CN116139342B - 一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，全层多孔骨软骨组织工程支架由全层骨软骨组织材料经过脱细胞化、激光打孔以及超声消化扩孔后得到；所述全层多孔骨软骨组织工程支架包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层。本发明提供的一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，在结构层次上、力学性能和成分组成上高度和天然骨软骨接近，同时可以给种子细胞提供良好的接种环境。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体来说，涉及一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法。
背景技术
对于外伤或疾病引起的骨软骨缺损修复是临床治疗的难题，应用组织工程技术构建组织工程软骨支架被认为是解决这一问题最好的技术手段。采用人工材料制作的支架，没有达到高仿生效果，对于骨软骨损伤的修复效果仍有改进的空间。自体骨软骨移植是取出自身关节非承重部分的骨软骨块放入关节缺损区域，被认为是缺损修复的金标准方法。自体骨软骨移植术优异的修复效果是由于其力学性能、层状结构和生物活性物质组成与自身天然骨软骨组织非常接近。但缺点是对非负重区造成损害，供区来源有限。因此，使用异体骨软骨组织块移植被用于修复缺损，但由于免疫原性引起的骨吸收等并发症时常导致修复失败。众所周知，同种异体骨软骨复合组织块的免疫原性主要来自其细胞成分。以往的研究表明，脱细胞后，脱细胞组织块的免疫原性大大降低。有人提出，异种组织脱细胞后可以达到同样的低免疫原性。因此去细胞化的同种异体或异种骨软骨组织块，接种自身的干细胞，能够达到接近自体骨软骨移植的修复效果。但脱细胞后软骨层的孔隙率过低，无法满足软骨组织工程支架的要求。因此，本领域迫切需要一种在结构层次上，力学性能上，成分组成上高度和天然骨软骨单元接近的骨软骨全层修复支架，同时可以给种子细胞提供良好的接种环境的制备技术和修复方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，在结构层次上、力学性能和成分组成上高度和天然骨软骨接近，同时可以给种子细胞提供良好的接种环境。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用如下技术方案：
第一方面，本发明实施例提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架，由全层骨软骨组织材料经过脱细胞化、激光打孔以及超声消化扩孔后得到；所述全层多孔骨软骨组织工程支架包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层。
作为本发明实施例的进一步改进，所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60％，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80％，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85％，压缩模量为20～40Mpa。
作为本发明实施例的进一步改进，所述全层骨软骨组织材料为从同种异体或异种动物体中获取。
第二方面，本发明实施例提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤10)获取全层骨软骨组织材料，所述全层骨软骨组织材料包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层；
步骤20)将所述全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理；
步骤30)对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔；
步骤40)将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
作为本发明实施例的进一步改进，激光打孔的孔径为150～200um，孔间距为150～200um，孔深度为500～1000um。
作为本发明实施例的进一步改进，所述步骤40)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1M。
作为本发明实施例的进一步改进，步骤40)中，超声消化的时间为120～240min。
作为本发明实施例的进一步改进，所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60％，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80％，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85％，压缩模量为20～40Mpa。
作为本发明实施例的进一步改进，还包括：
步骤40)将体外分离培养的种子细胞接种到全层多孔骨软骨组织工程支架中。
作为本发明实施例的进一步改进，所述步骤10)中，从同种异体或异种动物体中获取全层骨软骨组织材料。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，从同种异体或异种动物体中获取骨软骨组织材料，相比于获取自体骨软骨，不会对非负重区造成损害，且供区来源广。相比于采用人造骨软骨，同种异体或异种动物体的骨软骨组织材料具有生物活性物质，可以促进干细胞的成软骨和成骨分化，不需后期添加。
(2)本发明的全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，采用全层结构骨软骨组织材料，制备全层组织支架，和天然组织具备十分接近的层次结构、力学性能和生物活性成分，可以对缺损区域进行整体修复。
