CN1161374A - 果糖氨基酸氧化酶及其生产方法 - Google Patents
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Abstract
提供了一种来源于镰刀菌属，对果糖赖氨酸和果糖缬氨酸均有活性的新的果糖氨基酸氧化酶，一种生产此酶的方法，以及一种用此酶，测定阿玛窦利化合物的方法，含此酶的试剂或试剂盒。
Description
本发明涉及一种新的果糖氨基酸氧化酶。特别涉及一种来源于镰刀菌属的新的果糖氨基酸氧化酶，一种生产这种酶的方法，以及一种用这种酶，测定阿玛窦利(amadori)化合物的方法和含有这种酶的试剂或试剂盒。
当活性物质如蛋白质，肽以及带有一个(或多个)氨基的氨基酸与一种还原糖如含有一个(或多个)醛基的醛糖共同存在时，二者通过氨基和醛基发生非酶催化性不可逆结合，之后通过阿玛窦利重排形成一种阿玛窦利化合物。阿玛窦利化合物的生产率是反应物浓度，接触时间，温度等的函数，可以从阿玛窦利化合物的数量中获得许多关于含有一种(或多种)活性物质的样品的有用信息。含有一种阿玛窦利化合物的物质的例子包括食品如酱油和体液如血液。
在一种活体内，通过葡萄糖和一种氨基酸反应生成果糖胺，将血液中所得的血红蛋白，白蛋白和蛋白的糖化衍生物相应地称为糖血红蛋白，糖白蛋白和果糖胺。因为血液中这些糖化衍生物的浓度能够反映一个特定时期内血糖的平均水平，所以它可作为一个诊断和控制糖尿病的重要指标。因此，建立一种测定血液中阿玛窦利化合物的方法对临床非常有益。
此外，可以根据食品中阿玛窦利化合物的数量确定食品生产后的保存条件和时间。因而，这种测定阿玛窦利化合物的方法还有助于食品的质量控制。
如此看来，阿玛窦利化合物的测定在包括药品和食品的许多领域中都非常有用。
阿玛窦利化合物测定的已知方法有：利用高效液相层析[Chromatogr.Sci.10：659(1979)]将硼酸加于固体物质填充的层析柱[Clin.chem.28：2088-2094(1982)]，电泳[Clin.chem.26：1598-1602(1980)]或抗原-抗体反应[JJCLA18：620(1993)，J.clin.Lab.Inst.Reag.16：33-37(1993)]，一种测定果糖胺数量的方法[Clin.chim，Acta 127：87-95(1982)]，用硫代巴比土酸氧化后的比色测定[Clin.chim.Acta 112：197-204(1981)]等等。但是这些已有方法需要的装置昂贵，缺乏必要的准确性而且不够迅速。
目前利用酶催化的方法已广泛应用于临床测定和食品分析领域，因为可以根据酶的特性(在底物，反应，结构，活性部位等方面的特异性)准确和快速地选择分析预测定物质。
已经提出的测定方法包括一种氧化还原酶与阿玛窦利化合物反应，测定氧消耗或过氧化氢的产生作为阿玛窦利化合物数量的一个指标(如日本专利说明书(kokoku)第5-33997和6-65300，以及日本公开专利说明书第2-195900，3-155780，4-4874，5-192193和6-46846)。此外，测定糖化蛋白用于诊断糖尿病也已经公开(日本公开专利说明书第2-195899，2-195900，5-192193和6-46846)。
由一种氧化还原酶催化的阿玛窦利化合物的分解反应可以用下列的反应式表示： 其中R1是一个醛糖残基，R2是一个氨基酸，蛋白质或肽的残基。
催化上述反应的酶的实例如下：
1.来源于棒状杆菌属(日本专利说明书第5-33997和6-65300)或曲霉菌属(日本公开专利说明书第3-155780)]的果糖氨基酸氧化酶；
2.来源于念珠菌属的果糖胺脱糖酶(日本公开专利说明书第6-46846)；
3.来源于青霉菌属的果糖氨基酸脱糖酶(日本公开专利说明书第4-4874)；
4.来源于棒状杆菌属，镰刀菌属，支顶孢属或德氏酵母菌属的酮胺氧化酶(日本公开专利说明书第5-192193)]；以及
5.可以按照J.Biol.Chem.，Vol.239，pp.3790-3796(1964)中所述的方法制备的烷基赖氨酸酶。
但是，涉及这些已有酶的测定方法存在一些缺陷。
例如，血液中充当诊断糖尿病的指标的糖化蛋白是糖化白蛋白，糖化血红蛋白和果糖胺。葡萄糖与蛋白分子ε-位置的赖氨酸残基结合可生成糖化白蛋白[J.Biol.Chem.，261：13542-13545(1986)]。如果生成的是糖化血红蛋白，葡萄糖还与β-链的N-末端缬氨酸结合[J.Biol.Chem.254：3892-3898(1979)]。因此，必须使用一种对果糖缬氨酸和果糖赖氨酸高度特异的酶测定糖化蛋白作为一种诊断疾病的有效指标。但是，已有的来源于棒状杆菌属的酶对果糖赖氨酸不起作用。至于来源于曲霉菌属的酶，它对糖化蛋白及其水解产物作用不明显。虽然日本公开专利说明书第5-192193中所述的酮胺氧化酶对果糖缬氨酸起作用，但是它不能准确地测定赖氨酸残基与糖结合的糖化蛋白。因为果糖胺脱糖酶对于二果糖赖氨酸是高特异性，所以它不可用于特异性测定赖氨酸残基在ε-位被糖化或者缬氨酸残基被糖化的物质。而且，由于烷基赖氨酸酶缺乏特异性并与其赖氨酸残基与非糖部分结合的物质发生反应，所以使用烷基赖氨酸酶的方法不可靠和不准确。来源于青霉菌属的果糖氨基酸脱糖酶(日本公开专利说明书第4-4874)对果糖赖氨酸和果糖丙氨酸发生作用，但对果糖缬氨酸没有作用。
