CN116139335B - 具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架及其制备方法，支架为聚丙烯胺‑丝素蛋白‑聚乙二醇水凝胶，具有若干孔径渐变多孔微通道结构，孔径由1000‑600μm逐渐变小到100‑200μm；制备方法：首先通过脱水缩合反应将丙烯酰胺和丝素蛋白合成丙烯酰胺‑丝素蛋白；并且通过酯化反应将上述丙烯酰胺‑丝素蛋白与聚乙二醇合成聚丙烯酰胺‑丝素蛋白‑聚乙二醇(PAM‑SF‑PEG)水凝胶；然后将PAM‑SF‑PEG水凝胶灌注在特定的模具中制备仿生植物毛细作用的多孔微通道孔径渐变水凝胶支架；将该水凝胶支架植入长距离周围神经缺损处，可为神经再生提供良好的机械支撑，水凝胶支架的多孔微通道结构可引导新生神经轴突的定向生长，促进神经对合的准确度，防止神经错对。
Description
技术领域
本发明涉及高分子材料技术领域，特别涉及具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架及其制备方法。
背景技术
周围神经损伤是常见临床疾病之一，占所有创伤病例的2％-5％。自然衰老、医源性副作用以及意外事故等多种因素都会对人的周围神经造成不同程度的损伤，导致神经信号传递中断和相应靶器官的功能受损，进而造成感觉和运动功能丧失，肌肉瘫痪甚至终身残疾。因此周围神经损伤的修复与再生对于患者的生命健康和医疗***具有重要意义。
目前临床上修复周围神经损伤所采用的端端缝合难以修复长距离神经缺损，自体移植又存在供体神经短缺、匹配性差及易形成术后神经瘤等问题。水凝胶支架为周围神经损伤修复提供了新选择，其三维结构可为神经细胞的生长和功能化提供合适微环境，表面结构可引导新生神经轴突的定向生长，促进神经对合准确度，同时水凝胶支架可为神经再生提供足够的机械支撑，减轻手术缝合的张力，有效促进神经再生。然而，尽管多种水凝胶支架已应用于周围神经损伤修复，比如在Adv FunctMaterials公布的名称为ElectricallyConductive Hydrogel Nerve Guidance Conduits forPeripheralNerve Regeneration(用于周围神经再生的导电水凝胶神经引导导管)，但由于重力作用，这些导电水凝胶神经引导导管无法有效支持损伤神经远端的修复和再生，存在长距离神经缺损修复效果不理想、术后恢复时间较长等问题。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架及其制备方法，本发明首先通过脱水缩合反应将丙烯酰胺(Acrylamide,AM)和丝素蛋白(Silk fibroin,SF)合成丙烯酰胺-丝素蛋白(AM-SF)；并且通过酯化反应将上述丙烯酰胺-丝素蛋白与聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)合成聚丙烯酰胺(Polyacrylamide,PAM)-丝素蛋白-聚乙二醇(PAM-SF-PEG)水凝胶；然后将PAM-SF-PEG水凝胶灌注在特定的模具中制备仿生植物毛细作用的多孔微通道水凝胶支架，可用于反重力定向传输细胞。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架，为聚丙烯胺-丝素蛋白-聚乙二醇水凝胶，具有若干孔径渐变多孔微通道结构，孔径由1000-600μm逐渐变小到100-200μm。
所述聚丙烯胺-丝素蛋白-聚乙二醇水凝胶为：40wt％-60wt％聚丙烯胺溶液、5-10wt％的丝素蛋白溶液、8-10wt％的聚乙二醇溶液，三种溶液等体积比混合。
