CN116121357A - 免疫性肾病标志物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于肾脏疾病诊断技术领域，特别公开一种免疫性肾病标志物及应用，所述标志物包括TNF、IL1B、CCL17、CCL22、HLA、CD40、CD80、CD86、STAT4、RELB、CCL2、CXCL12、CX3CL1中的一种或多种，检测肾脏中标志物表达水平的试剂可制备用于病理分级或诊断免疫性肾病试剂盒，本发明使用scRNA‑seq、流式细胞术和mIHC染色方法，报道了LN患者中肾脏DC3（CD1c+CD163+）的存在。并与LN疾病中的血液DC3相比，以及和其他CDc2亚族对比，显示出众多区别特征，介于本发明发现的DC3在LN疾病中的特殊性，从而使这些区别特征可作为标志物在基因水平或者蛋白水平进行检测应用于狼疮性肾炎的预后评估、诊断或监测。

Description

免疫性肾病标志物及应用
技术领域
本发明属于肾脏疾病诊断技术领域，特别涉及一种免疫性肾病标志物及应用。
背景技术
免疫性肾病是一组由多种病因引起的具有相同免疫病理学特征的慢性肾小球疾病。免疫性肾病包括紫癜性肾炎、狼疮性肾炎、IgA肾病等，由于患者的免疫***功能紊乱，产生的免疫复合物沉积在肾脏中，对肾脏的固有细胞造成损伤，引发炎症反应等，破坏肾脏固有细胞的正常功能而使患者出现蛋白尿、血尿、水肿等肾病症状而发病。
特别的对于狼疮性肾炎（LN），尽管采用了先进的免疫抑制疗法，但仍有高达60%的LN患者无法获得完全缓解，而这些患者中有10~20%在10年内发展为终末期肾病（ESKD）。即使有精心设计的临床试验，也难以实现新的治疗性策略。这些不令人满意的情况增加了进一步研究疾病进展和个体异质性背后的致病机制的需要。
目前关于LN发病机制的知识表明，该疾病涉及多种细胞类型以及免疫和非免疫机制。B细胞可通过分泌直接针对结构细胞的自身抗体诱导肾损伤，而细胞毒性CD8+T细胞和CD4+T辅助（Th）细胞通过直接细胞毒性或促进B细胞分化和活化来驱动肾脏炎症。然而，小鼠研究表明，尽管有IC沉积，但Fcγ受体的缺乏或树突状细胞（DC）耗竭会消除LN肾脏中的T细胞活化和白细胞聚集，这意味着先天免疫细胞在人类疾病的免疫发病机制中的关键作用尚未明确。此外，肾结构细胞诸如内皮细胞、足细胞和肾小管上皮细胞被认为不仅是被动的受害者，而且是局部炎症的积极参与者。它们可在炎症状态期间通过免疫原性基因表达和细胞因子产生重塑肾脏微环境。尽管有多种细胞类型被认为与LN有关，并且它们复杂的细胞相互作用的结果与肾损伤程度密切相关，并可能影响LN患者的治疗结果，但它们的确切表型和在疾病进展中的作用仍不清楚。因此，对LN肾脏进行全面、深入的细胞分析以及组学研究，如转录组学，蛋白质组学等，以鉴定出疾病相关联特异性标志物，将有助于更好地理解致病机制，并为治疗性决策提供更精确的患者分层。
发明内容
本发明的主要目的是解决背景技术中存在的问题，为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
检测肾脏中标志物表达水平的试剂在制备用于病理分级或诊断免疫性肾病试剂盒中的应用，所述标志物包括DC3细胞高表达的基因TNF、IL1B、CCL17、CCL22、HLA、CD40、CD80、CD86中的一种或多种；和/或DC3细胞成熟相关联的转录因子STAT4、RELB中的一种或多种；和/或受损近端肾小管上皮细胞（iPT）高表达基因VCAM1、CCL2、CXCL12、CX3CL1中的一种或多种。
所述免疫性肾病包括狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、IgA肾病或ANCA相关性肾小球肾炎，优选的为狼疮性肾炎。
作为一种实施方式，所述试剂在基因水平或蛋白水平上检测所述标志物的表达水平。
作为一种实施方式，所述基因水平上检测的试剂选自所述标志物的引物、探针或基因芯片。
进一步的，所述蛋白水平上检测的试剂选自所述标志物的抗体。
在各种实施方案中，可以理解的是“测定”、“检测”具有等同的意思表示，“检测”可以是经由用于检测扩增产物的方法(例如但不限于PCR、RT-PCR、q-PCR等)来进行的，也可以使用本领域中已知的检测核酸/基因/蛋白质/标志物的其他合适的方法。
在各个实施方案中，本文所述的用于病理分级或诊断免疫性肾病试剂盒包括测定本发明所述的一种或多种标志物水平的试剂，例如对照、标准品和/或监测试剂等。在具体的一个实施例中，试剂盒具有实体形态，例如试剂盒可以是具有一个或多个空间的容器，该一个或多个空间用于容纳上述对照、标准品、检测试剂的材料或装置。
在各种实施方案中，由于在受试者的样品中表征上述任一所述的标志物，通过鉴定/测量在受试者的样品中的存在 /水平/比例，可以给出在所述受试者中身体应答，例如狼疮性肾炎的水平/严重度/程度/负荷/攻击性/疾病阶段/疾病状态的指示，具体的，如在受试者中诊断身体应答和/或疾病，确定在所述受试者中身体应答和/或疾病的预后，和确定在所述受试者中身体应答和/或疾病的改善和/或恶化。
作为一种在预估、诊断或监测中的实施方式，测定在受试者的样品中所述标志物至少一种的表达比例，其中所述比例与所述受试者中狼疮性肾炎的严重程度正相关。