(3)本发明的全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，先在软骨层进行激光打孔，再利用超声消化对全层进行孔隙优化，在保证工程支架力学强度的同时获得较高孔隙率，给致密的软骨层引入了更有利于细胞粘附和迁移的三维空间结构，便于种子细胞或自身细胞的增殖，具有优异的修复效果。
附图说明
图1是本发明实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架的照片；
图2(a)是实例1制备的工程支架的软骨层的电镜图，图2(b)是实例1制备的工程支架的软骨下骨层的电镜图，图2(c)是实例1制备的工程支架的松质骨层的电镜图；
图3(a)是将体外分离培养的干细胞接种到对比例1制备的工程支架后进行DAPI染色的荧光显微镜图；图3(b)是将体外分离培养的干细胞接种到实例1制备的工程支架后进行DAPI染色的荧光显微镜图；
图4(a)是移植实例1制备的工程支架修复后的大体观察照片，图4(b)是移植实例1制备的工程支架修复后进行HE染色的切片图，图4(c)是移植实例1制备的工程支架修复后的CT图像；图4(d)是移植实例4制备的工程支架修复后的大体观察照片，图4(e)是移植实例4制备的工程支架修复后进行HE染色的切片图，图4(f)是移植实例4制备的工程支架修复后的CT图像；图4(h)是移植对比例2得到的支架修复后的大体观察照片，图4(i)是移植对比例2得到的支架修复后的切片图，图4(j)是移植对比例2得到的支架修复后的CT图像。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的技术方案进行详细的说明。
以下的说明本质上仅仅是示例性的而并不是为了限制本公开、应用或用途。应当理解的是，在全部附图中，对应的附图标记表示相同或对应的部件和特征。
本发明实施例提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架，由全层骨软骨组织材料经过脱细胞化、激光打孔以及超声消化扩孔后得到。其中，全层多孔骨软骨组织工程支架包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层。
全层多孔骨-软骨组织工程支架为整体件。该组织工程支架可以用于关节骨软骨缺损、剥脱性骨软骨炎，股骨头坏死、骨肿瘤切除后骨软骨缺损等组织的修复。
优选的，全层骨软骨组织材料为从同种异体或异种动物体中获取。
全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，例如：0.2mm、0.8mm、1mm、1.5mm或者2mm。软骨层的孔隙率为50～60％，例如：50％、53％、58％或者60％。软骨层的压缩模量为0.5～2Mpa，例如：0.5Mpa、0.7Mpa、1Mpa、1.5Mpa或者2Mpa。全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，例如：0.2mm、0.5mm、0.7mm、0.9mm或者1mm。下骨层的孔隙率为65～80％，例如：65％、71％、77％或者80％。下骨层的压缩模量为20～50Mpa，例如：20Mpa、30Mpa、35Mpa、40Mpa或者50Mpa。全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，例如：2mm、2.5mm、3mm、3.5mm或者4mm。松质骨层的孔隙率为65～85％，例如：65％、71％、80％或者85％。松质骨层的压缩模量为20～40Mpa，例如：20Mpa、25Mpa、30Mpa、35Mpa或者40Mpa。
本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，从同种异体或异种动物体中获取骨软骨组织材料，相比于获取自体骨软骨，不会对非负重区造成损害，且供区来源广；相比于采用人造骨软骨，同种异体或异种动物体的骨软骨组织材料具有生物活性物质，不需后期添加。本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，采用全层结构骨软骨组织材料，制备全层组织支架，和天然组织具备十分接近的层次结构、力学性能和生物活性成分，可以对缺损区域进行整体修复。本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，先对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔，提供“细胞接种池”，增加细胞接种率，避免了细胞只粘附在表面。在激光打孔后还利用超声消化进行孔隙优化，增加整体的微孔隙率，有利于接种的细胞的迁移和增殖。本实施例通过激光打孔再进行超声消化扩孔，保证力学强度的同时获得较高孔隙率，给致密的软骨层引入了更有利于细胞粘附和迁移的三维空间结构，便于种子细胞或自身细胞的增殖，具有优异的修复效果。
本发明提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤10)从同种异体或异种动物体中获取全层骨软骨组织材料，全层骨软骨组织材料包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层。
步骤20)将全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理。在尽量保留原有组织结构和组成的情况下，完整地去除组织内细胞成分，可以使异体和异种来源的骨软骨组织工程支架都具有可接受的生物相容性。
步骤30)对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔。激光打孔的孔径为150～200um，例如：150um、172um、188um、195um或者200um。孔间距为150～200um，例如：150um、165um、177um、190um或者200um。孔深度为500～1000um，例如：500um、650um、780um、920um或者1000um。激光打孔可以在软骨层蚀刻出微孔阵列。