具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：首先将家蚕蚕茧切成薄片，用0.5wt％的Na2CO3水溶液煮2-3次，去离子水洗涤，干燥之后得到脱胶丝素蛋白纤维；随后用三元溶液溶解或5-8wt％的溴化锂/甲醇溶液溶解，且将其离心后去除杂质，最后将离心后的丝素蛋白溶液析，并冷冻干燥后得到固体丝素蛋白SF；
步骤二：首先将AM溶于去离子水中得到40wt％-60wt％溶液，加入0.4wt％-0.6wt％N,N-亚甲基双丙烯酰胺，常温搅拌，得到AM溶液；然后将SF溶解在去离子水中得到5-10wt％的SF水溶液，搅拌均匀，分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，加入量均为0.5-2wt％，并调节PH至4.5-5.5，室温反应1-2小时，得到SF溶液；用去离子水配制8-10wt％聚乙二醇PEG,常温搅拌，制备PEG溶液；
步骤三：将步骤二的AM溶液、SF水溶液和PEG溶液按体积比1:1:1混合，并搅拌反应得到AM-SF-PEG溶液，然后再加入0.1wt％-0.2wt％过硫酸铵和0.08wt％-0.16wt％四甲基乙二胺，搅拌混合均匀后，加入模具，在50-70℃的条件下反应10-15小时，可得到仿生毛细作用的PAM-SF-PEG水凝胶。
所述三元溶液为无水氯化钙/水/无水乙醇，三者体积比为1:8:2。
所述的模具为圆柱结构，圆柱体高度方向上具有若干孔径渐变多孔微通道结构，孔的直径由1000-600μm逐渐变小到100-200μm。
与现有技术相比，本发明的优点：
1、将该水凝胶支架植入长距离周围神经缺损处后，其多孔微通道结构可引导新生神经轴突的定向生长，促进神经对合的准确度，防止神经错对；而其孔径渐变多孔微通道结构可将神经细胞输送到神经缺损远端，进一步促进远端神经再生，提高长距离神经缺损修复效率，缩短患者的康复周期。
2、本发明所制备的聚丙烯胺-丝素蛋白-聚乙二醇水凝胶具有良好的力学性能，应变达到了100％以上，具有良好的柔韧性；应力达到了50Kpa以上，甚至超过100Kpa，为神经再生提供足够的机械支撑，减少手术缝合的张力。
附图说明
图1为本发明的具有孔径渐变的多孔微通道结构水凝胶支架示意图。
图2为本发明的三个实施例的水凝胶力学性能图。
图3为本发明的实施例二仿生毛细作用的AM-SF-PEG-2水凝胶孔径渐变的微观形貌图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更详细的说明。
具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架，为聚丙烯胺-丝素蛋白-聚乙二醇水凝胶，所述聚丙烯胺-丝素蛋白-聚乙二醇水凝胶为：40wt％-60wt％聚丙烯胺溶液、5-10wt％的丝素蛋白溶液、8-10wt％的聚乙二醇溶液，三种溶液等比例混合。
所述具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架，具有若干孔径渐变多孔微通道结构，如图1和图3，孔径由1000-600μm逐渐变小到100-200μm。这种水凝胶支架的具有约30个微通道结构，并且这种孔径渐变水凝胶支架可用于反重力定向传输细胞；将该水凝胶支架植入长距离周围神经缺损处后，其多孔微通道结构可引导新生神经轴突的定向生长，促进神经对合的准确度，防止神经错对；而其孔径渐变多孔微通道结构可将神经细胞输送到神经缺损远端，提高长距离神经缺损修复效率，缩短患者的康复周期。
实施例一
本实施例，包括以下步骤：
步骤一：首先将家蚕蚕茧切成薄片，用0.5％的Na2CO3水溶液(浴比为1:50)煮2次(每次30分钟)，去离子水清洗3次，干燥之后得到脱胶丝素蛋白纤维。随后将100g脱胶丝素蛋白纤维放入1000mL三元溶液(无水氯化钙/水/无水乙醇，体积比为1:8:2)溶解，并在70℃水浴中完全溶解，且将其在离心机中离心后去除杂质。最后将离心后的丝素蛋白溶液透析72小时，并冷冻干燥48小时后得到固体丝素蛋白SF，将其储存在4℃冰箱中，以备后用；