如上所述，已有的酶不能为糖化蛋白提供一个必要的准确测定方法，因此需要开发一种酶，这种酶对果糖赖氨酸和果糖缬氨酸具有很高的特异性。
通常，为了提高一种含有酶催化步骤的测定方法的准确性和实用性，必须使用一种适合于测定目的具有催化活性的酶。因此，有必要考虑如待测定物质，酶底物，样品的情况，测定条件等许多因素，选择一种合适的酶以便准确测定并且可重复生产。为了选择一种适宜的酶，必须先得到许多酶并分析其活性，底物特异性，温度稳定性，pH稳定性等方面的特性。因而，开发更多的果糖氨基酸氧化酶并对其特性进行相同分析就十分必要。
为了提供一种对阿玛窦利化合物，特别是对糖化蛋白具有特异性的新的果糖氨基酸氧化酶，本发明人进行了大量的研究，发现可以通过在果糖赖氨酸和/或果糖Nα-Z-赖氨酸存在下对镰刀菌株进行培养获得所要的酶。
因此，本发明提供了一种对果糖赖氨酸和果糖缬氨酸都有活性的新的果糖氨基酸氧化酶，这种酶可以通过在含有果糖赖氨酸和/或果糖Nα-Z-赖氨酸的培养基中培养能产生一种果糖氨基酸氧化酶的镰刀菌株而获得。
本发明中，一种含果糖赖氨酸的培养基可含有果糖赖氨酸和/或果糖Nα-Z-赖氨酸，用于培养能产生本发明果糖氨基酸氧化酶的微生物。果糖赖氨酸和/或果糖Nα-Z-赖氨酸(此后简称为“FZL”)通过葡萄糖与赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸在100-150℃下压热器中处理3-60分钟而获得。正如下文所述，本发明的果糖氨基酸氧化酶对包括FZL在内的果糖赖氨酸和果糖缬氨酸具有意想不到的特异性，其中对前者的活性等于或大于对后者的活性。本发明说明书中“果糖氨基酸氧化酶”一词简称为“FAOD”。
通过在含果糖赖氨酸和/或FZL的培养基中培养能产生FAOD的镰刀菌株可制造本发明的酶。
镰刀菌菌株的例子包括：亚麻尖孢镰孢(IFONO.5880)，甘薯尖孢镰孢(IFO NO.4668)，瓜类尖孢镰孢(IFO NO.4471)，黄瓜尖孢镰孢(IFO NO.6384)，苹果尖孢镰孢(IFO NO.7706)芹尖孢镰孢(9964)，松尖孢镰孢(IFO NO.9971)和草莓尖孢镰孢(IFONO.31180)。
本发明的FAOD通常具有以下理化特性：
1)能够在有氧条件下催化阿玛窦利化合物氧化，产生α-酮醛，胺的衍生物和过氧化氢；
2)在约4.0-13.0的pH范围内能保持稳定，最佳pH为8.5；
3)在约20-50℃的温度范围内能保持稳定，最佳温度为30-35℃；以及
4)通过Superdex 200pg上的凝胶过滤，估计其分子量约为106,000(106KDa) 。
将0.01-50％(W/W)葡萄糖与0.01-20％(W/W)赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸的溶液在100-150℃下置于压热器中处理3-60分钟，可以获得用于制备本发明FAOD的果糖赖氨酸和/或FZL。特别是通过将总体积为1000ml，含葡萄糖200g，Nα-Z-赖氨酸10g的溶液在120℃下置于压热器中处理20分钟，制备FZL。
虽然将用上述方法制备的果糖赖氨酸和/或FZL加入任何一个常用培养基都可获得一种含果糖赖氨酸和/或FZL的培养基(此培养基可称为FZL-培养基)，但通过如下制备更方便，即将含有0.01-50％(W/W)葡萄糖，0.01-20％(W/W)赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸，0.1％(W/W)K2HPO4，0.1％(W/W)NaH2PO4，0.05％(W/W)MgSO4·7H2O，0.01％(W/W)CaCl2·2H2O和0.2％(W/W)酵母抽提物的混合液(最佳pH为5.6-6.0)在100-150℃下置于压热器中处理3-60分钟。
用于制备本发明FAOD的培养基可以是本领域中常用的合成或天然培养基，它含有碳源，氮源，无机物以及其它养分。碳源的例子有葡萄糖，木糖，甘油等，氮源的例子有胨，酪蛋白水解液，酵母抽提物等；无机物的例子有钠，钾，钙，锰，镁，钴等其它一般培养基中常含的物质。
当一种微生物在含有果糖赖氨酸和/或FZL的培养基中培养出时，就在很大程度上诱导出了本发明的FAOD。最佳的培养基有含果糖赖氨酸-和/或FZL-的培养基(1.0％葡萄糖，0.5％果糖赖氨酸和/或FZL，1.0％K2HPO4，0.1％NaH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％CaCl2·2H2O和0.01％维生素的混合液)，其中果糖赖氨酸和/或FZL为唯一的氮源，葡萄糖为碳源。
