体具有下列特征中的1、2、3、4、5、6种或全部7种：
i)所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；
ii)所述融合体在例如293LX细胞上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测293XL细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量；
iii)所述融合体例如在活化T细胞(例如原代T细胞，例如Pan-T细胞)上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测活化T细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例3的测定所测量；
iv)其中所产生的多个融合体的在靶细胞上的滴度与在非靶细胞上的滴度的比率为至少2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、500:1、1000:1、5000:1、10,000:1、50,000:1或100,000:1，例如其中靶细胞过表达亨尼帕病毒G蛋白分子所结合的蛋白质，并且非靶细胞为野生型，例如其中例如在实施例1的测定中靶细胞过表达CD8并且非靶细胞为野生型；
v)所述融合体包含的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平比从组织蛋白酶分子的水平或活性没有升高的细胞中产生的其它方面类似的融合体中的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平高至少10％、20％、30％、40％或50％。
11.一种经修饰的细胞，其通过如实施方案6所述的方法产生。
12.一种经修饰的哺乳动物细胞，例如人细胞，其包含：
(i)与相应的未经修饰的细胞相比，水平或活性升高的成熟组织蛋白酶分子(例如组织蛋白酶L或组织蛋白酶B)，
(ii)任选的外源货物分子，例如核酸或蛋白质，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸，和
(iii)亨尼帕病毒F蛋白分子；和
(iv)任选的亨尼帕病毒G蛋白分子。
13.一种经修饰的哺乳动物细胞，例如人细胞，其包含：
(i)任选的外源货物分子，例如核酸或蛋白质，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸，和
(ii)亨尼帕病毒F蛋白分子，其中所述细胞中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和
(iii)任选的亨尼帕病毒G蛋白分子。
14.一种融合体，其包含：
(a)任选的外源货物，例如核酸或蛋白质，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；
(b)活性亨尼帕病毒F蛋白分子，其包含与野生型亨尼帕病毒蛋白F1分子相比具有多达30个连续氨基酸的C端截短的修饰F1形式，其中所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和
(c)亨尼帕病毒G蛋白分子。
15.如实施方案14所述的融合体，其中与野生型亨尼帕病毒F1蛋白相比，所述经修饰的F1形式具有10-30、15-30、10-20或20-30个氨基酸，例如22或25个氨基酸(连续氨基酸)的C端截短。
16.一种融合体，其包含：
(a)任选的外源货物，例如核酸或蛋白质，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；
(b)亨尼帕病毒F蛋白分子，其中所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和
(c)亨尼帕病毒G蛋白分子。
17.如实施方案14-16中任一项所述的融合体，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子缺乏内吞基序。
18.如实施方案17所述的融合体，其中所述内吞基序是
Figure BDA0004107707870000071
基序。
19.如实施方案17或18所述的融合体，其中所述内吞基序是YSRL基序。
20.一种融合体，其包含：
(a)任选的外源货物，例如核酸或蛋白质，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；
(b)亨尼帕病毒F蛋白分子，所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和
(c)亨尼帕病毒G蛋白分子；
其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子缺乏内吞基序，例如
Figure BDA0004107707870000072
基序，例如YRSL基序。
21.如实施方案20所述的融合体，其包含经修饰的F1形式，与野生型亨尼帕病毒蛋白F1分子相比，所述F1形式具有多达30个连续氨基酸的C末截短。
22.如实施方案21所述的融合体，其中相对于野生型亨尼帕病毒F蛋白，例如相对于SEQ ID NO:7，所述亨尼帕病毒F蛋白分子包含在C端的10-30、15-30、10-20或20-30个氨基酸，例如22或25个氨基酸的截短。
23.一种融合体，其包含：
(a)任选的外源货物，例如融合体核酸，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；
(b)亨尼帕病毒F蛋白分子，其中所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和
(c)亨尼帕病毒G蛋白分子。
24.一种药物组合物，其包含如实施方案14-23中任一项所述的融合体和任选的药学上可接受的赋形剂。
25.一种药物组合物，其包含多个包含以下的融合体：
(a)任选的外源货物，例如融合体核酸，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；
(b)亨尼帕病毒F蛋白分子，和
(c)亨尼帕病毒G蛋白分子，
其中所述药物组合物在例如293LX细胞上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测293XL细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量。
26.一种药物组合物，其包含多个包含以下的融合体：
(a)任选的外源货物，例如融合体核酸，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；
(b)亨尼帕病毒F蛋白分子，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子包含经修饰的F1形式，与野生型亨尼帕病毒蛋白F1分子相比，所述F1形式具有多达30个连续氨基酸的C端截短，或者其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子缺乏内吞基序(例如
Figure BDA0004107707870000091
基序，例如YRSL基序)，和
(c)亨尼帕病毒G蛋白分子，
其中所述药物组合物在例如293LX细胞上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测293XL细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量。
27.一种药物组合物，其包含多个包含以下的融合体：
(a)任选的外源货物，例如融合体核酸，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；
(b)亨尼帕病毒F蛋白分子，和
(c)亨尼帕病毒G蛋白分子，
其中所述药物组合物在靶细胞(例如活化T细胞，例如原代T细胞，例如Pan-T细胞)上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测活化T细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例3的测定所测量。
28.一种制造包含多个融合体的药物组合物的方法，其包括：
a)提供，例如产生，如实施方案14-23中任一项所述的多个融合体、如实施方案24-27中任一项所述的药物组合物或通过如实施方案1-10中任一项所述的方法制备的融合体；和
b)测定来自多个融合体的一个或多个融合体，以确定是否满足一个或多个(例如，2个、3个或更多个)标准，其中所述标准选自：
i)所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；
ii)所述药物组合物在例如293LX细胞上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测293XL细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量；
iii)所述药物组合物在例如活化T细胞(例如原代T细胞，例如Pan-T细胞)上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测T细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例3的测定所测量；
iv)其中多个融合体的在靶细胞上的滴度与在非靶细胞上滴度的比率为至少2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、500:1、1000:1、5000:1、10,000:1、50,000:1或100,000:1，例如其中靶细胞过表达亨尼帕病毒G蛋白分子所结合的蛋白质，并且非靶细胞为野生型，例如其中例如在实施例1的测定中靶细胞过表达CD8并且非靶细胞为野生型；
v)所述融合体包含的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平比从组织蛋白酶分子的水平或活性没有升高的细胞中产生的其它方面类似的融合体中的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平高至少10％、20％、30％、40％或50％；
c)(任选地)如果满足一个或多个标准，则批准所述多个融合体或药物组合物用于释放。
29.一种反应混合物，其包含：
a)多个靶细胞(例如人细胞，例如原代人细胞，例如来自受试者的细胞)，和
b)如实施方案14-23中任一项所述的多个融合体、如实施方案24-27中任一项所述的药物组合物或通过如实施方案1-10中任一项所述的方法制备的融合体。
30.一种靶细胞(例如人细胞，例如原代人细胞，例如来自受试者的细胞)，其包含：
a)外源货物分子(例如蛋白质或核酸，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸)，和
b)亨尼帕病毒F蛋白分子，其中所述靶细胞中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和
c)亨尼帕病毒G蛋白分子。
31.一种将外源货物(例如融合体核酸，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸)递送至细胞(例如体内或离体)的方法，其包括使所述细胞与如实施方案14-23中任一项所述的多个融合体、如实施方案24-27中任一项所述的药物组合物或通过如实施方案1-10中任一项所述的方法制备的融合体接触。
32.一种将外源货物(例如融合体核酸，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸)递送至受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效数量的如实施方案14-23中任一项所述的融合体、如实施方案24-27中任一项所述的药物组合物或通过如实施方案1-10中任一项所述的方法制备的融合体。
33.如实施方案24-27中任一项所述的药物组合物，其中所述多个融合体在例如293LX细胞上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的滴度，例如如通过检测293XL细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量。
34.如实施方案24-27中任一项所述的药物组合物，其中所述多个融合体在例如活化T细胞(例如原代T细胞，例如Pan-T细胞)上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的滴度，例如如通过检测T细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例3的测定所测量。
35.如实施方案24-27中任一项所述的药物组合物，其中所述多个融合体的在靶细胞上的滴度与在非靶细胞上的滴度的比率为至少2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、500:1、1000:1、5000:1、10,000:1、50,000:1或100,000:1，例如其中靶细胞过表达亨尼帕病毒G蛋白分子所结合的蛋白质，并且非靶细胞为野生型，例如其中例如在实施例1的测定中靶细胞过表达CD8并且非靶细胞为野生型。
36.如实施方案24-27中任一项所述的药物组合物，其中所述多个融合体包含的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平比从组织蛋白酶分子水平或活性没有升高的细胞中产生的其它方面类似的融合体高至少10％、20％、30％、40％或50％。
37.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述组织蛋白酶分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
38.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述组织蛋白酶分子包含融合体或嵌合体。
39.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中经修饰的细胞包含至少1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、50,000、100,000、500,000或1,000,000个外源性组织蛋白酶分子的拷贝。
40.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中经修饰的细胞包含至少1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、50,000、100,000、500,000或1,000,000个总组织蛋白酶L分子的拷贝。
41.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述组织蛋白酶分子的升高水平包括比相应的未经修饰的细胞中的内源性组织蛋白酶L的量大至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍或更多倍的组织蛋白酶分子。
42.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述组织蛋白酶分子的升高活性包括比相应的未经修饰的细胞的组织蛋白酶分子活性大至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1,000倍、10,000倍、100,000倍或更多的每细胞组织蛋白酶分子活性，例如如通过Diederich等人2012的测定所测量。
43.制备如前述实施方案中任一项所述的经修饰的细胞的方法，其中一些或所有组织蛋白酶分子位于所述经修饰的细胞的溶酶体和/或核内体中。
44.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体包含的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平比从组织蛋白酶分子的水平或活性没有升高的细胞中产生的其它方面类似的融合体的水平高至少10％、20％、30％、40％或50％。
45.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体中至少33％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白。
46.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞或药物组合物，其中所述融合体在例如293LX细胞上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测293XL细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量。
47.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞或药物组合物，其中所述融合体在例如活化T细胞(例如原代T细胞，例如Pan-T细胞)上具有至少约200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000或1,000,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测活化T细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例3的测定所测量。
48.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞或药物组合物，其中所产生的多个融合体的在靶细胞上的滴度与在非靶细胞上的滴度的比率为至少2:1、5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、500:1、1000:1、5000:1、10,000:1、50,000:1或100,000:1，例如其中靶细胞过表达亨尼帕病毒G蛋白分子所结合的蛋白质，并且非靶细胞为野生型，例如其中例如在实施例1的测定中靶细胞过表达CD8并且非靶细胞为野生型。
49.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体包含的总亨尼帕病毒蛋白F的水平是由从组织蛋白酶分子的水平或活性没有升高的细胞中产生的其它方面类似的融合体中所包含的总亨尼帕病毒蛋白F的水平的70％-130％、80％-120％、90％-110％、95％-105％或约100％之间。
50.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子包含尼帕病毒(Nipah virus)或亨德拉病毒(Hendravirus)蛋白F序列。
51.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子包含SEQ ID NO:7的野生型尼帕病毒氨基酸序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
52.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子包括表4的亨尼帕病毒F蛋白。
53.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中相对于野生型亨尼帕病毒F蛋白，例如表4的蛋白，所述亨尼帕病毒F蛋白分子包含在C端的10-30个、15-30个、10-20个或20-30个氨基酸，例如22或25个氨基酸的截短。
54.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子缺乏内吞基序，例如
Figure BDA0004107707870000151
基序，例如YRSL基序。
55.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子包含尼帕病毒或亨德拉病毒蛋白F序列。
56.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒G蛋白分子包含SEQ ID NO:9的野生型尼帕病毒氨基酸序列或与其具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
57.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中相对于野生型亨尼帕病毒G蛋白，例如表5的蛋白，所述亨尼帕病毒G蛋白分子包含在N端的10-50个、10-40个、20-50个、20-40个、20-30个、30-50个或30-40个氨基酸，例如34个氨基酸的截短。
58.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒G蛋白分子包含糖基化位点中的一个或多个突变(例如，至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个突变)，所述糖基化位点例如N-连接的糖基化位点，例如胞外域中的N-连接的糖基化位点，例如G1、G2、G3、G4、G5、G6和/或G7位点，如Biering等人(2012)J.Virol.86(22):11991-12002中所述。
59.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子包含糖基化位点中的一个或多个突变(例如，至少一个、两个、三个或四个突变)，所述糖基化位点例如N-连接的糖基化位点，例如F2(例如，在N67处)、F3(例如，在N99处)、F4(例如，在N414处)和/或F5(例如，在N464处)位点，如Lee等人(2011)Trends Microbiol.19(8):389-399中所述。
60.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒G蛋白分子是再靶向亨尼帕病毒G蛋白分子。
61.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中与野生型亨尼帕病毒G蛋白相比，所述亨尼帕病毒G蛋白分子对肝配蛋白B2和/或肝配蛋白B3的亲和力降低，例如其中所述亨尼帕病毒G蛋白分子包含位于E501、W504、Q530和E533中的一个或多个处的突变(例如突变为丙氨酸)。
62.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒G蛋白分子还包含对野生型亨尼帕病毒G蛋白而言为外源的靶向结构域。
63.如实施方案62所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述靶向结构域包含抗体分子。
64.如实施方案62或63所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述靶向结构域结合CD8、CD105、EpCAM或Gria4。
65.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体核酸包含至少一个，例如至少两个质粒。
66.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体核酸不是亨尼帕病毒核酸或不包含亨尼帕病毒基因。
67.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体核酸不是亨德拉病毒核酸或不包含亨德拉病毒基因。
68.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体核酸是慢病毒核酸。
69.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体核酸编码治疗有效载荷。
70.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述经修饰的细胞是人细胞。
71.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述经修饰的细胞、融合体或药物组合物根据GMP实践产生。
72.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述经修饰的细胞是犬细胞、灵长类动物(例如非人灵长类动物，例如非洲绿猴)细胞或鼠细胞。
73.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述经修饰的细胞是肾细胞或上皮细胞(例如，肾上皮细胞)
74.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述经修饰的细胞不是上皮细胞。
75.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述经修饰的细胞包含在核内体、溶酶体或细胞膜中的一者或多者中的亨尼帕病毒F蛋白分子。
76.如前述实施方案中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述经修饰的细胞包含在核内体、溶酶体或细胞膜中的一者或多者中的组织蛋白酶分子。
77.一种融合体，其包含：
a)脂质双层，其包含被重靶向以结合CD105的融合剂(fusogen)(例如亨尼帕病毒融合剂，例如亨尼帕病毒蛋白G分子)；和
b)包含核酸(例如融合体核酸，例如慢病毒核酸)的内腔。
78.一种融合体，其包含：
a)脂质双层，其包含被重靶向以结合EpCAM的融合剂(例如亨尼帕病毒融合剂，例如亨尼帕病毒蛋白G分子)；和
b)包含核酸(例如融合体核酸，例如慢病毒核酸)的内腔。
79.一种融合体，其包含：
a)脂质双层，其包含被重靶向以结合Gria4的融合剂(例如亨尼帕病毒融合剂，例如亨尼帕病毒蛋白G分子)；和
b)包含核酸(例如融合体核酸，例如慢病毒核酸)的内腔。
80.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中以下一者或多者：
i)所述融合体与靶细胞的融合速率高于与非靶细胞的融合速率，例如高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
ii)所述融合体与靶细胞的融合速率高于与另一融合体的融合速率，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
iii)所述融合体与靶细胞的融合速率使得所述融合体中的剂在24、48或72小时后被递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞中；
iv)所述融合体将所述核酸递送至靶细胞的速率高于递送至非靶细胞的速率，例如高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
v)所述融合体将所述核酸递送至靶细胞的速率高于递送至另一融合体的速率，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；或者
vi)所述融合体将所述核酸递送至靶细胞的速率使得所述融合体中的剂在24、48或72小时后被递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞。
81.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述核酸包含以下核酸序列中的一种或多种(例如，全部)：5’LTR(例如，包含U5且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、与有效载荷基因(例如，编码外源剂的核酸)可操作地连接的中心多嘌呤区(Centralpolypurine tract,cPPT)启动子、有效载荷基因(例如，编码外源剂的核酸)(任选地包含在开放阅读框前的内含子)、Poly A尾序列、WPRE和3’LTR(例如包含U5且缺乏功能性U3)。
82.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其包含以下一种或多种(例如，全部)：聚合酶(例如逆转录酶，例如pol或其部分)、整合酶(例如pol或其部分，例如功能性或非功能性变体)、基质蛋白(例如，gag或其部分)、衣壳蛋白(例如，gag或其部分)、核衣壳蛋白(例如，gag或其部分)和蛋白酶(例如pro)。
83.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中当向受试者施用所述融合体时，以下一种或多种：
i)小于10％、5％、4％、3％、2％或1％的可检测地存在于所述受试者中的外源剂是在非靶细胞中；
ii)至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的可检测地包含外源剂的受试者细胞是靶细胞(例如，单一细胞类型的细胞，例如T细胞)；
iii)可检测地包含外源剂的受试者细胞中少于1,000,000、500,000、200,000、100,000、50,000、20,000或10,000个细胞为非靶细胞；
iv)受试者所有靶细胞中外源剂的平均水平比受试者所有非靶细胞中外源剂的平均水平高至少100倍、200倍、500倍或1000倍；或者
v)在受试者的任何非靶细胞中都检测不到外源剂。
84.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述再靶向融合剂包含选自以下的序列：尼帕病毒F和G蛋白、麻疹病毒(measles virus)F和H蛋白、树鼩副粘病毒F和H蛋白、副粘病毒F和G蛋白或F和H蛋白或F和HN蛋白、亨德拉病毒F和G蛋白、亨尼帕病毒F和G蛋白、麻疹病毒(Morbilivirus)F和H蛋白、呼吸道病毒F和HN蛋白、仙台病毒F和HN蛋白、腮腺炎病毒F和HN蛋白、禽腮腺炎病毒(avulavirus)F和HN蛋白或其衍生物或其任何组合。
85.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合剂包含长度为至少40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸且与野生型副粘病毒融合剂，例如表4或表5的序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的结构域。
86.如实施方案85所述的融合体，其中所述副粘病毒是尼帕病毒，例如亨尼帕病毒。
87.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述靶细胞是癌细胞，并且所述非靶细胞是非癌细胞。
88.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其不将核酸递送至非靶细胞，例如抗原呈递细胞、MHC II类+细胞、专职抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、髓样树突细胞、浆细胞样树突细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞。
89.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中少于10％、5％、2.5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％或0.000001％的非靶细胞类型(例如，抗原呈递细胞、MHC II类+细胞、专职抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、髓样树突细胞、浆细胞样树突细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞中的一种或多种)包含核酸，例如逆转录病毒核酸，例如使用定量PCR。
90.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述靶细胞包含每个宿主细胞基因组0.00001-10、.0001-10、.001-10、.01-10、.1-10、.5–5、1-4、1-3或1-2个核酸的拷贝，例如逆转录病毒核酸或其部分，例如其中在体内施用后评估核酸的拷贝数。
91.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中：
少于10％、5％、2.5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％的非靶细胞(例如，抗原呈递细胞、MHC II类+细胞、专职抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、髓样树突细胞、浆细胞样树突细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞)包含外源剂；或者
所述外源剂(例如蛋白质)不可检测地存在于非靶细胞中，所述非靶细胞例如抗原呈递细胞、MHC II类+细胞、专职抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、髓样树突细胞、浆细胞样树突细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞。
92.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体将核酸(例如逆转录病毒核酸)递送至靶细胞，例如T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肝细胞、造血干细胞、CD34+造血干细胞、CD105+造血干细胞、CD117+造血干细胞、CD105+内皮细胞、B细胞、CD20+B细胞、CD19+B细胞、癌细胞、CD133+癌细胞、EpCAM+癌细胞、CD19+癌细胞、Her2/Neu+癌细胞、GluA2+神经元、GluA4+神经元、NKG2D+自然杀伤细胞、SLC1A3+星形胶质细胞、SLC7A10+脂肪细胞或CD30+肺上皮细胞。
93.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.00001％、0.0001％、0.001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞(例如，T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肝细胞、造血干细胞、CD34+造血干细胞、CD105+造血干细胞、CD117+造血干细胞、CD105+内皮细胞、B细胞、CD20+B细胞、CD19+B细胞、癌细胞、CD133+癌细胞、EpCAM+癌细胞、CD19+癌细胞、Her2/Neu+癌细胞、GluA2+神经元、GluA4+神经元、NKG2D+自然杀伤细胞、SLC1A3+星形胶质细胞、SLC7A10+脂肪细胞或CD30+肺上皮细胞中的一种或多种)包含所述核酸，例如使用定量PCR。
94.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.00001％、0.0001％、0.001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞(例如，T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肝细胞、造血干细胞、CD34+造血干细胞、CD105+造血干细胞、CD117+造血干细胞、CD105+内皮细胞、B细胞、CD20+B细胞、CD19+B细胞、癌细胞、CD133+癌细胞、EpCAM+癌细胞、CD19+癌细胞、Her2/Neu+癌细胞、GluA2+神经元、GluA4+神经元、NKG2D+自然杀伤细胞、SLC1A3+星形胶质细胞、SLC7A10+脂肪细胞或CD30+肺上皮细胞)包含外源剂。
95.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中在施用后，例如根据定量PCR测定，包含核酸的靶细胞与包含核酸的非靶细胞的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000。
96.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中例如根据定量PCR测定，靶细胞中核酸或其部分的平均拷贝数与非靶细胞中核酸或其部分的平均拷贝数的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000。
97.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中例如根据定量PCR测定，靶细胞中核酸或其部分的中值拷贝数与非靶细胞中核酸或其部分的中值拷贝数的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000。
98.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中例如根据逆转录定量PCR测定，包含外源性RNA剂的靶细胞与包含外源性RNA剂的非靶细胞的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000。
99.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中例如根据逆转录定量PCR测定，靶细胞的平均外源性RNA剂水平与非靶细胞的平均外源性RNA剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000。
100.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中例如根据逆转录定量PCR测定，靶细胞的外源性RNA剂中值水平与非靶细胞的外源性RNA剂中值水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000。
101.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中例如根据FACS测定，包含外源性蛋白质剂的靶细胞与包含外源性蛋白质剂的非靶细胞的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000。
102.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中例如根据FACS测定，靶细胞的平均外源性蛋白质剂水平与非靶细胞的平均外源性蛋白质剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000。
103.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中例如根据FACS测定，靶细胞的外源性蛋白质剂中值水平与非靶细胞的外源性蛋白质剂中值水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000。
104.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其包含以下一种或两种：
i)脂质双层(例如包膜)上的外源性或过表达的免疫抑制蛋白；和
ii)与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合体相比不存在或以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的免疫刺激性蛋白。
105.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其包含以下一种或多种：
i)脂质双层(例如包膜)上的第一外源性或过表达的免疫抑制蛋白，和脂质双层(例如包膜)上的第二外源性或过表达的免疫抑制蛋白；
ii)脂质双层(例如包膜)上的第一外源性或过表达的免疫抑制蛋白，和与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合体相比不存在或以降低的水平(例如降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的第二免疫刺激性蛋白；或者
iii)与由其他方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合体相比不存在或以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的第一免疫刺激性蛋白，和与由其他方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合体相比不存在或以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的第二免疫刺激性蛋白。
106.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述核酸包含一个或多个绝缘子元件。
107.如前述实施方案中任一项所述的融合体，当向受试者(例如，人受试者或小鼠)施用时，存在以下一种或多种情况:
i)例如通过FACS抗体检测测定，所述融合体不产生可检测的抗体反应(例如，在单次施用或多次施用后)，或针对融合体的抗体以高于背景水平小于10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；
ii)例如，通过PBMC裂解测定、通过NK细胞裂解测定、通过CD8杀伤T细胞裂解测定、通过巨噬细胞吞噬测定，所述融合体不产生可检测的细胞免疫反应(例如，T细胞反应、NK细胞反应或巨噬细胞反应)，或者针对融合体的细胞免疫反应以高于背景水平小于10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；
iii)例如通过补体活性测定，所述融合体不产生可检测的先天免疫反应，例如补体激活(例如，在单次施用或多次施用后)，或者针对融合体的先天免疫反应以高于背景水平小于10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；
iv)例如通过血清灭活测定，少于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.02％、0.01％、0.005％、0.002％或0.001％的融合体被血清灭活；
v)例如通过FACS抗体检测测定，已接受来自融合体的外源剂的靶细胞不产生可检测的抗体反应(例如，在单次施用或多次施用后)，或者针对靶细胞的抗体以高于背景水平小于10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；或者
vi)例如通过巨噬细胞吞噬测定、通过PBMC裂解测定、通过NK细胞裂解测定或通过CD8杀伤T细胞裂解测定，已接受来自融合体的外源剂的靶细胞不产生可检测的细胞免疫反应(例如，T细胞反应、NK细胞反应或巨噬细胞反应)，或者针对靶细胞的细胞反应以高于背景水平小于10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在。
108.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中以下一种或多种(例如，2种或全部3种)适用：所述融合体是逆转录病毒载体，所述脂质双层由包膜(例如，病毒包膜)组成，并且所述核酸是逆转录病毒核酸。
109.如实施方案107或108所述的融合体，其中所述背景水平是同一受试者在施用颗粒或载体之前的相应水平。
110.如实施方案107-109中任一项所述的融合体，其中所述免疫抑制蛋白是补体调节蛋白或CD47。
111.如实施方案107-110中任一项所述的融合体，其中所述免疫刺激性蛋白是MHC(例如，HLA)蛋白。
112.如实施方案107-111中任一项所述的融合体，其中存在以下一种或两种情况：所述第一外源性或过表达的免疫抑制蛋白不是CD47，并且所述第二免疫刺激蛋白不是MHC。
113.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中MHC I(例如，HLA-A、HLA-B或HLA-C)或MHC II(例如，HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ或HLA-DR)不存在于融合体中或以与由其他方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合体相比降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
114.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其包含以下一种或两种：(i)外源性或过表达的免疫抑制蛋白，或(ii)与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合体相比不存在或以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的免疫刺激蛋白。
115.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体在向受试者施用后至少0.5、1、2、3、4、6、12、18、24、36或48小时处于循环中。
116.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后30分钟处于循环中。
117.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后1小时处于循环中。
118.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后2小时处于循环中。
119.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后4小时处于循环中。
120.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后8小时处于循环中。
121.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后12小时处于循环中。
122.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后18小时处于循环中。
123.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后24小时处于循环中。
124.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后36小时处于循环中。
125.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体在施用后48小时处于循环中。
126.如前述实施方案中任一项所述的融合体，所述融合体与参考逆转录病毒(例如在其他方面类似于所述融合体的未经修饰的融合体)相比，具有降低的免疫原性，如通过向适当的动物模型(例如本文所述的动物模型)施用一次或多次所述融合体后体液反应的降低来测量。
127.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中通过抗细胞抗体滴度，例如抗逆转录病毒抗体滴度，例如通过ELISA，测量血清样品中体液反应的降低。
128.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中与来自施用未经修饰的细胞的受试者的血清样品相比，来自施用所述融合体的动物的血清样品的抗融合体抗体滴度降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
129.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中来自施用所述融合体的受试者的血清样品具有增加的抗细胞抗体滴度，例如相对于基线增加1％、2％、5％、10％、20％、30％或40％，例如其中所述基线是指来自同一受试者在施用所述融合体之前的血清样品。
130.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中：
待施用所述融合体的受试者具有或已知具有与所述融合体反应的预先存在的抗体(例如，IgG或IgM)或被针对所述预先存在的抗体进行测试；
待施用所述融合体的受试者不具有可检测水平的与所述融合体反应的预先存在的抗体；
已接受所述融合体的受试者具有或已知具有与所述融合体反应的抗体(例如，IgG或IgM)或被针对所述抗体进行测试；
已接受融合体(例如，至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次)的受试者不具有可检测水平的与所述融合体反应的抗体；或者
在两个时间点之间，抗体水平升高不超过1％、2％、5％、10％、20％或50％，所述第一时间点是在第一次施用所述融合体之前，并且所述第二时间点是在一次或多次施用所述融合体之后。
131.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体是由表达外源性或过表达的HLA-G或HLA-E的细胞，例如用编码HLA-G或HLA-E的核酸转染的细胞产生的逆转录病毒载体。
132.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体是从NMC-HLA-G细胞产生的逆转录病毒载体，并且与由NMC产生的逆转录病毒载体或NMC空载体相比，在特定时间点具有降低的裂解百分比，例如PBMC介导的裂解、NK细胞介导的裂解和/或CD8+T细胞介导的裂解。
133.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述经修饰的融合体逃避巨噬细胞的吞噬作用。
134.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体由表达外源性或过表达的CD47的细胞，例如用编码CD47的核酸转染的细胞产生。
135.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体是逆转录病毒载体，并且其中当巨噬细胞与来源于NMC-CD47的逆转录病毒载体一起孵育时，与来源于NMC的那些载体或NMC空载体相比，吞噬指数降低。
136.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其巨噬细胞吞噬作用降低，例如，与参考融合体(例如，在其他方面类似于所述融合体的未经修饰的融合体)相比，所述巨噬细胞吞噬作用降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中巨噬细胞吞噬作用的降低通过体外测定吞噬指数来确定。
137.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中当在巨噬细胞吞噬作用的体外测定中与巨噬细胞一起孵育时，包含多个融合体的组合物具有0、1、10、100或更高的吞噬指数。
138.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其被修饰并且与未经修饰的逆转录病毒载体相比具有降低的补体活性。
139.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其由包含外源性或过表达的补体调节蛋白(例如DAF)的细胞产生，例如由用编码补体调节蛋白(例如DAF)的核酸转染的细胞产生。
140.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体是逆转录病毒载体，并且其中存在200pg/ml C3a的逆转录病毒载体的剂量对于与相应小鼠血清(例如，HEK-293DAF小鼠血清)孵育的经修饰的逆转录病毒载体(例如，HEK293-DAF)相较于对于与相应小鼠血清(例如，HEK293小鼠血清)孵育的参考逆转录病毒载体(例如，HEK293逆转录病毒载体)较大。
141.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体是逆转录病毒载体，并且其中存在200pg/ml C3a的逆转录病毒载体的剂量对于与原始小鼠血清孵育的修饰逆转录病毒载体(例如，HEK293-DAF)相较于对于与原始小鼠血清孵育的参考逆转录病毒载体(例如，HEK293逆转录病毒载体)较大。
142.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其在施用后30分钟对患者血清中补体介导的失活有抗性。
143.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合体对补体介导的失活有抗性。
144.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述补体调节蛋白包括以下一种或多种：结合衰变加速因子(DAF，CD55)的蛋白，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b-结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白(MCP，CD46)，例如保护蛋白(CD59)，例如抑制经典和替代补体途径CD/C5转化酶的蛋白，例如调节MAC组装的蛋白。
145.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其由MHC I水平降低的细胞产生，例如，由用编码靶向MHC I类的shRNA的DNA转染的细胞产生，例如其中与NMC和NMC载体对照相比，来源于NMC-shMHC I类的逆转录病毒载体具有更低的MHC I类表达。
146.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体(例如，逆转录病毒载体)的免疫原性的量度是血清失活。
147.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中接受外源剂的细胞的百分比在已与来自融合体原始小鼠的血清和热灭活血清一起孵育的融合体样品之间没有差异。
148.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中接受外源剂的细胞的百分比在已与来自融合体原始小鼠的血清孵育的融合体样品和无血清对照孵育之间没有差异。
149.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中接受外源剂的细胞的百分比在已与阳性对照血清一起孵育的融合体样品中低于已与来自融合体原始小鼠的血清一起孵育的融合体样品。
150.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中经修饰的逆转录病毒载体(例如，通过本文所述的方法修饰的载体)在多次(例如多于一次，例如2次或更多次)施用所述经修饰的逆转录病毒载体后具有降低的(例如，与施用未经修饰的逆转录病毒载体相比降低的)血清失活。
151.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其在多次施用后不被血清灭活。
152.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体的免疫原性的量度是例如在多次施用后血清失活。
153.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中接受外源剂的细胞的百分比在已与来自用经修饰的(例如HEK293-HLA-G)融合体处理的小鼠的血清和热灭活血清孵育的融合体样品之间没有差异。
154.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中接受外源剂的细胞的百分比在已与来自用经修饰的(例如HEK293-HLA-G)逆转录病毒载体处理1、2、3、5或10次的小鼠的血清一起孵育的融合体样品之间没有差异。