作为另一种在预估、诊断或监测中的实施方式，所述应用为当在测试样品中标志物的表达水平大于在来自相同受试者的早期样品中的表达水平时，鉴定出在受试者疾病的恶化，当在测试样品中标志物表达水平低于在早期样品中的表达水平时，鉴定出在受试者中疾病的改善。
进一步的，所述试剂检测的样本为肾活检穿刺获得的肾皮质和/或髓质。
作为一种应有方式，本发明提供了一种治疗狼疮性肾炎的药物的筛选方法，包括以下步骤：将待筛药物与狼疮性肾炎模型作用，检测至少一种标志物的表达量，根据所述表达量的变化情况筛选出所述药物。
本发明使用scRNA-seq、流式细胞术和mIHC染色方法，报道了LN患者中肾脏DC3的存在。与LN中的血液DC3相比，肾脏DC3中MHC-II和共刺激分子的上调表达指示它们的成熟和活化状态，且肾脏DC3显示了 TNF、 IL1B、 CCL17和 CCL22的显著特征。与其他亚簇相比，与DC成熟相关联的转录因子（TF）在活化刺激转导后上调，包括STAT4和RELB，在肾脏DC3中是活跃的。
另外，使用高通量液滴测序（10x基因组学平台）技术同时对肾活检的免疫细胞和结构细胞进行测序，从而能够对LN肾脏中的微环境和细胞间通信进行全局表征。我们鉴定出LN患者中的肾脏DC3亚群，并提出了一种DC3介导的LN发病机制的炎症网络的新型范式：其中，受损的近端上皮细胞上调LN肾脏中促炎细胞因子和趋化因子，诸如CCL2、CXCL12、CX3CL1；介于由本发明DC3亚群带来的这些区别于cDC2的其他亚群及血液中的DC3的特征，因此这些区别特征，可作为标志物在基因水平或者蛋白水平进行检测应用于狼疮性肾炎的预后评估、诊断或监测。
附图说明
图1：LN肾脏中DC3的表征图
a、来源于LN患者的肾活检和外周血样本的DC3的UMAP，由细胞簇和组织起源预测。
b、显示每个cDC2亚簇的炎症反应特征（左）和抗原加工和呈递特征（右）的小提琴图。
c、显示与细胞因子、趋化因子、抗原呈递和成熟相关的基因在每个cDC2亚簇中的表达水平的热图。
d、显示每个cDC2子簇下TF活动的热图。TF，转录因子。
e、显示通过CytoTRACE分析推断的cDC2亚簇的分化状态的UMAP。
f、显示每个cDC2亚簇的伪时间的UMAP（上）和小提琴图（下）。
g、显示了9个功能基因沿图1f中的cDC2轨迹的表达趋势的图。
h.显示LN肾脏中富含DC3的途径的点图。
图2：DC3对LN患者治疗反应的预测值效果图
a、显示完全缓解（CR，n = 11）和非完全缓解（NCR，n = 8）LN患者肾脏中DC3、Th1和Th17细胞比例的箱线图。非配对双侧Wilcoxon检验。CR，完全缓解；NCR，非完全缓解。
b、显示独立队列中CR（n = 30）和NCR（n = 30）LN患者肾脏中DC3、Th1和Th17细胞数目的箱线图。非配对双侧Wilcoxon检验。
c、用抗CD11c和CD163对肾活检切片进行mIHC染色的代表性示例显示了来自独立队列的有CR和NCR的LN患者中的DC3。原始放大倍数，20倍；比例尺，50 μm。
d、棒棒糖图显示了DC3计数、Th1和Th17细胞计数、人口统计学、临床和病理学特征在伴有CR和NCR的LN患者之间的单变量分析。
e、DC3数目、24hUpro、WBC、eGFR和肾小管坏死的单变量逻辑回归模型的ROC曲线。WBC，白细胞计数。
f、棒棒糖图显示LN患者CR和NCR之间的多变量分析。
图3：LN肾脏中DC3和T细胞之间的相互作用示意图
a、显示LN肾脏中cDC2亚簇与CD4+和CD8+T细胞之间的相互作用的网络。箭头宽度表示两个簇之间的L-R对的总和。L-R，配体受体。
b、显示DC3与Th1和Th17细胞之间特异性相互作用的显著性（-log10 P-值+10-4）和强度（表达）的点图；顶部的直方图显示预测的配体-受体对的总计数。
c、NicheNet的配体-靶矩阵，表示DC3配体由簇cT02_CD4_IFNG表达的Th1分化途径中涉及的靶基因之间的调节潜力；左侧的热图显示了最能预测Th1分化途径中涉及的靶基因的前20个DC3配体。
d、NicheNet的配体-靶矩阵，表示DC3配体和由簇cT03_CD4_IL17A表达的Th17分化途径中涉及的靶基因之间的调节潜力；左侧的热图显示了最能预测Th17分化途径中涉及的靶基因的前20个DC3配体。
e、条形图显示了CD4+（上）和CD8+T细胞（下）亚型中具有独特克隆型或不同克隆扩增程度的细胞数目。
图4：LN肾脏中iPT细胞和DC3之间的相互作用示意图
a、来自HC和LN患者肾活检样本的肾结构细胞UMAP，共19个亚群。
b、显示肾结构区室中每个亚簇的比例（相对于肾结构细胞总数）与LN肾脏中DC3的比例（相对髓样细胞总数）之间的Pearson相关性的点图。
c、显示了PT（cEpi03_PT_ALDOB）和iPT（cEpi04_iPT_SOX9）细胞中的标记基因表达的小提琴图。
d、显示了通过细胞-细胞相互作用分析推断的肾结构区室中每个亚簇与LN肾脏中DC3之间的L-R对总数的热图。L-R，配体受体。
e、显示LN肾脏中PT细胞与DC3、iPT细胞和DC3之间特异性相互作用的显著性（-log10 P值+10-4）和强度（表达）的点图。