特别优选的一种培养基为1000ml总体积中含20g(2％)葡萄糖，10g(1％)果糖赖氨酸和/或FZL，1.0g(0.1％)K2HPO4，1.0(0.1％)NaH2PO4，0.5g(0.05％)MgSO4·7H2O，0.1g(0.01％)CaCl2·2H2O和2.0g(0.2％)酵母抽提物(其pH为5.6-6.0)。
含果糖赖氨酸和/或FZL的培养基可以通过向任何一种常用培养基中加果糖赖氨酸和/或FZL制备，也可以通过将含有葡萄糖和赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸的培养基置于压热器中处理而制备。由于果糖赖氨酸和/或FZL的存的，用任一方法制备的培养基均为褐色，因此被称为“FZL褐色培养基或GL(糖化赖氨酸和/或糖化Nα-Z-赖氨酸)褐色培养基”。
培养通常在pH为4.0-8.0的培养基中(优选pH为5.5-6.0)，25-37℃的温度(28℃为优选)下进行，但是，培养的条件可根据各种因素如微生物的情况等而变化，并不局限于如上所述条件。例如，亚麻镰刀菌属尖孢菌株，当它在这种条件下培养20-100小时，优选80小时，在培养基中则有FAOD积累(见附图1)。
然后用常规的方法处理所得的培养基，去掉核酸，细胞壁碎片等等，得到一种酶制剂。
因为本发明FAOD的酶活性通常在细菌/霉菌的细胞中积累，所以收集培养基中的细胞并进行研磨以提取此酶。
研磨细胞可以使用常规的方法，例如用机械研磨，用一种溶剂自动水解，冷冻，超声处理，高压密封等等。
分离和纯化一种酶的方法是本领域中已知的技术，可以结合以下已知方法进行，如用硫酸铵盐析，用如乙醇等的有机溶剂沉淀，离子交换层析，疏水性层析，凝胶过滤，亲合层析等。
例如，通过对所得的培养物进行离心或吸滤来收集菌丝，冲洗菌丝并将其悬浮于0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.5)中，用Dino-Mill研磨并进行离心。然后用硫酸铵分馏作为胞外提取物的上清液，经苯-琼脂糖疏水性柱层析而纯化。
本发明中，FAOD包括从所有纯化步骤中所得的任何含酶物质和溶液，不必顾及其酶的纯度，它也包括培养基，只要这些物质和溶液，具有如上所述的催化阿玛窦利化合物氧化的作用。
此外，任何具有FAOD活性或与FAOD酶催化活性有关的FAOD片段均在本发明的范围内，因为这些片段也可用于本发明。
如此获得的FAOD可用于阿玛窦利化合物，特别是糖尿病诊断中糖化蛋白的阿玛窦利化合物的测定。
因而，本发明提供了一种生产FAOD的方法，它包括在一个含选择性被保护的糖化氨基酸和/或糖化蛋白的培养基中培养一个霉菌菌株。
本发明还提供了一种生产FAOD的方法，它包括在一个含果糖赖氨酸和/或果糖Nα-Z-赖氨酸的培养基中培养一个能产生FAOD的镰刀菌株，并且从所得的培养基中回收FAOD。
本发明中通过镰刀菌株产生的所有FAOD均可用于解决本发明要解决的问题。因临时需要，将说明书中通过亚麻镰刀菌属尖孢菌株产生的FAOD称为FAOD-L。
本发明的FAOD具有以下特性：
1.一般的诱导特性
本发明的FAOD是一种由果糖赖氨酸和/或FZL诱导的可诱导酶，它可以通过在含有果糖赖氨酸和/或FZL作氮源以及葡萄糖作碳源的培养基中培养能产生FAOD的镰刀菌株而制备。FAOD可以在一种GL褐色培养基中诱导产生，这种培养通过将葡萄糖与赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸置于压热器中处理而获得，但不是含经过单独压热处理的葡萄糖以及赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸的培养基。这表明此酶对阿玛窦利化合物具有特异性。
2.反应特异性和酶底物特异性
本发明的FAOD对下式表示的反应具有催化作用： 其中R1是一个醛糖残基，R2是一个氨基酸，蛋白质或肽的残基。
在上反应式中，用通式R1-CO-CH2-NH-R2表示的阿玛窦利化合物，其中R1是-OH，-(CH2)n-或-[CH(OH)]n-CH2OH(n是0-6中的一个整数)，R2是-CHR3-[CONHR3]mCOOH(R3是一个α-氨基酸的侧链残基，m是1-480中的一个整数)是优选的底物。其中，R3为从赖氨酸，多聚赖氨酸，缬氨酸，天冬氨酸等中选择的一种氨基酸侧链残基，n为5-6，m≤55的化合物为更优选的底物。
本发明FAOD的底物特异性显示于表1中。
表1
酶底物对纯化的FAOD-L的特异性
酶底物 浓度 特异性活性(％)
Ne-果糖Nα-Z-赖氨酸 1.67mM 100
果糖缬氨酸 1.67 30.1
Ne-甲基-左旋-赖氨酸 1.67 N.D.*)
Ne-果糖多聚-左旋-赖氨酸 0.02％ 0.24
多聚-左旋-赖氨酸 0.02 N.D.
FBSA*2 0.17 N.D.
FHSA*3 0.17 N.D.
加有胰蛋白酶的FBSA 0.17 0.62
加有胰蛋白酶的FHSA 0.17 N.D.