步骤二：首先将AM溶于去离子水中得到40wt％溶液，加入0.4wt％N,N-亚甲基双丙烯酰胺，常温搅拌30分钟，得到AM溶液。然后将SF溶解在5mL去离子水中得到5wt％的SF水溶液，磁力搅拌器30分钟，分别加入0.5wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和0.5wt％N-羟基琥珀酰亚胺，并调节PH至5,室温反应1小时，得到SF溶液。用去离子水配置5mL 5％(w/v)PEG，常温搅拌10分钟，制备聚乙二醇PEG溶液；
步骤三：将步骤二的AM溶液、SF水溶液和PEG溶液按体积比1:1:1混合，并搅拌反应1小时,得到15mLAM-SF-PEG溶液，然后再加入0.1wt％过硫酸铵和0.08wt％四甲基乙二胺,搅拌混合均匀后，加入模具，在60℃的条件下反应12小时，可得到仿生毛细作用的AM-SF-PEG-1(ASP-1)水凝胶。
实施例二
本实施例，包括以下步骤：
步骤一：首先将家蚕蚕茧切成薄片，用0.5％的Na2CO3水溶液(浴比为1:50)煮3次(每次30分钟)，去离子水清洗3次，干燥之后得到脱胶丝素蛋白纤维。随后将100g脱胶丝素蛋白纤维放入1000mL的5wt％的溴化锂/甲醇溶液溶解，并在70℃水浴中完全溶解，且将其在离心机中离心后去除杂质。最后将离心后的丝素蛋白溶液透析72小时，并冷冻干燥48小时后得到固体丝素蛋白，将其储存在4℃冰箱中，以备后用；
步骤二：首先将AM溶于去离子水中得到50wt％溶液，加入0.5wt％N,N-亚甲基双丙烯酰胺，常温搅拌30分钟，得到AM溶液；然后将SF溶解在去离子水中得到5wt％的SF水溶液，磁力搅拌器30分钟，分别加入1wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和1wt％N-羟基琥珀酰亚胺，并调节PH至4.5，室温反应1小时，得到SF溶液。用去离子水配制8wt％聚乙二醇PEG,常温搅拌，制备PEG溶液；
步骤三：将步骤二的AM溶液、SF水溶液和PEG溶液按体积比1:1:1混合，并搅拌反应1小时,并搅拌反应得到AM-SF-PEG溶液，然后在AM-SF-PEG混合溶液中加入0.15wt％过硫酸铵和0.12wt％四甲基乙二胺,搅拌混合均匀后，加入模具，在50℃的条件下反应10小时，可得到仿生毛细作用的AM-SF-PEG-2(ASP-2)水凝胶，孔径由600μm逐渐变小到200μm，图3可以看出得到的水凝胶孔径渐变。
实施例三
本实施例，包括以下步骤：
步骤一：首先将家蚕蚕茧切成薄片，用0.5wt％的Na2CO3水溶液(浴比为1:50)煮3次(每次30分钟)，去离子水清洗3次，干燥之后得到脱胶丝素蛋白纤维。随后将100g脱胶丝素蛋白纤维放入1000mL的8wt％的溴化锂/甲醇溶液溶解，并在70℃水浴中完全溶解，且将其在离心机中离心后去除杂质。最后将离心后的丝素蛋白溶液透析72小时，并冷冻干燥48小时后得到固体丝素蛋白，将其储存在4℃冰箱中，以备后用；
步骤二：首先将AM溶于去离子水中得到60wt％溶液，加入0.6wt％N,N-亚甲基双丙烯酰胺，常温搅拌30分钟，得到AM溶液；然后将SF溶解在5mL去离子水中得到10wt％的SF水溶液，磁力搅拌器30分钟，分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，加入量均为2wt％，并调节PH至5.5，室温反应,2小时，得到SF溶液；用去离子水配制8wt％聚乙二醇PEG,常温搅拌，制备PEG溶液。