f、具有抗CD11c、CD163、CD3、SLC22A6和VCAM1的来自LN患者肾活检切片的代表性mIHC染色示例，显示肾小管间质空间中的DC3、iPT和T细胞。白色箭头表示DC3，红色箭头表示iPT细胞。原始放大倍数，20倍；比例尺，50 μm。
g、显示PT和iPT细胞中趋化因子相关基因的表达水平的UMAP。
h、DC3迁移测定。通过荧光活化细胞分选（FACS）从健康对照的外周血中分离DC3和DC2，并与SLE血清处理的HK-2细胞上清液一起培养。流式细胞术计数迁移的DC3和DC2。数据以平均值±s.e.m.呈现。非配对双尾t检验。* P<0.05。
图5：LN患者外周血样中cDC2的鉴定情况图
a、来源于具有5个亚簇的LN患者的外周血样本的髓样细胞的UMAP。
b、UMAP显示每个髓样细胞亚簇中的标准标记表达-，点图显示每个髓样亚簇中其他选定标记基因-。
c、来源于具有2个亚簇的LN患者的外周血样本的cDC2的UMAP。
d、显示cDC2亚簇中标记基因表达的热图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
试验方法中购入商品，品牌标注在试剂名称后的括号内，如中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市售购买获得的常规产品。
除非本文另有定义，否则结合本发明公开使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义，以下描述示例性方法和材料，但是与本文描述的那些类似或者等同的方法和材料也可以用于本公开的实践和测试中。
本文使用的以下词语和术语应具有所示出的含义：
本文中的 “标志物”是指其水平变化与疾病，特别是肾病的发生和发展具有相关性的化合物和代谢物，换句话说，疾病患者与健康者的样品中标志物水平存在差异，疾病患者在各分期至少有一期与前期之间存在差异，特别是显著差异，
在本文中所使用的术语“受试者”包括患者和非患者。术语“患者”是指罹患或可能罹患医学状况例如炎症或炎性疾病的个体，而“非患者”是指未罹患或可能不会罹患该医学状况的个
体。“非患者”包括健康的个体，未患病的个体，和/或没有该医学状况的个体。术语“受试者”包括人和动物。动物包括鼠类等。“鼠类”是指任何来自鼠科(Muridae)的哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。
在本文中所使用的术语“预后评估”、“诊断”或“监测”是指从医学的角度对人们的精神和体质状态做出判断，具体来说是一种确定哪种疾病或病症可以解释受试者的症状和体征的过程，例如，通过测定本文中所公开的标志物水平来确定受试者中肾脏疾病的存在，对肾脏疾病分期，判断肾病的严重程度，确定肾病的具体类型和阶段。
如本文所使用的，当可以使用句子中列出的事项中的“至少一种或多种”时使用“或”。当在本文中明确地描述为“在两个值”的“范围内”时，该范围还包括这两个值本身。
本文引用的参考文献诸如科学文献、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度与具体描述每个文献相同。
在本文中，术语“定量检测标志物”与鉴定/测量在受试者的样品中的存在/数量/水平/比例为等同意思。
在本文中，术语“iPT”特指受损的近端肾小管上皮细胞；“PT”指近端肾小管上皮细胞。
本文中描述的DC3均指代CD1c+CD163+的树突细胞亚群。
LN仍然是SLE发病率和死亡率的主要原因之一，但其发病机制仍不清楚。在我们目前的研究中，通过生成LN肾脏的免疫细胞和非免疫细胞的无偏单细胞转录组学谱，我们发现了患病肾脏中的致病性DC3（CD1c+CD163+）亚群，并观察和验证了肾DC3是预测LN治疗有效性的宝贵病理学标志，我们提出，肾脏DC3是在人类LN发病期间连接肾脏固有细胞iPT和免疫T细胞的桥梁。研究了LN肾脏中DC3细胞与血液中DC3的区别，以及DC3细胞与cDC2的其他亚群的区别特征，而基于这些特征，可以合理预期的是，这些区别特征，可作为标志物在基因水平或者蛋白水平进行检测应用于狼疮性肾炎的预后评估、诊断或监测。下面本发明对该研究做出进一步的说明。
实施例1：LN肾脏中的DC3被活化并高度促炎
我们描述了LN肾脏中DC3的细胞状态和功能属性。将外周血中检测到的cDC2纳入后续分析中，血液cDC2被无偏地分为两个亚簇C4和C5，根据标记基因表达，它们分别被鉴定为血液中的DC2和DC3（图5）。整合来源于LN肾脏和血液的cDC2亚簇并产生总共6个亚簇（图1a）。我们比较了LN肾脏DC3与其他cDC2亚簇的转录组学谱。LN肾脏DC3显示了炎症反应和抗原加工和呈递的总体强信号（图1b）。特别是，它们具有促炎细胞因子基因 TNF和 IL1B以及T细胞吸引趋化因子基因 CCL17和 CCL22的最高表达（图1c）。肾脏DC3还表达了最高水平的与主要组织相容性复合体（MHC）-II分子（ HLA-DQA1和 HLA-DQB1）和共刺激因子（ CD40、 CD80和 CD86）相关联的基因，表明它们具有向T细胞呈递抗原的引发能力。通过分析SCENIC的调节网络，鉴定出每个cDC2亚簇的转录因子（图1d）。与其他亚簇相比，与DC成熟相关联的转录因子（TF）在活化刺激转导后上调，包括STAT4和RELB，在肾脏DC3中是活跃的。我们进一步整合了多轨迹计算方法来预测它们的细胞状态。CytoTRACE推断血液cDC2处于分化程度最低的状态，而肾脏cDC2分化程度更高（图1e）。基于这一观察，我们将血液cDC2视为Monocle3生成的轨迹中的根状态，并根据推断的伪时间绘制细胞图，进而预测LN肾脏DC3为终点（图1f）。此外，成熟、MHC-II分子和促炎基因表达的上调趋势沿着伪时间被证实，这表明LN肾脏中的DC3与它们的血液对应物相比是成熟的、活化的，具有高度促炎作用的（图1g）。与这些发现一致，途径分析显示，T细胞活化在该亚群中最为上调（图1h）。