1)：未测到
2)：果糖牛血清白蛋白
3)：果糖人血清白蛋白
从表1中可以明显地看出：本发明FAOD对FZL和果糖缬氨酸均有很高的特异性。FAOD对果糖多聚赖氨酸和糖化蛋白的蛋白酶水解产物具有活性。
表2中显示能够产生FAOD的镰刀菌株的例子。
表2
酶底物对从生长于FZL褐色培养基的镰刀菌株中纯
化的FAOD的特异性
特异性活性(10-2μ/mg蛋白)IFONO，尖孢镰刀菌菌株
果糖Nα-Z-赖氨酸 果糖缬氨酸 L/V1)4468 甘薯菌株 3.76 0.228 16.54471 瓜类菌株 3.37 0.340 9.95880 亚麻菌株 48.6 13.5 3.66384 黄瓜菌株 2.26 0.234 9.77706 苹果菌株 4.86 0.276 17.69964 芹菌株 2.65 0.169 15.79971 松菌株 1.92 0.138 13.931180 草莓菌株 25.2 2.27 11.1
1)：对FZL的活性/对果糖缬氨酸的活性
从表2中可以明显地看出：本发明FAOD对果糖赖氨酸和果糖缬氨酸均有活性，这表明所述的FAOD还可用于糖化血红蛋白的分析。
3.pH和温度条件
pH值条件的测量：
用pH值为4-13的多种缓冲液如0.1M磷酸钾缓冲液(KPB)，盐酸三羟甲基氨基甲烷缓冲液，甘氨酸(Gly)-NaOH缓冲液等取代常用缓冲液，在一个常规测定FAOD活性的反应***中(如在下面“4滴度评价”中所显示的)完成酶反应，以此来测定最佳pH值。
将FAOD加入上述多种缓冲液中并在通常条件下(30℃，pH8.0)保温30℃10分钟后，测量FAOD的活性，以此测定pH值稳定性。
温度条件的测量
在20-60℃不同温度下进行反应并测量酶活性，以此测定最佳温度。以通常条件下在酶溶液中保持活性为标准来测定温度稳定性，这种酶溶液可以通过将FAOD溶于0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)，并在20-60℃范围的不同温度下保温10分钟制备。
按照这些方法评价本发明的FAOD，它在pH为4.0-13.0的范围内稳定，最佳pH为7.5-9.0，更优选pH为8.5(见附图2)。
在20-50℃下酶化反应能有效进行，优选温度为25-40℃，更优选温度为35℃(见附图3)。本发明的FAOD在20-50℃的温度范围内稳定。
4.滴度评价
滴定进行如下：
(1)用比色法测定所产生的过氧化氢的方法
A.测量产生率
将已经得到的FZL溶于蒸馏水中制备100mMFZL溶液。向100μl的45mM4-氨基安替比林，100μl的过氧化物酶(60U/ml)，100μl的60mM苯酚，1ml的0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)和50μl的酶溶液的混合物加蒸馏水，得到总体积为3.0ml。将此溶液在30℃下保温2分钟。加入50μl100mM FZL溶液后，测量在505nm下的吸光度的时间长度。按照所产生的醌颜料的摩尔吸光系数(5.16×103m-1cm-1)计算每分钟所产生的过氧化氢的量(μmol)，所得的数值被作为酶活性的一个单位(U)。
B.终点方法
按照上述方法A中的相同方法，制备一种溶液并将一种酶底物溶液加入其中。在30℃下保温30分钟后测量505nm下的吸光度。以所产生的过氧化氢的量为依据，参照用一种标准过氧化氢溶液所获得的校准曲线评价酶活性。
(2)测定酶反应氧吸收的方法
向1ml 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)和50μl的一种酶溶液的混合液中加蒸馏水，所得的总体积为3.0ml。在一个由Lank兄弟公司生产的氧电极槽中对所得溶液通电。在30℃下搅拌此溶液以使溶于其中的氧在此温度达到平衡，并向溶液中加入100μ500mM FZL。然后用记录器连续测量氧吸收度以获得最初的速率。按照一个标准曲线确定一分钟的氧吸收量，此氧吸收量被看成一个酶单位。
5.酶的抑制、活化和稳定
(1)金属的影响
向一种酶溶液中加一种溶液，此溶液为含有一种最终浓度为1mM的被测金属离子的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)，在30℃下保温5分钟后，评价酶活性，结果显示于下表3中。
表3
金属离子对FAOD-L活性的影响金属(1mM) 特异性活性 金属(1mM) 特异性活性
(％) (％)
无 100 FeSO4 93
LiCl 99 CoSO4 110
KCl 104 CuCl2 35
NaCl 109 ZnSO4 11
RbCl 109 AgNO3 0
CsCl 108 BaCl2 116
MgCl2 103 HgCl2 0
CaCl2 98 FeCl3 77
MnCl2 143
从表3中可以明显地看出：本发明FAOD的活性被铜和锌离子轻微抑制，被银和汞离子完金抑制。
(2)多种抑制剂的影响
用与上述(1)中基本类似的方法测定多种物质的抑制作用。其中PCMB(对氯苯甲酸汞)的最终浓度为0.1mM，其它的最终浓度为1mM。结果显示于表4中。将纯化的FAOD对含2mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)渗析一夜并测酶的活性，以此来确定其稳定作用。
表4
多种抑制剂对FAOD活性的影响试剂(1mM) 特异性 试剂(1mM) 特异性
活性(％) 活性(％)
无 100 氨基脲 96
PCMB*1 0 苯肼 49
DTNB*2 0 肼 10
碘乙酸 90 羟基胺 17
NaN3 102 Clorgyline N.D*3
α，α′-邻联吡啶 103 n，α-二甲基-n-2-丙炔基苯乙胺 104
o-菲咯啉 114 氨基胍 73
*1：PCMB，对氯苯甲酸汞