步骤40)将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。超声消化后可以给软骨层引入瓦楞状孔隙结构，孔隙大小为10～100um，例如：10um、30um、50um、80um或者100um。这些大小孔隙可以更好的使细胞粘附和迁移。
优选的，本发明实施例方法的步骤20)中，采用物理法和化学洗涤法相结合进行脱细胞处理，可以将完整组织块的细胞较为彻底的脱除，达到脱细胞标准(DNA含量小于50ng/mg)，并且不会对细胞外基质本身造成过多的丢失。
优选的，本发明实施例方法的步骤40)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1M，超声消化的时间为120～240min。氢氧化钠溶液的摩尔浓度为0.5～1mol/L。进行超声消化选择上述优选浓度范围内的氢氧化钠溶液，以及选择上述优选时间范围的处理时间，既可以保留理想的力学性能和细胞外基质，同时也可以一定程度提高孔隙率。
采用上述制备方法得到的全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60％，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80％，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85％，压缩模量为20～40Mpa。
将上述实施例结构的全层多孔骨软骨组织工程支架直接经过灭菌后，不需要将体外分离培养的种子细胞接种到该组织工程支架中。这样，组织工程支架直接与骨接触，通过募集体内的自身细胞的增殖，实现骨软骨缺损的原位修复。该过程也就无需从人体中提取细胞，进行体外培养成种子细胞。
优选的，所述方法还包括：
步骤40)将体外分离培养的种子细胞接种到全层多孔骨软骨组织工程支架中。
本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架的制备方法，从同种异体或异种动物体中获取骨软骨组织材料，相比于获取自体骨软骨，不会对非负重区造成损害，且供区来源广；相比于采用人造骨软骨，同种异体或异种动物体的骨软骨组织材料具有生物活性物质，不需后期添加。本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，采用全层结构骨软骨组织材料，制备全层组织支架，和天然组织具备十分接近的层次结构、力学性能和生物活性成分，可以对缺损区域进行整体修复。本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，先对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔，提供“细胞接种池”，增加细胞接种率，避免了细胞只粘附在表面。在激光打孔后还利用超声消化进行孔隙优化，增加整体的微孔隙率，有利于接种的细胞的迁移和增殖。本实施例通过激光打孔再进行超声消化扩孔，保证力学强度的同时获得较高孔隙率，给致密的软骨层引入了更有利于细胞粘附和迁移的三维空间结构(三维空间结构是指细胞外基质成分天然的结构)，便于种子细胞或自身细胞的增殖，具有优异的修复效果。
下面提供一个具体实例和两个对比例，实例1、对比例1和对比例2均是用于修复兔子的左膝关节的患处。
实例1
从幼猪的膝关节取一块圆柱形的全层骨软骨组织材料，进行清洗。其中，软骨层的厚度为0.2mm，孔隙率为60％，压缩模量为1Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.3mm，孔隙率为75％，压缩模量为50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为4mm，孔隙率为80％，压缩模量为40Mpa。将全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理，具体的，将组织通过液氮1min-37℃生理盐水5min冻融循环5次，在1％的Triton溶液中震荡洗涤24h，在混合0.2％ SDS+0.1％EDTA的10mM Tris-HCL溶液中震荡洗涤72h。对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔。激光打孔的孔径为200um，孔间距为200um，孔深度为1000um。将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入浓度为0.5M的氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化120min，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
从待处理的兔子体中提取细胞，进行体外分离培养，形成的种子细胞接种到上述全层多孔骨软骨组织工程支架中。
实例2
从幼猪的膝关节取一块圆柱形的全层骨软骨组织材料，进行清洗。其中，软骨层的厚度为1mm，孔隙率为50％，压缩模量为2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为1mm，孔隙率为80％，压缩模量为20Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为3mm，孔隙率为65％，压缩模量为30Mpa。
将全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理，具体的，将组织通过液氮1min-37℃生理盐水5min冻融循环6次，在1.5％的Triton溶液中震荡洗涤20h，在混合0.2％ SDS+0.1％EDTA的12mM Tris-HCL溶液中震荡洗涤80h。对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔。激光打孔的孔径为150um，孔间距为180um，孔深度为800um。将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入浓度为0.8M的氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化200min，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