155.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中接受外源剂的细胞的百分比在已与来自用媒介物处理的小鼠和来自用经修饰的(例如HEK293-HLA-G)融合体处理的小鼠的血清一起孵育的融合体样品之间没有差异。
156.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中接受外源剂的细胞百分比对于来源于参考细胞(例如，HEK293)的融合体相较于对于所述经修饰的(例如，HEK293-HLA-G)融合体较低。
157.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合体的免疫原性的量度是抗体反应。
158.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中接受本文所述的融合体的受试者具有与所述融合体结合并识别所述融合体的预先存在的抗体。
159.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中来自融合体原始小鼠的血清显示出比阴性对照(例如来自耗竭了IgM和IgG的小鼠的血清)更多的信号(例如，荧光)，例如，表明已发生免疫原性。
160.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中来自融合体原始小鼠的血清显示出与阴性对照相比类似的信号(例如，荧光)，例如，表明未可检测地发生免疫原性。
161.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其包含经修饰的逆转录病毒载体，例如通过本文所述的方法修饰的载体，并且在多次(例如多于一次，例如2次或更多次)施用所述经修饰的逆转录病毒载体后，具有降低的(例如，与施用未经修饰的逆转录病毒载体相比降低的)体液反应。
162.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中通过确定抗融合体抗体(例如，IgM、IgG1和/或IgG2抗体)的水平值来评估体液反应。
163.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中与对照(例如，NMC逆转录病毒载体或NMC空逆转录病毒载体)相比，经修饰的(例如，NMC-HLA-G)融合体(例如逆转录病毒载体)在注射后具有降低的抗病毒IgM或IgG1/2抗体滴度(例如，通过FACS上的荧光强度测量)。
164.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中受体细胞不被抗体反应靶向，或者抗体反应将低于参考水平。
165.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中对于来自用逆转录病毒载体处理的小鼠和用PBS处理的小鼠的受体细胞，信号(例如，平均荧光强度)相似。
166.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中受体细胞的免疫原性的量度是巨噬细胞反应。
167.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中受体细胞不被巨噬细胞靶向，或者靶向水平低于参考水平。
168.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中对于来源于用融合体处理的小鼠和用PBS处理的小鼠的受体细胞，吞噬指数相似。
169.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中受体细胞的免疫原性的量度是PBMC反应。
170.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中受体细胞不引发PBMC反应。
171.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中对于来源于用融合体处理的小鼠和用PBS处理的小鼠的受体细胞，CD3+/CMG+细胞的百分比相似。
172.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中受体细胞的免疫原性的量度是自然杀伤细胞反应。
173.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中受体细胞不引发自然杀伤细胞反应或引发较低的自然杀伤细胞反应，例如低于参考值。
174.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中对于来源于用融合体处理的小鼠和用PBS处理的小鼠的受体细胞，CD3+/CMG+细胞的百分比相似。
175.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中受体细胞的免疫原性的量度是CD8+T细胞反应。
176.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中受体细胞不引发CD8+T细胞反应或引发较低的CD8+T细胞反应，例如低于参考值。
177.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中对于来源于用融合体处理的小鼠和用PBS处理的小鼠的受体细胞，CD3+/CMG+细胞的百分比相似。
178.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其中所述融合剂是再靶向融合剂。
179.如前述实施方案中任一项所述的融合体，其包含编码以下一种或两种的逆转录病毒核酸：(i)与编码外源剂的核酸可操作地连接的阳性靶细胞特异性调控元件，或(ii)与编码外源剂的核酸可操作地连接的非靶细胞特异性调控元件。
180.如实施方案179所述的融合体，其中所述核酸包含两个绝缘子元件，例如编码所述外源剂的区域上游的第一绝缘子元件和编码所述外源剂的区域下游的第二绝缘子元件，例如其中所述第一绝缘子元件和第二绝缘子元件包含相同或不同的序列。
181.如实施方案179-180中任一项所述的融合体，其中在第一时间点向所述受试者施用融合体后分离的细胞样品中的外源剂中值水平的变化为在较晚的第二时间点向受试者施用所述融合体后分离的细胞样品中的外源剂中值水平的至少、小于或约10,000％、5,000％、2,000％、1,000％、500％、200％、100％、50％、20％、10％或5％。
182.如实施方案181所述的融合体，其中仅在逆转录病毒基因组拷贝数为至少1.0的细胞中评估每个细胞的中值表达水平。
183.如实施方案179-182中任一项所述的融合体，其中所述受试者中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞可检测地包含外源剂。
184.如实施方案181-182中任一项所述的融合体，其中在向所述受试者施用所述融合体后7天、14天、28天、56天、112天、365天、730天、1095天，评估从所述受试者分离的细胞的中值有效载荷基因表达水平。
185.如实施方案179-184中任一项所述的融合体，其中在第一时间点受试者中的可检测地包含外源剂的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞在较晚的第二时间点仍可检测地包含外源剂，例如其中第一时间点是向所述受试者施用所述融合体后7天、14天、28天、56天、112天、365天、730天、1095天。
186.如实施方案185所述的融合体，其中第二时间点是第一时间点后7天、14天、28天、56天、112天、365天、730天、1095天。
187.如实施方案179-186中任一项所述的融合体，其无基因毒性或与未用融合体处理的靶细胞相比不增加靶细胞中肿瘤形成的速率。
188.如实施方案179-187中任一项所述的融合体，其中在来自已接受所述融合体的受试者的细胞群中评估外源剂中值水平。
189.如实施方案179-188中任一项所述的融合体，其中在施用后不同天从受试者收集(例如，分离)的细胞群中评估的外源剂中值水平与在第7天、第14天、第28天或、第56天评估的细胞群中的外源剂中值水平的差异小于约10,000％、1000％、100％或10％，例如10,000％-1000％、1000％-100％或100％-10％，其中所述群体中的细胞的载体拷贝数为至少1.0。
190.如实施方案179-189中任一项所述的融合体，其中评估来自已接受所述融合体的受试者的细胞中的外源剂水平。
191.如实施方案179-190中任一项所述的融合体，其中在施用所述融合体后7天、14天、28天、56天、112天、365天、730天、1095天从所述受试者收集(例如，分离)的多个细胞中评估包含外源剂的细胞百分比。
192.如实施方案179-191中任一项所述的融合体，其中在施用后不同的两天分离的细胞中评估的包含外源剂的细胞百分比的差异小于1％、5％、10％、20％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、750％、1000％、1500％或2000％。
193.如实施方案179-192中任一项所述的融合体，其中在7天、14天、28天、56天、112天、365天、730天或1095天收集的细胞中，对外源剂呈阳性的靶细胞的百分比是相似的。
194.如实施方案179-193中任一项所述的融合体，其中：
至少与7天一样多的靶细胞在14天、28天、56天、112天、365天、730天或1095天对所述外源剂呈阳性；
至少与14天一样多的靶细胞在28天、56天、112天、365天、730天或1095天对所述外源剂呈阳性；
至少与28天一样多的靶细胞在56天、112天、365天、730天或1095天对所述外源剂呈阳性；
至少与56天一样多的靶细胞在112天、365天、730天或1095天对所述外源剂呈阳性；
至少与112天一样多的靶细胞在365天、730天或1095天对所述外源剂呈阳性；
至少与365天一样多的靶细胞在730天或1095天对所述外源剂呈阳性；或者
至少与730天一样多的靶细胞在1095天对所述外源剂呈阳性；
195.如实施方案179-194中任一项所述的融合体，其中：
在7天、14天、28天、56天、112天、365天、730天或1095天收集的细胞中，包含所述外源剂的靶细胞中的外源剂中值水平是相似的；
在14天、28天、56天、112天、365天、730天或1095天，包含所述外源剂的靶细胞中的外源剂中值水平至少与7天一样高；
在28天、56天、112天、365天、730天或1095天，包含所述外源剂的靶细胞中的外源剂中值水平至少与14天一样高；
在56天、112天、365天、730天或1095天，包含所述外源剂的靶细胞中的外源剂中值水平至少与28天一样高；
在112天、365天、730天或1095天，包含所述外源剂的靶细胞中的外源剂中值水平至少与56天一样高；
在365天、730天或1095天，包含所述外源剂的靶细胞中的外源剂中值水平至少与112天一样高；
在730天或1095天，包含所述外源剂的靶细胞中的外源剂中值水平至少与365天一样高；或者
在1095天，包含所述外源剂的靶细胞中的外源剂中值水平至少与730天一样高。
196.一种将外源剂递送至受试者(例如，人受试者)的方法，其包括向所述受试者施用如前述实施方案中任一项所述的融合体，从而将所述外源剂递送至所述受试者。
197.一种调节受试者(例如，人受试者)、靶组织或靶细胞中的功能的方法，其包括使所述受试者、靶组织或靶细胞接触(例如，向其施用)如前述实施方案中任一项所述的融合体。
198.如实施方案197所述的方法，其中所述靶组织或所述靶细胞存在于受试者中。
199.一种治疗或预防受试者(例如，人受试者)的病症(例如，癌症)的方法，其包括向所述受试者施用如前述实施方案中任一项所述的融合体。
200.一种制备如前述实施方案中任一项所述的融合体的方法，其包括：
a)提供包含核酸和融合剂(例如，再靶向融合剂)的源细胞；
b)在允许产生所述融合体的条件下培养所述源细胞，和
c)从所述源细胞中分离、富集或纯化所述融合体，从而产生所述融合体。
201.如前述实施方案中任一项所述的方法，其中用于产生所述融合体的所述源细胞缺乏融合剂受体，或者其中与其他方面类似的未经修饰的源细胞相比，所述融合剂受体以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
202.如实施方案201所述的源细胞，其中所述融合剂在与所述融合剂受体结合时导致所述融合体与所述靶细胞融合。
203.如实施方案201-202中任一项所述的源细胞，其与第二相似的源细胞结合，例如，所述源细胞的所述融合剂与所述第二源细胞上的所述融合剂受体结合。
204.一种如实施方案201-203中任一项所述的源细胞群。
205.如实施方案201-204中任一项所述的方法，其中其中少于10％、5％、4％、3％、2％或1％的源细胞是多核的。
206.如实施方案201-205中任一项所述的方法，其中在制造本文所述的融合体期间，源细胞被修饰为与其它源细胞具有降低的融合(例如，不融合)。
207.如实施方案201-206中任一项所述的方法，其中所述融合剂(例如，再靶向融合剂)不与源细胞所包含的蛋白质结合，例如不与所述源细胞表面上的蛋白质结合。
208.如实施方案201-207中任一项所述的方法，其中所述融合剂(例如，再靶向融合剂)与源细胞所包含的蛋白质结合，但不与所述细胞融合。
209.如实施方案201-208中任一项所述的方法，其中所述融合剂不诱导与源细胞的融合。
210.如实施方案201-209中任一项所述的方法，其中所述源细胞不表达结合所述融合剂的蛋白质(例如，抗原)。
211.如实施方案201-210中任一项所述的方法，其中多个源细胞在表达所述融合剂时不形成合胞体，或者所述群体中少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是多核的(例如，包含两个或更多个核)。
212.如实施方案201-211中任一项所述的方法，其中多个源细胞在产生融合体时不形成合胞体，或者所述群体中少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞是多核的。
213.如实施方案201-212中任一项所述的方法，其中所述群体中少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的细胞核是在合胞体中。
214.如实施方案201-213中任一项所述的方法，其中所述群体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的细胞核是在单核细胞中。
215.如实施方案201-214中任一项所述的方法，其中与未经修饰的源细胞的其他方面类似的群体相比，经修饰的源细胞群中多核细胞的百分比更低，例如低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
216.如实施方案201-215中任一项所述的方法，其中与未经修饰的源细胞的其他方面类似的群体相比，在经修饰的源细胞群中存在于合胞体中的核的百分比更低，例如低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
217.如实施方案201-216中任一项所述的方法，其中多核细胞(例如，具有两个或更多个核的细胞)例如使用DNA染色剂通过显微镜测定法检测。
218.如实施方案201-217中任一项所述的方法，其中从所述经修饰的源细胞获得的功能性融合体(例如，病毒颗粒)比从其他方面类似的未经修饰的源细胞获得的融合体的数量多至少10％、20％、40％、40％、50％、60％、70％、8-％、90％、2倍、5倍或10倍。
219.如前述实施方案中任一项所述的融合体，与来自其它方面类似的源细胞的未经修饰的融合体相比，所述融合体缺少融合剂受体或包含以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的融合剂受体。
220.如实施方案201-219中任一项所述的方法，其包括敲低或敲除源细胞中的融合剂受体或其前体。
从说明书和附图、以及从权利要求中，本发明的其它特征、目的以及优点将会显而易见。
除非另有限定，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用整体并入本文。例如，本文中提及的(例如本文的任何表格中提及的)所有GenBank、Unigene和Entrez序列都通过引用并入本文。除非另有说明，否则本文(包括本文中的任何表格)中指定的序列登录号是指截至2020年7月6日的当前数据库条目。当一个基因或蛋白质引用多个序列登录号时，包括所有序列变体。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。
附图说明
图1A-1B是示出亨尼帕病毒F蛋白加工概况的一系列图。图1A示出了由亨尼帕病毒F蛋白的初始翻译产生的无活性前体(F0)，所述无活性前体被运输到质膜(PM)，然后被再循环到核内体和溶酶体，以被组织蛋白酶L切割成融合活性F1/F2亚基。活性形式与蛋白G复合并启动膜融合。图1B示出了在亨尼帕病毒F蛋白胞质尾中的两个基序(Y(525)RSL和Y(542)Y)，其被鉴定为对于亨尼帕病毒F蛋白的内吞作用和暴露于组织蛋白酶L以进行切割是重要的。这些基序在用于增强慢病毒假型化的NivFd22截短蛋白中缺失。
图2A-2B是一系列实验的数据，其示出了组织蛋白酶L过表达后靶向CD8或其他细胞表面标志物的融合体的滴度。图2A示出了如实施例1所述，转导CD8过表达细胞后测量的功能性病毒滴度的定量。图2B示出了用Niv蛋白G构建体转导的靶细胞上的病毒滴度的定量，所述Niv蛋白G构建体具有识别不同细胞表面部分的靶向部分，具有或没有过表达的组织蛋白酶L，如实施例2中所述。
图3A-3B示出了靶向PanT细胞上的CD8的融合体的功能滴度的定量。如实施例3所述，用浓缩的(图3A)或粗制的(图3B)假型化慢病毒裂解物转导Pan T细胞。从左到右，每个条表示：1)NivF上没有HA并且没有CathL过表达；Xfect转染试剂；2)NivF上的HA并且没有CathL过表达；Xfect转染试剂；3)在NivF上没有HA并且CathL过表达；Xfect转染试剂；和4)NivF上的HA并且CathL过表达；Xfect转染试剂。
图4示出了通过对针对GFP呈阳性的转导的Pan T细胞进行流式细胞术来进行的定量。GFP在Pan T细胞中的表达表明融合体成功转导了靶细胞。用从293LX生产细胞分离的假型化慢病毒裂解物转导Pan T细胞，所述生产细胞如实施例3和表6所述进行转染。流式细胞术图在X轴上示出了GFP水平，其表明Pan T细胞的成功转导，并且在Y轴上示出了CD8水平，其表明群体中哪些细胞对CD8呈阳性并因此被融合体靶向。所有实验都使用0.04的假型化慢病毒稀释度。图4中所示的每次转导的双阳性CD8和GFP细胞的百分比包括在表7中。
图5A-5C示出了组织蛋白酶L的过表达对生产细胞和它们各自分离的假型化慢病毒样品中亨尼帕病毒F蛋白加工的影响。如先前所述转染293LX生产细胞，以产生靶向CD8的尼帕G和F假型化慢病毒载体。如实施例3和表6所述，分离它们各自含有假型化慢病毒的上清液。在图5A中，如实施例4A中所述定量了在生产细胞和假型化慢病毒样品中检测到的F0前体无活性蛋白和切割的融合活性F1亚基的蛋白质印迹条带强度。X轴表示样品(生产细胞–CathL和+CathL、LV–CathL和+CathL)，并且Y轴表示来自蛋白质印迹的蛋白质信号强度的AUC(曲线下面积)。生产细胞-CathL显示F0和F1的AUC值为约12-13,000；生产细胞+CathL显示F0的AUC值为约2,000并且F1的AUC值为约9,000；LV-CathL显示F0的AUC值为约20,000并且F1的AUC值为约9,000；并且LV+CathL显示F0和F1的AUC值均为约12,000。在图5B中，如在实施例4A中，测定切割的F1亚基占总F蛋白(F1+F0)的百分比。X轴表示样品(生产细胞-CathL和+CathL、LV–和+CathL)，并且Y轴表示切割的F1亚基占总F蛋白的百分比。切割的F1亚基占总F蛋白的百分比对于生产细胞-CathL为约45％，对于生产细胞+CathL为约80％，对于LV-CathL为约30％，并且对于LV+CathL为约50％。图5C是亨尼帕病毒F蛋白的示意图，其示出了具有切割位点的活性F1/F2亚基以及作为参考的整个非活性F0亚基。
图6测量生产细胞样品中成熟(蛋白水解加工的)组织蛋白酶L的生产和加工。如实施例3和表6所述，转染293LX生产细胞，并分离它们各自含有假型化慢病毒的上清液。如实施例4B中所述，裂解生产细胞以获得蛋白质样品，并用抗组织蛋白酶L抗体通过蛋白质印迹分析这些样品。图像示出了对应于成熟组织蛋白酶L的蛋白质条带。
图7测量分离的假型化慢病毒样品中的p24产生。如实施例3和表6所述，转染293LX生产细胞，并分离它们各自含有假型化慢病毒的上清液。如实施例4C所述，用抗p24抗体通过通过蛋白质印迹分析假型化慢病毒样品。
图8测量生产细胞样品中的亨尼帕病毒G蛋白表达。如实施例3和表6所述，转染293LX生产细胞，并分离它们各自含有假型化慢病毒的上清液。如实施例5中那样，裂解生产细胞以获得蛋白质样品，并用抗亨尼帕病毒G蛋白抗体通过蛋白质印迹分析这些样品。
具体实施方式
本公开至少部分提供了用于体内递送的融合体方法和组合物。特别地，本公开提供了用于使用哺乳动物生产细胞产生多个融合体的方法，所述哺乳动物生产细胞包含水平或活性升高的成熟组织蛋白酶分子(例如，组织蛋白酶L或组织蛋白酶B)、亨尼帕病毒F蛋白、亨尼帕病毒G蛋白和任选的外源货物分子。
定义
除非另有说明，否则权利要求书和说明书中使用的术语定义如下。
如本文所用，术语“抗体分子”是指包含来自免疫球蛋白重链可变区的足够序列和/或来自免疫球蛋白轻链可变区的足够序列以提供抗原特异性结合的多肽。抗体分子可包含支持抗原结合的全长抗体和/或其片段，例如Fab片段。在一些实施方案中，抗体分子将包含重链CDR1、CDR2和CDR3序列以及轻链CDR1、CDR2和CDR3序列。抗体分子包括例如人抗体、人源化抗体、CDR移植的抗体及其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体分子包含含有至少一个免疫球蛋白可变区区段的蛋白质，例如提供免疫球蛋白可变结构域的氨基酸序列或免疫球蛋白可变结构域序列。抗体分子的实例包括但不限于人源化抗体分子、完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如
Figure BDA0004107707870000461
等)；抗体片段，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段和分离的CDR或其集合；单链Fv；多肽-Fc融合物；单结构域抗体(例如鲨鱼单结构域抗体，诸如IgNAR或其片段)；骆驼样抗体；掩蔽的抗体(例如，/>
Figure BDA0004107707870000462
)；小模块免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双抗体
Figure BDA0004107707870000463
Figure BDA0004107707870000464
微型抗体；/>
Figure BDA0004107707870000465
锚蛋白重复蛋白或
Figure BDA0004107707870000466
Figure BDA0004107707870000467
DART；TCR样抗体；/>
Figure BDA0004107707870000468
Figure BDA0004107707870000469
微量蛋白(MicroProteins)；/>
Figure BDA00041077078700004610
Figure BDA00041077078700004611
以及/>
Figure BDA00041077078700004612
如本文所用，“货物分子”是指融合体所包含的分子(例如核酸分子或多肽，例如蛋白质)。在一些实施方案中，货物分子被细胞，例如如本文所述的源细胞包装到融合体中。在一些实施方案中，货物分子是相对于融合体或源细胞的外源剂。
如本文所用，术语“组织蛋白酶分子”是指具有组织蛋白酶(例如，如本文所述的组织蛋白酶B或组织蛋白酶L)的结构和/或功能的分子。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子可以是半胱氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子包含如本文所述的组织蛋白酶蛋白(例如组织蛋白酶B或组织蛋白酶L，例如人组织蛋白酶B或人组织蛋白酶L)的氨基酸序列。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子水平或活性升高可例如通过增加F蛋白(例如，亨尼帕病毒F蛋白)加工(不受理论束缚)导致融合体功能滴度增加(例如，如实施例3中所述)。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子增加生产细胞中活性F蛋白(例如，通过F1水平测量)与无活性F蛋白(F0)的比率，例如如实施例4中所述。如本文所用，“总组织蛋白酶分子”通常是指细胞(例如源细胞)中组织蛋白酶分子的总数。在一些情况下，总组织蛋白酶分子可包括细胞外源的组织蛋白酶分子和细胞内源的组织蛋白酶分子。如本文所用，“外源组织蛋白酶分子”是相对于融合体、源细胞和/或靶细胞为外源的组织蛋白酶分子。在一些实施方案中，外源组织蛋白酶分子相对于野生型组织蛋白酶分子(例如由源细胞，例如生产细胞表达)包含一个或多个差异(例如，突变)。在一些实施方案中，外源组织蛋白酶分子具有例如野生型组织蛋白酶分子的序列，并且由外源提供给源细胞(例如生产细胞)的核酸分子表达。
如本文所用，“融合体”是指包围内腔或空腔的两亲性脂质双层和与两亲性脂质双层相互作用的融合剂。在实施方案中，融合体包含核酸。在一些实施方案中，融合体是膜包围的制剂。在一些实施方案中，融合体来源于源细胞。
如本文所用，“融合体组合物”是指包含一种或多种融合体的组合物。
如本文所用，“融合剂”是指在两个膜包围的内腔之间产生相互作用的剂或分子。在实施方案中，融合剂促进膜的融合。在其他实施方案中，融合剂在两个内腔(例如，逆转录病毒载体的内腔和靶细胞的细胞质)之间产生连接，例如小孔。在一些实施方案中，融合剂包含两种或更多种蛋白质的复合物，例如，其中两种蛋白质单独都不具有融合活性。在一些实施方案中，融合剂包含靶向结构域。
如本文所用,“融合剂受体”是指靶细胞所包含的实体(例如，蛋白质)，其中融合体(例如，逆转录病毒)上的融合剂与靶细胞上的融合剂受体的结合促进了核酸(例如，逆转录病毒核酸)(以及任选地还有其中编码的外源剂)向靶细胞的递送。
如本文所用，“绝缘子元件”是指阻断增强子或防止异染色质扩散的核苷酸序列。绝缘子元件可以是野生型或突变型。
如本文所用，术语“有效量”意指足以显著且正面地改变待治疗的症状和/或疾患(例如，提供正面临床反应)的药物组合物的量。用于药物组合物的活性成分的有效量将随所治疗的具体疾患、疾患的严重程度、治疗的持续时间、并行疗法的性质、所使用的具体活性成分、所使用的具体药学上可接受的赋形剂和/或载体和主治医师知识和专业知识内的类似因素而变化。
如本文所用，涉及融合体的“外源剂”是指既不被相应的野生型病毒或由相应的野生型源细胞制备的融合剂包含也不被其编码的疾患。在一些实施方案中，外源剂不是天然存在的，诸如具有相对于天然存在的蛋白质改变(例如，通过***、缺失或取代)的序列的蛋白质或核酸。在一些实施方案中，外源剂不天然存在于源细胞中。在一些实施方案中，外源剂天然存在于源细胞中，但对于病毒而言是外源的。在一些实施方案中，外源剂不天然存在于受体细胞中。在一些实施方案中，外源剂天然存在于受体细胞中，但不以期望的水平或在期望时间存在。在一些实施方案中，外源剂包含RNA或蛋白质。
如本文所用，术语“亨尼帕病毒F蛋白分子”是指具有亨尼帕病毒融合蛋白(例如，由亨尼帕病毒F基因编码)的结构和/或功能的多肽。在一些实施方案中，亨尼帕病毒F蛋白分子参与(例如诱导，例如与亨尼帕病毒G蛋白分子组合来诱导)融合体膜和靶细胞膜之间的融合。在一些实施方案中，亨尼帕病毒F蛋白分子是多肽三聚体，例如同源三聚体的一部分。在一些实施方案中，融合体包含在其表面的多个亨尼帕病毒F蛋白分子。在一些实施方案中，亨尼帕病毒F蛋白分子与亨尼帕病毒F蛋白或由亨尼帕病毒F基因编码的蛋白具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，亨尼帕病毒F蛋白分子能够促进融合体膜和靶细胞膜之间的融合(例如，与亨尼帕病毒G蛋白分子组合)。亨尼帕病毒F蛋白分子可以是活性的或无活性的。通常，亨尼帕病毒F蛋白以非活性形式产生，并且然后加工成活性形式。更具体地说，亨尼帕病毒F蛋白通常以F0链形式产生，并且然后切割产生F1链和F2链(它们通过二硫桥彼此连接)并具有活性。如本文所用，“活性”亨尼帕病毒F蛋白分子是指包含F1链的亨尼帕病毒F蛋白分子，例如其通过切割F0链产生F1链和F2链而产生。如本文所用,“无活性”亨尼帕病毒F蛋白分子是指具有F0链的亨尼帕病毒F蛋白分子,“总”亨尼帕病毒蛋白F包括活性和无活性亨尼帕病毒蛋白F。
如本文所用，术语“亨尼帕病毒G蛋白分子”是指具有亨尼帕病毒G蛋白(例如，由亨尼帕病毒G基因编码)的结构和/或功能的多肽。在一些实施方案中，亨尼帕病毒G蛋白分子能够与靶细胞表面上的多肽结合。在一些实施方案中，融合体包含在其表面上的多个亨尼帕病毒G蛋白分子。在一些实施方案中，亨尼帕病毒G蛋白分子与亨尼帕病毒G蛋白或由亨尼帕病毒G基因编码的蛋白具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，亨尼帕病毒G蛋白分子是融合蛋白，例如包含异源靶向部分。在一些实施方案中，亨尼帕病毒G蛋白分子是再靶向融合剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症且具有合理的效益/风险比的赋形剂、组合物和/或剂型。
如本文所用，“阳性靶细胞特异性调控元件”(或阳性TCSRE)是指与非靶细胞相比增加靶细胞中外源剂水平的核酸序列，其中编码所述外源剂的核酸与阳性TCSRE可操作地连接。在一些实施方案中，阳性TCSRE是功能性核酸序列，例如阳性TCSRE可以包含启动子或增强子。在一些实施方案中，阳性TCSRE编码功能性RNA序列，例如阳性TCSRE可以编码促进靶细胞中RNA正确剪接的剪接位点。在一些实施方案中，阳性TCSRE编码功能性蛋白质序列或者阳性TCSRE可以编码促进蛋白质正确翻译后修饰的蛋白质序列。在一些实施方案中，阳性TCSRE降低外源剂的下调因子或抑制剂的水平或活性。
如本文所用，“非靶细胞特异性调控元件”(或NTCSRE)是指与靶细胞相比降低非靶细胞中的外源剂水平的核酸序列，其中编码外源剂的核酸与NTCSRE可操作地连接。在一些实施方案中，NTCSRE是功能性核酸序列，例如在非靶细胞中引起逆转录病毒核酸降解或抑制的miRNA识别位点。在一些实施方案中，核酸序列编码功能性RNA序列，例如核酸编码存在于编码外源性蛋白质剂的mRNA中的miRNA序列，使得mRNA在非靶细胞中被降解或抑制。在一些实施方案中，NTCSRE增加外源剂的下调因子或抑制剂的水平或活性。术语“阴性TCSRE”和“NTCSRE”在本文中可互换使用。
如本文所用，“再靶向融合剂”是指包含具有不是融合剂的天然存在形式的一部分的序列的靶向部分的融合剂。在实施方案中，融合剂包含相对于融合剂的天然存在形式中的靶向部分不同的靶向部分。在实施方案中，融合剂的天然存在形式缺乏靶向结构域，并且再靶向融合剂包含融合剂的天然存在形式不存在的靶向部分。在实施方案中，融合剂被修饰以包含靶向部分。在实施方案中，相对于融合剂的天然存在形式，融合剂包含在靶向部分的外侧的一个或多个序列改变，例如在跨膜结构域、融合活性结构域或胞质结构域中。
如本文所用,“靶细胞”是指期望融合体(例如慢病毒载体)向其递送外源剂的细胞类型。在实施方案中，靶细胞是特定组织类型或种类的细胞，例如免疫效应细胞，例如T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是患病细胞，例如癌细胞。
如本文所用，“非靶细胞”是指不期望融合体(例如慢病毒载体)向其递送外源剂的细胞类型。在一些实施方案中，非靶细胞是特定组织类型或种类的细胞。在一些实施方案中，非靶细胞是非患病细胞，例如非癌细胞。
如本文所用，术语“治疗”是指改善疾病或病症，例如减缓或阻止或减少疾病或病症的发展，例如病症的根本原因或其至少一种临床症状。
组织蛋白酶
本文描述了涉及融合体的方法和组合物，所述融合体包含水平或活性升高的组织蛋白酶分子，例如成熟组织蛋白酶分子。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子是组织蛋白酶L或组织蛋白酶B。通常，组织蛋白酶是通常在特征为低pH(例如，相对于细胞溶质pH低)的细胞器(例如溶酶体)中具有活性的蛋白酶。在某些情况下，组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶L和组织蛋白酶B)是参与细胞内蛋白水解(例如溶酶体蛋白水解)的半胱氨酸蛋白酶。
在一些实施方案中，组织蛋白酶分子最初是作为前酶原产生的，通常称为组织蛋白原，其随后在细胞中被加工成“成熟”组织蛋白酶分子。在一些实施方案中，成熟组织蛋白酶分子可以包括重链多肽和轻链多肽。成熟组织蛋白酶可以以单链形式(例如约28kDa)和/或重链和轻链(例如分别约24和4kDa)的双链形式存在。在一些实施方案中，重链多肽和轻链多肽例如通过一个或多个二硫化物连接。在一些实施方案中，成熟组织蛋白酶分子包含组织蛋白酶L1蛋白(例如人组织蛋白酶L1蛋白)的氨基酸序列(例如，下文SEQ ID NO:1的氨基酸序列)。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子与SEQ ID NO:1的示例性组织蛋白酶L1序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，成熟组织蛋白酶分子包含组织蛋白酶B蛋白(例如人组织蛋白酶B蛋白)的氨基酸序列(例如，下文SEQ ID NO:2的氨基酸序列)。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子与SEQ IDNO:2的示例性组织蛋白酶B序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
示例性组织蛋白酶L1序列(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0004107707870000521
示例性组织蛋白酶B序列(SEQ ID NO:2):
Figure BDA0004107707870000522
在一些实施方案中，成熟组织蛋白酶分子包含组织蛋白酶L1蛋白(例如，人组织蛋白酶L1蛋白)的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:37的氨基酸序列)。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子与SEQ ID NO:37的示例性组织蛋白酶L1序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，成熟组织蛋白酶分子包含组织蛋白酶B蛋白(例如人组织蛋白酶B蛋白)的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:38的氨基酸序列)。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子与SEQ ID NO:38的示例性组织蛋白酶B序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，成熟组织蛋白酶分子包含组织蛋白酶B蛋白(例如人组织蛋白酶B蛋白)的氨基酸序列(例如SEQ ID NO:39的氨基酸序列)。在一些实施方案中，组织蛋白酶分子与SEQ ID NO:39的示例性组织蛋白酶B序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。
在一些实施方案中，将编码组织蛋白酶分子的核酸引入到用于与产生如本文提供的融合体结合使用的宿主细胞中。例如，将编码组织蛋白酶(例如组织蛋白酶L或组织蛋白酶B)的核酸引入到包装细胞系(生产细胞)中，所述细胞系与如下所述的产生逆转录病毒载体的方法结合使用。在一些实施方案中，核酸分子编码包含成熟组织蛋白酶编码序列的组织蛋白酶的前肽形式。前肽切割后，产生成熟组织蛋白酶。在其他实施方案中，核酸分子编码成熟组织蛋白酶，例如在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38或SEQID NO:39中所示的。在一些实施方案中，核酸编码表现出与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％、95％、98％或更多序列同一性的组织蛋白酶L。在一些实施方案中，核酸编码SEQ IDNO:1中所示的组织蛋白酶L。在一些实施方案中，核酸编码表现出与SEQ ID NO:37具有至少85％、90％、95％、98％或更多序列同一性的组织蛋白酶L。在一些实施方案中，核酸编码SEQID NO:37中所示的组织蛋白酶L。在一些实施方案中，核酸分子编码与SEQ ID NO:2表现出至少85％、90％、95％、98％或更多序列同一性的组织蛋白酶B。在一些实施方案中，核酸分子编码如SEQ ID NO:2中所示的组织蛋白酶B。在一些实施方案中，核酸编码表现出与SEQID NO:38具有至少85％、90％、95％、98％或更多序列同一性的组织蛋白酶L。在一些实施方案中，核酸编码SEQ ID NO:38中所示的组织蛋白酶L。在一些实施方案中，核酸分子编码表现出与SEQ ID NO:39具有至少85％、90％、95％、98％或更多序列同一性的组织蛋白酶B。在一些实施方案中，核酸分子编码如SEQ ID NO:39中所示的组织蛋白酶B。
在一些实施方案中，生产细胞是哺乳动物细胞。根据生产融合体，例如逆转录病毒载体颗粒，如慢病毒载体，可以使用任何合适的细胞系作为生产或包装细胞系。在一些实施方案中，细胞系包括哺乳动物细胞，例如人细胞。可以使用的合适细胞系包括例如CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在实施方案中，包装细胞是293细胞、293T细胞或A549细胞。
在一些实施方案中，组织蛋白酶分子在宿主细胞(例如，用于产生融合体的生产细胞，如本文所述)中表达。任何合适的用于表达外源性多肽的方法都可以用于在此类宿主细胞中表达组织蛋白酶分子。
在一些实施方案中，例如通过用包含编码组织蛋白酶分子的序列的核酸构建体转染宿主细胞，例如在合适的启动子(例如，组成型启动子或诱导型启动子)的控制下使组织蛋白酶分子在宿主细胞中瞬时表达。在一些实施方案中，核酸分子被引入用于游离体递送至细胞。提供转基因作为游离体的方法包括用表达质粒、病毒样颗粒或腺病毒(AAV)递送。
在一些实施方案中，使用细胞(例如哺乳动物细胞)中组织蛋白酶基因座的位点特异性激活剂来实现表达。例如，可将融合蛋白引入到包含对于组织蛋白酶基因(例如CTSB或CTSL)具有特异性的位点特异性结合结构域和转录激活因子的细胞中。在一些任何实施方案中，位点特异性结合结构域选自由以下组成的组：锌指、转录激活样(TAL)效应物、大范围核酸酶和CRISPR/Cas9***组分或其修饰形式。在一些任何实施方案中，编码的调节因子是锌指转录因子(ZF-TF)。在一些任何实施方案中，位点特异性结合结构域是CRISPR/Cas***，其中CRISPR/Cas***包含缺乏核酸酶活性的经修饰的Cas核酸酶和指导RNA(gRNA)。在一些任何实施方案中，经修饰的核酸酶是无催化活性的Cas9(dCas9)。在一些任何实施方案中，转录激活因子选自单纯疱疹来源的反式激活结构域、Dnmt3a甲基转移酶结构域、p65、VP16和VP64。在一些任何实施方案中，转录激活因子是三联激活因子VP64-p65-Rta(VPR)。
在一些实施方案中，在组织蛋白酶稳定表达的条件下，将组织蛋白酶分子引入到细胞中。例如，在一些实施方案中，将组织蛋白酶分子引入到细胞中，以整合到细胞的染色体中。多种方法中的任何一种都可用于将递送的核酸分子稳定整合到细胞中。在一些实施方案中，使用慢病毒载体将编码组织蛋白酶的核酸递送至细胞。在其他实施方案中，编码组织蛋白酶的核酸通过靶向整合至细胞中的选定基因座来递送至细胞中。
用于靶向整合的方法是已知的。例如，多种位点特异性核酸酶中的任何一种都可用于介导宿主细胞DNA的靶向切割，以偏向***到选定的基因组基因座中(参见例如美国专利7,888,121和美国专利公开号201 10301073)。可以使用在内源性基因座内或附近切割的特异性核酸酶，并且可以通过同源定向修复(HDR)或通过非同源末端连接期间的末端捕获(NHEJ)将转基因整合到切割位点或切割位点附近。整合过程受转基因供体上同源区域的使用或不使用的影响。供体上的这些染色体同源区域侧接转基因盒，并与切割位点的内源性基因座序列同源。
在一些实施方案中，靶基因座是非同源性基因座，例如由于期望的有益特性而选择的基因座。在一些情况下，编码组织蛋白酶的核酸可以***到基因组中的特定“安全港”位置，所述位置可以利用在该安全港基因座处发现的启动子，或者允许通过在***前与转基因融合的外源启动子来调节转基因的表达。已描述了若干个此类“安全港”基因座，包括人细胞中的AAVS1(也称为PPP1R12C)和CCR5基因、Rosa26和白蛋白(参见共有的美国专利公开号20080299580、20080159996和201000218264以及美国申请号13/624,193和13/624,217)。如上所述，可以利用对安全港具有特异性的核酸酶，使得通过HDR或NHEJ驱动的过程***转基因构建体。
在一些实施方案中，用于产生融合体的其他组分也可以在生产细胞或包装细胞中表达，诸如下文所述，例如用于逆转录病毒或病毒样颗粒生产方法。在一些实施方案中，可以使用转移载体，其是编码所关注的转基因(例如外源剂)的逆转录病毒(例如慢病毒)转移质粒，其中转基因序列侧接长末端重复(LTR)序列，以促进转移质粒序列整合到宿主基因组中，并且反之则缺乏病毒序列，因此其是复制缺陷型的。然后可以将转移载体引入到含有gag、pol和env基因但没有LTR和包装组分的包装细胞系中。将重组逆转录病毒颗粒分泌到培养基中，然后收集，任选地浓缩，并将其用于基因转移。
在特定的实施方案中，包装细胞系含有编码亨尼帕病毒F蛋白分子(例如任何所述的)和亨尼帕病毒G蛋白分子(例如任何所述的)的基因，使得逆转录病毒载体(例如慢病毒载体)被来自亨尼帕病毒的包膜蛋白假型化。在特定的实施方案中，包装细胞系含有编码亨尼帕病毒F蛋白分子(例如任何所述的)和亨尼帕病毒G蛋白分子(例如任何所述的)的基因，使得病毒样颗粒(例如慢病毒样颗粒)被来自亨尼帕病毒的包膜蛋白假型化。在一些实施方案中，亨尼帕病毒是尼帕病毒。如本文所述，G蛋白分子可被修饰以掺入靶向/结合配体，从而将假型融合体(例如慢病毒载体或病毒样颗粒)再靶向任何所需的靶细胞。在一些实施方案中，使用所提供的生产细胞产生逆转录病毒颗粒(例如慢病毒载体或慢病毒样载体)产生用F和G蛋白分子假型化的逆转录病毒载体，所述生产细胞表现出组织蛋白酶表达的升高或增加(例如由于递送编码组织蛋白酶的外源核酸)，其中活性F蛋白的表达由于F蛋白加工得到改善而增加。
在一些实施方案中，组织蛋白酶分子水平或活性升高可例如通过增加F蛋白(例如，亨尼帕病毒F蛋白)加工来促进融合体功能滴度的增加(例如，如实施例1-3中所述)。例如，组织蛋白酶分子可增加生产细胞中活性F蛋白(F1+F2)与无活性F蛋白(F0)的比率，例如，如实施例4中所述。在一些实施方案中，通过降低无活性蛋白的水平来增加活性F蛋与无活性F蛋白的比率，例如，如实施例4中所述。
融合体，例如细胞来源的融合体
融合体可以呈现多种形式。通常，本文所述的融合体包含活性和/或水平升高的组织蛋白酶分子(例如，如本文所述)。在一些实施方案中，融合体包含亨尼帕病毒F蛋白分子和亨尼帕病毒G蛋白分子。在一些实施方案中，本文所述的融合体来源于源细胞(例如，本文所述的生产细胞)。融合体可包括例如细胞外泡囊、微泡、纳米泡囊、外泌体、凋亡体(来自凋亡细胞)、微粒(可来源于例如血小板)、外泌体(可来源于例如血清中的嗜中性粒细胞和单核细胞)、***小体(可获自***癌细胞)、心肌小体(可来源于心脏细胞)或其任何组合。在一些实施方案中，融合体从源细胞中自然释放，并且在一些实施方案中，处理源细胞以增强融合体的形成。在一些实施方案中，融合体的直径在约10-10,000nm之间，例如直径约30-100nm。在一些实施方案中，融合体包含一种或多种合成脂质。
在一些实施方案中，融合体是或包含病毒，例如逆转录病毒，例如慢病毒。在一些实施方案中，包含脂质双层的融合体包含含有包膜的逆转录病毒载体。例如，在一些实施方案中，两亲性脂质的融合体双层是或包含病毒包膜。病毒包膜可包含融合剂，例如对病毒内源的融合剂或假型化融合剂。在一些实施方案中，融合体的内腔或空腔包含病毒核酸，例如逆转录病毒核酸，例如慢病毒核酸。病毒核酸可以是病毒基因组。在一些实施方案中，融合体还包含例如在其空腔或内腔中的一种或多种病毒非结构蛋白。
融合体可具有有助于将有效载荷(例如期望的转基因或外源剂)递送至靶细胞的多种特性。例如，在一些实施方案中，融合体和源细胞一起包含足以产生可与靶细胞融合的颗粒的核酸。在实施方案中，这些核酸编码具有一种或多种(例如，全部)以下活性的蛋白质：gag多蛋白活性、聚合酶活性、整合酶活性、蛋白酶活性和融合剂活性。
融合体也可以包含促进有效载荷向靶细胞递送的各种结构。例如，在一些实施方案中，融合体(例如病毒，例如逆转录病毒，例如慢病毒)包含一种或多种(例如，全部)以下蛋白质：gag多蛋白、聚合酶(例如，pol)、整合酶(例如，功能性或非功能性变体)、蛋白酶和融合剂。在一些实施方案中，融合体还包含rev。在一些实施方案中，一种或多种前述蛋白质在逆转录病毒基因组中编码，并且在一些实施方案中，一种或多种前述蛋白质例如由辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒反式提供。在一些实施方案中，融合体核酸(例如，逆转录病毒核酸)包含一种或多种(例如，全部)以下核酸序列：5’LTR(例如，包含U5且缺乏功能性U3结构域)、Psi包装元件(Psi)、与有效载荷基因可操作地连接的中心多嘌呤区(cPPT)启动子、有效载荷基因(任选地包含开放阅读框前的内含子)、Poly A尾序列、WPRE和3’LTR(例如，包含U5并且缺乏功能性U3)在一些实施方案中，融合体核酸(例如，逆转录病毒核酸)还包含一个或多个绝缘子元件。在一些实施方案中，融合体核酸(例如，逆转录病毒核酸)还包含一个或多个miRNA识别位点。在一些实施方案中，一个或多个miRNA识别位点位于poly A尾序列的下游，例如在poly A尾序列和WPRE之间。
在一些实施方案中，将本文提供的融合体施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。在此类实施方案中，受试者可能有患上特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)的风险，可能具有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)的症状，或可能被诊断或鉴定为患有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)。在一个实施方案中，受试者患有癌症。在一个实施方案中，受试者患有感染性疾病。在一些实施方案中，融合体含有编码用于治疗疾病或疾患的外源剂的核酸序列。
融合体组分和辅助细胞
在一些实施方案中，融合体核酸包含以下一种或多种(例如，全部)：5’启动子(例如，控制整个包装RNA的表达)、5’LTR(例如，其包含R(聚腺苷酸化尾信号)和/或U5(其包含引物激活信号))、引物结合位点、psi包装信号、用于核输出的RRE元件、直接位于转基因上游以控制转基因表达的启动子、转基因(或其他外源剂元件)、多嘌呤区和3’LTR(例如，其包含突变的U3、R和U5)。在一些实施方案中，融合体核酸还包含cPPT、WPRE和/或绝缘子元件中的一种或多种。
在一些实施方案中，融合体包含逆转录病毒的一个或多个元件。逆转录病毒通常通过将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝来复制并随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。适用于特定的实施方案的说明性逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒(spumavirus)、弗瑞德鼠(Friend murine)白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV))和慢病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒是γ逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒是ε逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒是α逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒是β逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒是δ逆转录病毒。
在一些实施方案中，所述逆转录病毒是慢病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒是泡沫逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒是内源性逆转录病毒。
例示性的慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括HIV1型和HIV 2型)；维士那-梅地病毒(VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一些实施方案中，使用基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)。
在一些实施方案中，本文的载体是能够转移或转运另一核酸分子的核酸分子。转移的核酸通常与载体核酸分子连接，例如***载体核酸分子中。载体可包括在细胞中指导自主复制的序列，或可包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷逆转录病毒和慢病毒。病毒载体可包含例如核酸分子(例如，转移质粒)，其包含病毒来源的核酸元件，所述核酸元件通常促进核酸分子转移或整合到细胞基因组中或整合到介导核酸转移的病毒颗粒中。病毒颗粒通常将包括各种病毒组分，并且有时除了核酸外还包括宿主细胞组分。病毒载体可以包含例如能够将核酸转移到细胞中或转移到转移的核酸中的病毒或病毒颗粒(例如，作为裸DNA)。病毒载体和转移质粒可以包含主要来源于病毒的结构和/或功能遗传元件。逆转录病毒载体可包含病毒载体或质粒，其含有主要来源于逆转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分。慢病毒载体可包含含有结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒，包括主要来源于慢病毒的LTR。
在实施方案中，慢病毒载体(例如慢病毒表达载体)可包含慢病毒转移质粒(例如作为裸DNA)或感染性慢病毒颗粒。关于诸如克隆位点、启动子、调控元件、异源核酸等元件，应理解这些元件的序列可以在慢病毒颗粒中以RNA形式存在，并且可以在DNA质粒中以DNA形式存在。
在本文所述的一些载体中，与相应的野生型病毒相比，有助于复制或复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分可能不存在。这使得病毒载体复制有缺陷。在一些实施方案中，载体能够转导靶非***宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。
野生型逆转录病毒基因组的结构通常包含5’长末端重复序列(LTR)和3’LTR，在它们之间或之内有一个能使基因组被包装的包装信号、一个引物结合位点、实现整合到宿主细胞基因组中的整合位点以及编码促进病毒颗粒组装的包装组分的gag、pol和env基因。更复杂的逆转录病毒具有附加的特征，诸如HIV中的rev和RRE序列，其使得整合的原病毒的RNA转录物能够从感染靶细胞的细胞核有效输出到细胞质。在原病毒中，病毒基因在两个末端侧接称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR参与原病毒整合和转录。LTR也充当增强子-启动子序列，并且可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是通过位于病毒基因组的5’端的psi序列发生的。
LTR本身通常是相似的(例如相同的)序列，可以分成三个元件，称为U3、R和U5。U3来源于对RNA的3'末端独特的序列。R来源于在RNA两个末端重复的序列，并且U5来源于对RNA的5'末端独特的序列。这三种元件的尺寸在不同的逆转录病毒中可以有相当大的变化。
对于病毒基因组，转录起始位点通常位于一个LTR中U3和R之间的边界处，而poly(A)添加(终止)位点位于另一个LTR中R和U5之间的边界处。U3含有原病毒的大部分转录控制元件，其包括对细胞和在一些情况下病毒转录激活因子蛋白作出应答的启动子和多个增强子序列。一些逆转录病毒包含编码参与调节基因表达的蛋白质的任一种或多种下列基因：tot、rev、tax和rex。
关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白被蛋白水解加工成成熟蛋白MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，它含有介导基因组复制的DNA聚合酶、相关RNA酶H和整合酶(IN)。env基因编码病毒体的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，它们形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。这种相互作用例如通过使过病毒膜与细胞膜融合来促进感染。
在复制缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可能缺失或无功能。RNA两端的R区是典型的重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组5’端和3’端的独特序列。
逆转录病毒还可以含有编码除gag、pol和env以外的蛋白质的额外基因。额外基因的实例包括(在HIV中)vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef中的一种或多种。EIAV具有(尤其)额外基因S2。由额外基因编码的蛋白质具有多种功能，其中一些可能与细胞蛋白质提供的功能相同。例如，在EIAV中，tat充当病毒LTR的转录激活因子(Derse和Newbold1993Virology 194:530-6；Maury等人1994Virology200:632-42)。其与称为TAR的稳定的茎环RNA二级结构结合。Rev通过rev反应元件(RRE)调节和协调病毒基因的表达(Martarano等人1994J.Virol.68:3102-11)。这两种蛋白质的作用机制被认为与灵长类动物病毒中的类似机制大致相似。此外，已鉴定了一种EIAV蛋白Ttm，其由剪接到env编码序列的跨膜蛋白起始处的tat的第一外显子编码。
除了蛋白酶、逆转录酶和整合酶之外，非灵长类动物慢病毒还含有编码dUTP酶的第四种pol基因产物。这可能在这些慢病毒感染某些不***或缓慢***细胞类型的能力中起作用。
在实施方案中，重组慢病毒载体(RLV)是具有足够的逆转录病毒遗传信息以允许在包装组分的存在下将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中的载体。靶细胞的感染可以包括逆转录和整合到靶细胞基因组中。RLV通常携带非病毒编码序列，所述序列将由载体递送至靶细胞。在实施方案中，RLV不能在靶细胞内独立复制产生感染性逆转录病毒颗粒。通常，RLV缺乏功能性gag-pol和/或env基因和/或参与复制的其他基因。载体可以被配置为***内含子载体，例如，如PCT专利申请WO 99/15683中所述，所述申请通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，慢病毒载体包含最小的病毒基因组，例如，病毒载体已***纵以除去非必需元件并保留必需元件，从而提供感染、转导和递送所关注的核苷酸序列至靶宿主细胞所需的功能，例如，如WO 98/17815中所述，所述专利通过引用整体并入本文。