*2：DTNB，5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)
*3：未测到
从表4中可以明显看出：FAOD的活性被PCMB，DTNB，肼和苯肼很强地抑制，这表明SH和/或羰基在酶反应中具有重要作用。
用二硫苏糖醇DTT可以稳定此酶，含2mM DTT的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.5)为本发明的优选溶剂。
6.分子量
分子量的测定用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)和Superdex 200pg上的凝胶过滤测定。
按照Davis方法用10％凝胶在40mA进行SDS-PAGE三小时，并用考马斯亮蓝G-250给蛋白染色。通过用相同的方法对几种标准已知蛋白如磷酸化酶B，牛血清白蛋白，卵清蛋白，碳酸酐酶和大豆胰蛋白酶抑制剂进行电泳，获得校准曲线，以校准曲线为依据确定其分子量。结果一个亚单位的分子量约为51,000(51KDa)。(见附图4)
Suprerdex 200pg上的凝胶过滤显示FAOD的分子量约为106,000(106KDa)(见附图5)，这表明本发明的FAOD是一个二聚物。
7.等电点
FAOD的等电点(PI)为6.8，是用盘式聚焦电泳法测得的。
8.与已知酶的对照
本发明的FaOD与来源于多种微生物的已知果糖氨基酸氧化酶进行对照。
表5
与来源于微生物的多种果糖氨基酸氧化酶的对照
微生物 亚麻镰刀菌属 棒状杆菌1) 曲霉菌2)
尖孢菌(IF05880)
分子量(凝胶过滤 106,000 88,000 83,000(SDS-PAGE) 51,000 44,000 43,000
辅酶 共价结合的FAD 非共价结合的FAD 非共价结合的FAD酶底物的特异性(U/mg蛋白)(果糖赖氨酸) 18.53) N.D.4) 11.284)(果糖缬氨酸) 6.83 7.09 59.8米氏常数 0.37mM(FZL) 0.74mM(Gly) 2.2mM(Gly)
最佳pH 8.5 8.3 7.7最佳温度(℃) 30～35 40 40
等电点 6.8 4.6 6.8用SH试剂灭活 灭活 未灭活 灭活1)：T.Horiuchi et al.，Agric.Biol.Chem.，53(1)，103-110(1989)
2)：T.Horiuchi et al.，Agric.Biol.Chem.，53(2)333-338(1991)
3)：对果糖Nα-Z-赖氨酸的特异活性
4)：对Ne-D-果糖Nα-甲酰赖氨酸的特活性
从表5中可以明显地看出，本发明的FAOD与来源于两个菌株的其它酶存在以下区别。
(1)分子量：本发明的FAOD的分子量明显大于其它两种酶的分子量。
(2)辅酶：本发明的FAOD的辅酶是共价结合的FAD，而其它酶的辅酶是非共价结合的FAD。
(3)底物的特异性：本发明的FAOD对果糖赖氨酸的特异性比对果糖缬氨酸的特异性高，而来源于棒状杆菌的酶对果糖赖氨酸没有作用，来源于曲霉菌的酶对果糖赖氨酸的作用比对果糖缬氨酸的作用小。
(4)米氏常数：米氏常数的不同表明本发明的FAOD对底物果糖赖氨酸的亲合力大于其它酶对它的亲合力。
(5)最佳pH，最佳温度，等电点以及SH试剂对其的抑制：资料表明本发明的FAOD与其它酶明显不同。
如上所述，本发明的FAOD可用于阿玛窦利化合物的测定。
因此，本发明提供了一种测定样品中阿玛窦利化合物的方法，这个方法包括将含阿玛窦利化合物的样品与本发明的FAOD接触，并测定其耗氧量或过氯化氢的生成量。本发明以糖化蛋白量和/或糖化率的测定为依据，或以来源于活体的样品中果糖胺的测定为依据进行测定。
FAOD的酶活性用下反应式表示： 其中R1是一个醛糖残基，R2是一个氨基酸，蛋白质或肽的残基。
关于待测的样品溶液，可以使用任何含有一种(或多种)阿玛窦利化合物的溶液，例如来源于食品的如酱油。以及来源于活体的如血(例如全血、血浆或血清)和尿等等。
本发明的FAOD与含有一种阿玛窦利化合物的样品在一种适宜的缓冲液中反应。虽然反应混合物的适宜pH和温度随所用的酶和待测样品的不同而变化，但它们有一个如上所述的范围，那就是，pH为4.0-13.0，优选8.5，温度为20-50℃，优选35℃。至于缓冲液，可以用Tris-HCl缓冲液。
用于测定的FAOD的量通常大于等于0.1单位/ml，如果使用的是终点方法，1-100单位/ml的量为优选量。
本发明可以用如下所示的任一已知方法对阿玛窦利化合物进行测定。
(1)根据所产生的过氧化氢的量测定
按照一种过氧化氢的测定方法，如比色方法或使用过氧化氢电极的方法，可以从所产生的过氧化氢量中推算样品中阿玛窦利化合物的量。根据一条关于过氧化氢量与阿玛窦利化合物量的相关校准曲线计算样品中阿玛窦利化合物的量。特别是，用与“表4滴定的评价”中所述的类似方法进行推算，这种方法除FAOD的量为1单位/ml和在测定所产生的过氧化氢量之前对待测样品进行稀释外，其它都相似。
至于过氧化氢的显色***，可以使用任何由于一种色原与一种成色剂在过氧化物酶存在下发生氧化缩合而显色的***，色原如苯酚，成色剂如4-安替比林，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮。色原有苯酚衍生物，苯胺衍生物以及甲苯胺衍生物，例如N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺，N，N-二甲基苯胺，N，N-二乙基苯胺，2，4-二氯苯酚，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧苯胺，N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺。也可应用一种无色型显色剂，它在过氧化物酶存在下依靠氧化作用显色，这些无色型显色剂在本领域中是已知的，它们的例子包括：邻联(二)茴香胺，邻联甲苯胺，3，3-二氨基联苯胺，3，3，5，5-四甲基联苯胺，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲基氨基)-联二苯胺，10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-双(二甲基氨基)吩噻嗪等。