从待处理的兔子体中提取细胞，进行体外分离培养，形成的种子细胞接种到上述全层多孔骨软骨组织工程支架中。
实例3
从幼猪的膝关节取一块圆柱形的全层骨软骨组织材料，进行清洗。其中，软骨层的厚度为2mm，孔隙率为55％，压缩模量为0.5Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.8mm，孔隙率为65％，压缩模量为40Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2.5mm，孔隙率为70％，压缩模量为20Mpa。
将全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理，具体的，将组织通过液氮1min-37℃生理盐水5min冻融循环7次，在1％的Triton溶液中震荡洗涤18h，在混合0.2％ SDS+0.1％EDTA的10mM Tris-HCL溶液中震荡洗涤64h。对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔。激光打孔的孔径为180um，孔间距为150um，孔深度为500um。将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入浓度为0.7M的氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化240min，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
从待处理的兔子体中提取细胞，进行体外分离培养，形成的种子细胞接种到上述全层多孔骨软骨组织工程支架中。
实例4
从幼猪的膝关节取一块圆柱形的全层骨软骨组织材料，进行清洗。其中，软骨层的厚度为0.5mm，孔隙率为58％，压缩模量为1.5Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2mm，孔隙率为70％，压缩模量为30Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2mm，孔隙率为85％，压缩模量为35Mpa。
将全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理，具体的，将组织通过液氮1min-37℃生理盐水5min冻融循环5次，在1％的Triton溶液中震荡洗涤30h，在混合0.2％ SDS+0.1％EDTA的10mM Tris-HCL溶液中震荡洗涤80h。对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔。激光打孔的孔径为160um，孔间距为170um，孔深度为700um。将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入浓度为1M的氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化180min，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
直接将上述全层多孔骨软骨组织工程支架修复到兔子左膝关节处，不对该支架种植体外分离培养的种子细胞。
对比例1
从幼猪的膝关节取一块圆柱形的全层骨软骨组织材料，进行清洗。将全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理，具体的，将组织通过液氮1min-37℃生理盐水5min冻融循环5次，在1％的Triton溶液中震荡洗涤24h，在混合0.2％ SDS
+0.1％EDTA的10mM Tris-HCL溶液中震荡洗涤72h。对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔。激光打孔的孔径为200um，孔间距为200um，孔深度为1000um，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
对比例2
从兔子的右膝关节取一块圆柱形的全层骨软骨组织。
实例1制备得到的工程支架，如图1所示。如图2所示，对实例1得到的工程支架，将样品紧贴在导电碳膜双面胶上，用金钯金合金对样品表面进行喷涂，利用Zeiss Gemini30，进行观察材料表面超微结构并获取图片，得到工程支架各层的电镜图。从图2所示的实例1制备得到的工程支架的各层电镜图可以看出，软骨层经过脱细胞和空隙优化后，有较多的孔隙结构，软骨下骨层和松质骨层结构疏松，各层内的孔隙结构相互连通且均具有立体多维性。
进行体外分离培养种子细胞：使用的细胞来源于新西兰兔的骨髓间充质干细胞。方法如下：使用过量戊巴比妥钠将7～14日龄的新西兰兔安乐死后，无菌条件下暴露分离出兔股骨，剪去股骨两端暴露骨髓腔，使用1ml的注射器以L-DMEM反复冲洗骨髓腔直至骨髓腔发白，尽可能洗脱髓腔内细胞。将收集的髓腔冲洗液以1200rpm的转速离心5分钟，使用含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、1％的青霉素和链霉素的L-DMEM的培养基重悬，并置于细胞孵育箱(37℃、5％ CO2)中培养。利用骨髓间充质干细胞在培养基中的贴壁优势特性，定期更换培养液去除不贴壁细胞从而得到纯化骨髓间充质干细胞。培养24小时后，缓慢吸除悬浮细胞，之后2～3天更换一次培养基。进一步培养贴壁的细胞，显微镜观察下细胞融合达到80％左右时，将骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化，用含10％的FBS低糖培养基终止消化，离心后重悬到新的培养皿中继续培养。按上述步骤培养并扩增至第三代后使用。