步骤三：将步骤二的AM溶液、SF水溶液和PEG溶液按体积比1:1:1混合，并搅拌反应得到AM-SF-PEG溶液，并搅拌反应1小时,然后在AM-SF-PEG混合溶液中加入0.2wt％过硫酸铵和0.16wt％四甲基乙二胺,搅拌混合均匀后，加入模具，在60℃的条件下反应12小时，可得到仿生毛细作用的AM-SF-PEG-3(ASP-3)水凝胶。
如图2所示，本发明所制备的聚丙烯胺-丝素蛋白-聚乙二醇水凝胶具有良好的力学性能，应变达到了100％以上，具有良好的柔韧性；应力达到了50Kpa以上，甚至超过100Kpa，为神经再生提供足够的机械支撑，减少手术缝合的张力。在神经再生过程中，损伤神经的远近端可以自主识别，并且神经组织由近端向远端生长，选择性地向相应的靶器官延伸，该水凝胶支架可利用毛细作用将神经细胞输送到神经缺损的远端，进一步促进神经再生，缩短患者的康复周期。
Claims (6)
1.具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架，其特征在于，为聚丙烯酰胺-丝素蛋白-聚乙二醇水凝胶，具有若干孔径渐变多孔微通道结构，孔径由1000-600μm逐渐变小到100-200μm。
2.根据权利要求1所述的具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架，其特征在于，为聚丙烯酰胺-丝素蛋白-聚乙二醇水凝胶，具有若干孔径渐变多孔微通道结构，孔径由600μm逐渐变小到200μm。
3.根据权利要求1或2所述的具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架，其特征在于，所述聚丙烯酰胺-丝素蛋白-聚乙二醇水凝胶为：40wt％-60wt％聚丙烯酰胺溶液、5-10wt％的丝素蛋白溶液、8-10wt％的聚乙二醇溶液，三种溶液等体积比混合。
4.具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：首先将家蚕蚕茧切成薄片，用Na2CO3水溶液煮2-3次，去离子水洗涤，干燥之后得到脱胶丝素蛋白纤维；随后用三元溶液无水氯化钙/水/无水乙醇或溴化锂/甲醇溶液溶解，且将其离心后去除杂质，最后将离心后的丝素蛋白溶液析，并冷冻干燥后得到固体丝素蛋白SF；
步骤二：首先将AM溶于去离子水中得到40wt％-60wt％溶液，加入0.4wt％-0.6wt％N,N-亚甲基双丙烯酰胺，常温搅拌，得到AM溶液；然后将SF溶解在去离子水中得到5-10wt％的SF水溶液，搅拌均匀，分别加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和N-羟基琥珀酰亚胺，加入量均为0.5-2wt％，并调节pH至4.5-5.5，室温反应1-2小时，得到SF溶液；用去离子水配制8-10wt％聚乙二醇PEG,常温搅拌，制备PEG溶液；
步骤三：将步骤二的AM溶液、SF水溶液和PEG溶液按体积比1:1:1混合，并搅拌反应得到AM-SF-PEG溶液，然后再加入0.1wt％-0.2wt％过硫酸铵和0.08wt％-0.16wt％四甲基乙二胺，搅拌混合均匀后，搅拌混合均匀后，加入模具，在50-70℃的条件下反应10-15小时，可得到仿生毛细作用的PAM-SF-PEG水凝胶。
5.根据权利要求4所述的具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：所述的模具为圆柱结构，圆柱体高度方向上具有若干孔径渐变多孔微通道结构，孔的直径由1000-600μm逐渐变小到100-200μm。
6.根据权利要求4所述的具有定向输送能力的多通道孔径渐变水凝胶支架的制备方法，包括以下步骤：所述三元溶液为无水氯化钙/水/无水乙醇，三者体积比为1:8:2。
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