(2)根据耗氧量测定
应用关于耗氧量和阿玛窦利化合物数量间关系的校准曲线，通过从反应起始时的氧量中减去反应完成时的氧量而计算出耗氧量来估计样本中阿玛窦利化合物的量。特别是，除了FAOD的量为1单位/ml以及在测定耗氧量之前对将加入的样品进行适当的稀释外，它可以按照类似于上面“4.滴度评价”中所述的滴定法进行测定。
根据本发明的测定方法，对一种样品溶液也可应用此法，但最好对此样品进行预处理，以便在糖化蛋白中稀放出联接有糖的赖氨酸和/或缬氨酸残基。
为了这样的目的，用一种蛋白酶(酶法)或诸如盐酸等的化学物质(化学法)处理此样品，酶法为优选方法。在此情况下，本领域中已知的内、外型蛋白酶均可用于本发明方法。内型蛋白酶的例子包括：胰蛋白酶，2-糜蛋白酶，枯草溶菌素，蛋白酶K，木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B， 胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，蛋白酶XIV，赖氨酸肽链内切酶，proleser和菠萝蛋白酶F。外型蛋白酶的例子包括：氨肽酶和羧肽酶。酶处理的方法也是已知的，例如，可进行如下面实施例中所述的胰蛋白酶处理。
如上所述，本发明的FAOD对糖蛋白中的果糖赖氨酸具有高特异性。因此，可应用于糖尿病状态的诊断与控制，它包括测定血样中的糖蛋白。另一方面，本发明的FAOD对果糖缬氨酸具有特异性。因此，可用于糖化血红蛋白的测定。
当测定血液时(例如全血、血浆或血清)，来源于活体的血样可按此法应用，或者在诸如透析等预处理后应用。
另外，用于本发明中的酶(例如FAOD，过氧化物酶等)可以液态形式使用或固定于适宜的固体支持剂后使用。例如，可使用一种填充有固定于颗粒的酶的柱获得一种测定糖化蛋白等的自动装置，这种装置能提高诸如临床检验的常规测定的有效率，其中许多样品必须快速准确地测定。因这种固定酶可反复使用，所以它在经济效益方面还有另一种优势。
而且，以一种适宜的方式将一种(或多种)酶与一种(或多种)显色剂结合，有可能提供一种试剂盒。此试剂盒可用于阿玛窦利化合物的临床检测和食品分析。
可以用本领域中的已知方法进行酶的固定。例如，通过载体结合方法，交联方法，包合方法，配位方法等等。载体的例子包括聚合物凝胶，微胶囊，琼脂糖，藻酸，角叉胶等。按照本领域中的已知方法，可以通过共价键，离子键，物理吸收，生物化学亲合等将酶结合于载体。
使用固定酶时，测定可在流动或批量***中进行。如上所述，此固定酶特别适用于血样中糖蛋白的常规检测(临床检验)。
当此临床检验用于指导糖尿病的诊断时，作为糖尿病诊断的标准结果用果糖胺值，糖蛋白浓度或糖化率表示，其糖化率指血样中糖蛋白浓度与全部蛋白浓度的比率。全部蛋白浓度可用常规方法测定，例如通过280nm吸光度测定法，布来得福特法，洛里法，子弹法，白蛋白天然荧光，或血红蛋白吸光度等方法。
本发明还提供了一种用于阿玛窦利化合物测定的试剂或试剂盒，它由本发明的FAOD和一种缓冲液组成，此缓冲液的优选pH值为7.5-8.5，最佳pH值为8.0。固定FAOD时，固体支持剂可从聚合物凝胶等中选择，而且优选藻酸。
在终点测定中，对一个样品的试剂通常含有1-100单位/ml的FAOD，而且以Tris-HCl(pH8.0)作为缓冲液。
当根据所产生的过氧化氢测定阿玛窦利化合物时，任何如上“(1)根据所产生的过氧化氢的量测定”所述的因氧化缩合反应而显色的显色***，无色型显色剂等等均可使用。
可将此用于本发明阿玛窦利化合物测定的试剂与一种适宜的显色剂结合，连同显色标准或标准物质一起制成试剂盒，用于初步诊断和检查。
如上所述的试剂或试剂盒可用于来源于活体的样品的糖蛋白量和/或糖化率的测定或果糖胺的测定。
从上述内容可明显地看出：本发明的FAOD对果糖赖氨酸和果糖缬氨酸均有特异性，其中对前者的特异性更大，在底物的特异性等方面与已有的类似果糖氨基酸氧化酶不同。因此，本发明的FAOD可用于开发新的临床检测方法和食品分析方法。因而，它对糖尿病的诊断和食品的质量控制有很大帮助。特别是，可用于糖尿病的诊断，其中血中糖蛋白量和/或糖化率或果糖胺值可作为诊断或控制糖尿病状态的指标。现在通过使用本发明的一种用于测定阿玛窦利化合物的试剂的方法，使准确有效地确定糖蛋白成为可能，这可以促进糖尿病状态的诊断或控制。
附图1是说明培养时间与培养基所产生的FAOD量之间关系的图表。
附图2是说明溶剂中pH值与FAOD活性之间关系的图表。
附图3是说明溶剂中温度与FAOD活性之间关系的图表。
附图4显示通过对纯化FAOD进行SDS-PAGE而获得的移动方法。
附图5是显示通过Superdex 200pg上的凝胶过滤测定FAOD-L分子量的图表。
附图6显示纯化FAOD-L的吸收光谱
附图7是说明作为一种底物的糖化人血清白蛋白的浓度与由于FAOD作用而产生的过氧化氢的量之间关系的图表。
附图8是说明人血清白蛋白的糖化率与由于FAOD作用而产生的过氧化氢量之间关系的图表。
附图9是说明糖化血红蛋白的浓度与由于FAOD作用而产生的过氧化氢量之间关系的图表。
下面实施例进一步详细地说明本发明，但并不将本发明限于其范围内。
实施例1 亚麻镰刀菌属尖孢菌株的发酵和FAOD-L的纯化
1)发酵