最小的慢病毒基因组可以包含例如(5’)R-U5-一个或多个第一核苷酸序列-U3-R(3’)。然而，用于在源细胞中产生慢病毒基因组的质粒载体也可以包含可操作地连接到慢病毒基因组上以指导基因组在源细胞中的转录的转录调控控制序列。这些调控序列可以包含与转录的逆转录病毒序列缔合的天然序列，例如5’U3区，或者它们可以包含异源启动子，例如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组包含促进有效病毒产生的额外序列。例如，在HIV的情况下，可以包含rev和RRE序列。可替代地或组合地，可以使用密码子优化，例如，编码外源剂的基因可以是密码子优化的，例如，如WO 01/79518中所述，所述专利通过引用整体并入本文。也可以使用执行与rev/RRE***相似或相同的功能的替代性序列。例如，在梅森-菲舍猴病毒(Mason Pfizer monkey virus)中发现了rev/RRE***的功能类似物。这被称为CTE，并且包含基因组中被认为与受感染细胞中的因子相互作用的RRE型序列。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此，CTE可以用作rev/RRE***的替代物。此外，HTLV-I的Rex蛋白可以在功能上替代HIV-I的Rev蛋白。Rev和Rex具有对IRE-BP相似的效应。
在一些实施方案中，融合体核酸(例如逆转录病毒核酸，例如慢病毒核酸，例如灵长类或非灵长类慢病毒核酸)(1)包含缺失的gag基因，其中gag的缺失去除了gag编码序列的约核苷酸350或354下游的一个或多个核苷酸；(2)具有不存在于逆转录病毒核酸中的一个或多个辅助基因；(3)缺少tat基因，但包含5’LTR末端和gag ATG之间的前导序列；以及(4)(1)、(2)和(3)的组合。在一个实施方案中，慢病毒载体包含所有特征(1)和(2)和(3)。该策略在例如WO 99/32646中更详细地描述，所述专利通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，灵长类慢病毒最小***不需要HIV/SIV额外基因vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef用于载体产生或用于转导***和非***细胞。在一些实施方案中，EIAV最小载体***不需要S2用于载体产生或用于转导***和非***细胞。
额外基因的缺失可以允许产生没有与慢病毒(例如HIV)感染性疾病相关的基因的载体。特别地，tat与疾病相关。其次，额外基因的缺失允许载体包装更多的异源DNA。第三，功能未知的基因诸如S2可以省略，从而降低引起不良影响的风险。最小慢病毒载体的实例公开于WO 99/32646和WO 98/17815中。
在一些实施方案中，逆转录病毒核酸至少缺乏tat和S2(如果其是EIAV载体***)，也可能缺乏vif、vpr、vpx、vpu和nef。在一些实施方案中，逆转录病毒核酸还缺乏rev、RRE或两者。
在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包含vpx。Vpx多肽与SAMHD1限制因子结合并诱导其降解，所述SAMHD1限制因子降解细胞质中的游离dNTP。因此，随着Vpx降解SAMHD1和逆转录活性增加，细胞质中游离dNTP的浓度增加，从而促进逆转录病毒基因组的逆转录和整合到靶细胞基因组中。
不同的细胞在特定密码子的使用上有所不同。这种密码子偏好对应于细胞类型中特定tRNA相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，使它们与相应tRNA的相对丰度相匹配，有可能增加表达。出于同样的原因，有可能通过故意选择已知相应tRNA在特定的细胞类型中十分罕见的密码子来降低表达。因此，额外程度的翻译控制是可用的。密码子优化的另外描述见于例如WO 99/41397中，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，逆转录核酸缺乏所有非结构基因。在一些实施方案中，融合体是来源于病毒的病毒样颗粒(VLP)。在一些实施方案中，病毒包膜可包含融合剂，例如对病毒内源的融合剂或假型化融合剂。VLP包括来源于逆转录病毒或慢病毒的那些。虽然VLP模仿天然病毒体结构，但它们缺乏在宿主细胞内独立复制所必需的病毒基因组信息。因此，在某些方面，VLP是非感染性的。在特定的实施方案中，VLP不含有病毒基因组。在一些实施方案中，两亲性脂质的VLP双层是或包含病毒包膜。在一些实施方案中，VLP含有至少一种类型的来自病毒的结构蛋白。在大多数情况下，这种蛋白质会形成蛋白质衣壳。在一些情况下，衣壳也将被包裹在脂质双层中，所述脂质双层来源于已释放出组装的VLP(例如，包含人免疫缺陷病毒结构蛋白诸如GAG的VLP)的细胞。在一些实施方案中，VLP还包含靶向部分作为脂质双层内的包膜蛋白。
在一些实施方案中，融合体包含由病毒蛋白自组装成衣壳形成的超分子复合物。在一些实施方案中，融合体是来源于病毒衣壳蛋白的病毒样颗粒。在一些实施方案中，融合体是来源于病毒核衣壳蛋白的病毒样颗粒。在一些实施方案中，融合体包含保留包装核酸特性的核衣壳来源的蛋白质。在一些实施方案中，融合体，例如病毒样颗粒，在来自病毒基因组的蛋白质中仅包含病毒结构糖蛋白。在一些实施方案中，融合体不含有病毒基因组。
在一些实施方案中，融合体在表达过程期间包装来自宿主细胞的核酸，例如编码外源剂的核酸。在一些实施方案中，所述核酸不编码参与病毒复制的任何基因。在特定的实施方案中，融合体是复制缺陷的病毒样颗粒，例如逆转录病毒样颗粒，诸如慢病毒样颗粒。
在一些实施方案中，融合体是病毒样颗粒，其包含缺少或缺乏病毒RNA的序列，这可能是从序列中去除或消除病毒RNA的结果。在一些实施方案中，这可以通过使用gag上的内源性包装信号结合位点来实现。在一些实施方案中，内源性包装信号结合位点是在pol上。在一些实施方案中，待递送的RNA将含有同源性包装信号。在一些实施方案中，位于待递送RNA上的异源结合结构域(与gag异源)和位于gag或pol上的同源结合位点可用于确保待递送RNA的包装。在一些实施方案中，异源序列可以是非病毒的，或者也可以是病毒的，在这种情况下，它可以来源于不同的病毒。在一些实施方案中，融合体可用于递送治疗性RNA，在这种情况下，不需要功能性整合酶和/或逆转录酶。在一些实施方案中，融合体也可用于递送所关注的治疗基因，在这种情况下通常包括pol。
在一些实施方案中，VLP包含由病毒蛋白自组装成衣壳形成的超分子复合物。在一些实施方案中，VLP来源于病毒衣壳。在一些实施方案中，VLP来源于病毒核衣壳。在一些实施方案中，VLP是核衣壳来源的，并保留了包装核酸的特性。在一些实施方案中，VLP仅包含病毒结构糖蛋白。在一些实施方案中，VLP不含有病毒基因组。
许多病毒，包括HIV和其它慢病毒，使用大量稀有密码子，通过改变这些密码子使其对应于常用的哺乳动物密码子，可以提高包装组分在哺乳动物生产细胞中的表达。
密码子优化还有许多其他优点。由于其序列的改变，编码包装组分的核苷酸序列可以从其减少或消除RNA不稳定性序列(INS)。同时，保留包装组分的氨基酸序列编码序列，使得由所述序列编码的病毒组分保持相同或至少足够相似，使得包装组分的功能不受损害。在一些实施方案中，密码子优化还克服了输出的Rev/RRE要求，使得优化的序列为Rev非依赖性的。在一些实施方案中，密码子优化还减少了载体***内不同构建体之间的同源重组(例如在gag-pol和env开放阅读框中重叠的区域之间)。在一些实施方案中，密码子优化导致病毒滴度增加和/或安全性提高。
在一些实施方案中，只有与INS有关的密码子被密码子优化。在其他实施方案中，除了包含gag-pol移码位点的序列外，所述序列全部是密码子优化的。
gag-pol基因包含编码gag-pol蛋白的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达取决于翻译期间的移码。由于翻译期间核糖体“滑动”而发生这种移码。这种滑动被认为至少部分是由核糖体-停滞RNA二级结构引起的。这种二级结构存在于gag-pol基因中的移码位点的下游。对于HIV，重叠区从gag起点(其中核苷酸1是gag ATG的A)下游的核苷酸1222延伸到gag的末尾(nt 1503)。因此，跨越移码位点的281bp片段和两个阅读框的重叠区优选不是密码子优化的。在一些实施方案中，保留该片段将能够更有效地表达gag-pol蛋白。对于EIAV，重叠的起点位于nt 1262(其中核苷酸1是gag ATG的A)。重叠的末尾位于nt 1461。为了确保移码位点和gag-pol重叠被保留，可以保留从nt1156到1465的野生型序列。
例如，可以对最佳密码子使用进行衍生以便适应方便的限制性位点，并且可以将保守性氨基酸改变引入到gag-pol蛋白中。
在一些实施方案中，密码子优化是基于哺乳动物***中具有较差密码子使用的密码子。可以改变第三个碱基，有时也可以改变第二和第三个碱基。
由于遗传密码的简并性，可以理解，熟练技术人员可以获得许多gag-pol序列。此外，描述了许多逆转录病毒变体，它们可以用作产生密码子优化的gag-pol序列的起点。慢病毒基因组可以是相当可变的。例如，存在许多仍有功能的HIV-I的准种。这也是EIAV的情况。这些变体可以用于增强转导过程的特定部分。HIV-I变体的实例可以在os Alamos国家实验室维护的HIV数据库中找到。EIAV克隆的细节可以在国家卫生研究院(NationalInstitutes of Health)维护的NCBI数据库中找到。
密码子优化的gag-pol序列的策略可用于任何逆转录病毒，例如EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1和HIV-2。此外，该方法可以用于增加来自HTLV-I、HTLV-2、HFV、HSRV和人内源性逆转录病毒(HERV)、MLV和其他逆转录病毒的基因的表达。
如上所述，逆转录病毒载体的包装组分可以包括gag、pol和env基因的表达产物。此外，包装可以利用4个茎环随后是来自gag和env的部分序列作为包装信号的短序列。因此，可以在逆转录病毒载体基因组中包含缺失的gag序列(除了包装构建体上的完整gag序列之外)。在实施方案中，所述逆转录病毒载体包含包装信号，所述包装信号在仍保留env序列的载体中包含gag的255至360个核苷酸，或在剪接供体突变gag和env缺失的特定组合中包含gag的约40个核苷酸。在一些实施方案中，逆转录病毒载体包括包含一个或多个缺失的gag序列，例如所述gag序列包含可来源于N端的约360个核苷酸。
逆转录病毒载体、辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒可包含逆转录病毒结构蛋白和辅助蛋白，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef蛋白或其他逆转录病毒蛋白。在一些实施方案中，逆转录病毒蛋白来源于相同的逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒蛋白来源于多于一种逆转录病毒，例如2种、3种、4种或更多种逆转录病毒。
gag和pol编码序列通常被组织为天然慢病毒中的Gag-Pol前体。gag序列编码55-kD Gag前体蛋白，也称为p55。P55在成熟过程期间被病毒编码的蛋白酶4(pol基因的产物)切割成四种更小的蛋白质，命名为MA(基质[p17])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])和p6。pol前体蛋白被病毒编码的蛋白酶从Gag上切割开，并进一步消化以分离蛋白酶(p10)、RT(p50)、RNA酶H(p15)和整合酶(p31)活性。
天然Gag-Pol序列可以用于辅助载体(例如辅助质粒或辅助病毒)，或者可以进行修饰。这些修饰包括嵌合Gag-Pol，其中Gag和Pol序列获自不同的病毒(例如不同的种、亚种、病毒株、分化体等)，和/或其中所述序列已被修饰以改善转录和/或翻译和/或减少重组。
在各种实例中，融合体核酸包含编码gag蛋白的150-250(例如，168)个核苷酸部分的多核苷酸，所述多核苷酸(i)包含相对于野生型INS1减少RNA核输出限制的突变INS1抑制序列，(ii)含有导致移码和过早终止的两个核苷酸***，和/或(iii)不包含gag的INS2、INS3和INS4抑制序列。
在一些实施方案中，本文所述的载体是包含逆转录病毒(例如慢病毒)序列和非慢病毒病毒序列的杂合载体。在一些实施方案中，杂合载体包含用于逆转录、复制、整合和/或包装的逆转录病毒(例如慢病毒)序列。
根据某些具体实施方案，大部分或全部病毒载体骨架序列来源于慢病毒，例如HIV-1。然而，应当理解，可以使用许多不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，或者组合使用，并且可以适应某些慢病毒序列中的许多取代和改变，而不损害转移载体执行本文所述的功能的能力。Naldini等人,(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利号6,013,516和5,994,136中描述了多种慢病毒载体，其中许多可以适于产生逆转录病毒核酸。
在原病毒的每个末端，通常发现长末端重复序列(LTR)。LTR通常包含位于逆转录病毒核酸末端的结构域，在其天然序列背景下其是正向重复序列并且含有U3、R和U5区。LTR通常促进逆转录病毒基因的表达(例如，基因转录物的促进、起始和聚腺苷酸化)和病毒复制。LTR可包含许多调节信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号和用于病毒基因组复制和整合的序列。病毒LTR通常分为三个区域，称为U3、R和U5。U3区通常含有增强子和启动子元件。U5区通常是在引物结合位点与R区之间的序列，并且可以含有聚腺苷酸化序列。R(重复)区可以侧接U3和U5区。LTR通常由U3、R和U5区构成并且可以出现在病毒基因组的5'和3'末端。在一些实施方案中，与5'LTR相邻的是用于逆转录基因组(tRNA引物结合位点)和用于将病毒RNA有效包装成颗粒(Psi位点)的序列。
包装信号可包含位于逆转录病毒基因组内介导病毒RNA***病毒衣壳或颗粒的序列，参见例如Clever等人,1995.J.of Virology,第69卷第4期；第2101-2109页。几种逆转录病毒载体使用最小包装信号(psi[Ψ]序列)用于病毒基因组的衣壳化。
在各种实施方案中，融合体核酸包含经修饰的5’LTR和/或3’LTR。LTR中的任一个或两个可包含一个或多个修饰，包括但不限于一个或多个缺失、***或取代。通常对3'LTR进行修饰以通过使病毒成为复制缺陷的(例如不能完全、有效地复制从而不产生感染性病毒体的病毒(例如复制缺陷慢病毒子代))来改善慢病毒或逆转录病毒***的安全性。
在一些实施方案中，载体是自我失活(SIN)载体，例如复制缺陷载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中右(3')LTR增强子-启动子区(称为U3区)已被修饰(例如通过缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。这是因为在病毒复制期间右(3')LTR U3区可以用作左(5')LTR U3区的模板，并且因此不存在U3增强子-启动子会抑制病毒复制。在实施方案中，3'LTR被修饰使得U5区被除去、改变或例如被外源聚(A)序列替换。3'LTR、5'LTR或3'和5'LTR两者可以是经修饰的LTR。
在一些实施方案中，5'LTR的U3区被异源启动子替换以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组的转录。可以使用的异源启动子的实例包括例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如立即早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)和单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。在一些实施方案中，启动子能够以Tat非依赖性方式驱动高水平的转录。在某些实施方案中，异源启动子在控制病毒基因组转录的方式方面具有附加的优点。例如，异源启动子可以是诱导型的，使得只有当存在诱导因子时才发生全部或部分病毒基因组的转录。诱导因子包括但不限于一种或多种化学化合物或培养宿主细胞的生理条件诸如温度或pH。
在一些实施方案中，病毒载体包含TAR(反式激活反应)元件，例如位于慢病毒(例如HIV)LTR的R区中。该元件与慢病毒反式激活因子(tat)遗传元件相互作用以增强病毒复制。然而，例如在其中5'LTR的U3区被异源启动子替换的实施方案中，该元件不是必需的。
R区，例如逆转录病毒LTR内开始于加帽基团起点(即转录起点)并终止于poly A区起点之前的区域，可以侧接U3区和U5区。R区在将新生DNA从基因组的一端转移到另一端的逆转录期间起作用。
融合体核酸还可以包含FLAP元件，例如其序列包括逆转录病毒(例如HIV-1或HIV-2)的中心多嘌呤区和中心终止序列(cPPT和CTS)的核酸。合适的FLAP元件在美国专利号6,682,907中和在Zennou等人,2000,Cell,101:173中有所描述，所述文献通过引用整体并入本文。在HIV-1逆转录期间，正链DNA在中心多嘌呤区(cPPT)的中央起始和在中心终止序列(CTS)的中央终止可以导致三链DNA结构的形成：HIV-1中央DNA瓣。在一些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体骨架包含在编码外源剂的基因上游或下游的一个或多个FLAP元件。例如，在一些实施方案中，转移质粒包括FLAP元件，例如源自或分离自HIV-1的FLAP元件。
在实施方案中，逆转录病毒或慢病毒核酸包含一个或多个输出元件，例如调节将RNA转录物从细胞核转运到细胞质的顺式作用转录后调控元件。RNA输出元件的实例包括但不限于人免疫缺陷病毒(HIV)rev反应元件(RRE)(参见例如Cullen等人,1991.J.Virol.65:1053；以及Cullen等人,1991.Cell 58:423)和乙型肝炎病毒转录后调控元件(HPRE)，所述文献通过引用整体并入本文。通常，将RNA输出元件置于基因的3'UTR内，并且可以作为一个或多个拷贝***。
在一些实施方案中，通过将转录后调控元件、聚腺苷酸化位点和转录终止信号中的一个或多个(例如，全部)掺入载体中来增加异源序列的表达。多种转录后调控元件可以增加异源核酸表达于蛋白质，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE；Zufferey等人,1999,J.Virol.,73:2886)；存在于乙型肝炎病毒(HPRE)中的转录后调控元件(Huang等人,Mol.Cell.Biol.,5:3864)；等等(Liu等人,1995,Genes Dev.,9:1766)，所述文献中的每一篇通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒核酸包含转录后调控元件，例如WPRE或HPRE
在一些实施方案中，本文所述的融合体核酸缺乏或不包含转录后调控元件，例如WPRE或HPRE。
可以包括指导异源核酸转录物终止和聚腺苷酸化的元件，例如以增加外源剂的表达。可以在聚腺苷酸化信号的下游发现转录终止信号。在一些实施方案中，载体包含编码外源剂的多核苷酸3'的聚腺苷酸化序列。polyA位点可包含指导RNA聚合酶II终止和聚腺苷酸化新生RNA转录物的DNA序列。聚腺苷酸化序列可以通过向编码序列的3'末端添加polyA尾来促进mRNA稳定性，并且因此有助于增加翻译效率。可以用于逆转录病毒核酸中的polyA信号的例示性实例包括AATAAA、ATTAAA、AGTAAA、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β珠蛋白polyA序列(rβgpA)或另一种合适的异源或内源polyA序列。
在一些实施方案中，逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个绝缘子元件，例如本文所述的绝缘子元件。
在各种实施方案中，载体包含与编码外源剂的多核苷酸可操作地连接的启动子。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一个LTR包含一个或多个修饰，诸如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体还可包含一个或多个增加转导效率的辅助元件(例如cPPT/FLAP)、病毒包装(例如Psi(Ψ)包装信号，RRE)和/或增加外源基因表达的其他元件(例如聚(A)序列)，并且可以任选地包含WPRE或HPRE。
在一些实施方案中，慢病毒核酸例如从5'至3'包含以下中的一种或多种(例如全部)：启动子(例如CMV)、R序列(例如包含TAR)、U5序列(例如用于整合)、PBS序列(例如用于逆转录)、DIS序列(例如用于基因组二聚化)、psi包装信号、部分gag序列、RRE序列(例如用于核输出)、cPPT序列(例如用于核输入)、驱动外源剂表达的启动子、编码外源剂的基因、WPRE序列(例如，用于有效的转基因表达)、PPT序列(例如，用于逆转录)、R序列(例如，用于聚腺苷酸化和终止)和U5信号(例如，用于整合)。
被工程化以去除剪接位点的载体
一些慢病毒载体整合在活性基因内部，并具有强剪接和聚腺苷酸化信号，这可导致异常和可能截短的转录物的形成。
原癌基因激活机制可能涉及嵌合转录物的产生，所述嵌合转录物源自***诱变剂基因组中含有的启动子元件或剪接位点与整合所靶向的细胞转录单位的相互作用(Gabriel等人2009.Nat Med 15:1431-1436；Bokhoven等人J Virol 83:283-29)。包含载体序列和细胞mRNA的嵌合融合转录物可以通过从载体序列开始并进入侧翼细胞基因(或反之亦然)的通读转录来产生。
在一些实施方案中，本文所述的慢病毒核酸包含慢病毒骨架，其中至少两个剪接位点已被消除，例如以改善慢病毒载体的安全性。此类剪接位点的种类和鉴定方法在WO2012156839A2中有所描述，所有所述专利都通过引用纳入本文。
逆转录病毒产生方法
大规模病毒颗粒产生通常可用于实现所需的病毒滴度。可以通过将转移载体转染到包装细胞系中来产生病毒颗粒，所述包装细胞系包含病毒结构和/或辅助基因，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或其他逆转录病毒基因。
在实施方案中，包装载体是缺乏包装信号并且包含编码一种、两种、三种、四种或更多种病毒结构和/或辅助基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体。通常，包装载体包含在包装细胞中，并通过转染、转导或感染引入细胞中。可以通过转染、转导或感染将逆转录病毒(例如慢病毒)转移载体引入到包装细胞系中，以产生源细胞或细胞系。通过标准方法将包装载体引入人细胞或细胞系，所述标准方法包括例如磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔。在一些实施方案中，将包装载体与显性选择标记诸如新霉素、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、博来霉素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA一起引入细胞中，随后在适当药物的存在下进行选择并分离克隆。选择标记基因可与包装载体编码的基因例如通过IRES或自切割病毒肽物理连接。
包装细胞系包括不含包装信号，但稳定或瞬时表达病毒结构蛋白和可包装病毒颗粒的复制酶(诸如gag、pol和env)的细胞系。可以使用任何合适的细胞系，例如哺乳动物细胞，例如人细胞。可以使用的合适细胞系包括例如CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H 10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在实施方案中，包装细胞是293细胞、293T细胞或A549细胞。
源细胞系包括能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，所述细胞系包括包装细胞系和包含包装信号的转移载体构建体。制备病毒原液的方法由例如Y.Soneoka等人(1995)Nucl.Acids Res.23:628-633和N.R.Landau等人(1992)J.Virol.66:5110-5113例示，所述文献通过引用并入本文。例如通过细胞裂解或收集细胞培养物的上清液，感染性病毒颗粒可从包装细胞中收集。任选地，可以富集或纯化所收集的病毒颗粒。
包装质粒和细胞系
在一些实施方案中，用作包装细胞系的源细胞包含一种或多种质粒，所述质粒编码可包装病毒颗粒的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)。在一些实施方案中，编码gag、pol和env前体中的至少两种的序列在同一质粒上。在一些实施方案中，编码gag、pol和env前体的序列在不同的质粒上。在一些实施方案中，编码gag、pol和env前体的序列具有相同的表达信号，例如启动子。在一些实施方案中，编码gag、pol和env前体的序列具有不同的表达信号，例如不同的启动子。在一些实施方案中，gag、pol和env前体的表达是诱导型的。在一些实施方案中，在相同时间或在不同时间转染编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒。在一些实施方案中，在与包装载体相同的时间或不同的时间转染编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒。
在一些实施方案中，源细胞系包含一个或多个稳定整合的病毒结构基因。在一些实施方案中，稳定整合的病毒结构基因的表达是可诱导的。
在一些实施方案中，病毒结构基因的表达在转录水平上受到调节。在一些实施方案中，病毒结构基因的表达在翻译水平上受到调节。在一些实施方案中，病毒结构基因的表达在翻译后水平受到调节。
在一些实施方案中，病毒结构基因的表达受四环素(Tet)依赖性***调节，其中Tet调节的转录阻遏物(Tet-R)与在启动子中包含的DNA序列结合并且通过空间位阻抑制转录(Yao等人,1998；Jones等人,2005)。在添加多西环素(dox)后，Tet-R被释放，从而允许转录。多种其他合适的转录调节启动子、转录因子和小分子诱导物适合用于调节病毒结构基因的转录。
在一些实施方案中，将在Tet调节的启动子的控制下并与抗生素抗性盒偶联的第三代慢病毒组分、人免疫缺陷病毒1型(HIV)、Rev、Gag/Pol和包膜分别整合到源细胞基因组中。在一些实施方案中，源细胞仅在基因组中整合了一个拷贝的Rev、Gag/Pol和包膜蛋白中的每一种。
在一些实施方案中，编码外源剂的核酸(例如，编码外源剂的逆转录病毒核酸)也被整合到源细胞基因组中。在一些实施方案中，编码外源剂的核酸保持游离状态。在一些实施方案中，编码外源剂的核酸被转染到在基因组中具有稳定整合的Rev、Gag/Pol和包膜蛋白的源细胞中。参见例如Milani等人EMBO Molecular Medicine,2017，所述文献通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒核酸不能进行逆转录。在实施方案中，这样的核酸能够瞬时表达外源剂。逆转录病毒或融合体可以包含失活的逆转录酶蛋白，或者可以不包含逆转录酶蛋白。在实施方案中，逆转录病毒核酸包含无效的引物结合位点(PBS)和/或att位点。在实施方案中，一种或多种病毒辅助基因(包括rev、tat、vif、nef、vpr、vpu、vpx和S2或其功能等效物)在逆转录病毒核酸中是无效的或缺失的。在实施方案中，选自S2、rev和tat的一个或多个辅助基因在逆转录病毒核酸中是无效的或缺失的。
用于包装逆转录病毒核酸的策略
典型地，现代逆转录病毒载体***由携带顺式作用载体序列的病毒基因组和(2)生产细胞系组成，所述顺式作用载体序列用于病毒RNA的转录、逆转录、整合、翻译和包装到病毒颗粒中，所述生产细胞系表达产生病毒颗粒所需的反式作用逆转录病毒基因序列(例如gag、pol和env)。通过完全分离顺式作用载体序列和反式作用载体序列，病毒不能在超过一个感染周期内保持复制。可以通过许多策略来避免活病毒的产生，例如通过使顺式作用序列和反式作用序列之间的重叠最小化来避免重组。
包含缺少或缺乏病毒RNA的序列的病毒载体颗粒可能是从序列中去除或消除病毒RNA的结果。在一个实施方案中，这可以通过使用gag上的内源性包装信号结合位点来实现。或者，内源性包装信号结合位点是在pol上。在该实施方案中，待递送的RNA将含有同源包装信号。在另一个实施方案中，位于待递送RNA上的异源结合结构域(与gag异源)和位于gag或pol上的同源结合位点可用于确保待递送RNA的包装。异源序列可以是非病毒的，也可以是病毒的，在这种情况下，它可以来源于不同的病毒。载体颗粒可用于递送治疗性RNA，在这种情况下，不需要功能性整合酶和/或逆转录酶。这些载体颗粒也可用于递送所关注的治疗基因，在这种情况下通常包括pol。
在一个实施方案中，gag-pol被改变，并且包装信号被相应的包装信号置换。在这个实施方案中，颗粒可以包装具有新的包装信号的RNA。这种方法的优点是可以包装缺少病毒序列的RNA序列，例如RNAi。
另一种方法是依靠待包装的RNA的过量表达。在一个实施方案中，待包装的RNA在不存在任何含有包装信号的RNA的情况下过量表达。这可能导致大量的治疗性RNA被包装，并且该量足以转导细胞并具有生物学效应。
在一些实施方案中，多核苷酸包含编码病毒gag蛋白或逆转录病毒gag和pol蛋白的核苷酸序列，其中gag蛋白或pol蛋白包含能够识别RNA序列中相应序列的异源RNA结合结构域，以便于将RNA序列包装到病毒载体颗粒中。
在一些实施方案中，异源RNA结合结构域包含来源于噬菌体外壳蛋白、Rev蛋白、U1小核核糖核蛋白颗粒蛋白、Nova蛋白、TF111A蛋白、TIS11蛋白、trp RNA结合衰减蛋白(TRAP)或假尿苷合酶的RNA结合结构域。
在一些实施方案中，本文的方法包括检测或确认复制型逆转录病毒的缺失。所述方法可包括评估一种或多种靶基因的RNA水平，所述靶基因例如病毒基因，例如结构基因或包装基因，其基因产物在感染复制型逆转录病毒(例如γ-逆转录病毒或慢病毒)的某些细胞中表达，但不存在于用于转导具有异源核酸的细胞的病毒载体中，并且不存在于和/或表达于或预期不存在于和/或表达于不含有复制型逆转录病毒的细胞中。如果一种或多种靶基因的RNA水平高于参考值，可以确定存在复制型逆转录病毒，所述参考值可以直接或间接例如从含有靶基因的阳性对照样品中测量。对于进一步的公开，参见例如WO2018023094A1。
在一些实施方案中，融合体(即VLP)的组装通过核心蛋白与病毒基因组内独特的衣壳化序列(例如具有茎环结构的UTR)的结合而启动。在一些实施方案中，所述核心与所述衣壳化序列的相互作用促进寡聚化。
在一些实施方案中，用于产生VLP的源细胞包含一种或多种编码病毒结构蛋白(例如gag、pol)的质粒，所述质粒可以包装病毒颗粒(即包装质粒)。在一些实施方案中，编码gag和pol前体中的至少两种的序列在同一质粒上。在一些实施方案中，编码gag和pol前体的序列在不同的质粒上。在一些实施方案中，编码gag和pol前体的序列具有相同的表达信号，例如启动子。在一些实施方案中，编码gag和pol前体的序列具有不同的表达信号，例如不同的启动子。在一些实施方案中，gag和pol前体的表达是可诱导的。
在一些实施方案中，如上所述的VLP或任何病毒载体的形成可以通过本领域已知的任何合适的技术来检测。这些技术的实例包括例如电子显微镜、动态光散射、选择性色谱分离和/或密度梯度离心。
在源细胞中抑制编码外源剂的基因
在源细胞中(过量)表达的蛋白质可能对载体病毒体组装和/或感染性具有间接或直接的影响。将外源剂掺入载体病毒体也可能影响载体颗粒的下游加工。
在一些实施方案中，使用组织特异性启动子来限制外源剂在源细胞中的表达。在一些实施方案中，在真核细胞培养物中使用异源翻译控制***来抑制外源剂在源细胞中的翻译。更具体地，逆转录病毒核酸可包含与编码外源剂的基因可操作连接的结合位点，其中所述结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，从而在源细胞中抑制或阻止外源剂的翻译。
在一些实施方案中，RNA结合蛋白是色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)，例如细菌色氨酸RNA结合衰减蛋白。使用RNA结合蛋白(例如细菌trp操纵子调节蛋白、色氨酸RNA结合衰减蛋白、TRAP)及与其结合的RNA靶标将抑制或阻止源细胞内的转基因翻译。该***被称为载体生产细胞***或TRIP***中的转基因抑制。
在实施方案中，将RNA结合蛋白的结合位点(例如TRAP结合序列，tbs)置于NOI翻译起始密码子的上游，允许特异性抑制来源于内部表达盒的mRNA的翻译，同时对载体RNA的产生或稳定性没有不利影响。编码外源剂的基因的tbs和翻译起始密码子之间的核苷酸数目可以为0至12个核苷酸不等。tbs可置于内部核糖体进入位点(IRES)的下游，以抑制多顺反子mRNA中编码外源剂的基因的翻译。
断路开关***和放大
在一些实施方案中，含有编码外源剂的基因的多核苷酸或细胞利用***基因，例如诱导型***基因，来降低直接毒性和/或不受控制的增殖的风险。在具体方面，***基因对含有外源剂的宿主细胞没有免疫原性。***基因的实例包括半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-8或胞嘧啶脱氨酶。半胱天冬酶-9可以使用特定的二聚化化学诱导剂(CID)活化。
在某些实施方案中，载体包含导致靶细胞(例如免疫效应细胞，例如T细胞)易受体内阴性选择影响的基因区段。例如，转导的细胞可以由于个体体内条件的改变而被消除。阴性可选择表型可由基因的***产生，所述基因赋予对所施用剂例如化合物的敏感性。阴性选择基因是本领域已知的，并尤其包括下列基因：赋予更昔洛韦敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell 11:223,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)基因和细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992))。
在一些实施方案中，转导的细胞(例如免疫效应细胞，诸如T细胞)包含还含有阳性标记的多核苷酸，所述阳性标记使得能够在体外选择阴性选择表型的细胞。阳性选择标记可以是一种基因，所述基因在被引入到靶细胞中后，表达允许阳性选择携带所述基因的细胞的显性表型。这种类型的基因尤其包括赋予潮霉素B抗性的潮霉素B磷酸转移酶基因(hph)、编码抗生素G418抗性的来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)、二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、腺苷脱氨酶基因(ADA)和多药抗性(MDR)基因。
在一些实施方案中，阳性选择标记和阴性选择元件是连接的，使得阴性选择元件的丢失必然也伴随着阳性选择标记的丢失。例如，阳性选择标记和阴性选择标记可以融合，使得一个标记的丢失必然导致另一个的丢失。产生作为表达产物的多肽的融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)，所述多肽赋予上文所述的期望的阳性选择特征和阴性选择特征。该基因的表达产生一种多肽，所述多肽赋予潮霉素B抗性以进行体外阳性选择，并赋予更昔洛韦敏感性以进行体内阴性选择。参见Lupton S.D.等人,Mol.and Cell.Biology 1 1:3374-3378,1991。此外，在实施方案中，编码嵌合受体的多核苷酸位于含有融合基因的逆转录病毒载体中，特别是赋予潮霉素B抗性以进行体外阳性选择并赋予更昔洛韦敏感性以进行体内阴性选择的那些载体，例如Lupton,S.D.等人(1991),同上中所述的HyTK逆转录病毒载体。也参见PCT U591/08442和PCT/U594/05601的出版物，其描述了来源于显性阳性选择标记与阴性选择标记融合的双功能选择性融合基因的使用。
合适的阳性选择标记可来源于选自由hph、nco和gpt组成的组的基因，并且合适的阴性选择标记可来源于选自由胞嘧啶脱氨酶、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT和gpt组成的组的基因。其他合适的标记是双功能选择性融合基因，其中阳性选择标记来源于hph或neo，并且阴性选择标记来源于胞嘧啶脱氨酶或TK基因或选择标记。
用于调节慢病毒整合的策略
公开了逆转录病毒和慢病毒核酸，其在关键蛋白质/序列中缺乏或受到破坏，从而阻止逆转录病毒或慢病毒基因组整合到靶细胞基因组中。例如，缺乏构成逆转录病毒整合酶的高度保守性DDE基序的每一种氨基酸的病毒核酸(Engelman和Craigie(1992)J.Virol.66:6361-6369；Johnson等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7648-7652；Khan等人(1991)Nucleic Acids Res.19:851-860)能够产生整合缺陷型逆转录病毒核酸。
例如，在一些实施方案中，本文的逆转录病毒核酸包含慢病毒整合酶，所述慢病毒整合酶包含导致所述整合酶不能催化病毒基因组整合到细胞基因组中的突变。在一些实施方案中，所述突变是直接影响整合的I型突变或引发影响病毒体形态发生和/或逆转录的多效性缺陷的II型突变。I型突变的说明性非限制性实例是影响参与整合酶催化核心结构域的三个残基中的任一个的那些突变：DX39-58DX35E(HIV-1的整合酶的D64、D116和E152残基)。在一个特定的实施方案中，导致所述整合酶不能催化病毒基因组整合到细胞基因组中的突变是整合酶的催化核心结构域的DDE基序的一个或多个氨基酸残基的取代，优选地所述DEE基序的第一个天冬氨酸残基被天冬酰胺残基取代。在一些实施方案中，逆转录病毒载体不包含整合酶蛋白。
在一些实施方案中，逆转录病毒整合到活性转录单位中。在一些实施方案中，逆转录病毒在靠近转录起始位点、基因的5’末端或DNA酶1切割位点不整合。在一些实施方案中，逆转录病毒整合不具有活性原癌基因或失活的肿瘤抑制基因。在一些实施方案中，逆转录病毒没有基因毒性。在一些实施方案中，慢病毒整合到内含子中。
在一些实施方案中，逆转录病毒核酸以特定的拷贝数整合到靶细胞的基因组中。平均拷贝数可由单细胞、细胞群或单个细胞集落确定。用于确定拷贝数的示例性方法包括聚合酶链反应(PCR)和流式细胞术。
在一些实施方案中，编码外源剂的DNA被整合到基因组中。在一些实施方案中，编码外源剂的DNA保持游离状态。在一些实施方案中，编码外源剂的整合型DNA与游离型DNA的比率为至少0.01、0.1、0.5、1.0、2、5、10、100。
在一些实施方案中，编码外源剂的DNA是线性的。在一些实施方案中，编码外源剂的DNA是环状的。在一些实施方案中，编码外源剂的DNA的线性拷贝与环状拷贝的比率为至少0.01、0.1、0.5、1.0、2、5、10、100。
在实施方案中，编码外源剂的DNA是具有1个LTR的环状DNA。在一些实施方案中，编码外源剂的DNA是具有2个LTR的环状DNA。在一些实施方案中，编码外源剂的包含1个LTR的环状DNA与编码外源剂的包含2个LTR的环状DNA的比率为至少0.1、0.5、1.0、2、5、10、20、50、100。
游离型病毒的维持
在整合缺陷的逆转录病毒中，逆转录的环状cDNA副产物(例如1-LTR和2-LTR)可以在细胞核中积累，而不整合到宿主基因组中(参见
Figure BDA0004107707870000821
R J等人,Nat.Med.2006,12:348-353)。像其他外源性DNA一样，这些中间体然后可以以相同的频率整合到细胞DNA中(例如，103至105/细胞)。
在一些实施方案中，游离型逆转录病毒核酸不复制。游离型病毒DNA可以通过包含真核生物复制起点和用于与核基质缔合的支架/基质附着区(S/MAR)而被修饰以保持在复制细胞中。
因此，在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒核酸包含真核生物复制起点或其变体。所关注的真核生物复制起点的实例是如Aladjem等人(Science,1995,270:815-819)已经描述的β-珠蛋白基因的复制起点；如Price等人Journal of BiologicalChemistry,2003,278(22):19649-59已经描述的来自与先前从猴CV-1细胞和人皮肤成纤维细胞分离的α-卫星序列缔合的自主复制序列的共有序列；人c-myc启动子区的复制起点已由McWinney和Leffak(McWinney C.和Leffak M.,Nucleic Acid Research 1990,18(5):1233-42)进行描述。在实施方案中，变体基本上保持了在真核生物中启动复制的能力。特定序列启动复制的能力可以通过任何合适的方法来确定，例如基于溴脱氧尿苷掺入和密度偏移的自主复制测定(Araujo F.D.等人,同上；Frappier L.等人,同上)。
在一些实施方案中，逆转录病毒核酸包含支架/基质附着区(S/MAR)或其变体，例如长度为几百个碱基对的非共有样富含AT的DNA元件，其通过周期性附着于细胞核的蛋白质支架或基质来将真核生物基因组的核DNA组织成染色质结构域。它们通常发现于非编码区，诸如侧翼区、染色质边缘区和内含子。S/MAR区的实例是如由Bode等人(Bode J.等人.,Science,1992,255:195-7)描述的人IFN-γ基因(hIFN-γ大)的1.8kbp S/MAR；如已由Ramezani(Ramezani A.等人.,Blood 2003,101:4717-24)描述的人IFN-γ基因(hIFN-γ短)的S/MAR的0.7Kbp最小区域；如已由Mesner L.D.等人.,Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:3281-86)描述的人二氢叶酸还原酶基因(hDHFR)的S/MAR的0.2Kbp最小区域。在实施方案中，S/MAR的功能等同变体是基于设定的六条规则来选择的序列，这些规则一起或单独被提出促成S/MAR功能(Kramer等人(1996)Genomics 33,305；Singh等人(1997)Nucl.AcidsRes 25,1419)。这些规则已并入在genomecluster.secs.oakland.edu/MAR-Wiz免费提供的MAR-Wiz计算机程序。在实施方案中，变体基本上保持了与其所来源的S/MAR相同的功能，特别是与核基质特异性结合的能力。技术人员可以例如通过Mesner等人(Mesner L.D.等人,同上)所述的体外或体内MAR测定来确定特定变体是否能够与核基质特异性结合。在一些实施方案中，如果特定变体显示出DNA链分离的倾向，则该特定序列是S/MAR的变体。这种性质可以使用基于平衡统计力学方法的特定程序来确定。应力诱导双重不稳定(SIDD)分析技术“[...]计算所施加的超螺旋应力水平降低在沿着DNA序列的每个位置处打开双链体所需的自由能的程度。结果显示为SIDD谱，其中强烈不稳定位点显示为深度极小值[...]”，如Bode等人(2005)J.Mol.Biol.358,597中所定义。SIDD算法和数学基础(Bi和Benham(2004)Bioinformatics 20,1477)和SIDD谱的分析可以使用WebSIDD(www.genomecenter.ucdavis.edu/benham)的免费互联网资源进行。因此，在一些实施方案中，如果多核苷酸显示出与S/MAR相似的SIDD谱，则所述多核苷酸被认为是S/MAR序列的变体。
融合剂和假型化
融合剂包括例如病毒包膜蛋白(env)，其通常决定可被融合体感染和转化的宿主细胞的范围。在一些实施方案中，本文的融合体包含亨尼帕病毒F蛋白分子和亨尼帕病毒G蛋白分子。在一些实施方案中，亨尼帕病毒F蛋白分子和/或亨尼帕病毒G蛋白分子有助于融合体与细胞膜融合。例如，亨尼帕病毒F蛋白分子可以介导融合体的膜和例如所需靶细胞的细胞膜之间的融合。例如，亨尼帕病毒G蛋白可以与靶细胞表面上的分子(例如，多肽)结合。
也可用作融合剂的逆转录病毒来源的env基因的说明性实例包括但不限于：MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉(Ebola)、仙台(Sendai)、FPV(鸡瘟病毒)和流感病毒包膜。类似地，可以利用编码来自RNA病毒(例如，小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Calciviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、冠状病毒科、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、反转录病毒科(Retroviridae)的RNA病毒家族)以及来自DNA病毒(嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)、圆环病毒科(Circoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)和虹彩病毒科(Iridoviridae))的包膜的基因。代表性实例包括FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病病毒(Rabies)、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10和EIAV。在慢病毒诸如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV的情况下，天然env蛋白包括gp41和gp120。在一些实施方案中，如先前所述，由本文所述的源细胞表达的病毒env蛋白在与病毒gag和pol基因分开的载体上编码。
在一些实施方案中，用于展示在融合体上的包膜蛋白包括但不限于以下来源中的任一种：甲型流感诸如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感)、乙型流感、丙型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、诺沃克病毒(Norwalk virus)组的任何病毒、肠道腺病毒、细小病毒、登革热病毒、猴痘、单链反链病毒目(Mononegavirale)、狂犬病病毒属(Lyssavirus)诸如狂犬病病毒(rabies virus)、兔头蝙蝠病毒、莫科拉病毒(Mokola virus)、杜文哈格病毒(Duvenhage virus)、欧洲蝙蝠病毒1和2和澳大利亚蝙蝠病毒、暂时热病毒属(Ephemerovirus)、水泡病毒属(Vesiculovirus)、水泡性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒诸如1型和2型单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴病毒(Epstein-Bar virus，EBV)、人疱疹病毒(HHV)、6型和8型人疱疹病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、***瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒(诸如阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、Sabia相关出血热病毒、委内瑞拉出血热病毒、拉沙热病毒)、马丘波病毒(Machupo virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、布尼亚病毒目(Bunyaviridiae)诸如克里米亚-刚果出血热病毒、汉坦病毒、引起肾综合征出血热的病毒、裂谷热病毒、丝状病毒科(丝状病毒)(包括埃博拉出血热(Ebolahemorrhagic fever)和马尔堡出血热(Marburg hemorrhagic fever))、黄病毒科(包括卡萨诺尔森林病病毒(Kaysanur Forest disease virus))、鄂木斯克出血热病毒(Omsk hemorrhagic fevervirus)、引起蜱传脑炎的病毒和副粘病毒科(诸如亨德拉病毒和尼帕病毒)、大天花和小天花(天花(smallpox))、α病毒(诸如委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV))、西尼罗河病毒、任何引起脑炎的病毒。
融合体或假型化病毒通常具有对其一种或多种包膜蛋白的修饰，例如包膜蛋白被来自另一种病毒的包膜蛋白取代。例如，HIV可以被水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白假型化，这使得HIV感染更广泛范围的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常将病毒靶向CD4+呈递细胞。在一些实施方案中，慢病毒包膜蛋白被VSV-G假型化在一个实施方案中，源细胞产生用VSV-G包膜糖蛋白假型化的重组逆转录病毒，例如慢病毒。在一些实施方案中，本文所述的源细胞产生用VSV-G糖蛋白假型化的融合体，例如重组逆转录病毒，例如慢病毒。
此外，可以对融合剂或病毒包膜蛋白进行修饰或工程化，使其含有允许转导载体靶向并感染其正常范围之外的宿主细胞或者更具体地说限制对细胞或组织类型的转导的多肽序列。例如，融合剂或包膜蛋白可与靶向序列框内连接，所述靶向序列例如受体配体、抗体(使用抗体的抗原结合部分或重组抗体型分子，例如单链抗体)和多肽部分或其修饰(例如，其中糖基化位点存在于靶向序列中)，当所述靶向序列展示在转导载体外壳上时，有助于将病毒颗粒定向递送至所关注的靶细胞。此外，包膜蛋白可还包含调节细胞功能的序列。用转导载体调节细胞功能可以增加或降低混合细胞群中某些细胞类型的转导效率。例如，可以用含有包膜序列的配体或结合配偶体更特异性地转导干细胞，所述配体或结合配偶体特异性结合干细胞，而不是血液或骨髓中发现的其他细胞类型。非限制性实例是干细胞因子(SCF)和Flt-3配体。其他实例包括例如抗体(例如，对一种细胞类型具有特异性的单链抗体)，以及基本上任何结合组织诸如肺、肝、胰腺、心脏、内皮、平滑肌、乳腺、***、上皮、血管癌等的抗原(包括受体)。
示例性融合剂
在一些实施方案中，融合体包含一种或多种融合剂，例如以促进融合体与膜(例如细胞膜)融合。在一些实施方案中，一种或多种融合剂包括亨尼帕病毒F蛋白分子(例如，活性亨尼帕病毒F蛋白分子)和/或亨尼帕病毒G蛋白分子。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包含在其包膜上的一种或多种融合剂，以靶向特定的细胞或组织类型。融合剂包括但不限于基于蛋白质、基于脂质和基于化学品的融合剂。在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包括第一融合剂和第二融合剂，所述第一融合剂是蛋白质融合剂，所述第二融合剂是脂质融合剂或化学融合剂。融合剂可结合靶细胞表面上的融合剂结合配偶体。在一些实施方案中，包含融合剂的融合体将膜整合到靶细胞的脂质双层中。
在一些实施方案中，融合体中可以包含一种或多种本文所述的融合剂。
蛋白质融合剂
在一些实施方案中，融合剂是蛋白质融合剂，例如哺乳动物蛋白质或哺乳动物蛋白质的同源物(例如，具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性)、非哺乳动物蛋白质(例如病毒蛋白质或病毒蛋白质的同源物)(例如，具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性)、天然蛋白质、天然蛋白质的衍生物、合成蛋白质、其片段、其变体、包含一种或多种融合剂或片段的蛋白融合体及其任何组合。在一些实施方案中，蛋白质融合剂包含亨尼帕病毒F蛋白分子(例如，活性亨尼帕病毒F蛋白分子)和/或亨尼帕病毒G蛋白分子。
在一些实施方案中，融合剂导致逆转录病毒载体或融合体中的脂质与靶细胞中的脂质混合。在一些实施方案中，融合剂导致在逆转录病毒载体或融合体的内部和靶细胞的胞质溶胶之间形成一个或多个孔。
哺乳动物蛋白质
在一些实施方案中，融合剂可包括哺乳动物蛋白，参见例如表1。哺乳动物融合剂的实例可包括但不限于SNARE家族蛋白(诸如vSNARE和tSNARE)、合胞素蛋白(诸如合胞素-1(DOI:10.1128/JVI.76.13.6442–6452.2002)和合胞素-2)、myomaker(biorxiv.org/content/early/2017/04/02/123158,doi.org/10.1101/123158,doi:10.1096/fj.201600945R,doi:10.1038/nature12343)、myomixer(www.nature.com/nature/journal/v499/n7458/full/nature12343.html,doi:10.1038/nature12343)、myomerger(science.sciencemag.org/content/early/2017/04/05/science.aam9361,DOI:10.1126/science.aam9361)、FGFRL1(成纤维细胞生长因子受体样1)、Minion(doi.org/10.1101/122697)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的同种型(例如，如US 6,099,857A中所公开)、间隙连接蛋白诸如联接蛋白43、联接蛋白40、联接蛋白45、联接蛋白32或联接蛋白37(例如，如US2007/0224176中所公开的)、Hap2、能够诱导异源细胞间合胞体形成的任何蛋白质(参见表2)、具有融合剂特性的任何蛋白质(参见表3)、其同源物，其片段、其变体以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。在一些实施方案中，融合剂由在人基因组中发现的人内源性逆转录病毒元件(hERV)编码。在US 6,099,857A和US 2007/0224176中公开了另外的示例性融合剂，所述专利的全部内容通过引用并入本文。
表1：人和非人融合剂的非限制性实例。
Figure BDA0004107707870000881
Figure BDA0004107707870000891
表2：编码具有融合剂特性的蛋白质的基因。
Figure BDA0004107707870000892
Figure BDA0004107707870000901
表3：人融合剂候选物
Figure BDA0004107707870000902
/>
Figure BDA0004107707870000911
/>
Figure BDA0004107707870000921
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包含曲率生成蛋白，例如Epsin1、动力蛋白或包含BAR结构域的蛋白。参见例如Kozlov等人,CurrOp StrucBio 2015，Zimmerberg等人.Nat Rev 2006，Richard等人,Biochem J 2011。
非哺乳动物蛋白质
病毒蛋白质
在一些实施方案中，融合剂可包括非哺乳动物蛋白，例如病毒蛋白。在一些实施方案中，病毒融合剂是亨尼帕病毒F蛋白(例如，活性亨尼帕病毒F蛋白)。在一些实施方案中，病毒融合剂是I类病毒膜融合蛋白、II类病毒膜融合蛋白、III类病毒膜融合蛋白、病毒膜糖蛋白或其他病毒融合蛋白、或其同源物、其片段、其变体或包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合物。
在一些实施方案中，I类病毒膜融合蛋白包括但不限于杆状病毒F蛋白，例如核多角体病毒(NPV)属的F蛋白，例如MNPV甜菜夜蛾(SeMNPV)F蛋白和舞毒蛾MNPV(LdMNPV)以及副粘病毒F蛋白。
在一些实施方案中，II类病毒膜蛋白包括但不限于蜱骨脑炎E(TBEV E)、塞姆利基森林病毒E1/E2。
在一些实施方案中，III类病毒膜融合蛋白包括但不限于弹状病毒G(例如，水疱性口炎病毒(VSV-G)的融合蛋白G)、疱疹病毒糖蛋白B(例如，单纯疱疹病毒1(HSV-1)gB))、爱泼斯坦-巴尔病毒糖蛋白B(EBV gB)、托高土病毒G、杆状病毒gp64(例如，苜蓿银纹夜蛾多个NPV(AcMNPV)gp64)和玻那症病毒(Borna disease virus，BDV)糖蛋白(BDV G)。
其他病毒融合剂的实例，例如膜糖蛋白和病毒融合蛋白，包括但不限于：病毒合胞体蛋白，例如流感血凝素(HA)或突变体或其融合蛋白；1型人免疫缺陷病毒包膜蛋白(HIV-1ENV)、来自形成淋巴细胞合胞体的HIV结合LFA-1的gp120、HIV gp41、HIV gp160或HIV转录反式激活因子(TAT)；病毒糖蛋白VSV-G、来自弹状病毒科水泡性口炎病毒的病毒糖蛋白；水痘带状疱疹病毒的糖蛋白gB和gH-gL(VZV)；鼠白血病病毒(MLV)-10A1；长臂猿白血病病毒糖蛋白(GaLV)；狂犬病病毒、莫科拉病毒、水泡性口炎病毒和披膜病毒中的G型糖蛋白；鼠肝炎病毒JHM表面投影蛋白；猪呼吸道冠状病毒刺突和膜糖蛋白；禽传染性支气管炎刺突糖蛋白及其前体；牛肠道冠状病毒刺突蛋白；麻疹病毒的F和H、HN或G基因；犬瘟热病毒、新城疫病毒、人副流感病毒3、猿猴病毒41、仙台病毒和人呼吸道合胞病毒；人疱疹病毒1和猴水痘病毒的gH，伴有伴侣蛋白gL；人、牛和猕猴疱疹病毒gB；弗瑞德鼠白血病病毒和梅森-菲舍猴病毒的包膜糖蛋白；腮腺炎病毒血凝素神经氨酸酶和糖蛋白F1和F2；委内瑞拉马脑炎的膜糖蛋白；副粘病毒F蛋白；SIV gp160蛋白；埃博拉病毒G蛋白；或仙台病毒融合蛋白、或其同源物、其片段、其变体以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合物。
非哺乳动物融合蛋白包括病毒融合剂、其同源物、其片段以及包含一种或多种蛋白质或其片段的融合蛋白。病毒融合剂包括I类融合剂、II类融合剂、III类融合剂和IV类融合剂。在实施方案中，I类融合剂诸如人免疫缺陷病毒(HIV)gp41，具有特征性融合后构象，其具有带有中心卷曲螺旋结构的α-螺旋发夹的特征三聚体。I类病毒融合蛋白包括具有中心融合后六螺旋束的蛋白质。I类病毒融合蛋白包括流感HA、副流感F、HIV Env、埃博拉GP、来自正粘病毒的血凝素、来自副粘病毒的F蛋白(例如麻疹，(Katoh等人BMC Biotechnology 2010,10:37))、来自逆转录病毒的ENV蛋白以及丝状病毒和冠状病毒的融合剂。在实施方案中，II类病毒融合剂诸如登革热E糖蛋白具有形成延长的胞外域的β-折叠的结构特征，所述胞外域重折叠产生发夹三聚体。在实施方案中，II类病毒融合剂缺乏中心卷曲螺旋。II类病毒融合剂可在甲病毒(例如E1蛋白)和黄病毒(例如E糖蛋白)中发现。II类病毒融合剂包括来自塞姆利基森林病毒、辛比斯病毒、风疹病毒和登革热病毒的融合剂。在实施方案中，III类病毒融合剂诸如水泡性口炎病毒G糖蛋白结合了在I类和II类中发现的结构特征。在实施方案中，III类病毒融合剂包含α螺旋(例如，与I类病毒融合剂一样，形成六螺旋束以折叠蛋白质)和在其末端具有两亲融合肽的β折叠，使人想起II类病毒融合剂。III类病毒融合剂可在弹状病毒和疱疹病毒中发现。在实施方案中，IV类病毒融合剂是融合相关性小跨膜(FAST)蛋白(doi:10.1038/sj.emboj.7600767,Nesbitt,RaeL.,"TargetedIntracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formulated withMultifunctional FAST proteins"(2012)。Electronic Thesis and DissertationRepository.论文388)，其由无包膜呼肠孤病毒编码。在实施方案中，IV类病毒融合剂足够小，以至于它们不形成发夹(doi:10.1146/annurev-cellbio-101512-122422,doi:10.1016/j.devcel.2007.12.008)。
在一些实施方案中，融合剂是副粘病毒融合剂。在一些实施方案中，融合剂是亨尼帕病毒融合剂，例如来自表3A中所示的任何病毒。在一些实施方案中，所述融合剂是尼帕病毒蛋白F、麻疹病毒F蛋白、树鼩副粘病毒F蛋白、副粘病毒F蛋白、亨德拉病毒F蛋白、亨尼帕病毒F蛋白、麻疹病毒F蛋白、呼吸道病毒F蛋白、仙台病毒F蛋白、腮腺炎病毒F蛋白或禽腮腺炎病毒F蛋白。
在一些实施方案中，融合剂是痘病毒科融合剂。
在US 9,695,446、US 2004/0028687、US 6,416,997、US 7,329,807、US 2017/0112773、US 2009/0202622、WO 2006/027202和US 2004/0009604中公开了另外的示例性融合剂，所有这些文献的全部内容通过引用并入本文。
Figure BDA0004107707870000941
Figure BDA0004107707870000951
在一些实施方案中，所述融合剂包含具有疏水性融合肽结构域的蛋白质。在一些实施方案中，所述融合剂包含亨尼帕病毒F蛋白分子或其生物活性部分。在一些实施方案中，亨尼帕病毒F蛋白是亨德拉(Hev)病毒F蛋白、尼帕(NiV)病毒F蛋白、雪松(CedPV)病毒F蛋白、墨江病毒(Mojiang virus)F蛋白或蝙蝠副粘病毒F蛋白或其生物活性部分。
表4提供了F蛋白的非限制性实例。在一些实施方案中，F蛋白分子的N端疏水性融合肽结构域或其生物活性部分暴露在脂质双层的外部。
亨尼帕病毒的F蛋白被编码为含有信号肽(例如，对应于SEQ ID NO:7的氨基酸残基1-26)的F0前体。在切割信号肽后，成熟的F0(例如，SEQ ID NO:13)被转运到细胞表面，然后被组织蛋白酶L(例如，在SEQ ID NO:7的氨基酸109-110之间)内吞并切割成成熟的融合亚基F1(例如，对应于SEQ ID NO:7的氨基酸110-546；如SEQ ID NO:15中所示)和F2(例如，对应于SEQ ID NO:7的氨基酸残基27-109；如SEQ ID NO:14中所示)。F1和F2亚基通过二硫键缔合并循环回细胞表面。F1亚基含有位于F1亚基N端的融合肽结构域(例如，对应于SEQID NO:7的氨基酸110-129)，在这里它能够***细胞膜中以驱动融合。在特定的情况下，融合活性被F蛋白与G蛋白的缔合所阻断，直到G与靶分子接合，导致其从F解离并暴露融合肽以介导膜融合。
在不同的亨尼帕病毒种中，F蛋白的序列和活性是高度保守的。例如，NiV和HeV病毒的F蛋白共享89％的氨基酸序列同一性。此外，在一些情况下，亨尼帕病毒F蛋白表现出与来自其他种的G蛋白的相容性，以触发融合(Brandel-Tretheway等人Journal ofVirology.2019.93(13):e00577-19)。在一些方面或所提供的融合体中，F蛋白与G蛋白是异源的，即F蛋白和G蛋白或生物活性部分来自不同的亨尼帕病毒属种。例如，F蛋白来自亨德拉病毒，并且G蛋白来自尼帕病毒。在其他方面，F蛋白可以是含有来自不同亨尼帕病毒种的F蛋白区域的嵌合F蛋白。在一些实施方案中，将F蛋白的氨基酸残基的区域从亨尼帕病毒的一个种转换为另一个种可以导致与包含氨基酸***的物种的G蛋白融合。(Brandel-Tretheway等人2019)。在一些情况下，嵌合F蛋白含有来自一种亨尼帕病毒种的细胞外结构域和来自不同亨尼帕病毒种的跨膜和/或细胞质结构域。例如，F蛋白含有亨德拉病毒的细胞外结构域和尼帕病毒的跨膜/细胞质结构域。本文所公开的F蛋白序列主要公开为包括N端信号序列的表达序列。由于这样的N端信号序列通常被共翻译或翻译后切割，所以本文所公开的所有F蛋白序列的成熟蛋白序列也被认为缺乏N端信号序列。
在一些实施方案中，F蛋白由编码SEQ ID NO:3-7中任一者所示的序列的核苷酸序列编码，或者是与SEQ ID NO:3-7中的任一者具有至少为或约80％、至少为或约85％、至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％同一性的其功能活性变体或生物活性部分。在特定的实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分保留了与亨尼帕病毒G蛋白(例如表5中所示的G蛋白，例如NiV-G或HeV-G)结合的融合活性。融合活性包括F蛋白与亨尼帕病毒G蛋白结合以促进或帮助两个膜内腔(诸如在其脂质双层中包埋了亨尼帕病毒F和G蛋白的靶向脂质颗粒的内腔)和靶细胞(例如含有被靶向包膜蛋白识别或结合的表面受体或分子的细胞)的细胞质融合的活性。在一些实施方案中，所述F蛋白和G蛋白来自相同的亨尼帕病毒属种(例如NiV-G和NiV-F)。在一些实施方案中，所述F蛋白和G蛋白来自不同的亨尼帕病毒属种(例如NiV-G和HeV-F)。在特定的实施方案中，F蛋白或功能活性变体或生物活性部分保留了被组织蛋白酶L切割的切割位点(例如，对应于SEQ ID NO:7的氨基酸109-110之间的切割位点)。
提及保持融合活性包括相应野生型F蛋白(诸如SEQ ID NO:3-7所示)结合水平或程度的10％或约10％至150％或约150％或更大的活性(与亨尼帕病毒G蛋白结合)，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约10％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约15％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约20％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约25％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约30％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约35％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约40％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约45％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约50％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约55％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约60％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约65％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约70％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约75％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约80％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约85％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约90％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约95％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约100％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约120％。
在一些实施方案中，所述F蛋白是含有一个或多个氨基酸突变(诸如一个或多个氨基酸***、缺失、取代或截短)的功能活性片段或生物活性部分的突变体F蛋白。在一些实施方案中，本文所述的突变涉及与参考F蛋白序列相比氨基酸的氨基酸***、缺失、取代或截短。在一些实施方案中，参考F蛋白序列是F蛋白的野生型序列或其生物活性部分。在一些实施方案中，突变体F蛋白或其生物活性部分是野生型亨德拉(Hev)病毒F蛋白、尼帕(NiV)病毒F蛋白、雪松(CedPV)病毒F蛋白、墨江病毒F蛋白或蝙蝠副粘病毒F蛋白的突变体。在一些实施方案中，野生型F蛋白由编码SEQ ID NO:3-7中任一者的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒F蛋白分子包含表4的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:3-7中的任一者)，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒F蛋白分子包含与表4的任何氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒F蛋白分子包含与SEQ ID NO:3具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒F蛋白分子包含与SEQ ID NO:4具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒F蛋白分子包含与SEQ ID NO:5具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒F蛋白分子包含与SEQ ID NO:6具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒F蛋白分子包含与SEQ ID NO:7具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的核酸序列编码表4的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
表4.亨尼帕病毒F序列。第1列，Genbank ID包括作为簇的质心序列的病毒整个基因组序列的Genbank ID。第2列，CDS的核苷酸提供与整个基因组中基因的CDS对应的核苷酸。第3列，完整基因名称，提供基因的完整名称，包括Genbank ID、病毒种、毒株和蛋白质名称。第4列，序列，提供基因的氨基酸序列。第5列，SEQ ID编号。
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Figure BDA0004107707870001011
在一些实施方案中，突变体F蛋白是野生型F蛋白的生物活性部分，其是N端和/或C端截短片段。在一些实施方案中，突变体F蛋白或其野生型F蛋白的生物活性部分包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文所述的突变可以改善转导效率。在一些实施方案中，本文所述的突变可以增加融合能力。示例性突变包括所描述的任何突变，参见例如Khetawat和Broder 2010Virology Journal 7:312；Witting等人2013Gene Therapy 20:997-1005；公开的国际专利申请号WO/2013/148327。
在一些实施方案中，突变F蛋白是生物活性部分，其是截短的并且缺乏在野生型F蛋白(例如由编码SEQ ID NO:3-7中任一者所示的F蛋白的核苷酸序列编码的野生型F蛋白)的C端或其附近的多达20个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变体F蛋白是截短的并且缺乏在野生型F蛋白的C端处的多达19个连续氨基酸，诸如多达18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个连续氨基酸。
在一些实施方案中，所述F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分包含F1亚基或其融合剂部分。在一些实施方案中，所述F1亚基是F0前体的蛋白水解切割部分。在一些实施方案中，所述F0前体是非活性的。在一些实施方案中，所述F0前体的切割形成二硫键连接的F1+F2异二聚体。在一些实施方案中，所述切割暴露融合肽并产生成熟的F蛋白。在一些实施方案中，所述切割发生在单个碱性残基处或周围。在一些实施方案中，所述切割发生在NiV-F蛋白的精氨酸109处。在一些实施方案中，所述切割发生在亨德拉病毒F蛋白的赖氨酸109处。
在一些实施方案中，F蛋白是野生型尼帕病毒F(NiV-F)蛋白，或者是其功能活性变体或生物活性部分。在一些实施方案中，F0前体由编码SEQ ID NO:7中所示的序列的核苷酸序列编码。编码核酸可以编码具有序列MVVILDKRCY CNLLILILMI SECSVG(SEQ ID NO:16)的信号肽序列。在一些实施方案中，F蛋白具有SEQ ID NO:13中所示的序列。在一些实例中，F蛋白被切割成包含SEQ ID NO:15所示的序列的F1亚基和包含SEQ ID NO:14所示的序列的F2亚基。
在一些实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分包含具有SEQ IDNO:15中所示的序列或与SEQ ID NO:15具有至少为或约80％、至少为或约81％、至少为或约82％、至少为或约83％、至少为或约84％、至少为或约85％、至少为或约86％、至少为或约87％、至少为或约88％或至少为或约89％、至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性的氨基酸序列的F1亚基。
在一些实施方案中，F蛋白或其功能活性变体或生物活性部分包含具有SEQ IDNO:14中所示的序列或与SEQ ID NO:14具有至少为或约80％、至少为或约81％、至少为或约82％、至少为或约83％、至少为或约84％、至少为或约85％、至少为或约86％、至少为或约87％、至少为或约88％或至少为或约89％、至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性的氨基酸序列的F2亚基。
在一些实施方案中，F蛋白是突变的NiV-F蛋白，它是NiV-F蛋白的生物活性部分，所述生物活性部分包含在野生型NiV-F蛋白(SEQ ID NO:7或13)的C端或其附近的22个氨基酸的截短。在一些实施方案中，NiV-F蛋白由编码SEQ ID NO:17中所示的序列的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，NiV-F蛋白由核苷酸序列编码，所述核苷酸序列编码与SEQ IDNO:17具有至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白具有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，NiV-F蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性。
在一些实施方案中，G蛋白是亨尼帕病毒G蛋白或其生物活性部分。在一些实施方案中，亨尼帕病毒G蛋白是亨德拉(HeV)病毒G蛋白、尼帕(NiV)病毒G蛋白(NiV-G)、雪松(CedPV)病毒G蛋白、墨江病毒G蛋白、蝙蝠副粘病毒G蛋白或其生物活性部分。表5提供了G蛋白的非限制性实例。
附着G蛋白是II型跨膜糖蛋白，其含有N端胞质尾(例如对应于SEQ ID NO:9的氨基酸1-49)、跨膜结构域(例如对应于SEQ ID NO:9的氨基酸50-70)以及含有细胞外茎(例如对应于SEQ ID NO:9的氨基酸71-187)和球状头(对应于SEQ ID NO:9的氨基酸188-602)的细胞外结构域。N端胞质结构域在脂质双层的内部内腔中，并且C端部分是暴露在脂质双层外侧的细胞外结构域。已显示C端区中的茎的区域(例如，对应于NiV-G的氨基酸159-167)参与与F蛋白的相互作用和F蛋白融合的触发(Liu等人2015J of Virology 89:1838)。在野生型G蛋白中，球状头介导受体与亨尼帕病毒进入受体肝配蛋白B2和肝配蛋白B3的结合，但不是膜融合所必需的(Brandel-Tretheway等人Journal of Virology.2019.93(13)e00577-19)。在本文的特定实施方案中，G蛋白的向性通过G蛋白或其生物活性片段(例如胞质截短)与sdAb可变域的连接而改变。G蛋白与结合配偶体的结合可以触发由相容的F蛋白或其生物活性部分介导的融合。本文所公开的G蛋白序列主要公开为包括翻译起始所必需的N端甲硫氨酸的表达序列。由于这样的N端甲硫氨酸通常被共翻译或翻译后切割，所以本文所公开的所有G蛋白序列的成熟蛋白序列也被认为缺乏N端甲硫氨酸。
G糖蛋白在亨尼帕病毒种之间高度保守。例如，NiV和HeV病毒的G蛋白共享79％的氨基酸同一性。研究已显示G蛋白与不同物种的F蛋白之间的高度相容性，如通过异型融合激活所证明(Brandel-Tretheway等人Journal of Virology.2019)。如下面进一步描述，再靶向脂质颗粒可以含有来自不同物种的异源G和F蛋白。
在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒G蛋白分子包含表5的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:8-12中的任一者)，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒G蛋白分子包含与表5的任何氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒G蛋白分子包含与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒G蛋白分子包含与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒G蛋白分子包含与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒G蛋白分子包含与SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的亨尼帕病毒G蛋白分子包含与SEQ ID NO:12具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的核酸序列编码表5的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在特定的实施方案中，G蛋白或功能活性变体或生物活性部分是保留与亨尼帕病毒F蛋白(例如表4中所示的F蛋白，例如NiV-F或HeV-F)结合的融合活性的蛋白质。融合活性包括G蛋白与亨尼帕病毒F蛋白结合以促进或帮助两个膜内腔(诸如在其脂质双层中包埋了亨尼帕病毒F和G蛋白的靶向脂质颗粒的内腔)和靶细胞(例如含有被靶向包膜蛋白识别或结合的表面受体或分子的细胞)的细胞质融合的活性。在一些实施方案中，所述F蛋白和G蛋白来自相同的亨尼帕病毒属种(例如NiV-G和NiV-F)。在一些实施方案中，所述F蛋白和G蛋白来自不同的亨尼帕病毒属种(例如NiV-G和HeV-F)。
提及保持融合活性包括相应野生型F蛋白(诸如SEQ ID NO:8-12所示)结合水平或程度的10％或约10％至150％或约150％或更大的活性(与亨尼帕病毒F蛋白结合)，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约10％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约15％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约20％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约25％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约30％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约35％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约40％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约45％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约50％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约55％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约60％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约65％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约70％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约75％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约80％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约85％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约90％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约95％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约100％，诸如相应野生型F蛋白的融合活性水平或程度的至少或至少约120％。
表5.亨尼帕病毒蛋白G序列。第1列，Genbank ID包括作为簇的质心序列的病毒整个基因组序列的Genbank ID。第2列，CDS的核苷酸提供与整个基因组中基因的CDS对应的核苷酸。第3列，完整基因名称，提供基因的完整名称，包括Genbank ID、病毒种、毒株和蛋白质名称。第4列，序列，提供基因的氨基酸序列。第5列，SEQ ID编号。
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在一些实施方案中，G蛋白是含有一个或多个氨基酸突变(诸如一个或多个氨基酸***、缺失、取代或截短)的功能活性变体或生物活性部分的突变G蛋白。在一些实施方案中，本文所述的突变涉及与参考G蛋白序列相比氨基酸的氨基酸***、缺失、取代或截短。在一些实施方案中，参考G蛋白序列是G蛋白的野生型序列或其生物活性部分。在一些实施方案中，其功能活性变体或生物活性部分是野生型亨德拉(HeV)病毒G蛋白、野生型尼帕(NiV)病毒G蛋白(NiV-G)、野生型雪松(CedPV)病毒G蛋白、野生型墨江病毒G蛋白、野生型蝙蝠副粘病毒G蛋白或其生物活性部分的突变体。在一些实施方案中，野生型G蛋白具有SEQ IDNO:9-12中任一者所示的序列。
在一些实施方案中，所述G蛋白是作为突变体G蛋白，其是野生型亨德拉(HeV)病毒G蛋白、野生型尼帕(NiV)病毒G蛋白(NiV-G)、野生型雪松(CedPV)病毒G蛋白、野生型墨江病毒G蛋白、野生型蝙蝠副粘病毒G蛋白的N端和/或C端截短片段的生物活性部分。在特定的实施方案中，所述截短是全部或部分胞质结构域的N端截短。在一些实施方案中，突变G蛋白是生物活性部分，其是截短的并且缺乏在野生型G蛋白(例如SEQ ID NO:9-12中任一者所示的野生型G蛋白)的N端或其附近的多达49个连续氨基酸残基。在一些实施方案中，突变F蛋白是截短的并且缺乏在野生型G蛋白的N端处的多达49个连续氨基酸，诸如多达49个、48个、47个、46个、45个、44个、43个、42个、41个、40个、30个、38个、37个、36个、35个、34个、33个、32个、31个、30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个连续氨基酸。
在一些实施方案中，G蛋白是NiV-G或其功能活性变体或生物活性部分，并与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3结合。在一些方面，NiV-G具有SEQ ID NO:9-12中任一者所示的氨基酸序列，或者是能够与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3结合的其功能活性变体或其生物活性部分。在一些实施方案中，功能活性变体或生物活性部分具有与SEQ ID NO:9-12具有至少约80％、至少约85％、至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性的氨基酸序列，并且保留与肝配蛋白B2或B3的结合。示例性生物活性部分包括缺乏全部或部分细胞质结构域(例如1个或多个，诸如1至49个连续的N端氨基酸残基)的N端截短的变体。提及保留与肝配蛋白B2或B3的结合包括相应野生型NiV-G(诸如SEQ ID NO:9-12中所示)结合水平或程度的至少或至少约5％的结合。
在一些实施方案中，所述G蛋白或其生物是突变G蛋白，其表现出对野生型G蛋白的天然结合配偶体的降低的结合。在一些实施方案中，所述突变体G蛋白或其生物活性部分是野生型NiV-G的突变体，并且表现出与天然结合配偶体肝配蛋白B2或肝配蛋白B3中的一者或两者的降低的结合。在一些实施方案中，所述突变体G蛋白或生物活性部分(诸如突变体NiV-G蛋白)表现出与天然结合配偶体的降低的结合。在一些实施方案中，与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的降低的结合降低了大于为或约5％、为或约10％、为或约15％、为或约20％、为或约25％、为或约30％、为或约40％、为或约50％、为或约60％、为或约70％、为或约80％、为或约90％、或为或约100％。
在一些实施方案中，本文所述的突变可以改善转导效率。在一些实施方案中，本文所述的突变允许特异性靶向不是肝配蛋白B2或肝配蛋白B3的其他期望的细胞类型。在一些实施方案中，本文所述的突变导致至少部分不能结合至少一种天然受体，这降低了与肝配蛋白B2或肝配蛋白B3中的至少一种的结合。在一些实施方案中，本文所述的突变干扰天然受体识别。
在一些实施方案中，所述G蛋白含有在参与与肝配蛋白B2和肝配蛋白B3中的一者或两者相互作用的残基中的一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，参考SEQ ID NO:9中所示的编号，氨基酸取代对应于突变E501A、W504A、Q530A和E533A。
在一些实施方案中，G蛋白是含有一个或多个选自由参考SEQ ID NO:9中所示的编号的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的氨基酸取代的突变G蛋白。在一些实施方案中，G蛋白是含有一个或多个选自由参考SEQ ID NO:9的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的氨基酸取代的突变G蛋白，并且是含有N端截短的其生物活性部分。
在一些实施方案中，G蛋白是含有一个或多个选自由参考SEQ ID NO:9中所示的编号的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的氨基酸取代的突变G蛋白。在一些实施方案中，G蛋白是含有一个或多个选自由参考SEQ ID NO:9的E501A、W504A、Q530A和E533A组成的组的氨基酸取代的突变G蛋白，并且是含有N端截短的其生物活性部分。在一些实施方案中，突变NiV-G蛋白或其生物活性部分被截短，并且缺乏在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的多达5个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的6个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的7个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的8个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的9个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQID NO:9)的N端或其附近的多达10个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的11个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的12个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的13个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的14个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的多达15个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的16个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ IDNO:9)的N端或其附近的17个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的18个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的19个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的多达20个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的21个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的22个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的23个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的24个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的多达25个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的26个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的27个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的28个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的29个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ IDNO:9)的N端或其附近的多达30个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的多达31个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的32个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的33个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的34个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的35个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的多达36个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ IDNO:9)的N端或其附近的多达37个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的多达38个连续氨基酸残基，在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的多达39个连续氨基酸残基，或在野生型NiV-G蛋白(SEQ ID NO:9)的N端或其附近的多达40个连续氨基酸残基。
在一些实施方案中，NiV-G蛋白由编码SEQ ID NO:18中所示的序列的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，NiV-G蛋白由如下核苷酸序列编码，所述核苷酸序列编码与SEQID NO:18具有至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性的序列。在一些实施方案中，突变NiV-G蛋白具有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18具有至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施方案中，G蛋白具有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，NiV-F蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:17具有至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性，并且NiV-G蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO:18具有至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性。在一些实施方案中，NiV-F蛋白具有SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列，并且NiV-G蛋白具有SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
其他蛋白质
在一些实施方案中，融合剂可包括pH依赖性蛋白质、其同源物、其片段以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合体。融合剂可能在细胞表面或核内体或另一个细胞膜结合空间中介导膜融合。
在一些实施方案中，融合剂包括EFF-1、AFF-1、间隙连接蛋白(例如联接蛋白)(诸如Cn43、GAP43、CX43)(DOI:10.1021/jacs.6b05191)、其他肿瘤连接蛋白、其同源物、其片段、其变体以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白融合物。
蛋白质融合剂的修饰
蛋白质融合剂或病毒包膜蛋白(例如，亨尼帕病毒G蛋白分子)可通过使融合蛋白或靶向蛋白(例如，血凝素蛋白)中的氨基酸残基发生突变来被再靶向。在一些实施方案中，融合剂是随机突变的。在一些实施方案中，融合剂被合理地突变。在一些实施方案中，融合剂经历定向进化。在一些实施方案中，融合剂被截短，并且在逆转录病毒载体或融合体中仅使用肽的子集。例如，麻疹血凝素蛋白中的氨基酸残基可以被突变，以改变所述蛋白质的结合特性，从而重定向融合(doi:10.1038/nbt942,Molecular Therapy第16卷第8期,1427–14362008年8月,doi:10.1038/nbt1060,DOI:10.1128/JVI.76.7.3558–3563.2002,DOI:10.1128/JVI.75.17.8016–8020.2001,doi:10.1073pnas.0604993103)。
可通过将靶向部分共价缀合到融合蛋白或靶向蛋白(例如血凝素蛋白)上来再靶向蛋白质融合剂(例如亨尼帕病毒G蛋白分子)。例如，G蛋白可以连接到靶向部分(例如抗体或抗原结合片段)。在一些实施方案中，融合剂和靶向部分通过表达包含与靶向部分连接的融合剂的嵌合蛋白来共价缀合。靶标包括展示在靶细胞上的任何肽(例如受体)。在一些实例中，靶标在靶细胞上的表达水平高于非靶细胞。例如，单链可变片段(scFv)可以缀合至融合剂，以将融合活性重定向到展示scFv结合靶标的细胞(doi:10.1038/nbt1060,DOI10.1182/blood-2012-11-468579,doi:10.1038/nmeth.1514,doi:10.1006/mthe.2002.0550,HUMAN GENE THERAPY 11:817–826,doi:10.1038/nbt942,doi:10.1371/journal.pone.0026381,DOI10.1186/s12896-015-0142-z)。例如，设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)可以缀合至融合剂，以将融合活性重定向到展示DARPin结合靶标(doi:10.1038/mt.2013.16,doi:10.1038/mt.2010.298,doi:10.4049/jimmunol.1500956)以及不同DARPin的组合(doi:10.1038/mto.2016.3)的细胞。例如，受体配体和抗原可以缀合至融合剂，以将融合活性重定向到展示靶受体的细胞(DOI:10.1089/hgtb.2012.054,DOI:10.1128/JVI.76.7.3558–3563.2002)。靶向蛋白还可包括例如抗体或其抗原结合片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体诸如sdAb(VL或VH)、纳米抗体或骆驼科动物VHH结构域)、抗原结合纤连蛋白III型(Fn3)支架诸如纤连蛋白多肽微抗体、配体、细胞因子、趋化因子或T细胞受体(TCR)。可以通过将靶向部分非共价缀合到融合蛋白或靶向蛋白(例如血凝素蛋白)来再靶向蛋白质融合剂。例如，融合蛋白可以被工程化以结合靶向靶细胞上的抗原的抗体的Fc区，从而将融合活性重定向到展示抗体靶标的细胞(DOI:10.1128/JVI.75.17.8016–8020.2001,doi:10.1038/nm1192)。改变的和未改变的融合剂可以展示在相同的逆转录病毒载体或融合体上(doi:10.1016/j.biomaterials.2014.01.051)。
靶向部分可以包含人源化抗体分子、完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如
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等)；抗体片段，例如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd’片段、Fd片段和分离的CDR或其集合；单链Fv；多肽-Fc融合物；单结构域抗体(例如鲨鱼单结构域抗体，诸如IgNAR或其片段)；骆驼样抗体；掩蔽的抗体(例如，/>
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)；小模块免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双抗体/>
Figure BDA0004107707870001172
VHH；/>
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微型抗体；/>
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锚蛋白重复蛋白或/>
Figure BDA0004107707870001175
DART；TCR样抗体；
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微量蛋白；
Figure BDA0004107707870001177
以及/>
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靶向部分还可包括抗体或其抗原结合片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单结构域抗体诸如sdAb(VL或VH)、纳米抗体或骆驼科动物VHH结构域)、抗原结合纤连蛋白III型(Fn3)支架诸如纤连蛋白多肽微抗体、配体、细胞因子、趋化因子或T细胞受体(TCR)。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体是其互补决定区是单结构域多肽的一部分的抗体。在一些实施方案中，所述单结构域抗体是仅有重链的抗体可变域。在一些实施方案中，所述单结构域抗体不包含轻链。
在一些实施方案中，缺少轻链的重链抗体被称为VHH。在一些实施方案中，所述单结构域抗体具有12-15kDa的分子量。在一些实施方案中，所述单结构域抗体包括骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体。在一些实施方案中，所述单结构域抗体分子来源于骆驼科物种中产生的抗体，所述骆驼科种例如骆驼、美洲驼羊、单峰骆驼、羊驼、骆马和原驼。在一些实施方案中，所述单结构域抗体被称为免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)并且来源于软骨鱼。在一些实施方案中，通过将人或小鼠IgG的二聚体可变域***成单体并骆驼源化关键残基来产生所述单结构域抗体。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体可以从噬菌体展示文库产生。在一些实施方案中，噬菌体展示文库由用各种抗原免疫的骆驼科动物的VHH库产生，如Arbabi等人,FEBS Letters,414,
521-526(1997)；Lauwereys等人,EMBO J.,17,3512-3520(1998)；Decanniere等人,Structure,7,361-370(1999)中所述。在一些实施方案中，产生包含未免疫的骆驼科动物的抗体片段的噬菌体展示文库。在一些实施方案中，通过将多样性引入一个或多个支架而合成产生单结构域抗体人单结构域抗体文库。
在一些实施方案中，所述单结构域抗体的C端与所述G蛋白或其生物活性部分的C端连接。在一些实施方案中，所述单结构域抗体的N端暴露在脂质双层的外表面上。在一些实施方案中，所述单结构域抗体的N端与靶细胞的细胞表面分子结合。在一些实施方案中，所述单结构域抗体与存在于靶细胞上的细胞表面分子特异性地结合。在一些实施方案中，所述细胞表面分子是蛋白质、聚糖、脂质或低分子量分子。
在实施方案中，再靶向融合剂结合靶细胞上的细胞表面标志物，例如蛋白质、糖蛋白、受体、细胞表面配体、激动剂、脂质、糖、I类跨膜蛋白、II类跨膜蛋白或III类跨膜蛋白。
逆转录病毒载体或融合体可以展示不与蛋白质融合剂缀合的靶向部分，以便将融合活性重定向到被靶向部分结合的细胞，或影响归巢。
添加到逆转录病毒载体或融合体的靶向部分可以被调节以具有不同的结合强度。例如，具有不同结合强度的scFv和抗体可用于改变逆转录病毒载体或融合体对展示高量或低量靶抗原的细胞的融合活性(doi:10.1128/JVI.01415-07,doi:10.1038/cgt.2014.25,DOI:10.1002/jgm.1151)。例如，具有不同亲和力的DARPin可用于改变逆转录病毒载体或融合体对展示高量或低量靶抗原的细胞的融合活性(doi:10.1038/mt.2010.298)。靶向部分也可以被调节以靶向靶配体上的不同区域，这将影响与展示靶标的细胞的融合率(doi:10.1093/protein/gzv005)。
在一些实施方案中，靶细胞的细胞表面分子是抗原或其部分。在一些实施方案中，所述单结构域抗体或其部分是具有能够选择性地结合特定抗原的单体单结构域抗原结合/识别结构域的抗体。在一些实施方案中，所述单结构域抗体结合存在于靶细胞上的抗原。
示例性细胞包括多形核细胞(也称为PMN、PML、PMNL或粒细胞)、干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞、间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、人肌源性干细胞、肌肉来源的干细胞(MuStem)、胚胎干细胞(ES或ESC)、角膜缘上皮干细胞、心肌源性干细胞、心肌细胞、祖细胞、免疫效应细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞、T细胞、细胞毒性T淋巴细胞、同种细胞、常驻心脏细胞、诱导多能干细胞(iPS)、脂肪来源的或表型修饰的干细胞或祖细胞、CD133+细胞、醛脱氢酶阳性细胞(ALDH+)、脐带血(UCB)细胞、外周血干细胞(PBSC)、神经元、神经祖细胞、胰腺β细胞、胶质细胞或肝细胞。
在一些实施方案中，所述靶细胞是靶组织的细胞。所述靶组织可包括肝、肺、心脏、脾、胰腺、胃肠道、肾、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经***、外周神经***、骨骼肌、内皮、内耳或眼睛。
在一些实施方案中，所述靶细胞是肌肉细胞(例如骨骼肌细胞)、肾细胞、肝脏细胞(例如肝细胞)或心肌细胞(cadiac cell)(例如心肌细胞(cardiomyocyte))。在一些实施方案中，所述靶细胞是心脏细胞(例如心肌细胞(例如休眠心肌细胞))、成肝细胞(例如胆管成肝细胞)、上皮细胞、T细胞(例如原初T细胞)、巨噬细胞(例如肿瘤浸润巨噬细胞)或成纤维细胞(例如心脏成纤维细胞)。
在一些实施方案中，所述靶细胞是肿瘤浸润淋巴细胞、T细胞、赘生性或肿瘤细胞、病毒感染细胞、干细胞、中枢神经***(CNS)细胞、造血干细胞(HSC)、肝细胞或完全分化细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞选自CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肝细胞、造血干细胞、CD34+造血干细胞、CD105+造血干细胞、CD117+造血干细胞、CD105+内皮细胞、B细胞、CD20+B细胞、CD19+B细胞、癌细胞、CD133+癌细胞、EpCAM+癌细胞、CD19+癌细胞、Her2/Neu+癌细胞、GluA2+神经元、GluA4+神经元、NKG2D+自然杀伤细胞、SLC1A3+星形胶质细胞、SLC7A10+脂肪细胞或CD30+肺上皮细胞。
在一些实施方案中，所述靶细胞是抗原呈递细胞、MHC II类+细胞、专职抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突细胞、骨髓树突细胞、浆细胞样树突细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞。
在一些实施方案中，所述细胞表面分子是CD8、CD4、脱唾液酸糖蛋白受体2(ASGR2)、跨膜4L6家族成员5(TM4SF5)、低密度脂蛋白受体(LDLR)或脱唾液酸糖蛋白1(ASGR1)中的任一种。
在一些实施方案中，所述G蛋白或其功能活性变体或生物活性部分与sdAb可变域直接连接。在一些实施方案中，所述靶向包膜蛋白是具有以下结构的融合蛋白：(N'-单结构域抗体-C')-(C'-G蛋白-N')。
在一些实施方案中，所述G蛋白或其功能活性变体或生物活性部分通过接头间接连接至sdAb可变域。在一些实施方案中，所述接头是肽接头。在一些实施方案中，所述接头是化学接头。
在一些实施方案中，所述接头是肽接头，并且所述靶向包膜蛋白是融合蛋白，其含有通过肽接头与sdAb可变域连接的G蛋白或其功能活性变体或生物活性部分。在一些实施方案中，所述靶向包膜蛋白是具有以下结构的融合蛋白：(N'-单结构域抗体-C')-接头-(C'-G蛋白-N')。
在一些实施方案中，所述肽接头为多达65个氨基酸的长度。在一些实施方案中，所述肽接头包含从或从约2至65个氨基酸、2至60个氨基酸、2至56个氨基酸、2至52个氨基酸、2至48个氨基酸、2至44个氨基酸、2至40个氨基酸、2至36个氨基酸、2至32个氨基酸、2至28个氨基酸、2至24个氨基酸、2至20个氨基酸、2至18个氨基酸、2至14个氨基酸、2至12个氨基酸、2至10个氨基酸、2至8个氨基酸、2至6个氨基酸、6至65个氨基酸、6至60个氨基酸、6至56个氨基酸、6至52个氨基酸、6至48个氨基酸、6至44个氨基酸、6至40个氨基酸、6至36个氨基酸、6至32个氨基酸、6至28个氨基酸、6至24个氨基酸、6至20个氨基酸、6至18个氨基酸、6至14个氨基酸、6至12个氨基酸、6至10个氨基酸、6至8个氨基酸、8至65个氨基酸、8至60个氨基酸、8至56个氨基酸、8至52个氨基酸、8至48个氨基酸、8至44个氨基酸、8至40个氨基酸、8至36个氨基酸、8至32个氨基酸、8至28个氨基酸、8至24个氨基酸、8至20个氨基酸、8至18个氨基酸、8至14个氨基酸、8至12个氨基酸、8至10个氨基酸、10至65个氨基酸、10至60个氨基酸、10至56个氨基酸、10至52个氨基酸、10至48个氨基酸、10至44个氨基酸、10至40个氨基酸、10至36个氨基酸、10至32个氨基酸、10至28个氨基酸、10至24个氨基酸、10至20个氨基酸、10至18个氨基酸、10至14个氨基酸、10至12个氨基酸、12至65个氨基酸、12至60个氨基酸、12至56个氨基酸、12至52个氨基酸、12至48个氨基酸、12至44个氨基酸、12至40个氨基酸、12至36个氨基酸、12至32个氨基酸、12至28个氨基酸、12至24个氨基酸、12至20个氨基酸、12至18个氨基酸、12至14个氨基酸、14至65个氨基酸、14至60个氨基酸、14至56个氨基酸、14至52个氨基酸、14至48个氨基酸、14至44个氨基酸、14至40个氨基酸、14至36个氨基酸、14至32个氨基酸、14至28个氨基酸、14至24个氨基酸、14至20个氨基酸、14至18个氨基酸、18至65个氨基酸、18至60个氨基酸、18至56个氨基酸、18至52个氨基酸、18至48个氨基酸、18至44个氨基酸、18至40个氨基酸、18至36个氨基酸、18至32个氨基酸、18至28个氨基酸、18至24个氨基酸、18至20个氨基酸、20至65个氨基酸、20至60个氨基酸、20至56个氨基酸、20至52个氨基酸、20至48个氨基酸、20至44个氨基酸、20至40个氨基酸、20至36个氨基酸、20至32个氨基酸、20至28个氨基酸、20至26个氨基酸、20至24个氨基酸、24至65个氨基酸、24至60个氨基酸、24至56个氨基酸、24至52个氨基酸、24至48个氨基酸、24至44个氨基酸、24至40个氨基酸、24至36个氨基酸、24至32个氨基酸、24至30个氨基酸、24至28个氨基酸、28至65个氨基酸、28至60个氨基酸、28至56个氨基酸、28至52个氨基酸、28至48个氨基酸、28至44个氨基酸、28至40个氨基酸、28至36个氨基酸、28至34个氨基酸、28至32个氨基酸、32至65个氨基酸、32至60个氨基酸、32至56个氨基酸、32至52个氨基酸、32至48个氨基酸、32至44个氨基酸、32至40个氨基酸、32至38个氨基酸、32至36个氨基酸、36至65个氨基酸、36至60个氨基酸、36至56个氨基酸、36至52个氨基酸、36至48个氨基酸、36至44个氨基酸、36至40个氨基酸、40至65个氨基酸、40至60个氨基酸、40至56个氨基酸、40至52个氨基酸、40至48个氨基酸、40至44个氨基酸、44至65个氨基酸、44至60个氨基酸、44至56个氨基酸、44至52个氨基酸、44至48个氨基酸、48至65个氨基酸、48至60个氨基酸、48至56个氨基酸、48至52个氨基酸、50至65个氨基酸、50至60个氨基酸、50至56个氨基酸、50至52个氨基酸、54至65个氨基酸、54至60个氨基酸、54至56个氨基酸、58至65个氨基酸、58至60个氨基酸、或60至65个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽接头是长度为3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个或65个氨基酸的多肽。
在特定的实施方案中，所述接头是柔性肽接头。在一些此类实施方案中，所述接头为1-20个氨基酸，诸如主要由甘氨酸构成的1-20个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头为1-20个氨基酸，诸如主要由甘氨酸和丝氨酸构成的1-20个氨基酸。在一些实施方案中，所述接头是含有氨基酸甘氨酸和丝氨酸的柔性肽接头，称为GS-接头。在一些实施方案中，肽接头包括序列GS、GGS、GGGGS(SEQ ID NO:19)、GGGGGS(SEQ ID NO:20)或其组合。在一些实施方案中，所述多肽接头具有序列(GGS)n，其中n为1至10。在一些实施方案中，多肽接头具有序列(GGGGS)n(SEQ ID NO:21)，其中n是1至10。在一些实施方案中，多肽接头具有序列(GGGGGS)n(SEQ ID NO:22)，其中n是1至6。
在一些实施方案中，例如，如本文所述，可以改变蛋白质融合剂以降低免疫反应性。例如，蛋白质融合剂可以用减少免疫相互作用的分子来修饰，所述分子诸如PEG(DOI:10.1128/JVI.78.2.912–921.2004)。因此，在一些实施方案中，融合剂包含PEG，例如是聚乙二醇化的多肽。可改变免疫***靶向的融合剂中的氨基酸残基，以不被免疫***识别(doi:10.1016/j.virol.2014.01.027,doi:10.1371/journal.pone.0046667)。在一些实施方案中，融合剂的蛋白质序列被改变，以类似于在人中发现的氨基酸序列(人源化)。在一些实施方案中，融合剂的蛋白质序列被改变成较弱地结合MHC复合物的蛋白质序列。在一些实施方案中，蛋白质融合剂来源于不感染人的病毒或生物体(并且人没有针对它接种疫苗)，从而增加了患者的免疫***对蛋白质融合剂原始的可能性(例如，对融合剂的体液或细胞介导的适应性免疫反应可以忽略不计)(doi:10.1006/mthe.2002.0550,doi:10.1371/journal.ppat.1005641,doi:10.1038/gt.2011.209,DOI 10.1182/blood-2014-02-558163)。在一些实施方案中，可以改变融合剂的糖基化以改变免疫相互作用或降低免疫反应性。不希望受到理论束缚，在一些实施方案中，来源于不感染人的病毒或生物体的蛋白质融合剂在患者中不具有天然融合靶标，因此具有高特异性。
脂质融合剂
在一些实施方案中，例如除了本文所述的F蛋白和G蛋白之外，逆转录病毒载体或融合体可以包含一种或多种融合脂质，例如饱和脂肪酸。在一些实施方案中，饱和脂肪酸具有10-14个碳。在一些实施方案中，饱和脂肪酸具有长链羧酸。在一些实施方案中，饱和脂肪酸是单酯。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体可以包含一种或多种不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，不饱和脂肪酸具有C16和C18之间的不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，不饱和脂肪酸包括油酸、甘油单油酸酯、甘油酯、二酰基甘油、改性的不饱和脂肪酸及其任何组合。
不希望受到理论束缚，在一些实施方案中，负曲率脂质促进膜融合。在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包含在膜中的一种或多种负曲率脂质，例如外源性负曲率脂质。在实施方案中，将负曲率脂质或其前体添加到包含源细胞、逆转录病毒载体或融合体的培养基中。在实施方案中，源细胞被工程化以表达或过表达一种或多种脂质合成基因。负曲率脂质可以是例如二酰基甘油(DAG)、胆固醇、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)或脂肪酸(FA)。
不希望受到理论束缚，在一些实施方案中，正曲率脂质抑制膜融合。在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包含在膜中的降低水平的一种或多种正曲率脂质，例如外源性正曲率脂质。在实施方案中，通过抑制源细胞中脂质的合成，例如通过敲除或敲低脂质合成基因，来降低水平。正曲率脂质可以是例如溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(PtdIns)、溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)或单酰基甘油(MAG)。
化学融合剂
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体可以用融合化学物质处理。在一些实施方案中，融合化学物质是聚乙二醇(PEG)或其衍生物。
在一些实施方案中，化学融合剂诱导两个膜之间的局部脱水，这导致双层的不利分子堆积。在一些实施方案中，化学融合剂诱导脂质双层附近区域的脱水，引起两个膜之间的水性分子的置换，并允许两个膜一起相互作用。
在一些实施方案中，化学融合剂是阳离子。阳离子的一些非限制性实例包括Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、La3+、Sr3+和H+。
在一些实施方案中，化学融合剂通过改变表面极性与靶膜结合，这改变了依赖于水合的膜间排斥。
在一些实施方案中，化学融合剂是可溶性脂质。一些非限制性实例包括油酰甘油、二油酰甘油、三油酰甘油及其变体和衍生物。
在一些实施方案中，化学融合剂是水溶性化学物质。一些非限制性实例包括聚乙二醇、二甲基亚砜及其变体和衍生物。
在一些实施方案中，化学融合剂是小的有机分子。一个非限制性实例包括正溴己烷。
在一些实施方案中，化学融合剂不会改变融合剂或靶膜的组成、细胞活力或离子转运特性。
在一些实施方案中，化学融合剂是激素或维生素。一些非限制性实例包括脱落酸、视黄醇(维生素A1)、生育酚(维生素E)及其变体和衍生物。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包含肌动蛋白和稳定聚合肌动蛋白的剂。不希望受到理论束缚，逆转录病毒载体或融合体中稳定的肌动蛋白可以促进与靶细胞的融合。在实施方案中，稳定聚合肌动蛋白的剂选自肌动蛋白、肌球蛋白、生物素-链霉亲和素、ATP、神经元奥尔德里奇综合征(Wiskott–Aldrich syndrome)蛋白(N-WASP)或形成蛋白。参见例如Langmuir.2011年8月16日；27(16):10061-71和Wen等人,Nat Commun.2016年8月31日；7。在实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包含外源性肌动蛋白，例如野生型肌动蛋白或包含促进聚合的突变的肌动蛋白。在实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包含ATP或磷酸肌酸，例如外源性ATP或磷酸肌酸。
小分子融合剂
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体可以用融合小分子处理。一些非限制性实例包括氟烷、非甾体抗炎药(NSAIDs)，例如美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康和氯丙嗪。
在一些实施方案中，小分子融合剂可以胶束样聚集体的形式存在，或者不含聚集体。
阳性靶细胞特异性调控元件
在一些实施方案中，本文所述的融合体核酸包含阳性靶细胞特异性调控元件，例如组织特异性启动子、组织特异性增强子、组织特异性剪接位点、延长RNA或蛋白质半衰期的组织特异性位点、组织特异性mRNA核输出促进位点、组织特异性翻译增强位点或组织特异性翻译后修饰位点。在例如国际申请WO2019/222403中描述了另外的阳性靶细胞特异性调控元件，所述申请通过引用整体并入本文。
在特定的实施方案中，本文所述的融合体核酸包含控制元件，例如能够以细胞特异性方式引导、增加、调节或控制可操作连接的多核苷酸的转录或表达。在特定的实施方案中，融合体核酸包含一种或多种对特定细胞、细胞类型或细胞谱系(例如靶细胞)具有特异性的表达控制序列；也就是说，与对特定细胞、细胞类型或细胞谱系具有特异性的表达控制序列可操作地连接的多核苷酸的表达在靶细胞中表达，而在非靶细胞中不表达(或以较低水平表达)。在特定的实施方案中，融合体核酸可以包含外源、内源或异源控制序列，例如启动子和/或增强子。
在特定的实施方案中，在哺乳动物细胞中起作用的启动子包含位于转录起始位点上游约25至30个碱基处的富含AT的区域和/或位于转录起始位点上游70至80个碱基处的另一序列，所述另一序列是CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。在实施方案中，增强子包含如下DNA区段，所述区段含有能够提供增强转录的序列，并且在某些情况下可以独立于相对于另一个控制序列的方向发挥功能。增强子可以与启动子和/或其他增强子元件协同或相加地发挥作用。在一些实施方案中，DNA的启动子/增强子区段含有能够提供启动子和增强子功能的序列。在一些实施方案中，控制序列是普遍存在的表达控制序列。
在一些实施方案中，启动子是组织特异性启动子，例如驱动肝脏细胞中的表达的启动子，所述肝脏细胞例如肝细胞、肝窦内皮细胞、胆管细胞、星状细胞、肝脏驻留抗原呈递细胞(例如，库普弗细胞(Kupffer Cell))、肝脏驻留免疫淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)或门静脉成纤维细胞。
非靶细胞特异性调控元件
在一些实施方案中，非靶细胞特异性调控元件包含组织特异性miRNA识别序列、组织特异性蛋白酶识别位点、组织特异性泛素连接酶位点、组织特异性转录抑制位点或组织特异性表观遗传抑制位点。例如，在国际申请WO2019/222403中描述了另外的非靶细胞特异性调控元件，所述申请通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，非靶细胞包含内源miRNA。融合体核酸(例如，编码外源剂的基因)可以包含该miRNA的识别序列。因此，如果融合体核酸进入非靶细胞，miRNA可以下调外源剂的表达。这有助于实现靶细胞相对于非靶细胞的额外特异性。
在一些实施方案中，miRNA是20-22个核苷酸的小的非编码RNA，通常从称为前miRNA的约70个核苷酸的折返RNA前体结构中切下。miRNA(例如，天然存在的miRNA或人工设计的miRNA)可以特异性地靶向任何mRNA序列。在一个实施方案中，技术人员可以设计表达为人miRNA(例如，miR-30或miR-21)初级转录物的短发夹RNA构建体。这种设计在发夹构建体上添加了Drosha加工位点，并显示出极大地提高了敲除效率(Pusch等人,2004)。发夹茎由22-nt的dsRNA(例如，反义核酸与所需靶具有完美互补性)和15-19-nt的来自人miR的环组成。
数百种不同的miRNA基因在发育期间并在不同的组织类型中不同地表达。分子分析表明，miRNA在不同的组织中有不同的表达谱。已使用计算方法分析了大约7,000个预测的人miRNA靶的表达。这些数据表明，miRNA的表达在很大程度上有助于许多人组织中mRNA表达的组织特异性。(参见Sood等人2006PNAS USA103(8):2746-51。)
因此，基于miRNA的方法可用于通过使用内源性微RNA种类使非靶细胞类型中外源剂的表达沉默来限制外源剂在靶细胞群中的表达。在一些实施方案中，融合体核酸包含一个或多个(例如多个)组织特异性miRNA识别序列。在一些实施方案中，组织特异性miRNA识别序列的长度为约20-25、21-24或23个核苷酸。在实施方案中，组织特异性miRNA识别序列与存在于非靶细胞中的miRNA具有完美的互补性。在一些实施方案中，外源剂不包含GFP，例如不包含荧光蛋白，例如不包含报告蛋白。在一些实施方案中，脱靶细胞不是造血细胞和/或miRNA不存在于造血细胞中。
在一些实施方案中，本文的方法包括外源剂在靶细胞中的组织特异性表达，包括将包含编码外源剂的核苷酸和至少一种组织特异性微RNA(miRNA)靶序列的多个融合体核酸与包含靶细胞和非靶细胞的多个细胞接触，其中外源剂优选地在靶细胞中表达，例如局限于靶细胞。在实施方案中，融合体核酸包含在非靶细胞中可操作地连接到具有相应miRNA的核苷酸序列的至少一个miRNA识别序列，所述非靶细胞例如造血祖细胞(HSPC)、造血干细胞(HSC)，其防止或减少所述核苷酸序列在非靶细胞中的表达，而不是在靶细胞例如分化细胞中的表达。在一些实施方案中，融合体核酸包含至少一个miRNA序列靶标，该序列靶标针对在非靶细胞中以有效量(例如，内源性miRNA的浓度足以减少或阻止转基因的表达)存在的miRNA，并且包含转基因。在实施方案中，该***中使用的miRNA在非靶细胞诸如HSPC和HSC中强烈表达，但在例如骨髓和淋巴谱系的分化后代中不表达，从而防止或减少敏感干细胞群中转基因的表达，同时保持靶细胞中的表达和治疗功效。
免疫调节
在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒载体或融合体包含升高的CD47。参见例如美国专利9,050,269，所述专利通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒载体或融合体包含升高的补体调节蛋白。参见例如ES2627445T3和US6790641，其各自通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒载体或融合体缺乏或包含降低水平的MHC蛋白，例如MHC-1 1类或II类。参见例如US20170165348，其通过引用整体并入本文。
有时逆转录病毒载体或融合体被受试者的免疫***识别。在包膜病毒载体颗粒(例如逆转录病毒载体颗粒)的情况下，展示在病毒包膜表面上的膜结合蛋白可以被识别，并且病毒颗粒本身可以被中和。此外，在感染靶细胞时，病毒包膜变得与细胞膜整合，并且因此病毒包膜蛋白可以展示在细胞表面上或保持与细胞表面紧密结合。因此，免疫***也可以靶向已感染病毒载体颗粒的细胞。这两种效应都可能导致通过病毒载体递送外源剂的效力降低。
病毒颗粒包膜通常来源于源细胞的膜。因此，在病毒颗粒从其出芽的细胞膜上表达的膜蛋白可以整合到病毒包膜中。
免疫调节蛋白CD47
细胞外物质向细胞内的内化通常是通过称为内吞作用的过程进行的(Rabinovitch,1995,Trends Cell Biol.5(3):85-7；Silverstein,1995,Trends CellBiol.5(3):141-2；Swanson等人,1995,Trends Cell Biol.5(3):89-93；Allen等人,1996,J.Exp.Med.184(2):627-37)。内吞作用可分为两大类：涉及颗粒摄取的吞噬作用以及涉及液体和溶质摄取的胞饮作用。
基于对缺乏膜受体CD47的基因敲除小鼠的研究，专职吞噬细胞已显示出能够区分非自身和自身(Oldenborg等人,2000,Science288(5473):2051-4)。CD47是Ig超家族中普遍存在的成员，它与巨噬细胞上发现的免疫抑制受体SIRPα(信号调节蛋白)相互作用(Fujioka等人,1996,Mol.Cell.Biol.16(12):6887-99；Veillette等人,1998,J.Biol.Chem.273(35):22719-28；Jiang等人,1999,J.Biol.Chem.274(2):559-62)。虽然CD47-SIRPα相互作用似乎使小鼠中的自体巨噬细胞失活，但是在一些Rh基因型的人血细胞上发现CD47的严重减少(可能90％)，这些Rh基因型几乎没有显示贫血的证据(Mouro-Chanteloup等人,2003,Blood 101(1):338-344)，并且也几乎没有显示与吞噬单核细胞的细胞相互作用增强的证据(Arndt等人,2004,Br.J.Haematol.125(3):412-4)。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体(例如，半径小于约1μm、小于约400nm或小于约150nm的病毒颗粒)包含例如在逆转录病毒载体或融合体的暴露表面上的CD47的至少一个生物活性部分。在一些实施方案中，逆转录病毒载体(例如，慢病毒)或融合体包括脂质外壳。在实施方案中，逆转录病毒载体或融合体中生物活性CD47的量为约20-250、20-50、50-100、100-150、150-200或200-250个分子/μm2之间。在一些实施方案中，CD47是人CD47。
本文所述的方法可包括逃避吞噬细胞对颗粒的吞噬作用。所述方法可以包括在逆转录病毒载体或融合体中表达包含CD47的至少一个生物活性部分的至少一种肽，使得当包含CD47的逆转录病毒载体或融合体暴露于吞噬细胞时，病毒颗粒逃避吞噬细胞的吞噬作用，或者与其他方面类似的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体相比显示出降低的吞噬作用。在一些实施方案中，与其他方面类似的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体相比，逆转录病毒载体或融合体在受试者中的半衰期被延长。
MHC缺失
主要组织相容性复合物I类(MHC-I)是宿主细胞膜蛋白，其可以被整合到病毒包膜中，并且由于其在本质上是高度多态的，所以它是机体免疫反应的主要靶标(McDevittH.O.(2000)Annu.Rev.Immunol.18:1-17)。在载体出芽过程期间，暴露在源细胞的质膜上的MHC-I分子可以整合到病毒颗粒包膜中。这些来源于源细胞并整合到病毒颗粒中的MHC-I分子可以依次转移到靶细胞的质膜上。或者，由于病毒颗粒吸收并保持与靶细胞膜结合的趋势，MHC-I分子可以保持与靶细胞膜紧密结合。
在转导细胞的质膜上或附近存在外源性MHC-I分子可以在受试者中引发同种异体的反应性免疫反应。在离体基因转移后随后向受试者施用转导细胞或者在体内直接施用病毒颗粒后，这可能导致免疫介导的转导细胞的杀伤或吞噬。此外，在将携带MHC-I的病毒颗粒体内施用到血流中的情况下，病毒颗粒可以在到达它们的靶细胞之前被预先存在的MHC-I特异性抗体中和。
因此，在一些实施方案中，源细胞被修饰(例如，基因工程化)以降低细胞表面上MHC-I的表达。在实施方案中，来源包括编码β2-微球蛋白(β2M)的基因的基因工程化破坏。在实施方案中，源细胞包含编码MHC-Iα链的一个或多个基因的基因工程化破坏。所述细胞可包含编码β2-微球蛋白基因的所有拷贝的基因工程化破坏。所述细胞可包含编码MHC-Iα链的基因的所有拷贝的基因工程化破坏。所述细胞可包含编码β2-微球蛋白的基因的基因工程化破坏和编码MHC-Iα链的基因的基因工程化破坏。在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包含数量减少的表面暴露的MHC-I分子。可以减少表面暴露的MHC-I分子的数量，使得对MHC-I的免疫反应降低到治疗相关性程度。在一些实施方案中，包膜病毒载体颗粒基本上不含表面暴露的MHC-I分子。
HLA-G/E过表达
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体在其包膜上展示致耐受性蛋白，例如ILT-2或ILT-4激动剂，例如HLA-E或HLA-G或任何其他ILT-2或ILT-4激动剂。在一些实施方案中，与参考逆转录病毒(例如其他方面类似于逆转录病毒的未经修饰的逆转录病毒)相比，逆转录病毒载体或融合体增加了HLA-E、HLA-G、ILT-2或ILT-4的表达。
在一些实施方案中，逆转录病毒组合物与未经修饰的逆转录病毒相比具有降低的MHC I类，并且与未经修饰的逆转录病毒相比具有增加的HLA-G。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒(例如其他方面类似于逆转录病毒的未经修饰的逆转录病毒)相比，逆转录病毒载体或融合体具有HLA-G或HLA-E表达的增加，例如HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中HLA-G或HLA-E的表达使用流式细胞术例如FACS在体外测定。
在一些实施方案中，HLA-G表达增加的逆转录病毒表现出降低的免疫原性，例如如在畸胎瘤形成测定中通过降低的免疫细胞浸润来测量。
补体调节蛋白
补体活性通常由许多补体调节蛋白(CRP)控制。这些蛋白质防止假性炎症和宿主组织损伤。一组蛋白质，包括CD55/衰变加速因子(DAF)和CD46/膜辅因子蛋白(MCP)，抑制经典和替代途径C3/C5转化酶。包括CD59在内的另一组蛋白质调节MAC组装。CRP已用于预防异种移植组织的排斥反应，并已显示能保护病毒和病毒载体免于补体失活。
膜驻留补体控制因子包括例如衰变加速因子(DAF)或CD55、因子H(FH)-样蛋白-1(FHL-1)、C4b-结合蛋白(C4BP)、补体受体1(CD35)、膜辅因子蛋白(MCP)或CD46和CD59(保护蛋白)(例如，防止膜攻击复合物(MAC)形成并保护细胞免于裂解)。
白蛋白结合蛋白
在一些实施方案中，慢病毒结合白蛋白。在一些实施方案中，慢病毒包含在其表面上的结合白蛋白的蛋白质。在一些实施方案中，慢病毒包含在其表面上的白蛋白结合蛋白。在一些实施方案中，白蛋白结合蛋白是链球菌白蛋白结合蛋白。在一些实施方案中，白蛋白结合蛋白是链球菌白蛋白结合结构域。
非融合剂蛋白在慢病毒包膜上的表达
在一些实施方案中，慢病毒被工程化以包含在其表面上的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质影响与受试者的免疫相互作用。在一些实施方案中，蛋白质影响受试者中慢病毒的药理学。在一些实施方案中，蛋白质是受体。在一些实施方案中，蛋白质是激动剂。在一些实施方案中，蛋白质是信号传导分子。在一些实施方案中，慢病毒表面上的蛋白质包含抗CD3抗体(例如，OKT3)或IL7。
在一些实施方案中，促有丝***跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白存在于源细胞中，当逆转录病毒从源细胞膜出芽时，所述促有丝***跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白可被整合到逆转录病毒中。促有丝***跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白可以在源细胞上作为独立的细胞表面分子表达，而不是作为病毒包膜糖蛋白的一部分表达。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物基本上是非免疫原性的。免疫原性可以被定量，例如，如本文所述。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体与靶细胞融合产生受体细胞。在一些实施方案中，评估已融合到一种或多种逆转录病毒载体或融合体的受体细胞的免疫原性。在实施方案中，例如通过用抗IgM抗体染色，分析受体细胞的细胞表面上抗体的存在。在其他实施方案中，免疫原性是通过PBMC细胞裂解测定来评估。在实施方案中，将受体细胞与外周血单核细胞(PBMC)一起孵育，然后评估PBMC对细胞的裂解。在其他实施方案中，免疫原性是通过自然杀伤(NK)细胞裂解测定来评估。在实施方案中，将受体细胞与NK细胞一起孵育，然后评估NK细胞对细胞的裂解。在其他实施方案中，免疫原性是通过CD8+T细胞裂解测定来评估。在实施方案中，将受体细胞与CD8+T细胞一起孵育，然后评估CD8+T细胞对细胞的裂解。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，由其他方面类似于源细胞的未经修饰的源细胞或HEK293细胞产生的逆转录病毒载体或融合体)相比，所述逆转录病毒载体或融合体包含升高水平的免疫抑制剂(例如，免疫抑制蛋白)。在一些实施方案中，升高的水平为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体包含参考细胞中不存在的免疫抑制剂。在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，从其他方面类似于源细胞的未经修饰的源细胞或HEK293细胞产生的逆转录病毒载体或融合体)相比，逆转录病毒载体或融合体包含降低水平的免疫刺激剂(例如，免疫刺激剂蛋白)。在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体相比，降低的水平为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一些实施方案中，免疫刺激剂基本上不存在于逆转录病毒载体或融合体中。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体或逆转录病毒载体或融合体所来源的源细胞具有以下特征中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种或更多种：
a.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的源细胞或HeLa细胞或HEK293细胞的逆转录病毒载体或融合体)相比，MHC I类或MHC II类的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低；
b.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞或HEK细胞或本文所述的参考细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，一种或多种共刺激蛋白的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低，所述共刺激蛋白包括但不限于：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达，例如通过本文所述的方法可检测的表达，例如与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、Jurkat细胞或HEK293细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达超过1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍；
d.可溶性免疫抑制性细胞因子(例如IL-10)的表达，例如通过本文所述的方法可检测的表达，例如与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞或HEK293细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，可溶性免疫抑制性细胞因子(例如IL-10)的表达超过1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍；
e.可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达，例如通过本文所述的方法可检测的表达，例如与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞或HEK293细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达超过1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍；
f.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，来自其他方面类似于源细胞的细胞或HEK293细胞或U-266细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，可溶性免疫刺激细胞因子(例如，IFN-γ或TNF-α)的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更少；
g.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，来自其他方面类似于源细胞的细胞或HEK293细胞或A549细胞或SK-BR-3细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，内源性免疫刺激性抗原(例如，Zg16或Hormad1)的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更少；
h.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，HLA-E或HLA-G的表达，例如通过本文所述的方法可检测的表达；
i.表面糖基化分布，其例如含有唾液酸，起到例如抑制NK细胞活化的作用；
j.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，TCRα/β的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更少；
k.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，ABO血型的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低；
l.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，次要组织相容性抗原(MHA)的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低；或者
m.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，具有少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的线粒体MHA或没有可检测的线粒体MHA。
在实施方案中，共刺激蛋白是4-1BB、B7、SLAM、LAG3、HVEM或LIGHT，并且参考细胞是HDLM-2。在一些实施方案中，共刺激蛋白是BY-H3，并且参考细胞是HeLa。在一些实施方案中，共刺激蛋白是ICOSL或B7-H4，并且参考细胞是SK-BR-3。在一些实施方案中，共刺激蛋白是ICOS或OX40，并且参考细胞是MOLT-4。在一些实施方案中，共刺激蛋白是CD28，并且参考细胞是U-266。在一些实施方案中，共刺激蛋白是CD30L或CD27，并且参考细胞是Daudi。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物基本上不引发免疫***(例如先天免疫***)的免疫原性反应。在实施方案中，免疫原性反应可以被定量，例如，如本文所述。在一些实施方案中，先天免疫***的免疫原性反应包括先天免疫细胞的反应，所述先天免疫细胞包括但不限于NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞、肥大细胞或γ/δT细胞。在一些实施方案中，先天免疫***的免疫原性反应包括补体***的反应，所述补体***包括可溶性血液组分和膜结合组分。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物基本上不引发免疫***(例如适应性免疫***)的免疫原性反应。在一些实施方案中，适应性免疫***的免疫原性反应包括适应性免疫细胞的免疫原性反应，包括但不限于T淋巴细胞(例如，CD4T细胞、CD8T细胞和或γ-δT细胞)或B淋巴细胞的数量或活性的改变，例如增加。在一些实施方案中，适应性免疫***的免疫原性反应包括可溶性血液组分水平的增加，包括但不限于细胞因子或抗体(例如，IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)的数量或活性的改变，例如增加。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物被修饰以具有降低的免疫原性。在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体、融合体或药物组合物的免疫原性比参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)的免疫原性低5％、10％、20％、30％、40％或50％。
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其具有经修饰的基因组，例如使用本文所述的方法进行修饰，以降低例如减轻免疫原性。免疫原性可以被定量，例如，如本文所述。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物来源于缺失(例如敲除)以下一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种的哺乳动物细胞：
a.MHC I类、MHC II类或MHA；
b.一种或多种共刺激蛋白，包括但不限于：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.可溶性免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ或TNF-α；
d.内源性免疫刺激抗原，例如Zg16或Hormad1；
e.T细胞受体(TCR)；
f.编码ABO血型的基因，例如ABO基因；
g.驱动免疫激活的转录因子，例如NFkB；
h.控制MHC表达的转录因子，例如II类反式激活因子(CIITA)、Xbox 5调节因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复序列(RFXANK；又称为RFXB)；或者
i.降低MHC I类表达的TAP蛋白，例如TAP2、TAP1或TAPBP。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体来源于具有导致免疫抑制剂表达增加的遗传修饰的源细胞，所述免疫抑制剂例如以下一种、两种、三种或更多种(例如，其中在遗传修饰之前，细胞不表达所述因子)：
a.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白，例如CD47；例如与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，CD47的表达增加；
b.可溶性免疫抑制细胞因子，例如IL-10，例如与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，IL-10的表达增加；
c.可溶性免疫抑制蛋白，例如PD-1、PD-L1、CTLA4或BTLA；例如与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，免疫抑制蛋白的表达增加；
d.致耐受性蛋白，例如ILT-2或ILT-4激动剂，例如HLA-E或HLA-G或任何其他内源性ILT-2或ILT-4激动剂，例如与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，HLA-E、HLA-G、ILT-2或ILT-4的表达增加；或者
e.抑制补体活性的表面蛋白，例如补体调节蛋白，例如结合衰变加速因子(DAF，CD55)的蛋白，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b-结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白(MCP，CD46)，例如Profectin(CD59)，例如抑制经典和替代补体途径CD/C5转化酶的蛋白质，例如调节MAC组装的蛋白质；例如与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，补体调节蛋白的表达增加。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体相比，增加的表达水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体来源于经修饰以降低免疫刺激剂表达的源细胞，例如以下一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或多种：
a.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，MHC I类或MHC II类的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低；
b.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或本文所述的参考细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，一种或多种共刺激蛋白的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低，所述共刺激蛋白包括但不限于：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或U-266细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，可溶性免疫刺激细胞因子(例如，IFN-γ或TNF-α)的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低；
d.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或A549细胞或SK-BR-3细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，内源性免疫刺激性抗原(例如，Zg16或Hormad1)的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低；
e.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，T细胞受体(TCR)的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低；
f.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，ABO血型的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低；
g.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，驱动免疫激活的转录因子(例如NFkB)的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低
h.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或Jurkat细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，控制MHC表达的转录因子的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低，所述转录因子例如II类反式激活因子(CIITA)、Xbox 5调节因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复序列(RFXANK；也称为RFXB)；或者
i.与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，来自其他方面类似于源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，降低MHC I类表达的TAP蛋白(例如TAP2、TAP1或TAPBP)的表达低于50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更低。
在一些实施方案中，与未经修饰的逆转录病毒载体或融合体(例如来自未经修饰的细胞(例如间充质干细胞)的逆转录病毒载体或融合体)相比，来源于用表达shRNA的慢病毒修饰以降低MHC I类表达的哺乳动物细胞(例如HEK293)的逆转录病毒载体、融合体或药物组合物具有较低的MHC I类表达。在一些实施方案中，与未经修饰的逆转录病毒载体或融合体(例如来自未经修饰的细胞(例如HEK293)的逆转录病毒载体或融合体)相比，来源于用表达HLA-G的慢病毒修饰以增加HLA-G表达的哺乳动物细胞(例如HEK293)的逆转录病毒载体或融合体增加了HLA-G的表达。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物来源于基本上无免疫原性的源细胞，例如哺乳动物细胞，其中源细胞以0pg/mL至>0pg/mL的水平刺激(例如诱导)T细胞IFN-γ分泌，例如通过IFN-γELISPOT测定法在体外所测定。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞来自用免疫抑制剂处理的细胞培养物，所述免疫抑制剂例如糖皮质激素(例如***)、细胞抑制剂(例如甲氨蝶呤)、抗体(例如莫罗单抗(Muromonab)(OKT3)-CD3)或亲免素调节剂(例如环孢素或雷帕霉素)。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞包含外源剂，例如治疗剂。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是重组细胞。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体、融合体或药物来源于经基因修饰以表达病毒免疫逃逸素(immunoevasin)(例如hCMV US2或US11)的哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体或融合体的表面或源细胞的表面用聚合物(例如降低免疫原性和免疫介导的清除的生物相容性聚合物，例如PEG)共价或非共价修饰。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体或融合体的表面或源细胞的表面用含有NK抑制性聚糖表位的唾液酸(例如含有糖聚合物的唾液酸)共价或非共价修饰。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体或融合体的表面或源细胞的表面例如用糖苷酶(例如α-N-乙酰半乳糖胺酶)酶促处理，以去除ABO血型。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体的表面或源细胞的表面被酶促处理，以产生(例如诱导)与受体血型匹配的ABO血型的表达。
用于评估免疫原性的参数
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体来源于源细胞，例如基本上无免疫原性或被修饰(例如使用本文所述的方法修饰)以降低免疫原性的哺乳动物细胞。源细胞和逆转录病毒载体或融合体的免疫原性可以通过本文所述的任何测定来确定。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，来自其他方面类似于源细胞的细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，逆转录病毒载体或融合体的体内移植物存活率增加，例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施方案中，如通过与将参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)一次或多次植入合适的动物模型(例如本文所述的动物模型)后的体液反应相比，将逆转录病毒载体或融合体一次或多次植入合适的动物模型(例如本文所述的动物模型)后的体液反应降低所测量的，所述逆转录病毒载体或融合体具有降低的免疫原性。在一些实施方案中，通过例如通过ELISA获得的抗细胞抗体滴度，例如抗逆转录病毒或抗融合体抗体滴度来测量血清样品中的体液反应降低。在一些实施方案中，与施用来自未经修饰的逆转录病毒载体或融合体的动物的血清样品相比，来自施用逆转录病毒载体或融合体的动物的血清样品的抗逆转录病毒或抗融合体抗体滴度降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，来自施用逆转录病毒载体或融合体的动物的血清样品具有增加的抗逆转录病毒或抗融合体抗体滴度，例如相对于基线增加1％、2％、5％、10％、20％、30％或40％，例如其中所述基线是指来自施用逆转录病毒载体或融合体之前的相同动物的血清样品。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，逆转录病毒载体或融合体的巨噬细胞吞噬作用降低，例如巨噬细胞吞噬作用降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中巨噬细胞吞噬作用降低通过体外测定吞噬指数来确定。在一些实施方案中，当在巨噬细胞吞噬作用的体外测定中与巨噬细胞一起孵育时，逆转录病毒载体或融合体具有0、1、10、100或更高的吞噬指数。
在一些实施方案中，与参考细胞(例如其他方面类似于源细胞的未经修饰的细胞、或接受未经修饰的逆转录病毒载体或融合体的受体细胞、或间充质干细胞)相比，源细胞或受体细胞的由PBMC进行的细胞毒性介导的细胞裂解减少，例如细胞裂解减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在实施方案中，源细胞表达外源HLA-G。
在一些实施方案中，与参考细胞(例如，在其他方面类似于源细胞的未经修饰的细胞或接受未经修饰的逆转录病毒载体或融合体的受体细胞)相比，源细胞或受体细胞的NK介导的细胞裂解减少，例如NK介导的细胞裂解减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中NK介导的细胞裂解在体外通过铬释放测定或铕释放测定进行测定。
在一些实施方案中，与参考细胞(例如其他方面类似于源细胞的未经修饰的细胞或接受未经修饰的逆转录病毒载体或融合体的受体细胞)相比，源细胞或受体细胞的CD8+T细胞介导的细胞裂解减少，例如CD8T细胞介导的细胞裂解减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中在体外测定了CD8T细胞介导的细胞裂解。
在一些实施方案中，与参考细胞(例如其他方面类似于源细胞的未经修饰的细胞或接受未经修饰的逆转录病毒载体或融合体的受体细胞)相比，源细胞或受体细胞的CD4+T细胞增殖和/或活化减少，例如减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中在体外测定CD4T细胞增殖(例如经修饰或未经修饰的哺乳动物源细胞和CD4+T细胞与CD3/CD28免疫磁珠(Dynabeads)的共培养测定)。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，来自其他方面类似于源细胞的细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，逆转录病毒载体或融合体导致T细胞IFN-γ分泌减少，例如T细胞IFN-γ分泌减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中例如通过IFN-γELISPOT测定在体外测定T细胞IFN-γ分泌。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，逆转录病毒载体或融合体导致免疫原性细胞因子的分泌减少，例如免疫原性细胞因子的分泌减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中免疫原性细胞因子的分泌使用ELISA或ELISPOT在体外测定。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如，来自其他方面类似于源细胞的细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，逆转录病毒载体或融合体导致免疫抑制细胞因子的分泌增加，例如免疫抑制细胞因子的分泌增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中免疫抑制细胞因子的分泌使用ELISA或ELISPOT在体外测定。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，逆转录病毒载体或融合体具有HLA-G或HLA-E表达的增加，例如HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中HLA-G或HLA-E的表达使用流式细胞术例如FACS在体外测定。在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体来源于源细胞，所述源细胞经修饰以与未经修饰的细胞相比具有增加的HLA-G或HLA-E表达，例如HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中HLA-G或HLA-E的表达使用流式细胞术(例如FACS)在体外测定。在一些实施方案中，来源于HLA-G表达增加的经修饰的细胞的逆转录病毒载体或融合体表现出降低的免疫原性。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，所述逆转录病毒载体或融合体具有或导致T细胞抑制剂配体(例如CTLA4、PD1、PD-L1)的表达增加，例如T细胞抑制剂配体的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中T细胞抑制剂配体的表达使用流式细胞术(例如FACS)在体外测定。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，逆转录病毒载体或融合体具有共刺激配体的表达降低，例如共刺激配体的表达降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中共刺激配体的表达使用流式细胞术(例如FACS)在体外测定。
在一些实施方案中，与参考逆转录病毒载体或融合体(例如来自其他方面类似于源细胞的细胞或HeLa细胞的未经修饰的逆转录病毒载体或融合体)相比，逆转录病毒载体或融合体具有MHC I类或MHC II类表达的降低，例如MHC I类或MHC II类的表达降低1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中MHC I类或MHC II类的表达使用流式细胞术(例如FACS)在体外测定。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体或融合体来源于基本上无免疫原性的细胞来源，例如哺乳动物细胞来源。在一些实施方案中，例如，如本文所述，免疫原性可被定量。在一些实施方案中，哺乳动物细胞来源包含以下特征中的任一者、全部或组合：
a.其中所述源细胞获自自体细胞来源；例如从将接受(例如施用)逆转录病毒载体或融合体的受体获得的细胞；
b.其中所述源细胞获自同种异体细胞来源，所述同种异体细胞来源与将接受(例如施用)逆转录病毒载体或融合体的受体(例如本文所述的受体)具有匹配的(例如相似的)性别；
c.其中所述源细胞获自同种异体细胞来源，所述同种异体细胞来源是例如在一个或多个等位基因处与受体的HLA匹配的HLA；
d.其中所述源细胞获自同种异体细胞来源，所述同种异体细胞来源是HLA纯合子；
e.其中所述源细胞获自缺乏(或与参考细胞相比具有降低的水平的)MHC I类和II类的同种异体细胞来源；或者
f.其中所述源细胞获自已知基本上无免疫原性的细胞来源，包括但不限于干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、支持细胞(sertoli cell)或视网膜色素上皮细胞。
在一些实施方案中，待施用逆转录病毒载体或融合体的受试者具有或已知具有与逆转录病毒载体或融合体反应的预先存在的抗体(例如，IgG或IgM)或被针对所述抗体进行测试。在一些实施方案中，待施用逆转录病毒载体或融合体的受试者不具有可检测水平的与逆转录病毒载体或融合体反应的预先存在的抗体。描述了抗体的测试。
在一些实施方案中，已接受逆转录病毒载体或融合体的受试者具有或已知具有与逆转录病毒载体或融合体反应的抗体(例如，IgG或IgM)或被针对所述抗体进行测试。在一些实施方案中，接受逆转录病毒载体或融合体(例如，至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次)的受试者不具有可检测水平的与逆转录病毒载体或融合体反应的抗体。在实施方案中，两个时间点之间，抗体水平升高不超过1％、2％、5％、10％、20％或50％，第一时间点是在第一次施用逆转录病毒载体或融合体之前，并且第二时间点是在一次或多次施用逆转录病毒载体或融合体之后。描述了抗体的测试。
外源剂
在一些实施方案中，本文所述的逆转录病毒载体、融合体或药物组合物编码外源剂。
在实施方案中，外源剂是相对于源细胞为外源的货物(下文中也称为“剂”或“有效载荷”)。在一些实施方案中，所述外源剂是蛋白质或核酸(例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA(例如mRNA或miRNA))。在一些实施方案中，所述外源剂是编码蛋白质的核酸。所述蛋白质可以是靶向递送至靶细胞所需的任何蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，所述蛋白质是由疾病或疾患表达或与疾病或疾患相关的用于靶向细胞的抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。提及编码蛋白质的核酸的编码序列在本文中也称为有效负载基因。在一些实施方案中，外源剂或编码外源剂的核酸存在于融合体的内腔中。
在一些实施方案中，所述外源剂或货物包含或编码胞质蛋白。在一些实施方案中，所述外源剂或货物包含或编码膜蛋白。在一些实施方案中，所述外源剂或货物包含或编码治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂选自一种或多种蛋白质，例如酶、跨膜蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。
在实施方案中，所述外源剂以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝存在。在实施方案中，融合体具有改变的(例如增加的或降低的)水平的一种或多种内源性分子，例如蛋白质或核酸(例如，在一些实施方案中，相对于源细胞是内源的，并且在一些实施方案中，相对于靶细胞是内源的)，所述改变例如是由于用siRNA或基因编辑酶处理源细胞，例如哺乳动物源细胞。在实施方案中，所述内源分子以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝存在。在实施方案中，所述内源分子(例如RNA或蛋白质)以比其在源细胞中的浓度大至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0x103、104、5.0x104、105、5.0x105、106、5.0x106、1.0x107、5.0x107或1.0x108的浓度存在。在实施方案中，所述内源分子(例如RNA或蛋白质)以比其在源细胞中的浓度小至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0x103、104、5.0x104、105、5.0x105、106、5.0x106、1.0x107、5.0x107或1.0x108的浓度存在。
在一些实施方案中，融合体向靶细胞递送至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％由融合体所包含的货物(例如，治疗剂，例如，外源治疗剂)。在一些实施方案中，与靶细胞融合的融合体向靶细胞递送平均至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％由与靶细胞融合的融合体所包含的货物(例如治疗剂，例如外源性治疗剂)。在一些实施方案中，融合体组合物向靶组织递送至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％由融合体组合物所包含的货物(例如治疗剂，例如外源性治疗剂)。
在一些实施方案中，所述外源剂或货物在靶向脂质颗粒所来源的细胞中不天然表达。在一些实施方案中，所述外源剂或货物在靶向脂质颗粒所来源的细胞中天然表达。在一些实施方案中，通过在融合体所来源的细胞中的表达(例如，通过转染、转导或电穿孔引入的DNA或mRNA的表达)，将外源剂或货物装载到靶向脂质颗粒中。在一些实施方案中，所述外源剂或货物由整合到基因组中的DNA表达或保持游离状态。在一些实施方案中，所述外源剂或货物的表达是组成型的。在一些实施方案中，所述外源剂或货物的表达是诱导型的。在一些实施方案中，紧接在产生所述靶向脂质颗粒之前诱导所述外源剂或货物的表达。在一些实施方案中，在融合剂表达的同时诱导所述外源剂或货物的表达。
在一些实施方案中，通过电穿孔将外源剂或货物装载到融合体本身或融合体所来源的细胞中。在一些实施方案中，通过转染(例如，编码货物的DNA或mRNA)到融合体本身或融合体所来源的细胞中，将外源剂或货物装载到脂质颗粒中。
示例性外源剂
在一些实施方案中，所述外源剂包含胞质蛋白，例如在受体细胞中产生并定位于受体细胞的细胞质的蛋白质。在一些实施方案中，所述外源剂包含分泌蛋白，例如由受体细胞产生和分泌的蛋白质。在一些实施方案中，所述外源剂包含核蛋白，例如在受体细胞中产生并被输入受体细胞的细胞核的蛋白质。在一些实施方案中，所述外源剂包含细胞器蛋白(例如线粒体蛋白)，例如在受体细胞中产生并被输入受体细胞的细胞器(例如线粒体)中的蛋白质。
在一些实施方案中，外源剂包含核酸，例如RNA、内含子、外显子、mRNA(信使RNA)、tRNA(转移RNA)、经修饰的RNA、微RNA、siRNA(小干扰RNA)、tmRNA(转移信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mtRNA(线粒体RNA)、snRNA(小核RNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA(mRNA反式剪接RNA)、gRNA(指导RNA)、TERC(端粒酶RNA组分)、aRNA(反义RNA)、顺式-NAT(顺式天然反义转录物)、CRISPR RNA(crRNA)、lncRNA(长非编码RNA)、piRNA(piwi-相互作用RNA)、shRNA(短发夹RNA)、tasiRNA(反式作用siRNA)、eRNA(增强子RNA)、卫星RNA、pcRNA(蛋白质编码RNA)、dsRNA(双链RNA)、RNAi(干扰RNA)、circRNA(环状RNA)、重编程RNA、适体及其任何组合。在一些实施方案中，核酸是野生型核酸或突变核酸。在一些实施方案中，所述核酸是多个核酸序列的融合物或嵌合体。
在一些实施方案中，所述外源剂包含多肽，例如酶、结构多肽、信号传导多肽、调节多肽、转运多肽、感觉多肽、运动多肽、防御多肽、贮存多肽、转录因子、抗体、细胞因子、激素、分解代谢多肽、合成代谢多肽、蛋白水解多肽、代谢多肽、激酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、酶调节多肽、蛋白结合多肽、脂质结合多肽、膜融合多肽、细胞分化多肽、表观遗传多肽、细胞死亡多肽、核转运多肽、核酸结合多肽、重编程多肽、DNA编辑多肽、DNA修复多肽、DNA重组多肽、转座酶多肽、DNA整合多肽、靶向核酸内切酶(例如锌指核酸酶、转录激活物样核酸酶(TALEN)、cas9及其同源物)、重组酶以及它们的任何组合。在一些实施方案中，所述蛋白质靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施方案中，所述蛋白质靶向细胞中的蛋白质以通过将蛋白质定位到蛋白酶体而进行降解。在一些实施方案中，所述蛋白质是野生型蛋白质或突变蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是融合蛋白或嵌合蛋白。
在一些实施方案中，所述外源剂或货物可包括一种或多种核酸序列、一种或多种多肽、核酸序列和/或多肽的组合、一种或多种细胞器以及它们的任何组合。在一些实施方案中，所述外源剂或货物可包括一种或多种细胞组分。在一些实施方案中，所述外源剂或货物包括一种或多种胞质和/或核组分。
在一些实施方案中，所述外源剂或货物包括核酸，例如DNA、nDNA(核DNA)、mtDNA(线粒体DNA)、编码蛋白质的DNA、基因、操纵子、染色体、基因组、转座子、反转录转座子、病毒基因组、内含子、外显子、经修饰的DNA、mRNA(信使RNA)、tRNA(转移RNA)、经修饰的RNA、微RNA、siRNA(小干扰RNA)、tmRNA(转移信使RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mtRNA(线粒体RNA)、snRNA(小核RNA)、小核仁RNA(snoRNA)、SmY RNA(mRNA反式剪接RNA)、gRNA(向导RNA)、TERC(端粒酶RNA组分)、aRNA(反义RNA)、顺式-NAT(顺式-天然反义转录物)、CRISPR RNA(crRNA)、IncRNA(长非编码RNA)、piRNA(piwi相互作用RNA)、shRNA(短发夹RNA)、tasiRNA(反式作用siRNA)、eRNA(增强子RNA)、卫星RNA、pcRNA(编码蛋白质的RNA)、dsRNA(双链RNA)、RNAi(干扰RNA)、circRNA(环状RNA)、重编程RNA、适体以及它们的任何组合。在一些实施方案中，所述核酸是野生型核酸。在一些实施方案中，所述蛋白质是突变体核酸。在一些实施方案中，所述核酸是多个核酸序列的融合物或嵌合体。
在一些实施方案中，所述外源剂或货物可包括核酸。例如，所述外源剂或货物可包含增强内源蛋白表达的RNA，或抑制内源蛋白的蛋白质表达的siRNA或miRNA。例如，所述内源蛋白可以调节在靶细胞中的结构或功能。在一些实施方案中，所述货物可包含编码调节在靶细胞中的结构或功能的工程化蛋白质的核酸。在一些实施方案中，所述外源剂或货物是靶向调节在靶细胞中的结构或功能的转录激活因子的核酸。
在一些实施方案中，所述外源剂或货物是或编码多肽，例如酶、结构多肽、信号传导多肽、调节多肽、转运多肽、感觉多肽、运动多肽、防御多肽、贮存多肽、转录因子、抗体、细胞因子、激素、分解代谢多肽、合成代谢多肽、蛋白水解多肽、代谢多肽、激酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶、酶调节多肽、蛋白结合多肽、脂质结合多肽、膜融合多肽、细胞分化多肽、表观遗传多肽、细胞死亡多肽、核转运多肽、核酸结合多肽、重编程多肽、DNA编辑多肽、DNA修复多肽、DNA重组多肽、转座酶多肽、DNA整合多肽、靶向核酸内切酶(例如锌指核酸酶、转录激活物样核酸酶(TALEN)、cas9及其同源物)、重组酶以及它们的任何组合。在一些实施方案中，所述蛋白质靶向细胞中的蛋白质以进行降解。在一些实施方案中，所述蛋白质靶向细胞中的蛋白质以通过将蛋白质定位到蛋白酶体而进行降解。在一些实施方案中，所述蛋白质是野生型蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是突变蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是融合蛋白或嵌合蛋白。
在一些实施方案中，所述外源剂或货物是小分子，例如离子(例如Ca2+、C1-、Fe2+)、碳水化合物、脂质、活性氧物质、活性氮物质、类异戊二烯、信号传导分子、血红素、多肽辅因子、电子接受化合物、电子供给化合物、代谢物、配体以及它们的任何组合。在一些实施方案中，所述小分子是与细胞中的靶标相互作用的药物。在一些实施方案中，所述小分子靶向细胞中的蛋白质用于降解。在一些实施方案中，所述小分子靶向细胞中的蛋白质以通过将蛋白质定位到蛋白酶体而降解。在一些实施方案中，所述小分子是蛋白水解靶向嵌合体分子(PROTAC)。
在一些实施方案中，所述外源剂或货物包括蛋白质、核酸或代谢物的混合物，例如多种多肽、多种核酸、多种小分子；核酸、多肽和小分子的组合；核糖核蛋白复合物(例如Cas9-gRNA复合物)；多种转录因子、多种表观遗传因子、重编程因子(例如Oct4、Sox2、cMyc和Klf4)；多种调节RNA；以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，所述外源剂或货物包括一种或多种细胞器，例如线粒体(chondrisomes)、线粒体(mitochondria)、溶酶体、细胞核、细胞膜、细胞质、内质网、核糖体、液泡、内体、剪接体、聚合酶、衣壳、顶体、自体吞噬体、中心粒、糖体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素小体、纺锤剩体、肌原纤维、刺丝囊、过氧化物酶体、蛋白酶体、囊泡、应激颗粒、细胞器网络、以及它们的任何组合。
在一些实施方案中，所述外源剂是或编码胞质蛋白，例如在受体细胞中产生并定位于受体细胞的细胞质的蛋白质。在一些实施方案中，所述外源剂是或编码分泌蛋白，例如由受体细胞产生和分泌的蛋白质。在一些实施方案中，所述外源剂是或编码核蛋白，例如在受体细胞中产生并被输入受体细胞的细胞核的蛋白质。在一些实施方案中，所述外源剂是或编码细胞器蛋白(例如线粒体蛋白)，例如在受体细胞中产生并被输入受体细胞的细胞器(例如线粒体)中的蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是野生型蛋白质或突变蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是融合蛋白或嵌合蛋白。
在一些实施方案中，所述外源剂能够被递送至肝细胞或肝脏细胞。在一些实施方案中，可以递送所述外源剂或货物以治疗肝细胞或肝脏细胞中的疾病或病症。
在一些实施方案中，所述外源剂由选自以下的基因编码：OTC、CPS1、NAGS、BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD、MUT、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MCEE、PCCA、PCCB、UGT1A1、ASS1、PAH、PAL、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、IVD、GCDH、ETFA、ETFB、ETFDH、ASL、D2HGDH、HMGCL、MCCC1、MCCC2、ABCD4、HCFC1、LNBRD1、ARG1、SLC25A15、SLC25A13、ALAD、CPOX、HMBS、PPOX、BTD、HLCS、PC、SLC7A7、CPT2、ACADM、ACADS、ACADVL、AGL、G6PC、GBE1、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、SLC37A4、PMM2、CBS、FAH、TAT、GALT、GALK1、GALE、G6PD、SLC3A1、SLC7A9、MTHFR、MTR、MTRR、ATP7B、HPRT1、HJV、HAMP、JAG1、TTR、AGXT、LIPA、SERPING1、HSD17B4、UROD、HFE、LPL,GRHPR、HOGA1、LDLR、ACAD8、ACADSB、ACAT1、ACSF3、ASPA、AUH、DNAJC19、ETHE1、FBP1、FTCD、GSS、HIBCH、IDH2、L2HGDH、MLYCD、OPA3、OPLAH、OXCT1、POLG、PPM1K、SERAC1、SLC25A1、SUCLA2、SUCLG1、TAZ、AGK、CLPB、TMEM70、ALDH18A1、OAT、CA5A、GLUD1、GLUL、UMPS、SLC22A5、CPT1A、HADHA、HADH、SLC52A1、SLC52A2、SLC52A3、HADHB、GYS2、PYGL、SLC2A2、ALG1、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、ALG11、ALG12、ALG13、ATP6V0A2、B3GLCT、CHST14、COG1、COG2、COG4、COG5、COG6、COG7、COG8、DOLK、DHDDS、DPAGT1、DPM1、DPM2、DPM3、G6PC3、GFPT1、GMPPA、GMPPB、MAGT1、MAN1B1、MGAT2、MOGS、MPDU1、MPI、NGLY1、PGM1、PGM3、RFT1、SEC23B、SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SSR4、SRD5A3、TMEM165、TRIP11、TUSC3、ALG14、B4GALT1、DDOST、NUS1、RPN2、SEC23A、SLC35A3、ST3GAL3、STT3A、STT3B、AGA、ARSA、ARSB、ASAH1、ATP13A2、CLN3、CLN5、CLN6、CLN8、CTNS、CTSA、CTSD、CTSF、CTSK、DNAJC5、FUCA1、GAA、GALC、GALNS、GLA、GLB1、GM2A、GNPTAB、GNPTG、GNS、GRN、GUSB、HEXA、HEXB、HGSNAT、HYAL1、IDS、IDUA、KCTD7、LAMP2、MAN2B1、MANBA、MCOLN1、MFSD8、NAGA、NAGLU、NEU1、NPC1、NPC2、SGSH、PPT1、PSAP、SLC17A5、SMPD1、SUMF1、TPP1、AHCY、GNMT、MAT1A、GCH1、PCBD1、PTS、QDPR、SPR、DNAJC12、ALDH4A1、PRODH、HPD、GBA、HGD、AMN、CD320、CUBN、GIF、TCN1、TCN2、PREPL、PHGDH、PSAT1、PSPH、AMT,GCSH、GLDC、LIAS、NFU1、SLC6A9、SLC2A1、ATP7A、AP1S1、CP、SLC33A1、PEX7、PHYH、AGPS、GNPAT、ABCD1、ACOX1、PEX1、PEX2、PEX3、PEX5、PEX6、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、PEX26、AMACR、ADA、ADSL、AMPD1、GPHN、MOCOS、MOCS1、PNP、XDH、SUOX、OGDH、SLC25A19、DHTKD1、SLC13A5、FH、DLAT、MPC1、PDHA1、PDHB、PDHX、PDP1、ABCC2、SLCO1B1、SLCO1B3、HFE2、ADAMTS13、PYGM、COL1A2、TNFRSF11B、TSC1、TSC2、DHCR7、PGK1、VLDLR、KYNU、F5、C3、COL4A1、CFH、SLC12A2、GK、SFTPC、CRTAP、P3H1、COL7A1、PKLR、TALDO1、TF、EPCAM、VHL、GC、SERPINA1、ABCC6、F8、F9、ApoB、PCSK9、LDLRAP1、ABCG5、ABCG8、LCAT、SPINK5或GNE。
在一些实施方案中，所述外源剂由选自以下的基因编码：OTC、CPS1、NAGS、BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD、MUT、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MCEE、PCCA、PCCB、UGT1A1、ASS1、PAL、PAH、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、IVD、GCDH、ETFA、ETFB、ETFDH、ASL、D2HGDH、HMGCL、MCCC1、MCCC2、ABCD4、HCFC1、LMBRD1、ARG1、SLC25A15、SLC25A13、ALAD、CPOX、HMBS、PPOX、BTD、HLCS、PC、SLC7A7、CPT2、ACADM、ACADS、ACADVL、AGL、G6PC、GBE1、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、SLC37A4、PMM2、CBS、FAH、TAT、GALT、GALK1、GALE、G6PD、SLC3A1、SLC7A9、MTHFR、MTR、MTRR、ATP7B、HPRT1、HJV、HAMP、JAG1、TTR、AGXT、LIPA、SERPING1、HSD17B4、UROD、HFE、LPL、GRHPR、HOGA1或LDLR。在一些实施方案中，所述外源剂是酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)。
在一些实施方案中，外源剂或货物可以被递送以治疗表5A中列出的疾病或适应症。在一些实施方案中，所述适应症对肝脏细胞或肝细胞具有特异性。
在一些实施方案中，外源货物包含下表5A的蛋白质。在一些实施方案中，外源剂包含表5A中任何蛋白质的野生型人序列、其功能片段(例如，其酶活性片段)或其功能变体。在一些实施方案中，外源剂包含与表5A的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码外源剂的有效载荷基因编码与表5A的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码外源剂的有效载荷基因具有与表5A的核酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
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在一些实施方案中，外源货物包含OTC蛋白。在一些实施方案中，外源剂包含野生型人OTC序列、其功能片段(例如，其酶活性片段)或其功能变体。在一些实施方案中，外源剂包含与SEQ ID NO 23具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码外源剂的有效载荷基因编码与SEQ IDNO.23具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码外源剂的有效载荷基因具有与SEQ ID NO.23具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，外源货物包含LDLR蛋白。在一些实施方案中，外源剂包含野生型人LDLR序列、其功能片段(例如，其酶活性片段)或其功能变体。在一些实施方案中，外源剂包含与SEQ ID NO 24具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码外源剂的有效载荷基因编码与SEQ IDNO.24具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码外源剂的有效载荷基因具有与SEQ ID NO.24具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，融合体或慢病毒载体含有能够靶向T细胞的外源剂。在一些实施方案中，所述能够靶向T细胞的外源剂是嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体、整联蛋白、离子通道、成孔蛋白、Toll样受体、白介素受体、细胞粘附蛋白或转运蛋白。
在一些实施方案中，所述CAR是或包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域(例如，一个、两个或三个信号传导结构域)的第一代CAR。在一些实施方案中，所述CAR包含含有抗原结合结构域、跨膜结构域和至少三个信号传导结构域的第三代CAR。在一些实施方案中，***CAR包含抗原结合结构域、跨膜结构域、三个或四个信号传导结构域和在CAR成功信号传导时诱导细胞因子基因表达的结构域。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。
在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域是或包含scFv或Fab。在一些实施方案中，CAR抗原结合结构域包含以下的scFv或Fab片段：T细胞α链抗体；T细胞β链抗体；T细胞γ链抗体；T-细胞δ链抗体；CCR7抗体；CD3抗体；CD4抗体；CD5抗体；CD7抗体；CD8抗体；CD11b抗体；CD11c抗体；CD16抗体；CD19抗体；CD20抗体；CD21抗体；CD22抗体；CD25抗体；CD28抗体；CD34抗体；CD35抗体；CD40抗体；CD45RA抗体；CD45RO抗体；CD52抗体；CD56抗体；CD62L抗体；CD68抗体；CD80抗体；CD95抗体；CD117抗体；CD127抗体；CD133抗体；CD137(4-1BB)抗体；CD163抗体；F4/80抗体；IL-4Ra抗体；Sca-1抗体；CTLA-4抗体；GITR抗体GARP抗体；LAP抗体；粒酶B抗体；LFA-1抗体；MR1抗体；uPAR抗体；或运铁蛋白受体抗体。
在一些实施方案中，CAR结合结构域与细胞的细胞表面抗原结合。在一些实施方案中，细胞表面抗原是一种类型的细胞的特征。在一些实施方案中，细胞表面抗原是多于一种类型的细胞的特征。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域靶向表征T细胞的抗原。在一些实施方案中，所述表征T细胞的抗原选自表征T细胞的细胞表面受体、膜转运蛋白(例如，主动或被动转运蛋白，例如离子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受体、膜酶和/或细胞粘附蛋白。在一些实施方案中，表征T细胞的抗原可以是G蛋白偶联受体、受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶相关受体、受体样酪氨酸磷酸酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、组氨酸激酶相关受体、AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D(CD3δ)、CD3E(CD3ε)、CD3G(CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)、CD247(CD3ζ)、CTLA4(CD152)、ELK1、ERK1(MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2(GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA(CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG(NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MKK3)、MAP2K4(MKK4)、MAP2K6(MKK6)、MAP2K7(MKK7)、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14(NIK)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(p38β)、MAPK12(p38γ)、MAPK13(p38δ)、MAPK14(p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3(VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1(穿孔素)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。
在一些实施方案中，CAR的抗原结合结构域靶向表征疾病的抗原。在一些实施方案中，所述疾病或病症与CD4+T细胞相关。在一些实施方案中，所述疾病或病症与CD8+T细胞相关。
在一些实施方案中，CAR跨膜结构域至少包含以下的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能变体。在一些实施方案中，所述跨膜结构域至少包含以下的跨膜区：CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS和FGFR2B或其功能变体。
在一些实施方案中，所述CAR包含选自以下中的一种或多种的至少一个信号传导结构域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6)、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配体/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配体/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配体/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配体/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配体/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNF-β、OX40/TNFRSF4、OX40配体/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNF-α、TNF RII/TNFRSF1B)、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150)、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I类、HLA-DR、Ikaros、整联蛋白α4/CD49d、整联蛋白α4β1、整联蛋白α4β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、NKG2C、CD3ζ结构域、基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性地结合CD83的配体、或其功能片段。
在一些实施方案中，所述CAR包含CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体。在一些实施方案中，所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体；和(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体。在一些实施方案中，所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；和(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中，所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或4-1BB结构域或其功能变体，和/或(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体。在一些实施方案中，所述CAR包含(i)CD3ζ结构域或基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)或其功能变体；(ii)CD28结构域或其功能变体；(iii)4-1BB结构域或CD134结构域或其功能变体；和(iv)细胞因子或共刺激配体转基因。
在某些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含与CD3(例如CD3-ζ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含与CD3ζ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB、TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，所述CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括4-1BB信号传导结构域和CD3-ζ信号传导结构域的细胞内组分。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包括CD28信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域的细胞内组分。
在一些实施方案中，所述CAR包含与抗原(例如肿瘤抗原)结合的细胞外抗原结合结构域(例如抗体或抗体片段，诸如scFv)、间隔子(例如含有铰链结构域，诸如本文所述的任何一种)、跨膜结构域(例如本文所述的任何一种)和细胞内信号传导结构域(例如任何细胞内信号传导结构域，诸如本文所述的初级信号传导结构域或共刺激信号传导结构域)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包括初级胞质信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域另外包括共刺激分子的细胞内信号传导结构域(例如，共刺激结构域)。表5B中描述了示例性CAR组分的实例。在所提供的方面，CAR中每个组分的序列可以包括表5B中列出的任何组合。
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在一些实施方案中，所述CAR还包含一个或多个间隔子，例如，其中所述间隔子是抗原结合结构域与跨膜结构域之间的第一间隔子。在一些实施方案中，所述第一间隔子包括免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰版本的至少一部分。在一些实施方案中，所述间隔子是跨膜结构域与信号传导结构域之间的第二间隔子。在一些实施方案中，所述第二间隔子是寡肽，例如，其中所述寡肽包含甘氨酸-丝氨酸双联体。除了本文所述的CAR之外，各种嵌合抗原受体和编码其的核苷酸序列是已知的，并且将适合于如本文所述在体内和体外融合体递送和重编程靶细胞。参见例如WO2013040557；WO2012079000；WO2016030414；Smith T等人,Nature Nanotechnology.2017.(DOI:10.1038/NNANO.2017.57)，其公开内容通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，将包含CAR或编码CAR的核酸(例如，DNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-MRNA、mRNA、miRNA、siRNA等)的靶向脂质颗粒递送至靶细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是效应细胞，例如表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应子功能的免疫***细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞可包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(例如T细胞)，γδT细胞、B淋巴细胞(例如B细胞)中的一种或多种，并且可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。
在一些实施方案中，所述外源剂包含胞质蛋白，例如在受体细胞中产生并定位于受体细胞的细胞质的蛋白质。在一些实施方案中，所述外源剂包含分泌蛋白，例如由受体细胞产生和分泌的蛋白质。在一些实施方案中，所述外源剂包含核蛋白，例如在受体细胞中产生并被输入受体细胞的细胞核的蛋白质。在一些实施方案中，所述外源剂包含细胞器蛋白(例如线粒体蛋白)，例如在受体细胞中产生并被输入受体细胞的细胞器(例如线粒体)中的蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是野生型蛋白质或突变蛋白质。在一些实施方案中，所述蛋白质是融合蛋白或嵌合蛋白。
在一些实施方案中，外源剂与造血干细胞(HSC)疾病相关。在一些实施方案中，外源剂包含下表5C的蛋白质。在一些实施方案中，外源剂包含表5C中任何蛋白质的野生型人序列、其功能片段(例如，其酶活性片段)或其功能变体。在一些实施方案中，外源剂包含与表5C的氨基酸序列，例如表5C的Uniprot蛋白质登录号序列或表5C的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，有效载荷基因编码与表5C的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，有效载荷基因具有与表5C的核酸序列，例如表5C的Ensemble基因登录号具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。
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在一些实施方案中，外源剂与溶酶体贮积症相关。在一些实施方案中，外源剂包含下表5D的蛋白质。在一些实施方案中，外源剂包含表5D中任何蛋白质的野生型人序列、其功能片段(例如，其酶活性片段)或其功能变体。在一些实施方案中，外源剂包含与表5D的氨基酸序列，例如表5D的Uniprot蛋白质登录号序列或表5D的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，有效载荷基因编码与表5D的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，有效载荷基因具有与表5D的核酸序列，例如表5D的Ensemble基因登录号具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的核酸序列。
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融合剂受体和防止源细胞融合的方法
在一些实施方案中，源细胞被修饰(例如，使用siRNA、miRNA、shRNA、基因组编辑或其他方法)以降低结合由源细胞表达的融合剂的融合剂受体的表达(例如，不表达)。在一些实施方案中，融合剂是再靶向融合剂，例如融合剂可以包含靶结合结构域，例如抗体，例如scFv。在一些实施方案中，融合剂受体被抗体结合。
绝缘子元件
在一些实施方案中，融合体核酸还包含一个或多个绝缘子元件，例如本文所述的绝缘子元件。绝缘子元件可有助于保护慢病毒表达的序列，例如治疗性多肽，免受整合位点效应的影响，所述整合位点效应可由基因组DNA中存在的顺式作用元件介导，并导致转移序列的去调节表达(例如位置效应；参见例如Burgess-Beusse等人,2002,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,99:16433；和Zhan等人,2001,Hum.Genet.,109:471)或与转移序列相邻的内源序列的去调节表达。在一些实施方案中，转移载体包含一个或多个3’LTR的绝缘子元件，并且在原病毒整合到宿主基因组中后，由于复制3’LTR，原病毒包含在5’LTR和/或3’LTR处的一个或多个绝缘子。合适的绝缘子包括但不限于鸡β-珠蛋白绝缘子(参见Chung等,1993.Cell 74:505；Chung等人,1997.N4S 94:575；和Bell等人.,1999.Cell 98:387，其通过引用并入本文)或来自人β-珠蛋白基因座的绝缘子，例如鸡HS4。在一些实施方案中，绝缘子结合CCCTC结合因子(CTCF)。在一些实施方案中，绝缘子是屏障绝缘子。在一些实施方案中，绝缘子是增强剂阻断绝缘子。参见例如Emery等人,Human Gene Therapy,2011以及Browning and Trobridge,Biomedicines,2016，这两篇文献通过引用整体包括在本文中。
在一些实施方案中，逆转录病毒核酸中的绝缘子降低了受体细胞中的基因毒性。基因毒性可以被测量，例如，如Cesana等人,“Uncovering and dissecting thegenotoxicity of self-inactivating lentiviral vectors in vivo”Mol Ther.2014年4月；22(4):774-85.doi:10.1038/mt.2014.3.电子版2014年1月20日中所述。
药物组合物及其制备方法
在一些实施方案中，向受试者施用融合体或逆转录病毒载体的一个或多个转导单位。在一些实施方案中，向受试者施用1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个转导单位/kg。在一些实施方案中，向受试者施用至少1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个转导单位/靶细胞/ml血液。
慢病毒的浓缩和纯化
在一些实施方案中，本文所述的融合体制剂可以通过包括以下步骤(i)至(vi)中的一个或多个(例如全部)步骤(例如按时间顺序)的方法来产生：
(i)培养产生融合体的细胞；
(ii)收获含有融合体的上清液；
(iii)任选地使上清液澄清；
(iv)纯化融合体以得到融合体制剂；
(v)任选地对融合体制剂进行过滤灭菌；以及
(vi)将融合体制剂浓缩以产生最终的散装产品。
在一些实施方案中，所述方法不包括澄清步骤(iii)。在其它实施方案中，所述方法确实包括澄清步骤(iii)。在一些实施方案中，步骤(vi)使用超滤或切向流过滤，更优选中空纤维超滤来进行。在一些实施方案中，步骤(iv)中的纯化方法是离子交换色谱法，例如阴离子交换色谱法。在一些实施方案中，步骤(v)中的过滤灭菌使用0.22μm或0.2μm灭菌过滤器来进行。在一些实施方案中，步骤(iii)通过过滤澄清来进行。在一些实施方案中，步骤(iv)使用选自色谱法、超滤/渗滤或离心的方法或方法组合来进行。在一些实施方案中，色谱方法或方法的组合选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、反相色谱和固定化金属离子亲和色谱。在一些实施方案中，离心方法选自区域离心、等密度离心和造粒离心。在一些实施方案中，超滤/渗滤方法选自切向流渗滤、搅拌细胞渗滤和透析。在一些实施方案中，在所述方法中包括降解核酸以改进纯化的至少一个步骤。在一些实施方案中，所述步骤是核酸酶处理。
在一些实施方案中，载体的浓缩是在过滤前进行的。在一些实施方案中，载体的浓缩是在过滤后进行的。在一些实施方案中，重复浓缩和过滤步骤。
在一些实施方案中，最终浓缩步骤在过滤-灭菌步骤之后进行。在一些实施方案中，所述方法是用于生产适用于作为治疗剂向人施用的临床级制剂的大规模方法。在一些实施方案中，过滤-灭菌步骤发生在浓缩步骤之前。在一些实施方案中，浓缩步骤是所述方法的最后步骤，并且过滤-灭菌步骤是所述方法的倒数第二步骤。在一些实施方案中，浓缩步骤使用超滤，优选地切向流过滤，更优选地中空纤维超滤来进行。在一些实施方案中，过滤灭菌步骤使用最大孔径为约0.22μm的灭菌过滤器来进行。在另一个优选的实施方案中，最大孔径为0.2μm。
在一些实施方案中，在过滤灭菌前，载体浓度小于或等于约4.6×1011个RNA基因组拷贝/ml制剂。如果合适的话，合适的浓度水平可以通过使用例如稀释步骤控制载体浓度来实现。因此，在一些实施方案中，逆转录病毒载体制剂在过滤灭菌之前被稀释。
澄清可以通过过滤步骤进行，从而去除细胞碎片和其他杂质。合适的过滤器可以利用纤维素过滤器、再生纤维素纤维、与无机助滤剂(例如硅藻土、珍珠岩、煅制二氧化硅)组合的纤维素纤维、与无机助滤剂和有机树脂组合的纤维素过滤器或其任何组合，以及实现有效去除和可接受的回收的聚合物过滤器(实例包括但不限于尼龙、聚丙烯、聚醚砜)。可以使用多阶段方法。示例性两阶段或三阶段方法将由粗过滤器组成，以去除大的沉淀物和细胞碎片，随后对标称孔径大于0.2微米但小于1微米的第二级过滤器进行抛光。最佳组合可以是沉淀物粒度分布以及其他变量的函数。此外，采用相对小孔径过滤器的单级操作或离心也可用于澄清。更一般地，任何澄清方法在本发明的澄清步骤中使用将是可接受的，所述澄清方法包括但不限于死端过滤、微滤、离心或助滤剂(例如硅藻土)的主体进料与死端过滤或深度过滤的组合，其提供合适澄清度的滤液而不会在后续步骤中污染膜和/或树脂。
在一些实施方案中，使用深度过滤和膜过滤。在这方面有用的可商购获得的产品例如在WO 03/097797第20-21页中提到。可以使用的膜可以由不同的材料组成，孔径可以不同，并且可以组合使用。它们可以从几家供应商处商购获得。在一些实施方案中，用于澄清的过滤器是在1.2至0.22μm的范围内。在一些实施方案中，用于澄清的过滤器是1.2/0.45μm过滤器或最小标称孔径为0.22μm的不对称过滤器。
在一些实施方案中，所述方法使用核酸酶来降解污染的DNA/RNA，即主要是宿主细胞核酸。适用于本发明的示例性核酸酶包括
Figure BDA0004107707870002051
核酸酶(EP 0229866)，其攻击并降解所有形式的DNA和RNA(单链、双链线性或环状)或本领域中常用于从制剂中消除不想要的或污染的DNA和/或RNA的任何其它DNA酶和/或RNA酶。在优选的实施方案中，核酸酶是
Figure BDA0004107707870002052
核酸酶，其通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键来快速水解核酸，从而减小含有载体的上清液中多核苷酸的大小。/>
Figure BDA0004107707870002053
核酸酶可以从Merck KGaA(代码W214950)商购获得。使用核酸酶的浓度优选地是在1-100单位/毫升的范围内。
在一些实施方案中，在例如浓缩载体和/或缓冲液交换的过程期间，对载体悬浮液进行至少一次超滤(当用于缓冲液交换时，有时称为渗滤)。用于浓缩载体的方法可以包括任何过滤方法(例如超滤(UF))，其中通过迫使稀释剂以一种方式穿过过滤器来增加载体的浓度，所述方式使得稀释剂从载体制剂中去除，而载体不能穿过过滤器，从而以浓缩形式保留在载体制剂中。UF详细描述于例如Microfiltration and Ultrafiltration:Principlesand Applications,L.Zeman和A.Zydney(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1996)；以及Ultrafiltration Handbook,Munir Cheryan(Technomic Publishing,1986；ISBN编号87762-456-9)。合适的过滤方法是切向流过滤(“TFF”)，如在例如标题为“PharmaceuticalProcess Filtration Catalogue”第177-202页(Bedford,Mass.,1995/96)的MILLIPORE目录中所述。TFF广泛用于生物加工行业，用于细胞收获、澄清、纯化和浓缩包括病毒在内的产品。所述***由以下三种不同的工艺流组成：进料溶液、渗透物和滞留物。根据应用，可以使用不同孔径的过滤器。在一些实施方案中，滞留物含有产物(慢病毒载体)。所选择的特定超滤膜可以具有足够小到保留载体，但又足够大到有效清除杂质的孔径。根据制造商和膜类型，对于逆转录病毒载体，100和1000kDa之间的标称分子量截止值(NMWC)可能是合适的，例如具有300kDa或500kDa NMWC的膜。膜组合物可以是但不限于再生纤维素、聚醚砜、聚砜或其衍生物。膜可以是平板(也称为平筛)或中空纤维。合适的UF是中空纤维UF，例如使用孔径小于0.1μm的过滤器进行过滤。产品通常被保留，而体积可通过渗透而减少(或在渗滤期间通过以与在渗透物侧去除含有缓冲剂和杂质的渗透物的速度相同的速度添加缓冲剂来保持恒定)。
TFF在生物制药行业中最广泛使用的两种几何形状是板框式(平板筛)和中空纤维模块。用于超滤和微滤的中空纤维单元是由Amicon和Ramicon在20世纪70年代早期开发的(Cheryan,M.Ultrafiltration Handbook)，尽管现在有多个供应商，包括Spectrum和GEHealthcare。中空纤维模块由具有致密表层的自支撑纤维阵列组成。纤维直径范围为0.5mm-3mm。在某些实施方案中，中空纤维用于TFF。在某些实施方案中，使用500kDa(0.05μm)孔径的中空纤维。超滤可以包括渗滤(DF)。可以通过以等于UF速率的速率向超滤溶液中添加溶剂来去除微溶物。这将从溶液中以恒定的体积洗去微量物质，从而纯化保留的载体。
UF/DF可用于在纯化过程的不同阶段对载体悬浮液进行浓缩和/或缓冲液交换。所述方法可以利用DF步骤在色谱或其他纯化步骤之后交换上清液的缓冲液，但也可以在色谱法之前使用。
在一些实施方案中，浓缩来自色谱步骤的洗出液并通过超滤-渗滤进一步纯化。在此过程期间，载体被交换到制剂缓冲液中。浓缩至最终所需浓度可以在过滤-灭菌步骤之后进行。在所述无菌过滤后，将过滤灭菌的物质通过无菌UF浓缩，以产生大量载体产品。
在实施方案中，超滤/渗滤可以是切向流渗滤、搅拌细胞渗滤和透析。
纯化技术往往涉及从细胞环境中分离载体颗粒，并且在需要时，进一步纯化载体颗粒。多种色谱方法中的一种或多种可用于这种纯化。离子交换色谱，尤其是阴离子交换色谱是合适的方法，并且也可以使用其他方法。下文给出了一些色谱技术的描述。
离子交换色谱利用了以下事实，带电荷物质诸如生物分子和病毒载体可以可逆地结合到固定相(诸如膜，或者柱中的填料)上，所述固定相在其表面上固定有带相反电荷的基团。有两种类型的离子交换剂。阴离子交换剂是带正电荷基团的固定相，因此可以结合带负电荷的物质。阳离子交换剂具有带负电荷基团，因此可以结合带正电荷的物质。介质的pH对此有影响，因为它可以改变一种物质上的电荷。因此，对于诸如蛋白质的物质，如果pH高于pI，则净电荷将为负，而如果低于pI，则净电荷将为正。
结合物质的置换(洗脱)可以通过使用合适的缓冲液来实现。因此，通常增加缓冲液的离子浓度，直到通过缓冲液离子对固定相上的离子位点的竞争来置换物质。替代的洗脱方法需要改变缓冲液的pH，直到物质的净电荷不再有利于结合到固定相上。实例是降低pH，直到所述物质呈现净正电荷，并且不再与阴离子交换剂结合。
如果杂质不带电荷，或者如果它们带的电荷与所需物质的电荷符号相反，但与离子交换剂上的电荷符号相同，就可以实现某种程度的纯化。这是因为不带电荷的物质和带有与离子交换剂相同符号电荷的物质通常不会结合。对于不同的结合物质，结合的强度随着诸如各种物质上的电荷密度和电荷分布等因素而变化。因此，通过应用离子或pH梯度(作为连续梯度或作为一系列步骤)，所需物质可以与杂质分开洗脱。
尺寸排阻色谱是根据大小分离各物质的技术。典型地，它通过使用填充有具有明确尺寸的孔的颗粒的柱来进行。对于色谱分离，选择具有相对于待分离混合物中物质的尺寸而言合适的孔径的颗粒。当将混合物作为溶液(或在病毒的情况下为悬浮液)施加到柱上，然后用缓冲液洗脱时，最大颗粒将首先洗脱，因为它们进入孔的途径有限(或没有)。较小颗粒将在稍后洗脱，因为它们可以进入孔中，因此通过色谱柱的路径更长。因此，在考虑使用尺寸排阻色谱法纯化病毒载体时，预期载体将在较小杂质诸如蛋白质之前被洗脱。
诸如蛋白质的物质在其表面上具有疏水区域，其可以可逆地结合到固定相上的弱疏水位点。在具有相对高盐浓度的介质中，这种结合得到促进。通常，在HIC中，待纯化的样品在高盐环境中与固定相结合。然后通过应用盐浓度递减的梯度(连续的或作为一系列步骤)来实现洗脱。常用的盐是硫酸铵。具有不同疏水性水平的物质将倾向于在不同的盐浓度下被洗脱，因此可以从杂质中纯化目标物质。其他因素诸如pH、温度和洗脱介质的添加剂(诸如去污剂、离液盐和有机物)也会影响物质与HIC固定相的结合强度。可以调整或利用这些因素中的一个或多个来优化产物的洗脱和纯化。
病毒载体在其表面上具有疏水部分，诸如蛋白质，因此HIC可潜在地被用作纯化手段。
像HIC一样，RPC根据疏水性的差异来分离物质。使用疏水性高于HIC中所用的疏水性的固定相。固定相通常由与疏水部分诸如烷基或苯基结合的材料(通常为二氧化硅)组成。或者，固定相可以是没有连接基团的有机聚合物。将含有待分离物质混合物的样品在促进结合的相对高极性的水性介质中施加到固定相。然后通过添加有机溶剂诸如异丙醇或乙腈降低水性介质的极性来实现洗脱。通常使用增加有机溶剂浓度的梯度(连续的或作为一系列步骤)，并且按照它们各自的疏水性的顺序洗脱这些物质。
其他因素诸如洗脱介质的pH和添加剂的使用，也会影响物质与RPC固定相的结合强度。可以调整或利用这些因素中的一个或多个来优化产物的洗脱和纯化。常见的添加剂是三氟乙酸(TFA)。这抑制了样品中酸性基团诸如羧基部分的电离。它还降低了洗脱介质的pH，并且这抑制了可能存在于具有二氧化硅基质的固定相表面上的游离硅烷醇基团的电离。TFA是被称为离子对试的一类添加剂中的一种。这些离子对试与样品物质中带有相反电荷的离子基团相互作用。所述相互作用会掩盖电荷，从而增加物质的疏水性。阴离子离子对试(例如TFA和五氟丙酸)与物质上的带正电荷的基团相互作用。阳离子离子对试(例如三乙胺)与带负电荷的基团相互作用。
病毒载体在其表面上具有疏水部分，例如蛋白质，因此RPC潜在地被用作纯化手段。
亲和色谱利用了如下事实，与生物分子诸如蛋白质或核苷酸特异性结合的某些配体可以固定在固定相上。然后，改性的固定相可用于从混合物中分离相关生物分子。高度特异性配体的实例是用于纯化靶抗原的抗体和用于纯化酶的酶抑制剂。也可以利用更普遍的相互作用，例如使用蛋白A配体来分离广泛多种抗体。
通常，亲和色谱通过将含有所关注物质的混合物施加到附着有相关配体的固定相上来进行。在适当的条件下，这将导致物质与固定相结合。然后，在应用洗脱介质之前，洗去未结合的组分。选择洗脱介质来破坏配体与靶标物质的结合。这通常通过选择适当的离子强度、pH或通过使用与靶标物质竞争配***点的物质来实现。对于一些结合的物质，离液剂诸如尿素用于影响从配体的置换。然而，这可能导致物质的不可逆变性。
病毒载体在其表面上具有能够特异性结合适当配体的部分，诸如蛋白质。这意味着，潜在地，亲和色谱可以用于分离它们。
生物分子诸如蛋白质在其表面上可以具有给电子部分，所述给电子部分可以与金属离子形成配位键。这可以促进它们与携带固定金属离子诸如Ni2+、Cu2+、Zn2+或Fe3+的固定相结合。IMAC中使用的固定相具有螯合剂，通常是共价连接到其表面的次氮基乙酸或亚氨基二乙酸，并且是保留金属离子的螯合剂。螯合的金属离子有必要保留至少一个配位位点，以便与生物分子形成配位键。潜在地，在生物分子表面上存在能够结合到固定的金属离子上的几个部分。这些部分包括组氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基以及磷酸基团。然而，对于蛋白质来说，主要的供体似乎是组氨酸残基的咪唑基团。如果天然蛋白质在其表面上展示合适的供体部分，则可以使用IMAC分离天然蛋白质。另外，IMAC可用于分离携带若干连接的组氨酸残基链的重组蛋白。
通常，IMAC通过将含有所关注的物质的混合物施加于固定相来进行。在适当的条件下，这将导致物质与固定相发生配位键合。然后，在应用洗脱介质之前，洗去未结合的组分。对于洗脱，可以使用增加盐浓度或降低pH的梯度(连续的或作为一系列步骤)。而且，常用的方法是应用咪唑浓度递增的梯度。具有不同供体性质的生物分子，例如在不同环境中具有组氨酸残基的生物分子，可以通过使用梯度洗脱来分离。
病毒载体在其表面上具有能够与IMAC固定相结合的部分，例如蛋白质。这意味着，潜在地，IMAC用于分离它们。
合适的离心技术包括区域离心、超等密度离心和造粒离心。
过滤灭菌适用于制药级材料的加工。过滤灭菌使所得制剂基本上不含污染物。过滤灭菌后的污染物水平使得所述制剂适用于临床使用。过滤-灭菌步骤后的进一步浓缩(例如通过超滤)可以在无菌条件下进行。在一些实施方案中，灭菌过滤器的最大孔径为0.22μm。
本文中的融合体或逆转录病毒载体也可以经受使用流通超速离心和高速离心以及切向流过滤来浓缩和纯化慢病毒载体的方法。流通超速离心可用于纯化RNA肿瘤病毒(Toplin等人,Applied Microbiology 15:582-589,1967；Burger等人.,Journal of theNational Cancer Institute 45:499-503,1970)。流通超速离心可用于纯化慢病毒载体。该方法可以包括一个或多个以下步骤。例如，可以使用细胞工厂或生物反应器***从细胞中产生慢病毒载体。可以使用瞬时转染***，或者也可以类似地使用包装或生产细胞系。如果需要，可以在将材料装入超速离心机之前使用预澄清步骤。流通超速离心可以使用连续流动或分批沉淀来进行。用于沉淀的材料是例如：氯化铯、酒石酸钾和溴化钾，虽然它们都具有腐蚀性，但它们能产生高密度和低粘度。CsCl经常用于工艺开发，因为由于可以产生较宽的密度梯度(1.0至1.9g/cm3)，可以实现高纯度。溴化钾可以在高密度下，例如在升高的温度诸如25℃下使用，这可能与一些蛋白质的稳定性不相容。蔗糖由于便宜、无毒而被广泛使用并且可以形成适用于分离大多数蛋白质、亚细胞级分和全细胞的梯度。通常，最大密度为约1.3g/cm3。蔗糖的渗透势可能对细胞有毒，在这种情况下，可以使用复杂的梯度材料，例如Nycodenz。梯度可以与梯度中的一个或多个步骤一起使用。一个实施方案是使用阶梯式蔗糖梯度。每次运行的材料体积可以是从0.5升到超过200升。流速可以从每小时5升到超过25升。合适的运行速度在25,000与40,500rpm之间，产生的力多达122,000×g。转子可以所需体积分数静态卸载。一个实施方案是卸载100ml级分中的离心材料。然后可以用凝胶过滤或尺寸排阻色谱法在所需缓冲液中对含有纯化和浓缩的慢病毒载体的分离级分进行交换。阴离子或阳离子交换色谱法也可用作用于缓冲液交换或进一步纯化的替代或附加方法。此外，如果需要，切向流过滤也可用于缓冲液交换和最终制剂。切向流过滤(TFF)也可用作超高速或高速离心的替代步骤，其中将实施两步TFF程序。第一步将减少载体上清液的体积，而第二步将用于缓冲液交换、最终配制和材料的进一步浓缩。TFF膜可以具有100至500千道尔顿的膜尺寸，其中第一TFF步骤可以具有500千道尔顿的膜尺寸，而第二TFF可以具有300至500千道尔顿的膜尺寸。最终的缓冲液应含有允许载体长期保存的材料。
在实施方案中，所述方法使用含有贴壁细胞的细胞工厂或含有悬浮细胞的生物反应器，所述悬浮细胞用载体和辅助构建体转染或转导以产生慢病毒载体。生物反应器的非限制性实例包括Wave生物反应器***和Xcellerex生物反应器。两者都是一次性***。然而，也可以使用非一次性***。所述构建体可以是本文所述的那些，以及其他慢病毒转导载体。或者，所述细胞系可以被工程化以产生慢病毒载体，而不需要转导或转染。转染后，可以收获慢病毒载体并过滤以去除微粒，然后使用连续流高速或超速离心进行离心。一个优选的实施方案是使用高速连续流动装置，如带有高速离心机的JCF-分区连续流动转子。还优选使用Contifuge Stratus离心机进行中等规模的慢病毒载体生产。离心速度大于5,000×g RCF且小于26,000×g RCF的任何连续流动离心机也是合适的。优选地，连续流离心力为约10,500×g至23,500×g RCF，旋转时间为20小时至4小时之间，其中离心时间越长，离心力越慢。慢病毒载体可以在更致密的材料缓冲层(非限制性实例是蔗糖，但是其他试剂也可以用于形成缓冲层，这些试剂是本领域中熟知的)上离心，使得慢病毒载体不会形成不可过滤的聚集体，正如有时直接离心会产生病毒载体沉淀的载体一样。连续流动离心到缓冲层上使载体避免形成大聚集体，还使载体从产生慢病毒载体的大量转染材料中浓缩到高水平。此外，第二密度较低的蔗糖层可用于结合慢病毒载体制剂。连续流动离心机的流速可以在每分钟1与100ml之间，但是也可以使用更高或更低的流速。调节流速，以为载体进入离心机核心提供充足的时间，而不会由于高流速而损失大量的载体。如果需要更高的流速，那么流出连续流动离心机的材料可以再循环并第二次穿过离心机。在使用连续流动离心浓缩病毒后，可以使用切向流过滤(TFF)进一步浓缩载体，或者可以简单地使用TFF***进行缓冲液交换。TFF***的非限制性实例是由GB-Healthcare生产的Xampler滤筒***。优选的滤筒是MW截止值为500,000MW或更低的那些。优选地，使用MW截止值为300,000MW的滤筒。也可以使用100,000MW截止值的滤筒。对于更大的体积，可以使用更大的滤筒，并且对于本领域技术人员来说，在载体制剂的最终填充之前，很容易找到用于该最终缓冲液交换和/或浓缩步骤的合适TFF***。最终填充制剂可含有使载体稳定的因素—糖是本领域中常用和已知的。
蛋白质含量
在一些实施方案中，融合体包括各种源细胞基因组来源的蛋白质、外源蛋白质和病毒基因组来源的蛋白质。在一些实施方案中，逆转录病毒颗粒含有各种比率的源细胞基因组来源的蛋白质与病毒基因组来源的蛋白质、源细胞基因组来源的蛋白质与外源蛋白质以及外源蛋白质与病毒基因组来源的蛋白质。
在一些实施方案中，病毒基因组来源的蛋白质是GAG多蛋白前体、HIV-1整合酶、POL多蛋白前体、衣壳、核衣壳、p17基质、p6、p2、VPR、Vif。
在一些实施方案中，源细胞来源的蛋白质是亲环蛋白A、热休克70kD、人延伸因子-1α(EF-1R)、组蛋白H1、H2A、H3、H4、β-珠蛋白、胰蛋白酶前体、细小蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Lck、泛素、SUMO-1、CD48、同线蛋白(Syntenin)-1、核磷蛋白、异质核核糖核蛋白C1/C2、核仁蛋白、可能的ATP依赖性解旋酶DDX48、Matrin-3、过渡型ER ATP酶、GTP-结合核蛋白Ran、异质核核糖核蛋白U、白介素增强子结合因子2、含有非-POU结构域的八聚体结合蛋白质、RuvB样2、HSP 90-b、HSP 90-a、延伸因子2、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶、a-烯醇酶、C-1-四氢叶酸合酶、细胞质、丙酮酸激酶、同工酶M1/M2、泛素激活酶E1、26S蛋白酶调节亚基S10B、60S酸性核糖体蛋白P2、60S酸性核糖体蛋白P0、40S核糖体蛋白SA、40S核糖体蛋白S2、40S核糖体蛋白S3、60S核糖体蛋白L4、60S核糖体蛋白L3、40S核糖体蛋白S3a、40S核糖体蛋白S7、60S核糖体蛋白L7a、60S酸性核糖体蛋白L31、60S核糖体蛋白L10a、60S核糖体蛋白L6,26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基1、微管蛋白b-2链、肌动蛋白、细胞质1、肌动蛋白、主动脉平滑肌、微管蛋白a-泛素链、网格蛋白重链1、组蛋白H2B.b、组蛋白H4、组蛋白H3.1、组蛋白H3.3、组蛋白H2A型8、26S蛋白酶调节亚基6A、泛素-4、RuvB样1、26S蛋白酶调节亚基7、亮氨酰-tRNA合成酶、细胞质、60S核糖体蛋白L19、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基13、组蛋白H2B.F、U5小核核糖核蛋白200kDa解旋酶、聚[ADP-核糖]聚合酶-1、ATP依赖性DNA解旋酶II、DNA复制执照因子MCM5、核酸酶敏感元件结合蛋白1、ATP依赖性RNA解旋酶A、白介素增强子结合因子3、转录延伸因子B多肽1、前mRNA加工剪接因子8、含有葡萄球菌核酸酶结构域的蛋白质1、程序性细胞凋亡6-相互作用蛋白、RNA聚合酶II转录亚基8同源物的介体、核仁RNA解旋酶II、内质网蛋白(Endoplasmin)、DnaJ同源物亚家族A成员1、热休克70kDa蛋白质1L、T-复合蛋白1e亚基、GCN1样蛋白1、血清转铁蛋白、果糖二磷酸醛缩酶A、肌苷-5’单磷酸脱氢酶2、26S蛋白酶调节亚基6B、脂肪酸合酶、DNA依赖性蛋白激酶催化亚基、40S核糖体蛋白S17、60S核糖体蛋白L7、60S核糖体蛋白L12、60S核糖体蛋白L9、40S核糖体蛋白S8、40S核糖体蛋白S4X同工型、60S核糖体蛋白L11、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基、衣被蛋白a亚基、组蛋白H2A.z、组蛋白H1.2、细胞溶质动力蛋白重链。参见：Saphire等人,Journal of Proteome Research,2005以及Wheeler等人,Proteomics Clinical Applications,2007。
在一些实施方案中，融合体是聚乙二醇化的。
粒度
在一些实施方案中，融合体的中值直径是10与1000nM之间、25与500nm 40与300nm之间、50与250nm之间、60与225nm之间、70与200nm之间、80与175nm之间或90与150nm之间。
在一些实施方案中，90％的融合体落在中值直径的50％内。在一些实施方案中，90％的融合体落在中值直径的25％内。在一些实施方案中，90％的融合体落在中值直径的20％内。在一些实施方案中，90％的融合体落在中值直径的15％内。在一些实施方案中，90％的融合体落在中值直径的10％内。
适应症和用途
在一些实施方案中，本文所述的融合体或其药物组合物可以施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。在一些方面，本文提供了融合体或药物组合物，例如本文所述的任何一种，其可以施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。在此类实施方案中，受试者可能有患上特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)的风险，可能具有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)的症状，或可能被诊断或鉴定为患有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)。在一个实施方案中，受试者患有癌症。在一个实施方案中，受试者患有感染性疾病。在一些实施方案中，融合体，例如逆转录病毒载体或颗粒含有编码用于治疗受试者疾病或疾患的外源剂的核酸序列。例如，外源剂是靶向肿瘤细胞的蛋白质或对肿瘤细胞的蛋白质具有特异性的剂，并且融合体被施用于受试者以治疗受试者的肿瘤或癌症。在另一个实例中，外源剂是炎性介质或免疫分子，例如细胞因子，并且将融合体施用于受试者以治疗其中期望调节(例如增加)免疫反应的任何疾患，例如癌症或传染病。
因此，在一些方面，还提供了施用所提供的融合体(例如逆转录病毒载体和颗粒，例如慢病毒载体和颗粒)和/或包含它们的组合物的方法以及其用途，例如治疗用途和预防用途。此类方法和用途包括例如涉及向患有疾病、疾患或病症的受试者施用融合体(例如逆转录病毒载体或颗粒，诸如慢病毒载体或颗粒)或含有它们的组合物以递送用于治疗所述疾病、疾患或病症的外源性剂的治疗方法和用途。在一些实施方案中，以有效量或剂量施用融合体(例如逆转录病毒载体或颗粒，诸如慢病毒载体或颗粒)，以实现对疾病、疾患或病症的治疗。本文提供了任何所提供的融合体(例如逆转录病毒载体或颗粒，诸如慢病毒载体或颗粒)在此类方法和治疗中的用途，以及在制备用于实施此类治疗方法的药物中的用途。在一些实施方案中，通过向患有、曾经患有或疑似患有疾病或疾患或病症的受试者施用融合体(例如逆转录病毒载体或颗粒，诸如慢病毒载体或颗粒)或包含它们的组合物来实施所述方法。在一些实施方案中，所述方法由此治疗受试者的疾病或疾患或病症。本文还提供了任何组合物(例如本文提供的药物组合物)用于治疗与外源剂所靶向或提供的特定基因或蛋白质相关的疾病、疾患或病症的用途。
本文所述的药物组合物的施用可以是例如通过口服、吸入、透皮或肠胃外(包括静脉内、肿瘤内、腹膜内、肌内、腔内和皮下)施用。在一些实施方案中，融合体可以单独施用或被配制成药物组合物。
在实施方案中，融合体组合物介导对靶细胞的作用，并且所述作用持续至少1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4周，或1、2、3、6或12个月。在一些实施方案中(例如，其中融合体组合物包含外源蛋白)，所述作用持续少于1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4周，或1、2、3、6或12个月。
在实施方案中，本文所述的融合体组合物被离体递送至细胞或组织，例如人细胞或组织。
在一些实施方案中，本文所述的融合体组合物可以施用于受试者，例如哺乳动物，例如人。在某些实施方案中，受试者可能有患上特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)的风险，可能具有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)的症状，或可能被诊断或鉴定为患有特定疾病或疾患(例如，本文所述的疾病或疾患)。
在一些实施方案中，融合体的来源来自施用融合体组合物的同一受试者。在其他实施方案中，他们是不同的。例如，融合体和受体组织的来源可以是自体的(来自同一受试者)或异源的(来自不同受试者)。在任一情况下，本文所述的融合体组合物的供体组织可以是与受体组织不同的组织类型。例如，供体组织可以是肌肉组织，并且受体组织可以是***(例如，脂肪组织)。在其他实施方案中，供体组织和受体组织可以是相同或不同的类型，但来自不同的器官***。
在一些实施方案中，融合体与抑制膜融合的蛋白质抑制剂共同施用。例如，Suppressyn是抑制细胞-细胞融合的人蛋白质(Sugimoto等人,“A novel humanendogenous retroviral protein inhibits cell-cell fusion”Scientific Reports 3:1462 DOI:10.1038/srep01462)。因此，在一些实施方案中，融合体与sypressyn的抑制剂，例如siRNA或抑制性抗体共同施用。
在一些实施方案中，本文所述的组合物可用于类似地调节多种其他生物体的细胞或组织功能或生理学，包括但不限于：农场或工作动物(马、牛、猪、鸡等)、宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)、水产动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、植物种类(树木、农作物、观赏植物、花卉等)、发酵种类(酵母菌等)。在一些实施方案中，本文所述的融合体组合物可以由此类非人来源制备，并施用于非人靶细胞或组织或受试者。
融合体组合物对于靶标可以是自体的、同种异体的或异种的。
其他治疗剂
在一些实施方案中，融合体组合物与另外的剂，例如治疗剂，共同施用于受试者，例如接受者，例如本文所述的接受者。在一些实施方案中，共同施用的治疗剂是免疫抑制剂，例如糖皮质激素(例如***)、细胞抑制剂(例如甲氨蝶呤)、抗体(例如莫罗单抗-CD3)或亲免素调节剂(例如环孢素或雷帕霉素)。在实施方案中，免疫抑制剂降低了融合体的免疫介导的清除。在一些实施方案中，融合体组合物与免疫刺激剂，例如佐剂、白介素、细胞因子或趋化因子共同施用。
在一些实施方案中，融合体组合物和免疫抑制剂同时施用，例如同期施用。在一些实施方案中，在施用免疫抑制剂之前施用融合体组合物。在一些实施方案中，在施用免疫抑制剂之后施用融合体组合物。
在一些实施方案中，免疫抑制剂是小分子，例如布洛芬、对乙酰氨基酚、环孢菌素、他克莫司、雷帕霉素、霉酚酸酯、环磷酰胺、糖皮质激素、西罗莫司、硫唑嘌呤(azathriopine)或甲氨蝶呤。
在一些实施方案中，免疫抑制剂是抗体分子，包括但不限于：莫罗单抗(抗CD3)、达克珠单抗(Daclizumab)(抗IL12)、巴利昔单抗(Basiliximab)、英夫利西单抗(Infliximab)(抗TNFa)或利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)。
在一些实施方案中，与单独施用融合体组合物相比，融合体组合物与免疫抑制剂的共同施用导致融合体组合物在受试者中的持久性增强。在一些实施方案中，与单独施用时融合体组合物的持久性相比，在共同施用中融合体组合物的持久性增强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更长。在一些实施方案中，与单独施用时融合体组合物的存活相比，在共同施用中融合体组合物增强的持久性为至少1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25或30天或更长。
实施例
阐述以下实施例以帮助理解本发明，但不旨在也不应被解释为以任何方式限制其范围。
实施例1：组织蛋白酶分子水平升高导致靶细胞上融合体功能滴度增加
本实施例描述了活性融合体(特别是假型化慢病毒融合体)的产生，以及这些融合体生产细胞中组织蛋白酶L水平升高对CD8过表达靶细胞上所得假型化慢病毒滴度的影响。用载体psPAX2、pLenti-GFP和pCAGGS Niv-CD8/Fd22转染人胚胎肾细胞(293LX细胞)，以用作融合体生产细胞。还用1μg pcDNA(无CathL对照)或组织蛋白酶L DNA(CathL)转染生产细胞。在48小时收获这些经修饰的生产细胞。收获时，在与pcDNA转染的对照细胞相比，在组织蛋白酶L分子水平升高的生产细胞的大合胞体中检测到用作融合体活性生产的标志物的GFP(数据未显示)。
然后将含有假型化慢病毒的上清液用于转导靶CD8过表达细胞。将慢病毒载体上清液在293LX细胞培养基(含10％胎牛血清的DMEM)中连续稀释，并应用于被转染以过量表达人CD8A和B 24小时的293LX细胞。转导后72小时，通过流式细胞术分析GFP表达，并且使用对应于5-15％GFP阳性细胞的系列稀释点计算慢病毒载体滴度。如图2A所示，在组织蛋白酶L水平升高的经修饰的293LX生产细胞中产生的融合体在CD8过表达细胞上具有约1,000,000TU/mL的功能滴度。在仅用pcDNA转染的对照细胞(组织蛋白酶L没有升高)中产生的融合体具有仅约10,000TU/mL的功能滴度。这些结果表明，在融合体生产细胞中掺入升高水平的组织蛋白酶L导致靶细胞的功能滴度增加大约100倍。
实施例2：组织蛋白酶分子水平升高导致靶细胞上再靶向融合体的功能滴度增加
本实施例描述了再靶向融合体的产生以及在这些再靶向融合体生产细胞中组织蛋白酶L水平升高对它们在靶细胞上产生的假型化慢病毒滴度的影响。用载体psPAX2和pLenti-GFP转染人胚肾细胞(293LX细胞)。为了用额外结合部分再靶向融合体，也用NivGm-CD105-ScFv、NivGm-EpCAM-Darpin或NivGm-Gria4-ScFv转染这些生产细胞。此外，用pcDNA(无CathL对照)或组织蛋白酶LDNA(CathL)转染生产细胞。在48小时后收获来自经修饰的生产细胞的上清液。然后将含有假型化慢病毒的上清液用于转导被转染以过表达CD105、EpCAM或Gria4受体(或模拟作为对照的DNA，称为-CathL)的靶293LX细胞。转导后72小时，通过流式细胞术分析GFP表达。如图2B所示，在组织蛋白酶L水平升高的经修饰的细胞中产生的靶向CD105的融合体在靶细胞上具有至少1,000,000TU/mL的功能滴度，相比之下，由仅用pcDNA转染的对照细胞(组织蛋白酶L没有升高)产生的融合体在靶细胞上产生的功能滴度略高于10,000TU/mL。类似地，也如图2B中所示，在组织蛋白酶L水平升高的经修饰的细胞中产生的靶向Gria4的融合体在靶细胞上具有大于1,000,000TU/mL的功能滴度，相比之下，由仅用pcDNA转染的对照细胞(组织蛋白酶L没有升高)产生的融合体在靶细胞上产生的功能滴度超过10,000TU/mL。这些结果表明，除了实施例1中所述的CD8靶向融合体之外，在这些再靶向融合体生产细胞中掺入升高水平的组织蛋白酶L导致靶向CD105和Gria4的融合体的功能滴度增加至少10至100倍。该实验还证明了非靶向融合体和靶向CD105、EpCAM、Gria4和CD8的融合体的产生。
实施例3：组织蛋白酶分子水平升高增加了活化T细胞上融合体的功能滴度
本实施例描述了活性融合体的产生以及这些活性融合体产生细胞中组织蛋白酶L水平升高对PanT细胞(被阴性选择以去除任何CD3阴性细胞的人T细胞；从StemCell Tech获得)上所得假型化慢病毒滴度的作用。将PanT细胞解冻并用CD3/CD28和IL-2活化48小时，然后通过旋转接种用慢病毒载体转导90分钟。为了制备生产细胞，用载体psPAX2和pLenti-SFFV-eGFP连同表6所示的其它载体和条件转染人胚胎肾细胞(293LX细胞系)。转染后48小时收获假型化慢病毒样品。
然后通过超速离心将假型化慢病毒样品浓缩大约400倍。使用粗样品和浓缩样品来转导靶细胞，包括在转染后24小时用hCD8A和B瞬时转染的PanT细胞、Molt4.8细胞和293LX细胞(并且不天然地表达可检测量的CD8)。转导后六天，通过流式细胞术分析GFP表达。
表6：用于生产融合剂及其产生的假型化慢病毒样品的转染条件和载体，其然后用于靶细胞的转导
Figure BDA0004107707870002211
如图3A-3B所示，在用Xfect/DMEM转染的组织蛋白酶L水平升高的经修饰的细胞中产生的CD8靶向融合体在PanT细胞上的功能滴度比仅用pcDNA转染的对照细胞中产生的融合体高大约100倍。当用粗制或浓缩的假型化慢病毒样品转导靶细胞时，观察到这种大约100倍的差异。虽然在图3A-3B中仅显示PanT细胞的数据，但是用hCD8A和B瞬时转染的Molt4.8靶细胞和293LX靶细胞观察到类似结果。
此外，如图4和表7所示，通过流式细胞术对双重阳性CD8和GFP PanT细胞的数量进行定量。将GFP用作活性NivFd22-HA标记或未标记融合剂，从而成功转导靶细胞的标志物。当在由Xfect/DMEM转染的组织蛋白酶L水平升高的经修饰的细胞中产生融合体时，也对GFP呈阳性的CD8+PanT细胞的数量增加。
表7：用来自如表中所述经修饰的生产细胞的假型化慢病毒样品转导PanT细胞后，通过流式细胞术定量的双阳性CD8和GFP细胞的百分比
Figure BDA0004107707870002221
实施例4：在融合体生产细胞中，组织蛋白酶分子水平升高增加了亨尼帕病毒F蛋白加工并降低了总慢病毒颗粒数
本实施例描述了融合体生产细胞中组织蛋白酶L水平升高对所述生产细胞中亨尼帕病毒F蛋白加工的影响，以及组织蛋白酶水平升高对所得假型化慢病毒颗粒总数的影响。如实施例3和实施例3的表6中所述产生本实施例中的CD8靶向融合体生产细胞。
A.组织蛋白酶水平升高增加了融合体生产细胞及其所得假型化慢病毒中的亨尼帕病毒蛋白F加工
无活性的(F0)和有活性的(F1)亨尼帕病毒蛋白F的总量使用用抗HA抗体探测的蛋白质印迹上的条带密度进行定量。无活性亨尼帕病毒蛋白F(F0)的分子量为大约60kD，而活性亨尼帕病毒蛋白F(F1)的分子量为大约40kD。当生产细胞的组织蛋白酶L水平升高时，生产细胞及其相应假型化慢病毒样品中活性亨尼帕病毒蛋白F(F1)的量保持大致不变，而非活性蛋白(F0)的量减少，如图5A所示。通过使用抗蛋白F抗体的蛋白质印迹证实，该观察不受HA标签的存在的影响(数据未显示)。此外，在图5B中，在用高水平的组织蛋白酶L转染的生产细胞及其相应假型化慢病毒样品中，活性亨尼帕病毒蛋白F占总亨尼帕病毒蛋白F的百分比也增加。因此，图5A-5B表明，与仅用pcDNA转染的融合体生产对照细胞相比，高水平的组织蛋白酶增加了生产细胞中的亨尼帕病毒蛋白F加工。
B.用组织蛋白酶转染的经修饰的生产细胞表现出组织蛋白酶分子水平升高和加工组织蛋白酶的能力
使用来自实施例4A的相同蛋白质印迹膜评价前组织蛋白酶L和成熟组织蛋白酶L的水平。剥离膜并用抗组织蛋白酶L抗体重新探测。如图6中所观察到的，使用Xfect/DMEM方法用组织蛋白酶L转染的生产细胞显示出组织蛋白酶L水平升高，并且还将组织蛋白酶L原形式(分子量：大约38-42kD)加工成成熟的组织蛋白酶L形式(分子量：约25-35kD)。
C.组织蛋白酶水平升高降低了融合体生产细胞产生的假型化慢病毒颗粒中的p24水平
使用来自实施例4A和4B的相同蛋白质印迹膜测量由经修饰的生产细胞产生的假型化慢病毒样品中p24的表达水平。剥离膜并用抗p24抗体重新探测。p24是慢病毒衣壳蛋白，在此用作慢病毒颗粒的标志物。如图7所示，生产细胞中组织蛋白酶L水平升高降低了其相应假型化慢病毒样品中p24的表达。因此，与不过表达组织蛋白酶的生产对照细胞相比，生产细胞中组织蛋白酶水平升高降低了假型化慢病毒颗粒的总产量。尽管观察到生产细胞中组织蛋白酶水平升高导致形成更少的总体假型化慢病毒颗粒，但是观察到产生更大比例的活性颗粒。在一些实施方案中，包含较高比例活性颗粒的药物组合物有利于施用于受试者。
实施例5：组织蛋白酶水平升高降低了融合体生产细胞中亨尼帕病毒蛋白G的水平
本实施例描述了融合体生产细胞中组织蛋白酶L水平升高对生产细胞及其所得假型化慢病毒样品中亨尼帕病毒G蛋白表达的影响。使用实施例3和实施例3的表6中描述的相同方法产生本实施例中的CD8靶向融合体生产细胞。
如图8中所示，用抗His抗体对生产细胞及其所得假型化慢病毒样品中的亨尼帕病毒蛋白G(His标记)的水平进行蛋白质印迹分析。在经修饰的融合体生产细胞中，组织蛋白酶L水平升高导致亨尼帕病毒蛋白G的细胞表达降低。这些结果与产生的慢病毒颗粒总数较低一致，与上述实施例4中描述的结果一致。
序列表
Figure BDA0004107707870002241
/>
Figure BDA0004107707870002251
/>
Figure BDA0004107707870002261
/>
Figure BDA0004107707870002271
/>
Figure BDA0004107707870002281
/>
Figure BDA0004107707870002291
/>
Figure BDA0004107707870002301
/>
序列表
<110> 旗舰先锋创新V股份有限公司
<120> 用于产生病毒融合体的方法和组合物
<130> V2050-7026WO
<140> 随同提交
<141> 2021-07-06
<150> 63/048,524
<151> 2020-07-06
<160> 39
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性组织蛋白酶L1序列
<400> 1
Met Asp Tyr Ala Phe Gln Tyr Val Gln Asp Asn Gly Gly Leu Asp Ser
1 5 10 15
Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala Thr Glu Glu Ser Cys Lys Tyr Asn
20 25 30
Pro Lys Tyr Ser Val Ala Asn Asp Thr Gly Phe Val Asp Ile Pro Lys
35 40 45
Gln Glu Lys Ala Leu Met Lys Ala Val Ala Thr Val Gly Pro Ile Ser
50 55 60
Val Ala Ile Asp Ala Gly His Glu Ser Phe Leu Phe Tyr Lys Glu Gly
65 70 75 80
Ile Tyr Phe Glu Pro Asp Cys Ser Ser Glu Asp Met Asp His Gly Val
85 90 95
Leu Val Val Gly Tyr Gly Phe Glu Ser Thr Glu Ser Asp Asn Asn Lys
100 105 110
Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp Gly Glu Glu Trp Gly Met Gly Gly
115 120 125
Tyr Val Lys Met Ala Lys Asp Arg Arg Asn His Cys Gly Ile Ala Ser
130 135 140
Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val
145 150
<210> 2
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 示例性组织蛋白酶B序列
<400> 2
Met His Gly Asn Asn Gly His Ser Val Pro Pro Ser Lys Arg Ser Glu
1 5 10 15
Thr Arg Ala Pro Val Ala Pro Ala Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Ala
20 25 30
Glu Ala Trp Asn Phe Trp Thr Arg Lys Gly Leu Val Ser Gly Gly Leu
35 40 45
Tyr Glu Ser His Val Gly Cys Arg Pro Tyr Ser Ile Pro Pro Cys Glu
50 55 60
His His Val Asn Gly Ser Arg Pro Pro Cys Thr Gly Glu Gly Asp Thr
65 70 75 80
Pro Lys Cys Ser Lys Ile Cys Glu Pro Gly Tyr Ser Pro Thr Tyr Lys
85 90 95
Gln Asp Lys His Tyr Gly Tyr Asn Ser Tyr Ser Val Ser Asn Ser Glu
100 105 110
Lys Asp Ile Met Ala Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala
115 120 125
Phe Ser Val Tyr Ser Asp Phe Leu Leu Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Gln
130 135 140
His Val Thr Gly Glu Met Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly
145 150 155 160
Trp Gly Val Glu Asn Gly Thr Pro Tyr Trp Leu Val Ala Asn Ser Trp
165 170 175
Asn Thr Asp Trp Gly Asp Asn Gly Phe Phe Lys Ile Leu Arg Gly Gln
180 185 190
Asp His Cys Gly Ile Glu Ser Glu Val Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr
195 200 205
Asp Gln Tyr Trp Glu Lys Ile
210 215
<210> 3
<211> 546
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> HeVF
<400> 3
Met Ala Thr Gln Glu Val Arg Leu Lys Cys Leu Leu Cys Gly Ile Ile
1 5 10 15
Val Leu Val Leu Ser Leu Glu Gly Leu Gly Ile Leu His Tyr Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Ile Thr Arg Lys Tyr Lys Ile
35 40 45
Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val Ile Lys Met Ile Pro Asn
50 55 60
Val Ser Asn Val Ser Lys Cys Thr Gly Thr Val Met Glu Asn Tyr Lys
65 70 75 80
Ser Arg Leu Thr Gly Ile Leu Ser Pro Ile Lys Gly Ala Ile Glu Leu
85 90 95
Tyr Asn Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Lys Leu Ala Gly
100 105 110
Val Val Met Ala Gly Ile Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala Asp Asn Ile
130 135 140
Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala Val Val Lys
145 150 155 160
Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr Ala Leu Gln
165 170 175
Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Gln Ile Ser Cys
180 185 190
Lys Gln Thr Glu Leu Ala Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys Tyr Leu Ser
195 200 205
Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro Val Ser Asn
210 215 220
Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe Asp Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Ser Asp Ser Ile Ala Gly Gln Ile Val Tyr Val Asp Leu Ser
260 265 270
Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu Thr Glu Ile
275 280 285
Gln Gln Ala Tyr Val Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe Asn Asn Asp
290 295 300
Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Val Leu Ile Arg Asn
305 310 315 320
Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Val Lys Tyr Cys Leu Ile Thr Lys Lys
325 330 335
Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr Ala Ser Val
340 345 350
Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Asp Lys Cys Pro Arg Glu Leu Val
355 360 365
Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Gly Gly Val Leu Phe
370 375 380
Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr Gly Arg Ala
385 390 395 400
Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp Asn Thr Thr
405 410 415
Cys Thr Thr Val Val Leu Gly Asn Ile Ile Ile Ser Leu Gly Lys Tyr
420 425 430
Leu Gly Ser Ile Asn Tyr Asn Ser Glu Ser Ile Ala Val Gly Pro Pro
435 440 445
Val Tyr Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser Ser Met Asn
450 455 460
Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala Gln Lys Ile
465 470 475 480
Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile Ile
485 490 495
Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ala Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr Phe
500 505 510
Ile Ser Phe Val Ile Val Glu Lys Lys Arg Gly Asn Tyr Ser Arg Leu
515 520 525
Asp Asp Arg Gln Val Arg Pro Val Ser Asn Gly Asp Leu Tyr Tyr Ile
530 535 540
Gly Thr
545
<210> 4
<211> 557
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CedVF
<400> 4
Met Ser Asn Lys Arg Thr Thr Val Leu Ile Ile Ile Ser Tyr Thr Leu
1 5 10 15
Phe Tyr Leu Asn Asn Ala Ala Ile Val Gly Phe Asp Phe Asp Lys Leu
20 25 30
Asn Lys Ile Gly Val Val Gln Gly Arg Val Leu Asn Tyr Lys Ile Lys
35 40 45
Gly Asp Pro Met Thr Lys Asp Leu Val Leu Lys Phe Ile Pro Asn Ile
50 55 60
Val Asn Ile Thr Glu Cys Val Arg Glu Pro Leu Ser Arg Tyr Asn Glu
65 70 75 80
Thr Val Arg Arg Leu Leu Leu Pro Ile His Asn Met Leu Gly Leu Tyr
85 90 95
Leu Asn Asn Thr Asn Ala Lys Met Thr Gly Leu Met Ile Ala Gly Val
100 105 110
Ile Met Gly Gly Ile Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr
115 120 125
Ala Gly Phe Ala Leu Tyr Glu Ala Lys Lys Asn Thr Glu Asn Ile Gln
130 135 140
Lys Leu Thr Asp Ser Ile Met Lys Thr Gln Asp Ser Ile Asp Lys Leu
145 150 155 160
Thr Asp Ser Val Gly Thr Ser Ile Leu Ile Leu Asn Lys Leu Gln Thr
165 170 175
Tyr Ile Asn Asn Gln Leu Val Pro Asn Leu Glu Leu Leu Ser Cys Arg
180 185 190
Gln Asn Lys Ile Glu Phe Asp Leu Met Leu Thr Lys Tyr Leu Val Asp
195 200 205
Leu Met Thr Val Ile Gly Pro Asn Ile Asn Asn Pro Val Asn Lys Asp
210 215 220
Met Thr Ile Gln Ser Leu Ser Leu Leu Phe Asp Gly Asn Tyr Asp Ile
225 230 235 240
Met Met Ser Glu Leu Gly Tyr Thr Pro Gln Asp Phe Leu Asp Leu Ile
245 250 255
Glu Ser Lys Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Met Glu Asn
260 265 270
Leu Tyr Val Val Ile Arg Thr Tyr Leu Pro Thr Leu Ile Glu Val Pro
275 280 285
Asp Ala Gln Ile Tyr Glu Phe Asn Lys Ile Thr Met Ser Ser Asn Gly
290 295 300
Gly Glu Tyr Leu Ser Thr Ile Pro Asn Phe Ile Leu Ile Arg Gly Asn
305 310 315 320
Tyr Met Ser Asn Ile Asp Val Ala Thr Cys Tyr Met Thr Lys Ala Ser
325 330 335
Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ser Leu Pro Met Ser Gln Asn Leu Arg
340 345 350
Ser Cys Tyr Gln Gly Glu Thr Glu Tyr Cys Pro Val Glu Ala Val Ile
355 360 365
Ala Ser His Ser Pro Arg Phe Ala Leu Thr Asn Gly Val Ile Phe Ala
370 375 380
Asn Cys Ile Asn Thr Ile Cys Arg Cys Gln Asp Asn Gly Lys Thr Ile
385 390 395 400
Thr Gln Asn Ile Asn Gln Phe Val Ser Met Ile Asp Asn Ser Thr Cys
405 410 415
Asn Asp Val Met Val Asp Lys Phe Thr Ile Lys Val Gly Lys Tyr Met
420 425 430
Gly Arg Lys Asp Ile Asn Asn Ile Asn Ile Gln Ile Gly Pro Gln Ile
435 440 445
Ile Ile Asp Lys Val Asp Leu Ser Asn Glu Ile Asn Lys Met Asn Gln
450 455 460
Ser Leu Lys Asp Ser Ile Phe Tyr Leu Arg Glu Ala Lys Arg Ile Leu
465 470 475 480
Asp Ser Val Asn Ile Ser Leu Ile Ser Pro Ser Val Gln Leu Phe Leu
485 490 495
Ile Ile Ile Ser Val Leu Ser Phe Ile Ile Leu Leu Ile Ile Ile Val
500 505 510
Tyr Leu Tyr Cys Lys Ser Lys His Ser Tyr Lys Tyr Asn Lys Phe Ile
515 520 525
Asp Asp Pro Asp Tyr Tyr Asn Asp Tyr Lys Arg Glu Arg Ile Asn Gly
530 535 540
Lys Ala Ser Lys Ser Asn Asn Ile Tyr Tyr Val Gly Asp
545 550 555
<210> 5
<211> 545
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 墨江病毒F
<400> 5
Met Ala Leu Asn Lys Asn Met Phe Ser Ser Leu Phe Leu Gly Tyr Leu
1 5 10 15
Leu Val Tyr Ala Thr Thr Val Gln Ser Ser Ile His Tyr Asp Ser Leu
20 25 30
Ser Lys Val Gly Val Ile Lys Gly Leu Thr Tyr Asn Tyr Lys Ile Lys
35 40 45
Gly Ser Pro Ser Thr Lys Leu Met Val Val Lys Leu Ile Pro Asn Ile
50 55 60
Asp Ser Val Lys Asn Cys Thr Gln Lys Gln Tyr Asp Glu Tyr Lys Asn
65 70 75 80
Leu Val Arg Lys Ala Leu Glu Pro Val Lys Met Ala Ile Asp Thr Met
85 90 95
Leu Asn Asn Val Lys Ser Gly Asn Asn Lys Tyr Arg Phe Ala Gly Ala
100 105 110
Ile Met Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala Ala Thr Val Thr
115 120 125
Ala Gly Ile Ala Leu His Arg Ser Asn Glu Asn Ala Gln Ala Ile Ala
130 135 140
Asn Met Lys Ser Ala Ile Gln Asn Thr Asn Glu Ala Val Lys Gln Leu
145 150 155 160
Gln Leu Ala Asn Lys Gln Thr Leu Ala Val Ile Asp Thr Ile Arg Gly
165 170 175
Glu Ile Asn Asn Asn Ile Ile Pro Val Ile Asn Gln Leu Ser Cys Asp
180 185 190
Thr Ile Gly Leu Ser Val Gly Ile Arg Leu Thr Gln Tyr Tyr Ser Glu
195 200 205
Ile Ile Thr Ala Phe Gly Pro Ala Leu Gln Asn Pro Val Asn Thr Arg
210 215 220
Ile Thr Ile Gln Ala Ile Ser Ser Val Phe Asn Gly Asn Phe Asp Glu
225 230 235 240
Leu Leu Lys Ile Met Gly Tyr Thr Ser Gly Asp Leu Tyr Glu Ile Leu
245 250 255
His Ser Glu Leu Ile Arg Gly Asn Ile Ile Asp Val Asp Val Asp Ala
260 265 270
Gly Tyr Ile Ala Leu Glu Ile Glu Phe Pro Asn Leu Thr Leu Val Pro
275 280 285
Asn Ala Val Val Gln Glu Leu Met Pro Ile Ser Tyr Asn Ile Asp Gly
290 295 300
Asp Glu Trp Val Thr Leu Val Pro Arg Phe Val Leu Thr Arg Thr Thr
305 310 315 320
Leu Leu Ser Asn Ile Asp Thr Ser Arg Cys Thr Ile Thr Asp Ser Ser
325 330 335
Val Ile Cys Asp Asn Asp Tyr Ala Leu Pro Met Ser His Glu Leu Ile
340 345 350
Gly Cys Leu Gln Gly Asp Thr Ser Lys Cys Ala Arg Glu Lys Val Val
355 360 365
Ser Ser Tyr Val Pro Lys Phe Ala Leu Ser Asp Gly Leu Val Tyr Ala
370 375 380
Asn Cys Leu Asn Thr Ile Cys Arg Cys Met Asp Thr Asp Thr Pro Ile
385 390 395 400
Ser Gln Ser Leu Gly Ala Thr Val Ser Leu Leu Asp Asn Lys Arg Cys
405 410 415
Ser Val Tyr Gln Val Gly Asp Val Leu Ile Ser Val Gly Ser Tyr Leu
420 425 430
Gly Asp Gly Glu Tyr Asn Ala Asp Asn Val Glu Leu Gly Pro Pro Ile
435 440 445
Val Ile Asp Lys Ile Asp Ile Gly Asn Gln Leu Ala Gly Ile Asn Gln
450 455 460
Thr Leu Gln Glu Ala Glu Asp Tyr Ile Glu Lys Ser Glu Glu Phe Leu
465 470 475 480
Lys Gly Val Asn Pro Ser Ile Ile Thr Leu Gly Ser Met Val Val Leu
485 490 495
Tyr Ile Phe Met Ile Leu Ile Ala Ile Val Ser Val Ile Ala Leu Val
500 505 510
Leu Ser Ile Lys Leu Thr Val Lys Gly Asn Val Val Arg Gln Gln Phe
515 520 525
Thr Tyr Thr Gln His Val Pro Ser Met Glu Asn Ile Asn Tyr Val Ser
530 535 540
His
545
<210> 6
<211> 662
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Bat PV F
<400> 6
Met Lys Lys Lys Thr Asp Asn Pro Thr Ile Ser Lys Arg Gly His Asn
1 5 10 15
His Ser Arg Gly Ile Lys Ser Arg Ala Leu Leu Arg Glu Thr Asp Asn
20 25 30
Tyr Ser Asn Gly Leu Ile Val Glu Asn Leu Val Arg Asn Cys His His
35 40 45
Pro Ser Lys Asn Asn Leu Asn Tyr Thr Lys Thr Gln Lys Arg Asp Ser
50 55 60
Thr Ile Pro Tyr Arg Val Glu Glu Arg Lys Gly His Tyr Pro Lys Ile
65 70 75 80
Lys His Leu Ile Asp Lys Ser Tyr Lys His Ile Lys Arg Gly Lys Arg
85 90 95
Arg Asn Gly His Asn Gly Asn Ile Ile Thr Ile Ile Leu Leu Leu Ile
100 105 110
Leu Ile Leu Lys Thr Gln Met Ser Glu Gly Ala Ile His Tyr Glu Thr
115 120 125
Leu Ser Lys Ile Gly Leu Ile Lys Gly Ile Thr Arg Glu Tyr Lys Val
130 135 140
Lys Gly Thr Pro Ser Ser Lys Asp Ile Val Ile Lys Leu Ile Pro Asn
145 150 155 160
Val Thr Gly Leu Asn Lys Cys Thr Asn Ile Ser Met Glu Asn Tyr Lys
165 170 175
Glu Gln Leu Asp Lys Ile Leu Ile Pro Ile Asn Asn Ile Ile Glu Leu
180 185 190
Tyr Ala Asn Ser Thr Lys Ser Ala Pro Gly Asn Ala Arg Phe Ala Gly
195 200 205
Val Ile Ile Ala Gly Val Ala Leu Gly Val Ala Ala Ala Ala Gln Ile
210 215 220
Thr Ala Gly Ile Ala Leu His Glu Ala Arg Gln Asn Ala Glu Arg Ile
225 230 235 240
Asn Leu Leu Lys Asp Ser Ile Ser Ala Thr Asn Asn Ala Val Ala Glu
245 250 255
Leu Gln Glu Ala Thr Gly Gly Ile Val Asn Val Ile Thr Gly Met Gln
260 265 270
Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Gln Ile Asp Lys Leu Gln Cys
275 280 285
Ser Gln Ile Lys Thr Ala Leu Asp Ile Ser Leu Ser Gln Tyr Tyr Ser
290 295 300
Glu Ile Leu Thr Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asn Pro Val Thr Thr
305 310 315 320
Ser Met Ser Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ser Phe Gly Gly Asn Ile Asp
325 330 335
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Ser Asn Ala Tyr Val Gln Glu Leu Ile Lys Ile Ser Phe Asn Val Asp
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<210> 12
<211> 625
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 墨江病毒G
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245 250 255
Arg Ile Val Asp Lys Gly Gln Gln Gly Pro Gln Ala Ser Pro Leu Leu
260 265 270
Val Trp Ala Val Pro Asn Pro Lys Ile Ile Asn Ser Cys Ala Val Ala
275 280 285
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Leu Lys Ser Gln Asp Pro Ile Met Lys Ile Leu Ser Thr Cys Thr Asn
485 490 495
Thr Asp Arg Asp Met Cys Pro Glu Ile Cys Asn Thr Arg Gly Tyr Gln
500 505 510
Asp Ile Phe Pro Leu Ser Glu Asp Ser Glu Tyr Tyr Thr Tyr Ile Gly
515 520 525
Ile Thr Pro Asn Asn Gly Gly Thr Lys Asn Phe Val Ala Val Arg Asp
530 535 540
Ser Asp Gly His Ile Ala Ser Ile Asp Ile Leu Gln Asn Tyr Tyr Ser
545 550 555 560
Ile Thr Ser Ala Thr Ile Ser Cys Phe Met Tyr Lys Asp Glu Ile Trp
565 570 575
Cys Ile Ala Ile Thr Glu Gly Lys Lys Gln Lys Asp Asn Pro Gln Arg
580 585 590
Ile Tyr Ala His Ser Tyr Lys Ile Arg Gln Met Cys Tyr Asn Met Lys
595 600 605
Ser Ala Thr Val Thr Val Gly Asn Ala Lys Asn Ile Thr Ile Arg Arg
610 615 620
Tyr
625
<210> 13
<211> 520
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 尼帕病毒NiV-F F0 (aa 27-546)
<400> 13
Ile Leu His Tyr Glu Lys Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val
1 5 10 15
Thr Arg Lys Tyr Lys Ile Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val
20 25 30
Ile Lys Met Ile Pro Asn Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser
35 40 45
Val Met Glu Asn Tyr Lys Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile
50 55 60
Lys Gly Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly
65 70 75 80
Asp Val Arg Leu Ala Gly Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile
85 90 95
Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met
100 105 110
Lys Asn Ala Asp Asn Ile Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr
115 120 125
Asn Glu Ala Val Val Lys Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr
130 135 140
Val Leu Thr Ala Leu Gln Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr
145 150 155 160
Ile Asp Lys Ile Ser Cys Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala
165 170 175
Leu Ser Lys Tyr Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu
180 185 190
Gln Asp Pro Val Ser Asn Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala
195 200 205
Phe Gly Gly Asn Tyr Glu Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr
210 215 220
Glu Asp Phe Asp Asp Leu Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile
225 230 235 240
Ile Tyr Val Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe
245 250 255
Pro Ile Leu Thr Glu Ile Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro
260 265 270
Val Ser Phe Asn Asn Asp Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn
275 280 285
Phe Ile Leu Val Arg Asn Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe
290 295 300
Cys Leu Ile Thr Lys Arg Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr
305 310 315 320
Pro Met Thr Asn Asn Met Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys
325 330 335
Cys Pro Arg Glu Leu Val Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu
340 345 350
Ser Asn Gly Val Leu Phe Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys
355 360 365
Gln Thr Thr Gly Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu
370 375 380
Met Ile Asp Asn Thr Thr Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile
385 390 395 400
Ile Ser Leu Gly Lys Tyr Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly
405 410 415
Ile Ala Ile Gly Pro Pro Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser
420 425 430
Gln Ile Ser Ser Met Asn Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile
435 440 445
Lys Glu Ala Gln Arg Leu Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser
450 455 460
Met Leu Ser Met Ile Ile Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys
465 470 475 480
Ile Gly Leu Ile Thr Phe Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg
485 490 495
Asn Thr Tyr Ser Arg Leu Glu Asp Arg Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser
500 505 510
Gly Asp Leu Tyr Tyr Ile Gly Thr
515 520
<210> 14
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NiV-F F2 (aa 27-109)
<400> 14
Ile Leu His Tyr Glu Lys Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val
1 5 10 15
Thr Arg Lys Tyr Lys Ile Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val
20 25 30
Ile Lys Met Ile Pro Asn Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser
35 40 45
Val Met Glu Asn Tyr Lys Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile
50 55 60
Lys Gly Ala Leu Glu Ile Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly
65 70 75 80
Asp Val Arg
<210> 15
<211> 437
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NiV F F1 (aa 110-546)
<400> 15
Leu Ala Gly Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ile Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala
20 25 30
Asp Asn Ile Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala
35 40 45
Val Val Lys Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr
50 55 60
Ala Leu Gln Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Lys
65 70 75 80
Ile Ser Cys Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys
85 90 95
Tyr Leu Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro
100 105 110
Val Ser Asn Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly
115 120 125
Asn Tyr Glu Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe
130 135 140
Asp Asp Leu Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val
145 150 155 160
Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu
165 170 175
Thr Glu Ile Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe
180 185 190
Asn Asn Asp Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Ile Leu
195 200 205
Val Arg Asn Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe Cys Leu Ile
210 215 220
Thr Lys Arg Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr
225 230 235 240
Asn Asn Met Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys Cys Pro Arg
245 250 255
Glu Leu Val Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Asn Gly
260 265 270
Val Leu Phe Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr
275 280 285
Gly Arg Ala Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp
290 295 300
Asn Thr Thr Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile Ile Ser Leu
305 310 315 320
Gly Lys Tyr Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly Ile Ala Ile
325 330 335
Gly Pro Pro Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser
340 345 350
Ser Met Asn Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala
355 360 365
Gln Arg Leu Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser
370 375 380
Met Ile Ile Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys Ile Gly Leu
385 390 395 400
Ile Thr Phe Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg Asn Thr Tyr
405 410 415
Ser Arg Leu Glu Asp Arg Arg Val Arg Pro Thr Ser Ser Gly Asp Leu
420 425 430
Tyr Tyr Ile Gly Thr
435
<210> 16
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 信号序列
<400> 16
Met Val Val Ile Leu Asp Lys Arg Cys Tyr Cys Asn Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ile Leu Met Ile Ser Glu Cys Ser Val Gly
20 25
<210> 17
<211> 524
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NiVF T234
<400> 17
Met Val Val Ile Leu Asp Lys Arg Cys Tyr Cys Asn Leu Leu Ile Leu
1 5 10 15
Ile Leu Met Ile Ser Glu Cys Ser Val Gly Ile Leu His Tyr Glu Lys
20 25 30
Leu Ser Lys Ile Gly Leu Val Lys Gly Val Thr Arg Lys Tyr Lys Ile
35 40 45
Lys Ser Asn Pro Leu Thr Lys Asp Ile Val Ile Lys Met Ile Pro Asn
50 55 60
Val Ser Asn Met Ser Gln Cys Thr Gly Ser Val Met Glu Asn Tyr Lys
65 70 75 80
Thr Arg Leu Asn Gly Ile Leu Thr Pro Ile Lys Gly Ala Leu Glu Ile
85 90 95
Tyr Lys Asn Asn Thr His Asp Leu Val Gly Asp Val Arg Leu Ala Gly
100 105 110
Val Ile Met Ala Gly Val Ala Ile Gly Ile Ala Thr Ala Ala Gln Ile
115 120 125
Thr Ala Gly Val Ala Leu Tyr Glu Ala Met Lys Asn Ala Asp Asn Ile
130 135 140
Asn Lys Leu Lys Ser Ser Ile Glu Ser Thr Asn Glu Ala Val Val Lys
145 150 155 160
Leu Gln Glu Thr Ala Glu Lys Thr Val Tyr Val Leu Thr Ala Leu Gln
165 170 175
Asp Tyr Ile Asn Thr Asn Leu Val Pro Thr Ile Asp Lys Ile Ser Cys
180 185 190
Lys Gln Thr Glu Leu Ser Leu Asp Leu Ala Leu Ser Lys Tyr Leu Ser
195 200 205
Asp Leu Leu Phe Val Phe Gly Pro Asn Leu Gln Asp Pro Val Ser Asn
210 215 220
Ser Met Thr Ile Gln Ala Ile Ser Gln Ala Phe Gly Gly Asn Tyr Glu
225 230 235 240
Thr Leu Leu Arg Thr Leu Gly Tyr Ala Thr Glu Asp Phe Asp Asp Leu
245 250 255
Leu Glu Ser Asp Ser Ile Thr Gly Gln Ile Ile Tyr Val Asp Leu Ser
260 265 270
Ser Tyr Tyr Ile Ile Val Arg Val Tyr Phe Pro Ile Leu Thr Glu Ile
275 280 285
Gln Gln Ala Tyr Ile Gln Glu Leu Leu Pro Val Ser Phe Asn Asn Asp
290 295 300
Asn Ser Glu Trp Ile Ser Ile Val Pro Asn Phe Ile Leu Val Arg Asn
305 310 315 320
Thr Leu Ile Ser Asn Ile Glu Ile Gly Phe Cys Leu Ile Thr Lys Arg
325 330 335
Ser Val Ile Cys Asn Gln Asp Tyr Ala Thr Pro Met Thr Asn Asn Met
340 345 350
Arg Glu Cys Leu Thr Gly Ser Thr Glu Lys Cys Pro Arg Glu Leu Val
355 360 365
Val Ser Ser His Val Pro Arg Phe Ala Leu Ser Asn Gly Val Leu Phe
370 375 380
Ala Asn Cys Ile Ser Val Thr Cys Gln Cys Gln Thr Thr Gly Arg Ala
385 390 395 400
Ile Ser Gln Ser Gly Glu Gln Thr Leu Leu Met Ile Asp Asn Thr Thr
405 410 415
Cys Pro Thr Ala Val Leu Gly Asn Val Ile Ile Ser Leu Gly Lys Tyr
420 425 430
Leu Gly Ser Val Asn Tyr Asn Ser Glu Gly Ile Ala Ile Gly Pro Pro
435 440 445
Val Phe Thr Asp Lys Val Asp Ile Ser Ser Gln Ile Ser Ser Met Asn
450 455 460
Gln Ser Leu Gln Gln Ser Lys Asp Tyr Ile Lys Glu Ala Gln Arg Leu
465 470 475 480
Leu Asp Thr Val Asn Pro Ser Leu Ile Ser Met Leu Ser Met Ile Ile
485 490 495
Leu Tyr Val Leu Ser Ile Ala Ser Leu Cys Ile Gly Leu Ile Thr Phe
500 505 510
Ile Ser Phe Ile Ile Val Glu Lys Lys Arg Asn Thr
515 520
<210> 18
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 变体NiVG
<400> 18
Met Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser Ala
1 5 10 15
Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val Met
20 25 30
Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln Ala
35 40 45
Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly Leu
50 55 60
Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp
65 70 75 80
Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser
85 90 95
Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu Lys
100 105 110
Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser
115 120 125
Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu Gly
130 135 140
Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys Thr
145 150 155 160
Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Val
165 170 175
Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met Asp
180 185 190
Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys Ser
195 200 205
Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp
210 215 220
Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro
225 230 235 240
Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn Glu
245 250 255
Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile Leu
260 265 270
Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala Val
275 280 285
Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala Leu
290 295 300
Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro
305 310 315 320
Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe
325 330 335
Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Thr
340 345 350
Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Ile
355 360 365
Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn
370 375 380
Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser Asp
385 390 395 400
Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu Gly
405 410 415
Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys
420 425 430
Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg Asn
435 440 445
Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn
450 455 460
Thr Cys Pro Ala Ile Cys Ala Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe Leu
465 470 475 480
Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser Asn
485 490 495
Ala Thr Ala Ala Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile
500 505 510
Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr
515 520 525
Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser Leu
530 535 540
Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe
545 550 555 560
Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys
565
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<400> 19
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<400> 20
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223>接头
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)...(5)
<223> N =1-10
<400> 21
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)...(6)
<223> N=1-6
<400> 22
Gly Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 23
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OTC
<400> 23
Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn
1 5 10 15
Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln
20 25 30
Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe
35 40 45
Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys
50 55 60
Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys
65 70 75 80
Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser
85 90 95
Thr Glu Thr Gly Phe Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr
100 105 110
Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala
115 120 125
Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys
130 135 140
Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile
145 150 155 160
Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr
165 170 175
Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser
180 185 190
Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala
195 200 205
Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu
210 215 220
Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly
245 250 255
Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu
260 265 270
Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met
275 280 285
Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu
290 295 300
Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg
305 310 315 320
Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala
325 330 335
Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro
340 345 350
Lys Phe
<210> 24
<211> 860
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> LDLR
<400> 24
Met Gly Pro Trp Gly Trp Lys Leu Arg Trp Thr Val Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Thr Ala Val Gly Asp Arg Cys Glu Arg Asn Glu Phe
20 25 30
Gln Cys Gln Asp Gly Lys Cys Ile Ser Tyr Lys Trp Val Cys Asp Gly
35 40 45
Ser Ala Glu Cys Gln Asp Gly Ser Asp Glu Ser Gln Glu Thr Cys Leu
50 55 60
Ser Val Thr Cys Lys Ser Gly Asp Phe Ser Cys Gly Gly Arg Val Asn
65 70 75 80
Arg Cys Ile Pro Gln Phe Trp Arg Cys Asp Gly Gln Val Asp Cys Asp
85 90 95
Asn Gly Ser Asp Glu Gln Gly Cys Pro Pro Lys Thr Cys Ser Gln Asp
100 105 110
Glu Phe Arg Cys His Asp Gly Lys Cys Ile Ser Arg Gln Phe Val Cys
115 120 125
Asp Ser Asp Arg Asp Cys Leu Asp Gly Ser Asp Glu Ala Ser Cys Pro
130 135 140
Val Leu Thr Cys Gly Pro Ala Ser Phe Gln Cys Asn Ser Ser Thr Cys
145 150 155 160
Ile Pro Gln Leu Trp Ala Cys Asp Asn Asp Pro Asp Cys Glu Asp Gly
165 170 175
Ser Asp Glu Trp Pro Gln Arg Cys Arg Gly Leu Tyr Val Phe Gln Gly
180 185 190
Asp Ser Ser Pro Cys Ser Ala Phe Glu Phe His Cys Leu Ser Gly Glu
195 200 205
Cys Ile His Ser Ser Trp Arg Cys Asp Gly Gly Pro Asp Cys Lys Asp
210 215 220
Lys Ser Asp Glu Glu Asn Cys Ala Val Ala Thr Cys Arg Pro Asp Glu
225 230 235 240
Phe Gln Cys Ser Asp Gly Asn Cys Ile His Gly Ser Arg Gln Cys Asp
245 250 255
Arg Glu Tyr Asp Cys Lys Asp Met Ser Asp Glu Val Gly Cys Val Asn
260 265 270
Val Thr Leu Cys Glu Gly Pro Asn Lys Phe Lys Cys His Ser Gly Glu
275 280 285
Cys Ile Thr Leu Asp Lys Val Cys Asn Met Ala Arg Asp Cys Arg Asp
290 295 300
Trp Ser Asp Glu Pro Ile Lys Glu Cys Gly Thr Asn Glu Cys Leu Asp
305 310 315 320
Asn Asn Gly Gly Cys Ser His Val Cys Asn Asp Leu Lys Ile Gly Tyr
325 330 335
Glu Cys Leu Cys Pro Asp Gly Phe Gln Leu Val Ala Gln Arg Arg Cys
340 345 350
Glu Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Pro Asp Thr Cys Ser Gln Leu Cys
355 360 365
Val Asn Leu Glu Gly Gly Tyr Lys Cys Gln Cys Glu Glu Gly Phe Gln
370 375 380
Leu Asp Pro His Thr Lys Ala Cys Lys Ala Val Gly Ser Ile Ala Tyr
385 390 395 400
Leu Phe Phe Thr Asn Arg His Glu Val Arg Lys Met Thr Leu Asp Arg
405 410 415
Ser Glu Tyr Thr Ser Leu Ile Pro Asn Leu Arg Asn Val Val Ala Leu
420 425 430
Asp Thr Glu Val Ala Ser Asn Arg Ile Tyr Trp Ser Asp Leu Ser Gln
435 440 445
Arg Met Ile Cys Ser Thr Gln Leu Asp Arg Ala His Gly Val Ser Ser
450 455 460
Tyr Asp Thr Val Ile Ser Arg Asp Ile Gln Ala Pro Asp Gly Leu Ala
465 470 475 480
Val Asp Trp Ile His Ser Asn Ile Tyr Trp Thr Asp Ser Val Leu Gly
485 490 495
Thr Val Ser Val Ala Asp Thr Lys Gly Val Lys Arg Lys Thr Leu Phe
500 505 510
Arg Glu Asn Gly Ser Lys Pro Arg Ala Ile Val Val Asp Pro Val His
515 520 525
Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Thr Pro Ala Lys Ile Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Leu Asn Gly Val Asp Ile Tyr Ser Leu Val Thr Glu Asn Ile
545 550 555 560
Gln Trp Pro Asn Gly Ile Thr Leu Asp Leu Leu Ser Gly Arg Leu Tyr
565 570 575
Trp Val Asp Ser Lys Leu His Ser Ile Ser Ser Ile Asp Val Asn Gly
580 585 590
Gly Asn Arg Lys Thr Ile Leu Glu Asp Glu Lys Arg Leu Ala His Pro
595 600 605
Phe Ser Leu Ala Val Phe Glu Asp Lys Val Phe Trp Thr Asp Ile Ile
610 615 620
Asn Glu Ala Ile Phe Ser Ala Asn Arg Leu Thr Gly Ser Asp Val Asn
625 630 635 640
Leu Leu Ala Glu Asn Leu Leu Ser Pro Glu Asp Met Val Leu Phe His
645 650 655
Asn Leu Thr Gln Pro Arg Gly Val Asn Trp Cys Glu Arg Thr Thr Leu
660 665 670
Ser Asn Gly Gly Cys Gln Tyr Leu Cys Leu Pro Ala Pro Gln Ile Asn
675 680 685
Pro His Ser Pro Lys Phe Thr Cys Ala Cys Pro Asp Gly Met Leu Leu
690 695 700
Ala Arg Asp Met Arg Ser Cys Leu Thr Glu Ala Glu Ala Ala Val Ala
705 710 715 720
Thr Gln Glu Thr Ser Thr Val Arg Leu Lys Val Ser Ser Thr Ala Val
725 730 735
Arg Thr Gln His Thr Thr Thr Arg Pro Val Pro Asp Thr Ser Arg Leu
740 745 750
Pro Gly Ala Thr Pro Gly Leu Thr Thr Val Glu Ile Val Thr Met Ser
755 760 765
His Gln Ala Leu Gly Asp Val Ala Gly Arg Gly Asn Glu Lys Lys Pro
770 775 780
Ser Ser Val Arg Ala Leu Ser Ile Val Leu Pro Ile Val Leu Leu Val
785 790 795 800
Phe Leu Cys Leu Gly Val Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg Leu Lys
805 810 815
Asn Ile Asn Ser Ile Asn Phe Asp Asn Pro Val Tyr Gln Lys Thr Thr
820 825 830
Glu Asp Glu Val His Ile Cys His Asn Gln Asp Gly Tyr Ser Tyr Pro
835 840 845
Ser Arg Gln Met Val Ser Leu Glu Asp Asp Val Ala
850 855 860
<210> 25
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 scFv (FMC63)
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 26
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗CD19 scFv (FMC63)
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu
115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg
145 150 155 160
Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser
165 170 175
Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile
180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln
195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly
210 215 220
Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IgG4铰链
<400> 27
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
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<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD8铰链
<400> 28
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
20 25
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<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28
<400> 29
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1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro
35
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<400> 30
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
1 5 10 15
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
20 25 30
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
35 40
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28
<400> 31
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
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<211> 27
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28
<400> 32
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
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Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 4-1BB
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
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<212> PRT
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<223> CD3ζ
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
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<220>
<223> CD3ζ
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Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
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<212> PRT
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<220>
<223> Uniprot P07711
<400> 37
Ala Pro Arg Ser Val Asp Trp Arg Glu Lys Gly Tyr Val Thr Pro Val
1 5 10 15
Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Thr Gly
20 25 30
Ala Leu Glu Gly Gln Met Phe Arg Lys Thr Gly Arg Leu Ile Ser Leu
35 40 45
Ser Glu Gln Asn Leu Val Asp Cys Ser Gly Pro Gln Gly Asn Glu Gly
50 55 60
Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Gln Tyr Val Gln Asp Asn
65 70 75 80
Gly Gly Leu Asp Ser Glu Glu Ser Tyr Pro Tyr Glu Ala Thr Glu Glu
85 90 95
Ser Cys Lys Tyr Asn Pro Lys Tyr Ser Val Ala Asn Asp Thr Gly Phe
100 105 110
Val Asp Ile Pro Lys Gln Glu Lys Ala Leu Met Lys Ala Val Ala Thr
115 120 125
Val Gly Pro Ile Ser Val Ala Ile Asp Ala Gly His Glu Ser Phe Leu
130 135 140
Phe Tyr Lys Glu Gly Ile Tyr Phe Glu Pro Asp Cys Ser Ser Glu Asp
145 150 155 160
Met Asp His Gly Val Leu Val Val Gly Tyr Gly Phe Glu Ser Thr Glu
165 170 175
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180 185 190
Trp Gly Met Gly Gly Tyr Val Lys Met Ala Lys Asp Arg Arg Asn His
195 200 205
Cys Gly Ile Ala Ser Ala Ala Ser Tyr Pro Thr Val
210 215 220
<210> 38
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Uniprot P07858
<400> 38
Leu Pro Ala Ser Phe Asp Ala Arg Glu Gln Trp Pro Gln Cys Pro Thr
1 5 10 15
Ile Lys Glu Ile Arg Asp Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe
20 25 30
Gly Ala Val Glu Ala Ile Ser Asp Arg Ile Cys Ile His Thr Asn Ala
35 40 45
His Val Ser Val Glu Val Ser Ala Glu Asp Leu Leu Thr Cys Cys Gly
50 55 60
Ser Met Cys Gly Asp Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Ala Glu Ala Trp
65 70 75 80
Asn Phe Trp Thr Arg Lys Gly Leu Val Ser Gly Gly Leu Tyr Glu Ser
85 90 95
His Val Gly Cys Arg Pro Tyr Ser Ile Pro Pro Cys Glu His His Val
100 105 110
Asn Gly Ser Arg Pro Pro Cys Thr Gly Glu Gly Asp Thr Pro Lys Cys
115 120 125
Ser Lys Ile Cys Glu Pro Gly Tyr Ser Pro Thr Tyr Lys Gln Asp Lys
130 135 140
His Tyr Gly Tyr Asn Ser Tyr Ser Val Ser Asn Ser Glu Lys Asp Ile
145 150 155 160
Met Ala Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala Phe Ser Val
165 170 175
Tyr Ser Asp Phe Leu Leu Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Gln His Val Thr
180 185 190
Gly Glu Met Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly Trp Gly Val
195 200 205
Glu Asn Gly Thr Pro Tyr Trp Leu Val Ala Asn Ser Trp Asn Thr Asp
210 215 220
Trp Gly Asp Asn Gly Phe Phe Lys Ile Leu Arg Gly Gln Asp His Cys
225 230 235 240
Gly Ile Glu Ser Glu Val Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr Asp Gln Tyr
245 250 255
Trp Glu Lys Ile
260
<210> 39
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Uniprot P07858
<400> 39
Leu Pro Ala Ser Phe Asp Ala Arg Glu Gln Trp Pro Gln Cys Pro Thr
1 5 10 15
Ile Lys Glu Ile Arg Asp Gln Gly Ser Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe
20 25 30
Gly Ala Val Glu Ala Ile Ser Asp Arg Ile Cys Ile His Thr Asn Ala
35 40 45
His Val Ser Val Glu Val Ser Ala Glu Asp Leu Leu Thr Cys Cys Gly
50 55 60
Ser Met Cys Gly Asp Gly Cys Asn Gly Gly Tyr Pro Ala Glu Ala Trp
65 70 75 80
Asn Phe Trp Thr Arg Lys Gly Leu Val Ser Gly Gly Leu Tyr Glu Ser
85 90 95
His Val Gly Cys Arg Pro Tyr Ser Ile Pro Pro Cys Glu His His Val
100 105 110
Asn Gly Ser Arg Pro Pro Cys Thr Gly Glu Gly Asp Thr Pro Lys Cys
115 120 125
Ser Lys Ile Cys Glu Pro Gly Tyr Ser Pro Thr Tyr Lys Gln Asp Lys
130 135 140
His Tyr Gly Tyr Asn Ser Tyr Ser Val Ser Asn Ser Glu Lys Asp Ile
145 150 155 160
Met Ala Glu Ile Tyr Lys Asn Gly Pro Val Glu Gly Ala Phe Ser Val
165 170 175
Tyr Ser Asp Phe Leu Leu Tyr Lys Ser Gly Val Tyr Gln His Val Thr
180 185 190
Gly Glu Met Met Gly Gly His Ala Ile Arg Ile Leu Gly Trp Gly Val
195 200 205
Glu Asn Gly Thr Pro Tyr Trp Leu Val Ala Asn Ser Trp Asn Thr Asp
210 215 220
Trp Gly Asp Asn Gly Phe Phe Lys Ile Leu Arg Gly Gln Asp His Cys
225 230 235 240
Gly Ile Glu Ser Glu Val Val Ala Gly Ile Pro Arg Thr Asp
245 250

Claims (29)

1.一种产生多个融合体的方法，其包括：
(a)提供经修饰的哺乳动物生产细胞，例如人细胞，其包含：
(i)与相应的未经修饰的细胞相比，水平或活性升高的成熟组织蛋白酶分子(例如组织蛋白酶L或组织蛋白酶B)，
(ii)任选的外源性货物分子，例如蛋白质或核酸，和
(iii)亨尼帕病毒F蛋白分子；和
(iv)亨尼帕病毒G蛋白分子；
(b)在允许产生多个包含所述亨尼帕病毒F蛋白分子和所述亨尼帕病毒G蛋白分子的融合体的条件下，维持(例如，培养)所述经修饰的哺乳动物细胞。
2.一种产生经修饰的哺乳动物生产细胞的方法，所述方法包括：
(i)在增加哺乳动物细胞中组织蛋白酶分子的成熟形式的表达的条件下，向所述哺乳动物细胞中引入编码所述组织蛋白酶分子的核酸分子；
(ii)任选地向所述哺乳动物细胞中引入外源货物分子，例如蛋白质或核酸；
(iii)向所述哺乳动物细胞中引入亨尼帕病毒F蛋白分子(例如，在适用于表达所述亨尼帕病毒F蛋白分子的条件下引入编码所述亨尼帕病毒F蛋白分子的核酸)；和
(iv)向所述哺乳动物细胞中引入亨尼帕病毒G蛋白分子(例如，在适用于表达所述亨尼帕病毒G蛋白分子的条件下引入编码所述亨尼帕病毒G蛋白分子的核酸)，
其中步骤(i)-(iv)可以以任何顺序进行，或者步骤(i)-(iv)中的一个或多个可以同时进行。
3.一种经修饰的哺乳动物细胞，例如人细胞，其包含：
(i)与相应的未经修饰的细胞相比，水平或活性升高的成熟组织蛋白酶分子(例如组织蛋白酶L或组织蛋白酶B)，
(ii)任选的外源货物分子，例如核酸或蛋白质，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸，和
(iii)亨尼帕病毒F蛋白分子；和
(iv)任选的亨尼帕病毒G蛋白分子。
4.一种融合体，其包含：
(a)任选的外源货物，例如核酸或蛋白质，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；
(b)活性亨尼帕病毒F蛋白分子，其包含与野生型亨尼帕病毒蛋白F1分子相比具有多达30个连续氨基酸的C端截短的经修饰的F1形式，其中所述融合体中至少33％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和
(c)亨尼帕病毒G蛋白分子。
5.一种融合体，其包含：
(a)任选的外源货物，例如融合体核酸，例如病毒核酸(例如慢病毒核酸)；
(b)亨尼帕病毒F蛋白分子，其中所述融合体中至少33％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白；和
(c)亨尼帕病毒G蛋白分子。
6.一种药物组合物，其包含权利要求4或权利要求5所述的融合体和任选的药学上可接受的赋形剂。
7.一种将外源货物(例如融合体核酸，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸)递送至细胞(例如，体内或离体)的方法，其包括使所述细胞与多个权利要求4或5中任一项所述的融合体、权利要求6所述的药物组合物或通过权利要求1所述的方法制备的融合体接触。
8.一种向受试者递送外源货物(例如融合体核酸，例如病毒核酸，例如慢病毒核酸)的方法，其包括向所述受试者施用有效数量的权利要求4或5中任一项所述的融合体、权利要求6所述的药物组合物或通过权利要求1所述的方法制备的融合体。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子缺乏内吞基序。
10.如权利要求9所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述内吞基序是
Figure FDA0004107707860000031
基序或所述内吞基序是YSRL基序。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述组织蛋白酶分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述组织蛋白酶分子包含SEQ ID NO:37或SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述升高水平的组织蛋白酶分子包括比相应未经修饰的细胞中内源组织蛋白酶L的量多至少50％或更多的组织蛋白酶分子。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体包含的活性亨尼帕病毒F蛋白分子的水平比从组织蛋白酶分子的水平或活性没有升高的细胞产生的其它方面类似的融合体高至少10％。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体中至少33％的亨尼帕病毒F蛋白分子是活性亨尼帕病毒F蛋白。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞或药物组合物，其中所述融合体在例如293LX细胞上具有至少约200,000TU/mL的功能性滴度，例如如通过检测293XL细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例1的测定所测量。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞或药物组合物，其中所述融合体在例如活化T细胞，例如原代T细胞，例如Pan-T细胞上具有至少约200,000TU/mL的功能滴度，例如如通过检测所述活化T细胞中的GFP报告蛋白所测量，例如通过实施例3的测定所测量。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞或药物组合物，其中所产生的多个融合体的在靶细胞上的滴度与在非靶细胞上的滴度的比率为至少2:1，例如其中靶细胞过表达亨尼帕病毒G蛋白分子所结合的蛋白质，并且所述非靶细胞为野生型，例如其中例如在实施例1的测定中靶细胞过表达CD8并且非靶细胞为野生型。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体包含的总亨尼帕病毒蛋白F的水平为从组织蛋白酶分子的水平或活性没有升高的细胞中产生的其他方面类似的融合体所包含的总亨尼帕病毒蛋白F的水平的70％-130％之间。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子包含SEQ ID NO:7的野生型尼帕病毒氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子包括表4的亨尼帕病毒蛋白F。
22.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子包含相对于野生型亨尼帕病毒F蛋白例如，表4的蛋白质在C端的10-30、15-30、10-20或20-30个氨基酸，例如22或25个氨基酸的截短，任选地，其中所述亨尼帕病毒F蛋白包含与SEQ ID NO:17具有至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性的氨基酸序列，任选地其中所述亨尼帕病毒F蛋白在SEQ ID NO:17中示出。
23.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒F蛋白分子缺乏内吞基序，例如
Figure FDA0004107707860000051
基序，例如YRSL基序。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒G蛋白分子包含SEQ ID NO:9的野生型尼帕病毒氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的序列。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒G蛋白分子包含相对于野生型亨尼帕病毒G蛋白例如表5的蛋白质在N端的10-50个氨基酸的截短，任选地其中所述亨尼帕病毒F蛋白包含与SEQ ID NO:18具有至少为或约90％、至少为或约91％、至少为或约92％、至少为或约93％、至少为或约94％、至少为或约95％、至少为或约96％、至少为或约97％、至少为或约98％或至少为或约99％序列同一性的氨基酸序列，任选地其中所述亨尼帕病毒F蛋白在SEQ ID NO:18中示出。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述亨尼帕病毒G蛋白分子是再靶向亨尼帕病毒G蛋白分子。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体核酸是慢病毒核酸。
28.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述融合体核酸编码治疗有效载荷。
29.如前述权利要求中任一项所述的方法、经修饰的细胞、融合体或药物组合物，其中所述经修饰的细胞为人细胞。
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