将上述体外分离培养的种子细胞接种到实例1得到的工程支架中，进行DAPI染色，得到图3(b)。将体外分离培养的种子细胞接种到对比例1得到的工程支架中，进行DAPI染色，得到图3(a)。未进行孔隙优化的软骨层只有少数粘附的细胞；而激光打孔联合超声扩孔后，软骨层中不仅有细胞在孔壁粘附，更有大量细胞在孔壁之间分散，彼此相互融合。可以看出，实例1通过激光打孔和超声消化结合优化孔隙得到的工程支架，更有利于干细胞粘附和迁移，便于干细胞增殖。
将实例1得到的工程支架移植到兔子的左膝关节的患处，修复12周后,进行大体截面切片拍照，得到图4(a)；进行HE染色，得到组织切片图，如图4(b)所示；进行micro-CT扫描，得到图4(c)。
将实例4得到的工程支架移植到兔子的左膝关节的患处，修复12周后，进行大体截面切片拍照，得到图4(d)；进行HE染色，得到组织切片图，如图4(e)所示；进行micro-CT扫描，得到图4(f)。
将对比例2得到的全层骨软骨组织移植到兔子的左膝关节的患处，修复12周后进行大体截面切片拍照，得到图4(h)；进行HE染色，得到组织切片图，如图4(i)所示；进行micro-CT扫描，得到图4(j)。
从图4(a)、图4(d)、图4(h)可以看出，实例1的缺损区域被关节软骨组织填充，表面光泽度与对比例2效果相当。同样，实例4的缺损区域被关节软骨组织填充，表面光泽度与对比例2效果相当。
从图4(b)、图4(e)、图4(i)可以看出，实例1的可见缺损修复完整，表面与相邻软骨面平齐，呈典型的软骨组织结构，有软骨陷窝结构。软骨下骨完整清晰，骨小梁区有新生血管形成，和对比例2效果无明显差异。实例4也具有和实例1相当的修复效果。
从图4(c)、图4(f)、图4(j)可以看出，实例1、实例4和对比例2中，软骨下的骨质都几乎完全修复。
因此，移植实例1制备得到的工程支架具有优异的修复效果，其修复效果与自体骨软骨移植的修复效果一致。移植实例4制备得到的工程支架具有优异的修复效果，其修复效果与自体骨软骨移植的修复效果基本一致。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述具体实施例的限制，上述具体实施例和说明书中的描述只是为了进一步说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种全层多孔骨软骨组织工程支架，其特征在于，由全层骨软骨组织材料经过脱细胞化、激光打孔以及超声消化扩孔后得到；所述全层多孔骨软骨组织工程支架包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层；
所述激光打孔的孔径为150～200um；超声消化后给软骨层引入瓦楞状孔隙结构，孔隙大小为10～100um，所述孔隙更好的使细胞粘附和迁移。
2.根据权利要求1所述的全层多孔骨软骨组织工程支架，其特征在于，所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60%，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80%，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85%，压缩模量为20～40Mpa。
3.根据权利要求1所述的全层多孔骨软骨组织工程支架，其特征在于，所述全层骨软骨组织材料为从同种异体或异种动物体中获取。
4.一种全层多孔骨软骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤10）获取全层骨软骨组织材料，所述全层骨软骨组织材料包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层；
步骤20）将所述全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理；
步骤30）对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔；激光打孔的孔径为150～200um；
步骤40）将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化，得到全层多孔骨软骨组织工程支架；超声消化后给软骨层引入瓦楞状孔隙结构，孔隙大小为10～100um，所述孔隙更好的使细胞粘附和迁移。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，激光打孔的孔间距为150～200um，孔深度为500～1000um。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤40）中，氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1M。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤40）中，超声消化的时间为120～240min。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60%，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80%，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85%，压缩模量为20～40Mpa。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括：
步骤40）将体外分离培养的种子细胞接种到全层多孔骨软骨组织工程支架中。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤10）中，从同种异体或异种动物体中获取全层骨软骨组织材料。
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