将亚麻镰刀菌属尖孢菌株(IFO第5880)培植于含有O.5％FZL，1.0％葡萄糖，0.1％K2HPO4，0.1％NaH2PO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.01％CaCl2·2H2O和0.2％酵母抽提物的一种培养基中，并且在28℃下培养80小时，同时用一个发酵桶进行通气(2升/分钟)和搅拌(400转/分钟)。过滤培养物获得菌丝。
2)粗提液的制备
将一部分菌丝(270g湿重)悬浮于含2mM DTT的0.1M Tris-HCl缓冲液中(pH值8.5，800ml)，并且用Dino-Mill进行研磨，将研磨混合物以9,500转/分钟离心20分钟以获得作为粗提液的上清液(无胞提取液)，然后对其进行纯化。
3)纯化
第一步：硫酸铵分馏
将粗提液加入硫酸铵达到40％饱和度，将混合物进行12,000转/分钟的离心，保持4℃，以去除沉淀物。向上清液中加入硫酸铵达到75％饱和度，并且分离沉淀物。
第二步：疏水性层析(分批法)
将从上面第一步中获得的沉淀物溶于含2mM DTT的50mM Tris-HCl(pH8.5)(此后称为“缓冲液A”)中。加入含有40％硫酸铵的同体积的缓冲液A后，将丁基-Toyopearl树脂(200ml)加入粗提物的溶液以进行吸附。用缓冲液A通过分批法进行洗脱。用硫酸铵浓缩活性馏分。
第三步：疏水性柱层析
将从上面第二步中获得的浓缩液在用含25％饱和度硫酸铵的缓冲液A平衡过的苯基-Toyopearl柱上吸附。用相同的缓冲液冲洗后，在25-0％饱和度硫酸铵的线性梯度下进行洗脱。收集活性馏份并用硫酸铵浓缩，所得的浓缩液在下一步中使用。
第四步：疏水性层析(柱方法)
将从上面第三步中获得的浓缩液用含40％饱和度硫酸铵的缓冲液A平衡过的丁基-Toyopearl柱上吸附，用相同的缓冲液冲洗柱。在40-0％饱和度硫酸铵的线性梯度下进行洗脱，得到活性馏分。
第五步：离子交换柱层析
然后，将从上面第四步中获得的活性馏分加于用缓冲液A平衡过的DEAE-Toyopearl柱上。在收集并用硫酸铵浓缩的冲洗馏分中检测FAOD活性。所得的浓缩液在下一步中使用。
第六步：凝胶过滤
作为最后一步，用含有0.1M NaCl和2mM DTT的0.1M Tris-HCl缓冲液平衡过的sephacryl 300完成凝胶过滤，以得到一种70-100单位的酶制剂。
此纯化酶的紫外吸收光谱显示于附图6中，它表明此酶是一种黄素酶。
通过SDS-PAGE(十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)和Superdex 200pg上的凝胶过滤确定此纯化酶的分子量。
按照Davis法用10％凝胶在40mA下进行SDS-PAGE三小时。用考马斯亮蓝G-250给蛋白染色。用一条通过用相同方法对如磷酸化酶B，牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白，磷酸酐酶和大豆胰蛋白酶抑制剂的标准蛋白进行电泳所获得的校准曲线，推算其分子量。SDS-PAGE显示：此纯化酶的亚单位的分子量约为51,000(51KDa)(见附图4)。
用含有0.1M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.5)进行凝胶过滤，显示其分子量约为106,000(106KDa)，此见于附图5中。
另外，在实施例1中制备的FAOD-L显示出如前所述相同的与酶活性、最佳pH值和温度，pH值和温度的稳定性，金属和抑制剂的影响等相关的数值和理化特性。
实施例2 糖化人白蛋白量的测定
通过将糖化人血清白蛋白(Sigma)溶解于0.9％NaCl溶液中，制备一组浓度为0-10％之间不等的糖化人白蛋白溶液。用这些溶液按下面的方法进行测定。
1)蛋白酶处理
将一种糖化白蛋白溶液(60μl)和12.5mg/ml蛋白酶XIV(Sigma)溶液(60μl)的混合物在37℃下保温30分钟。然后在约90℃下给此混合物加热5分钟以终止反应。
2)活性测定
FAOD反应混合物由下列试剂制备：
45mM 4-氨基安替此林溶液30μl
60mM N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺溶液30μl
过氧化物酶溶液(60单位/ml)30μl
0.1M tris-HCl缓冲液(pH8.0)300μl
FAOD-L溶液(6单位/ml)50μl
混合这些试剂后，用蒸馏水将总体积调到1ml。通过用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释由实施例1获得的纯化FAOD-L，制备FAOD-L溶液(6单位/ml)。将FAOD反应混合物在30℃下保温2分钟后，向其中加入每种经蛋白酶处理的溶液(100μl)。然后，测量其30分钟后555nm下的吸光度，以评价糖化白蛋白浓度与吸光度间的关系。其结果显示于附图7中，其中纵坐标表示555nm下的吸光度，它与所产生的过氧化氢的量相对应，横坐标表示糖化白蛋白浓度。附图7表明：糖化白蛋白的浓度与过氧化氢的量是相互关联的。
实施例3人血清白蛋白糖化率的测定
将糖化人血清白蛋白(sigmaCo.)(150mg)和人血清白蛋白(Sigma Co.)(150mg)分别溶于0.9％NaCl溶液中(3ml)。将这些溶液合并以制备不同糖化率的溶液，用一种糖化白蛋白自动测定装置(kyoto Daiichi KagakuCo.Ltd.)测定其糖化率。测定显示：其糖化率为24.6-61.1％。用这些溶液按下面的方法进行测定。
1)蛋白酶处理
将一种糖化白蛋白溶液(60μl)和12.5mg/ml蛋白酶XIV(Sigma)溶液(60μl)的混合物在37℃下保温30分钟。然后在约90℃下给此混合物加热5分钟以终止反应。
2)活性测定
FAOD反应混合物由下列试剂制备：
45mM 4-氨基安替比林溶液30μl