基于上述研究，针对LN肾脏中DC3细胞与血液中DC3的区别，TNF、IL1B、CCL17、CCL22、HLA、CD40、CD80、CD86、STAT4、RELB可以预期的作为从基因或蛋白水平上，用于LN疾病或具有相同免疫病理学特征的慢性肾小球疾病的预后评估、分级等应用。
实施例2：肾脏DC3预测LN患者的治疗效果
肾脏DC3在疾病严重程度中的临床意义促使我们研究DC3浸润程度是否与LN患者的治疗效果相关联。在本研究中，在肾活检后接受免疫抑制剂联合糖皮质激素诱导疗法的LN患者中，13例患者完全缓解，6例患者未完全缓解。不完全缓解患者中的肾脏DC3比例显著较高（图2a）。我们还比较了不同缓解组之间Th1和Th17细胞的比例，因为它们是与疾病严重程度相关的两个其他细胞群，并观察到相同的趋势。然而，当我们通过肾活检石蜡切片的mIHC染色在独立LN队列中验证这些发现时，在不完全缓解的患者中，只有DC3显著富集（图2b-c）。为了进一步检验肾脏DC3在治疗效果中的预测能力，首先进行了使用人口统计学特性、临床病理学参数、肾脏中的DC3、Th1和Th17细胞计数的单变量分析。24h-Upro、外周血白细胞计数、血小板计数、肾脏病理中肾小管坏死、mIHC染色中Th1细胞计数和DC3计数与治疗无效性呈正相关，而eGFR与治疗无效性呈负相关（图2d）。此外，对这些变量的受试者操作特性（ROC）曲线进行比较，发现DC3计数具有最高的曲线下面积（AUC）0.84（图2e）。在多因素logistic回归分析中，仅肾脏中的DC3计数具有统计学差异（图2f）。这些结果强调肾脏DC3是接受诱导疗法的LN患者治疗效果的预测标志，其可用于临床实践中的患者分层。
实施例3：LN肾脏中的DC3表现出促进T细胞活化的表达谱。
我们下一步的工作是研究肾脏DC3在LN发病机制中的意义。LN肾脏DC3显示与T细胞活化相关联的表达特征。因此，我们应用配体-受体算法来推断DC3和T细胞之间的潜在相互作用。首先计算每个cDC2亚群与CD4+和CD8+T细胞之间的配体-受体（L-R）对的总数。我们观察到，DC3与CD4+和CD8+T细胞均具有很强的相互作用可能性（图3a）。关于T细胞亚型，预测DC3主要与Th17、Th1、 GZMK +和 GZMB +活化的细胞毒性T细胞相互作用（图3b）。它们可经由共刺激分子CD86、CD58和CD40（CD86-CD28、CD58-CD2和CD40-CD40LG）以及经由细胞因子肿瘤坏死因子（TNF-TNFRSF1A）和白细胞介素-15（IL-15-IL-15受体）向T细胞提供活化信号，表明它们在T细胞活化中的关键作用（图3b）。除活化外，DC3还可经由CCL2-CCR2、CCL3-CCR5、CXCL16-CXCR6、CCL17-CCR4和CCL22-CCR6轴募集多种T细胞。
人类血液DC3能够在体外极化Th1和Th17细胞。我们进行了NicheNet分析，以探讨DC3对LN肾脏中这些亚型的免疫调节作用。在调节Th1细胞的DC3配体中，优先考虑IL-1家族细胞因子编码基因 IL1B和 IL18（图3c），它们是参与Th1分化的细胞因子。相比之下，转化生长因子-β（TGF-β），一种引发Th17分化的基本细胞因子，被预测为由DC3在诱导Th17特征基因表达时产生的活性配体（图3d）。此外，进行TCR测序以检查不同T细胞亚群之间的克隆扩增程度。在同一患者中共享相同TCR序列的两个或更多T细胞被视为克隆扩增T细胞。在CD4+T和CD8+T两大群细胞中，CD4+Th1和CD8+ GZMK +细胞毒性T细胞分别表现出最高程度的克隆扩增（图3e）。
基于上述研究中，LN肾脏DC3显示与T细胞活化相关联的表达特征，血液中DC3的表达与T细胞的相互作用，与肾脏中DC3与T细胞的相关作用，有区别，故进一步的可以预期，DC3中高表达的一些和T细胞相互作用的基因，能用于LN疾病或具有相同免疫病理学特征的慢性肾小球疾病的预后评估、分级等应用。
实施例4：受损的近端肾小管上皮细胞-DC3串扰可导致肾脏炎症
肾结构细胞是协调局部炎症中的积极参与者。通过解剖肾脏中复杂的微环境（图4a），我们发现iPT细胞在肾脏固有细胞中的比例与LN的疾病严重程度显著相关联。有趣的是，iPT细胞的比例也与LN肾脏DC3的比例呈正相关（R=0.44， P=0.0046）（图4b）。与正常PT细胞相比，iPT细胞表达一些文献报道参与炎症的基因，包括 CCL2、 SOX9、 CDH6和 VCAM1（图4c）。因此，我们假设这些iPT细胞可与DC3相互作用以放大LN中的炎症反应。我们的数据显示，基于受体配体对的总数，iPT细胞与DC3的相互作用在所有肾结构细胞亚簇中位居第二（图4d）。互作分析发现，iPT可以通过分泌趋化因子 CCL2、 CXCL12和 CX3CL1经由 CCL2-CCR2、 CXCL2-CXCR4和 CX3CL-CX3CR1轴与DC3相互作用，即可以通过这3条趋化因子轴募集DC3细胞（图4e和4g）。我们进行了趋化性分析，以研究受损肾细胞在体外募集DC3的能力。首先用来自活动性LN患者的血清处理人肾-2（HK-2）细胞以诱导细胞损伤。受损的HK-2细胞上清液用于来自健康对照外周血中流式分选的CD1c+CD163+DC3和CD1c+CD163-非DC3的体外趋化性测定。迁移细胞的定量显示，与非DC3相比，响应于受损的HK-2上清液的反应，募集了显著增加的DC3（图4h）。
此外，我们还发现iPT可以通过粘附分子和DC3相互作用，如iPT表达粘附分子VCAM1，与DC3细胞表面的整合素a4b7或a4b1相互作用，增强DC3的粘附。除此之外，iPT还可以通过表达TNC或SPP1，作用于DC3的整合素a4b1；iPT通过表达ICAM1，与DC3的整合素aXb2、aMb2、aLb2相互作用，这种相互作用可增强细胞粘附。LN患者肾活检切片的mIHC染色显示DC3聚集并接近iPT细胞（图4f）。这些数据表明，受损的近端肾小管上皮细胞可募集DC3并将其粘附在肾小管间质空间，随后在那里可诱导T细胞应答。
 基于上述研究中，我们的数据表明iPT-DC3-T细胞通信建立正反馈回路，进一步加重组织损伤并使肾脏炎症长期存在，该反馈回路现有技术并未有相关报道，介于iPT和DC3（CD1c+CD163+）高促炎性，且在LN肾中的iPT-DC3相互作用放大LN中的炎症反应的分子，可以预期的，这些分子能在基因和蛋白水平上作为标志物，用于LN疾病或具有相同免疫病理学特征的慢性肾小球疾病的预后评估、分级等应用。
论述
LN仍然是SLE发病率和死亡率的主要原因之一，但其发病机制仍不清楚。在此，本发明通过生成LN肾脏的免疫细胞和非免疫细胞的无偏单细胞转录组学谱，我们发现了患病肾脏中的致病性DC3亚群，并观察到肾DC3是预测LN治疗有效性的宝贵病理学标志，并提出，肾脏DC3是在人类LN发病期间连接肾脏固有细胞iPT和免疫T细胞的桥梁。
我们鉴定出LN患者中的肾脏DC3亚群，并提出了一种DC3介导的LN发病机制的炎症网络的新型范式：（i）受损的近端上皮细胞上调LN肾脏中促炎细胞因子和趋化因子，诸如CCL2、CXCL12、CX3CL1；（ii）这些受损的上皮细胞促进血液DC3向肾脏的募集；（iii）肾脏DC3被重新编程并变成促炎性的以活化适应性T细胞应答；（iv）扩增的免疫细胞浸润进一步损害肾结构细胞，包括肾小管上皮细胞。上述iPT-DC3-T细胞通信将建立正反馈回路，进一步加重组织损伤并使肾脏炎症长期存在。我们认为，我们的数据可最好地解释为肾脏DC3作为连接肾实质损伤和适应性免疫细胞浸润的桥梁，这可代表人类LN发病机制的新型疾病范式，并可能为治疗性开发开辟新途径。
DC3代表首次在健康人类血液液中发现的cDC2谱系的亚群。在狼疮患者中，血液DC3通过上调细胞因子-趋化因子相关转录物而变成促炎因子。使用scRNA-seq、流式细胞术和mIHC染色方法，我们报道了LN患者中肾脏DC3的存在。与LN中的血液DC3相比，肾脏DC3中MHC-II和共刺激分子的上调表达指示它们的成熟和活化状态，表明它们获得了局部激活组织内T细胞的能力。Th1和Th17亚型在LN病理学中起关键作用，并与疾病进展相关。值得注意的是，肾脏DC3显示了 TNF、 IL1B、 CCL17和 CCL22的显著特征，表明它们可能是驱动组织损伤并促进T细胞运输的炎性细胞因子和趋化因子的有效产生者。事实上，我们的细胞-细胞相互作用分析显示，LN肾脏DC3与Th1和Th17细胞强烈相互作用，并可能分别经由IL-1B和TGF-β诱导Th1和Th17反应。肾脏DC3的这些转录特征突出了DC3在放大炎症方面的多种潜力。
我们的目前的研究中，已经证明肾脏DC3可为鉴定可对免疫抑制剂有反应或无反应的LN患者的有效标记物，而通过我们的分析，肾脏中DC3与血液中，以及其他亚族高表达一些促炎因子、细胞因子等，iPT-DC3-T细胞通信建立正反馈回路在加重炎症方面的发现，涉及其中的因子，应当可以预期的是可以作为标志物，在基因或者蛋白层面用于患者分层，指导临床实践中的个性化治疗修改。
试验方法
样本采集
肾活检样本收集自在五个临床中心接受诊断性肾活检的LN患者。有两个独立的队列；一个是儿童LN的随机对照试验（ChiCTR2100053545），而另一个是成人LN的前瞻性队列。正常人肾组织从供肾移植前肾穿刺活检获得。该研究得到了中山大学附属第一医院机构审查委员会的批准，并获得了所有患者的知情同意。
将所有肾活检样本在采集后置于MACS®组织储存溶液（Miltenyi Biotec）中，并在2至3小时内新鲜处理用于测序。
组织加工和单细胞解离（参考：文献Arazi, A., et al., The immune cell  landscape in kidneys of patients with lupus nephritis.Nat Immunol, 2019. 20(7): p. 902-914. +联川生物公司提供的方法；）
新鲜肾活检标本切片约1 mm3，并在消化前用磷酸盐缓冲盐水（PBS，Gibco）洗涤2至3次。将切片和洗涤后的样本放入5 mL离心管中，用多组织解离试剂盒（MiltenyiBiotec）的2.5 mL消化酶溶液消化，并在振动筛（125 r.p.m）上于37℃下孵育30分钟，用3mL移液管每10分钟上下吸取悬浮液5至10次，以促进细胞解离。消化后，所得单细胞悬浮液通过30 μmMACS®智能过滤器（Miltenyi Biotec）过滤，残余组织用PBS（Gibco）洗涤2至3次，并且悬浮液也过滤，将两种悬浮液收集在15 mL锥形管中，于4℃下以400 g离心6分钟。沉淀物用200 μL PBS（Gibco）再悬浮，并与2 mL红细胞（RBC）裂解缓冲液（eBioscience™10X RBC裂解缓冲液）于4℃下孵育5分钟。RBC裂解后，悬浮液以400 g于4℃下离心6分钟，沉淀物用RPMI-1640培养基（Invitrogen）再悬浮以进行进一步操作。使用双荧光AO/PI方法，通过自动细胞计数器（Countstar Rigel）对产生的单细胞进行定量和生存力分析。通过这种方法产生的单细胞悬液的存活力大于80%。
外周血单核细胞的分离（参考：密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞）
血样首先用PBS（Gibco）稀释至1:2，然后在50 mL锥形管中用15 mL Ficoll-Paque小心分层，并于室温下以1800 r.p.m离心30分钟并制动。离心后，抽吸外周血单核细胞（PBMC）层并用PBC（Gibco）洗涤两次。
多重免疫组织化学染色（染色参考：IHC一抗染色方法+PANO试剂盒提供的染色方法；病理切片扫描和分析参考：TissueGnostics公司提供的扫描仪及分析软件）
根据制造商的方案，使用PANO 7-plex IHC试剂盒（Panovue）对4至5 μm***固定的石蜡包埋（FFPE）肾活检切片进行多重免疫组织化学（mIHC）染色。载玻片在二甲苯中脱蜡，并用100%、95%、75%乙醇和双蒸馏水再水合。通过柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0）回收抗原，并在微波中加热至沸腾约20分钟，然后于室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭切片10分钟。依次应用抗CD163（abcam，ab182422）、抗CD11c（abcam，ab52632）和抗CD4（abcam，ab133616）、抗SLC22A6（abcam，ab135924）、抗VCAM1（abcam，ab134047）抗体。一级抗体于37℃下孵育30分钟，与辣根过氧化物酶结合的二级抗体于室温下孵育10分钟。用1:200的5%BSA双荧光团Opal 520、540、570、620和650进行酪酰胺信号扩增，并于室温下孵育10分钟。一级抗体染色后，用DAPI对细胞核进行染色。使用TissueFAXS平台（TissueGnostics）扫描染色载玻片，并使用StrataQuest软件（Tissue gnostics）处理图像。
采用抗体：
抗体 品牌 货号 克隆号
抗CD11c Abcam ab52632 EP1347Y
抗CD163 Abcam ab182422 EPR19518
抗CD4 Abcam ab133616 EPR6855
抗SLC22A6 Abcam ab135924 /
抗VCAM1 Abcam ab134047 EPR5047
mIHC染色切片上的细胞定量（参考：TissueGnostics公司提供的扫描仪及分析软件）
根据“多重免疫组织化学染色”中描述的程序对肾活检切片进行mIHC染色。应用的抗体为抗CD163（abcam，ab182422）、抗CD11c（abcam、ab52632）。用StrataQuest软件（TissueGnostics）进行细胞定量分析。计算整个载玻片中DC3（CD11c+CD163+）的总数。
文库制备和scRNA-seq（由联川公司进行测序和文库制备）
使用Chromium Next GEM单细胞5’试剂盒v2（10X基因组学）按照制造商的方案进行乳液中凝胶珠的生成和条形码、cDNA扩增、5’基因表达文库构建、cDNA的V（D）J扩增和V（D）J文库构建。用生物分析仪高灵敏度芯片（Agilent）对构建的V（D）J富集和5’基因表达文库进行定量和评估。两个库均包含标准Illumina配对末端构建体，以P5开始，以P7结束，并且包括在读段1开始时编码的16 bp 10x条形码。样本索引序列作为i7索引读段并入。最终文库在NovaSeq 6000（Illumina）上测序，具有150 bp配对末端读段。
scRNA-seq数据的质量控制（使用10x Genomics提供的Cell Ranger单细胞软件分析）
使用由10x Genomics提供的Cell Ranger单细胞软件套件（v5.0.1）对原始scRNA-seq数据进行预处理，用于解复用细胞条形码、读段比对和在GRCh38人类参考基因组下生成基因-细胞矩阵。Seurat R软件包（v4.0.5）生成并评估了详细的QC指标。在少于3个细胞中检测到的基因和其中检测到的转录物少于200或多于8000个基因，或大于70%的UMI来源于线粒体基因或log10基因计数/log10UMI计数>0.80的细胞被滤出，并从后续分析中排除。由于免疫细胞和肾驻留细胞之间线粒体含量的差异，UMI ＜ 15%来源于线粒体基因的免疫细胞、UMI ＜ 30%来源于粒线基因的肾驻留细胞（近端肾小管细胞除外）被纳入进一步分析。对于主要细胞类型的亚聚类，检测到的基因小于500的细胞被进一步去除，但髓样细胞除外，其中检测到的基因<200的截止值被保留，以避免去除中性粒细胞。通过簇标记基因表达鉴定双倍体：一个簇的细胞表达来自两个或多个不同细胞谱系的标记（例如PTPRC和EPCAM、CD3D和CD79A）。我们仔细审查了典型标记基因的表达，并重复了上述步骤几次，以确保我们已经去除了与细胞双倍体相关联的大多数条形码。然后我们去除了细胞质基因，诸如线粒体、核糖体和血红蛋白基因。
细胞聚类和注释（使用Seurat R包进行数据分析，并参考文献进行注释）
在去除劣质细胞和双倍体后，Seurat R包（v4.0.5）应用于基因计数矩阵归一化、缩放和具有默认参数的高度可变基因鉴定。主成分（PC）由ElbowPlot函数鉴定。前2000个可变基因和前25个PC用于非监督聚类分析，分辨率设定为0.1。我们基于典型细胞类型特异性标记物鉴定出六种主要细胞类型，包括T细胞（CD3E）、髓样细胞（LYZ）、B细胞（CD79A）、肾上皮细胞（EPCAM）、内皮细胞（PECAM1）和间充质细胞（PDGFRB）。使用适当调整的参数对每个主要细胞类型进行第二轮亚聚类，以鉴定出主要细胞类型内的亚簇和细胞亚型注释。为了可视化，使用具有Seurat的 RunUMAP函数的UMAP方法降低维数。经由 FindAllMarkers函数鉴定簇特异性标记基因，这些标准如下：1）only.pos = TRUE，2）min.pct = 0.25，3）log FC>0.25。
基因集和通路分析（使用Seurat R包和clusterProfiler R软件包分析）
从分子特征数据库（MSigDB v6.2, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)。使用Seurat中的 AddModuleScore函数计算每个细胞的基因集得分。
基于每个细胞簇的簇特异性标记基因，用clusterProfiler R软件包（v4.3.0.991）进行基因本体（GO）生物过程富集分析。显著的GO项被鉴定为 p值<0.05。
SCENIC分析（参考：方法学文献Aibar, S., et al., SCENIC: single-cell  regulatory network inference and clustering.Nat Methods, 2017. 14(11): p.1083-1086.）
使用SCENIC，以原始计数矩阵作为输入，分析每个cDC2亚簇中的活化调节子。共表达网络由GRNBoost2计算，调节子由RcisTarget鉴定。每个细胞的调节子活性由AUCell评分。双尾Wilcoxon秩和检验用于鉴定每个cDC2亚簇中的差异活化调节子，并以来自其他亚簇的细胞作为对照。然后使用Benjamini-Hochberg程序校正多重假设。
单细胞轨迹推断（参考：方法学文献Gulati, G.S., et al., Single-cell  transcriptional diversity is a hallmarkof developmental potential.Science,2020. 367(6476): p. 405-411；Trapnell, C., et al., The dynamics and regulators  of cell fate decisions are revealed by pseudotemporalordering of single  cells.Nat Biotechnol, 2014. 32(4): p. 381-386.）
为了描述cDC2的发展过程，我们应用了具有默认参数的Monocle 3算法。在降维和细胞排序后，使用Monocle 3的缺省参数推断cDC2细胞的分化轨迹。
我们还使用了CytoTRACE算法，该算法基于转录多样性在分化期间减少的假设，从scRNA-seq数据预测分化状态。使用默认参数进行细胞示踪，以补充Monocle 3算法推断的轨迹。
细胞间相互作用分析（参考：方法学文献Efremova, M., et al., CellPhoneDB:  inferring cell-cell communication from combined expression of multi-subunit  ligand-receptorcomplexes.Nat Protoc, 2020. 15(4): p. 1484-1506.）
使用CellPhoneDB算法（https://www.cellphonedb.org/）推断DC3和其他细胞之间的细胞间相互作用。简而言之，该算法允许使用如前所述的统计框架检测scRNA-seq数据中细胞类型之间的配体-受体相互作用。通过细胞类型1中的基因1和细胞类型2中的基因2的平均表达计算表达，然后归一化到相同的尺度。基于置换试验计算两种细胞亚型之间配体-受体相互作用的显著性。我们提取了 p值<0.05且表达细胞比例>10%的配体-受体对作为显著相互作用。
NicheNet分析（参考：方法学文献Browaeys, R., W. Saelens, and Y. Saeys, NicheNet: modeling intercellular communication by linking ligands to target  genes.Nat Methods, 2020. 17(2): p. 159- 162.）
NicheNet，一种预测驱动靶细胞转录组变化的配体的工具，被用来推断驱动T细胞分化的DC3的潜在配体。在DC3中，所有在其细胞簇内至少10%的细胞中具有非零值的表达基因被用作基因背景。分别下载来自KEGG数据库的Th1和Th17分化基因集（Th17细胞分化：hsa04659，Th1/Th2细胞分化：hsa04658）。配体活性分别使用Th1和Th17分化基因集评估。DC3配体与Th1/Th17分化基因之间的潜在调节相互作用是通过Th1/Th17中靶向Th1/Th17分化基因的表达受体构建的。
单细胞T细胞受体（TCR）分析（参考：方法学文献Borcherding, N., N.L.Bormann, and G. Kraus, scRepertoire: An R-based toolkit for single-cell immune  receptor analysis.F1000Res, 2020. 9: p. 47.）
TCR库是通过运行10x Genomics cellranger vdj管道（https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj/software/pipelines/latest/using/vdj）生成的。在获得过滤器重叠输出后，使用scRepertoire软件包（v1.3.2）中的quantContig函数结合CDR3核苷酸序列和VDJC基因鉴定TCR克隆型。克隆的大小根据具有相同TCR序列的细胞数目进行分选，包括大细胞（20至100个细胞）、中细胞（5至20个细胞）、小细胞（1至5个细胞）和单细胞（仅1个细胞）。
统计分析
除上述用于scRNA-seq数据分析的生物信息学方法外，所有其他统计分析均使用统计软件R v4.0进行。使用非配对双尾Wilcoxon秩和检验分析两组的细胞比例。双尾Studentt检验用于基因表达或APC评分的比较。进行Pearson相关分析以评估两个连续变量之间的关系（例如，细胞比例与临床病理学表型）。结果在 p值<0.05时具有统计学意义。

Claims (10)

1.检测肾脏中标志物表达水平的试剂在制备用于病理分级或诊断免疫性肾病试剂盒中的应用，其特征在于，所述标志物包括TNF、IL1B、CCL17、CCL22、HLA、CD40、CD80、CD86、STAT4、RELB、VCAM1、CCL2、CXCL12、CX3CL1中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述免疫性肾病包括狼疮性肾炎、紫癜性肾炎、IgA肾病或ANCA相关性肾小球肾炎。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述免疫性肾病为狼疮性肾炎。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂在基因水平或蛋白水平上检测所述标志物的表达水平。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因水平上检测的试剂选自所述标志物的引物、探针或基因芯片。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白水平上检测的试剂选自所述标志物的抗体。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，测定在受试者的样品中所述标志物至少一种的表达比例，其中所述比例与所述受试者中狼疮性肾炎的严重程度正相关。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为当在测试样品中标志物的表达水平大于在来自相同受试者的早期样品中的表达水平时，鉴定出在受试者疾病的恶化，当在测试样品中标志物表达水平低于在早期样品中的表达水平时，鉴定出在受试者中疾病的改善。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述试剂检测的样本为肾活检穿刺获得的肾皮质和/或髓质。
10.治疗狼疮性肾炎的药物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：将待筛药物与狼疮性肾炎模型作用，检测权利要求1中至少一种标志物的表达量，根据所述表达量的变化情况筛选出所述药物。
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