60mM N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲苯胺溶液30μl
过氧化物酶溶液(60单位/ml)30μl
0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)300μl
FAOD-L溶液(6单位/ml)50μl
混合这些试剂后，用蒸馏水将总体积调到1ml。通过用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释由实施例1获得的纯化FAOD-L，制备FAOD-L溶液(6单位/ml)。
将FAOD反应混合物在30℃下保温2分钟后，向其中加入每种经蛋白酶处理的溶液(100μl)，然后，测量其30分钟后555nm下的吸光度，以评价白蛋白糖化率与吸光度之间的关系。其结果显示于附图8中，其中纵坐标表示555nm下的吸光度，它与所产生的过氧化氢的量相对应，横坐标表示白蛋白的糖化率。附图8表明：白蛋白的糖化率与过氧化氢的量是相互关联的。
实施例4 糖化血红蛋白水平的测定
通过将糖化血红蛋白对照物(Sigma)溶于蒸馏水中，制备一组0-35％不同浓度的糖化血红蛋白溶液。用这些溶液按下面的方法的进行测定。
1)蛋白酶处理
将一种糖化血红蛋白溶液(25μl)，500单位/ml氨肽酶溶液(5μl)和0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的混合液，在30℃下保温30分钟，向其中加入10％三氯乙酸(50μl)并搅拌。此混合物在0℃下静置30分钟后，以12000转/分钟离心10分钟。用约50μl 2M NaOH中和此上清液。
2)活性测定
FAOD反应混合物由下列试剂制备：
3mM N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-二(二甲氨)二苯胺溶液30μl
过氧化物酶溶液(60单位/ml)30μl
0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)300μl
FAOD-L溶液(4单位/ml)10μl
混合这些试剂后，用蒸馏水将总体积调到1ml。通过用0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释由实施例1获得的纯化FAOD-L，制备FAOD-L溶液(4单位/ml)。将FAOD反应混合物在30℃下保温2分钟后，向其中加入每种经蛋白酶处理的溶液(80μl)。然后，测量其30分钟后727nm下的吸光度，以评价糖化血红蛋白浓度与吸光度间的关系。其结果显示于附图9中，其中纵坐标表示727nm下的吸光度，它与所产生的过氧化氢的量相对应，横坐标表示糖化血红蛋白浓度。附图9表明，糖化血红蛋白的浓度与过氧化氢的量是相互关联的。
Claims (11)
1.一种果糖氨基酸氧化酶，它对果糖赖氨酸和果糖缬氨酸均有活性，并且通过一种含果糖赖氨酸的培养基培养一种能产生果糖氨基酸氧化酶的镰刀菌属菌株产生。
2.如权利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶，它对果糖赖氨酸的活性高于或等于对果糖缬氨酸的活性。
3.如权利要求1的所述的果糖氨基酸氧化酶，其中含果糖赖氨酸的培养基含有经100-150℃下葡萄糖与赖氨酸和/或Nα-Z-赖氨酸在压热器中共同处理3-60分钟而获得的果糖赖氨酸和/或果糖Nα-Z-赖氨酸。
4.如权利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶，其中镰刀菌属的菌株可从亚麻尖孢镰孢(IFO NO.5880)，甘薯尖孢镰孢(IFO NO.4468)，瓜类尖孢镰孢(IFONO.4471)，黄瓜尖孢镰孢(IFO NO.6384)，苹果尖孢镰孢(IFO NO.7706)，芹尖孢镰孢(9964)，松尖孢镰孢(IFO NO.9971)和草霉尖孢镰孢(IFO NO.31180)。
5.如权利要求1-4中任一所述的果糖氨基酸氧化酶，其特征在于具有以下理化特性：
1)能够在有氧存在下催化阿玛窦利(amadori)化合物氧化，产生α-酮醛、胺的衍生物和过氧化氢；
2)在pH约4.0-13.0的范围内能保持稳定，其最佳pH为8.5；
3)在温度约20-50℃的范围内能保持稳定，其最佳温度为30-35℃；以及
4)通过Superdex 200pg凝胶过滤估计其分子量约为106,000(106KDa)。
6.一种如权利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶的生产方法，它包括在含任意保护的果糖氨基酸和/或糖化蛋白的培养基中培养一种霉菌。
7.如权利要求6所述的方法，其中将一种能产生果糖氨基酸氧化酶的镰刀菌属菌株在一种含果糖赖氨酸和/或果糖Nα-Z-赖氨酸的培养基培养，并从所得培养物中回收果糖氨基酸氧化酶。
8.一种含阿玛窦利化合物样品中阿玛窦利化合物的测定方法，包括将一种如权利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶接触样品和测其耗氧量或所产生的过氧化氢量。
9.如权利要求8所述的测定方法，其中样品来源于活体，阿玛窦利化合物的测定按样品中糖化蛋白量和/或糖化率的测定或者果糖胺的测定进行。
10.一种用于测定阿玛窦利化合物的试剂或试剂盒，它包括如权利要求1所述的果糖氨基酸氧化酶。
11.如权利要求10所述的试剂或试剂盒，它可用于测定来源于活体样品中的糖化蛋白量和/或糖化率，或者果糖胺。
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| C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |