CN116113832A - 用于诊断原发性胆汁性肝硬化的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及使用抗KLHL12抗体作为临床生物标志物用于诊断原发性胆汁性肝硬化(PBC)，现被称为原发性胆汁性胆管炎。本公开进一步提供了用于检测生物样本中抗KLHL12抗体的组合物和方法。

Description

用于诊断原发性胆汁性肝硬化的组合物和方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年01月08日提交的美国申请号63/135,469的优先权，其通过引用整体并入本文。

以电子方式提交的序列表的参考

本申请含有序列表，该序列表通过EFS-Web以ASCII格式序列表以电子方式提交，文件的名称为“13510-035-228_SEQ_listing.txt”，创建日期为2022年01月02日，大小为6,613字节。通过EFS-Web提交的该序列表是说明书的一部分，通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及自身免疫性疾病领域，并且更特别涉及用于诊断原发性胆汁性肝硬化的组合物和方法。

背景技术

原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis，PBC)，现称为原发性胆汁性胆管炎，是一种慢性、炎症性、自身免疫性的肝脏疾病。PBC的特征在于对肝脏中胆管的进行性损害。最近有研究鉴定了循环自身抗体的存在，其可作为PBC的生物标志物。参见Normanet al.，Liver Int.，35(2):642-651(2015)；Hirschfield et al.,Annu Rev Pathol.,8:303-330(2013)；Bogdanos et al.,Dig Dis.,30Suppl 1:20-31(2012)。然而，PBC患者的亚组对已知的自身抗体保持血清阴性，并且无法确诊直到形成更晚期的疾病。因此，需要一种新的和/或更特异的生物标志物来检测另外的自身抗体种类或增加诊断的准确性或灵敏性。本公开解决了这一需求，并也提供了相关益处。

发明概述

在一些实施方案中，本公开提供了含有Kelch样12(KLHL12)片段的分离的多肽。该KLHL12片段包含选自由SEQ ID NO:1-25组成的组中的氨基酸序列，其中氨基酸序列开始于第一个叙述的氨基酸残基。

在一些实施方案中，该KLHL12片段包含15-622个氨基酸残基。在一些实施方案中，该KLHL12片段包含15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。在一些实施方案中，该KLHL12片段为15个氨基酸残基。

在一些实施方案中，通过方法获得该KLHL12片段，所述方法包括从天然来源分离、化学合成或重组表达。

在一些实施方案中，该KLHL12片段包含固体支持物。在一些实施方案中，该固体支持物选自由珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管组成的组。在一些实施方案中，该珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。在一些实施方案中，该膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)组成的组。

在一些实施方案中，该KLHL12片段特异性结合抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，该抗KLHL12抗体包含自身抗体。在一些实施方案中，该结合表现出25或更低的信噪比的标准分(standard score)(ZS)。

在一些实施方案中，本公开提供了试剂盒。该试剂盒包含：(a)一个或多个包含KLHL12片段的分离的多肽，该片段具有选自由SEQ ID NO:1-25组成的组中的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列始于第一个叙述的氨基酸残基；和(b)对抗KLHL12抗体特异性的检测探针。

在一些实施方案中，该试剂盒中的KLHL12片段包含15-622个氨基酸残基。在一些实施方案中，该试剂盒中的KLHL12片段包含15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。在一些实施方案中，该试剂盒中的KLHL12片段为15个氨基酸残基。

在一些实施方案中，该试剂盒中的KLHL12片段特异性结合抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，该抗KLHL12抗体包含自身抗体。在一些实施方案中，该KLHL12片段和抗KLHL12抗体之间的结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

在一些实施方案中，通过方法获得该试剂盒中的KLHL12片段，所述方法包括从天然来源分离、化学合成或重组表达。

在一些实施方案中，该检测探针包含抗体、抗体特异性结合多肽或抗体的或抗体特异性结合多肽的功能片段。在某些实施方案中，该抗体或其功能片段包含抗IgG。在某些实施方案中，该抗体特异性结合多肽或其功能片段包含蛋白A或蛋白G。

在一些实施方案中，该检测探针进一步包含报告标签。在一些实施方案中，该报告标签是标记物。在一些实施方案中，该标记物选自由荧光团、酶、化学发光部分、放射性部分、有机染料和小分子组成的组。在一些实施方案中，该标记物是荧光标记物。在一些实施方案中，该荧光标记物为藻红蛋白(PE)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。

在一些实施方案中，该报告标签包含配体或颗粒。在一些实施方案中，该配体是生物素。在一些实施方案中，该颗粒包含纳米颗粒。

在一些实施方案中，该试剂盒还包含固体支持物、对照或辅助试剂。

在一些实施方案中，该固体支持物选自由珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管组成的组。在一些实施方案中，该珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。在一些实施方案中，该膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)组成的组。

在一些实施方案中，该试剂盒中的一个或多个分离的多肽与该固体支持物缀合。

在一些实施方案中，该对照包含特异于分离的多肽的抗体或其功能片段，所述分离的多肽具有选自由SEQ ID NO:1-25组成的组中的氨基酸序列。在某些实施方案中，该抗体或其功能片段选自单克隆或多克隆抗体。

在一些实施方案中，该辅助试剂选自由孵育缓冲液、洗涤缓冲液、检测缓冲液和检测仪器组成的组。

在一些实施方案中，本公开提供了诊断PBC的方法。该方法包含：(a)使来自疑似患有PBC的受试者的生物样本接触一个或多个分离的多肽，所述分离的多肽包含KLHL12片段，所述KLHL12片段具有选自由SEQ ID NO:1-25组成的组中的氨基酸序列，和(b)检测该生物样本中抗KLHL12抗体的存在，其中结合的抗KLHL12抗体的存在指示PBC。

在一些实施方案中，该方法中的KLHL12片段包含15-622个氨基酸残基。在一些实施方案中，该方法中的KLHL12片段包含15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。在一些实施方案中，该方法中的KLHL12片段为15个氨基酸残基。在一些实施方案中，该方法中KLHL12片段的氨基酸序列始于第一个叙述的氨基酸残基。

在一些实施方案中，该方法中的KLHL12片段特异性结合抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，该抗KLHL12抗体包含自身抗体。在一些实施方案中，该KLHL12片段和抗KLHL12抗体之间的结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

在一些实施方案中，通过包括包含从天然来源分离、化学合成或重组表达的方法获得方法中的KLHL12片段。

在一些实施方案中，该生物样本包含全血、血浆、血清、痰液或胆汁。在一些实施方案中，生物样品包含血清、血浆或痰液。

在一些实施方案中，所述检测包含免疫测定。在一些实施方案中，该免疫测定选自由荧光免疫吸附测定(FIA)、化学发光免疫测定(CIA)、放射免疫测定(RIA)、多重免疫测定、蛋白质/肽阵列免疫测定、固相放射免疫测定(SPRIA)、间接免疫荧光测定(IIF)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于颗粒的多分析物测试(PMAT)或点印迹测定(Dot Blot assay)组成的组。

在一些实施方案中，所述检测包含：(a)使所述抗KLHL12抗体接触特异于所述抗KLHL12抗体的检测探针接触，和(b)检测该检测探针的特异性结合。在一些实施方案中，该检测探针包含抗体、抗体特异性结合多肽或抗体的或抗体特异性结合多肽的功能片段。在一些实施方案中，该抗体或其功能片段包含抗IgG。在某些实施方案中，该抗体特异性结合多肽或其功能片段包含蛋白A或蛋白G。

在一些实施方案中，该检测探针包含报告标签。在一些实施方案中，该报告标签是一种标记物。在一些实施方案中，该标记物选自由荧光团、酶、化学发光部分、放射性部分、有机染料和小分子组成的组。在一些实施方案中，该标记物是荧光标记物。在一些实施方案中，该荧光标记物为藻红蛋白(PE)、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

在一些实施方案中，该报告标签包含配体或颗粒。在一些实施方案中，该配体是生物素。在一些实施方案中，该颗粒包含纳米颗粒。

在一些实施方案中，所述检测在固体支持物上进行。在一些实施方案中，该固体支持物选自由珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管组成的组。在一些实施方案中，该珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。在一些实施方案中，该膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)组成的组。

在一些实施方案中，本公开提供了在对已知PBC自身抗体呈血清阴性的受试者中诊断PBC的方法。该方法包含：(a)将来自已知PBC自身抗体呈血清阴性受试者的生物样本与一个或多个分离的多肽接触，所述分离的多肽包含KLHL12片段，所述KLHL12片段具有选自由SEQ ID NO:1-25组成的组中的氨基酸序列，和(b)检测生物样本中与一个或多个分离的多肽结合的抗KLHL12抗体的存在，其中结合的抗KLHL12抗体的存在指示PBC。

在一些实施方案中，该受试者无症状的。

在一些实施方案中，该已知PBC自身抗体选自由抗线粒体抗体(AMA)、抗核抗体(ANA)、抗多核点(MND)自身抗体、抗核体(NB)自身抗体、抗己糖激酶1(HK1)抗体和抗Kelch样12(KLHL12)抗体组成的组。在一些实施方案中，该已知PBC自身抗体选自由M2线粒体自身抗体、gp230自身抗体、核孔蛋白p62自身抗体、核纤层蛋白B受体自身抗体、早幼粒细胞白血病蛋白(PML)自身抗体、抗sp100(斑点型)抗体、抗gp210、抗着丝粒、抗97/VCP、抗嗜酸性粒细胞过氧化物酶(抗EPO)、丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(PDC-E2)自身抗体、分支/链2-酮-酸脱氢酶复合体E2亚单位(BCOADC-E2)自身抗体、2-酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚单位(OGDC-E2)自身抗体和NDP52自身抗体组成的组。

在一些实施方案中，该方法中的KLHL12片段包含15-622个氨基酸残基。在一些实施方案中，该方法中的KLHL12片段包含15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。在一些实施方案中，该方法中的KLHL12片段为15个氨基酸残基。在一些实施方案中，方法中KLHL12片段的氨基酸序列始于第一个叙述的氨基酸残基。

在一些实施方案中，该方法中的KLHL12片段特异性结合抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，该抗KLHL12抗体包含自身抗体。在一些实施方案中，该KLHL12片段和抗KLHL12抗体之间的结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

在一些实施方案中，该方法中的一个或多个分离的多肽通过包含从天然来源分离、化学合成或重组表达的方法获得。

在一些实施方案中，该生物样本包含全血、血浆、血清、痰液或胆汁。在一些实施方案中，生物样品包含血清、血浆或痰液。

在一些实施方案中，所述检测包含免疫测定。在一些实施方式中，所述免疫测定选自由荧光免疫吸附测定(FIA)、化学发光免疫测定(CIA)、放射免疫测定(RIA)、多重免疫测定、蛋白质/肽阵列免疫测定、固相放射免疫测定(SPRIA)、间接免疫荧光测定(IIF)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于颗粒的多分析物测试(PMAT)或点印迹测定组成的组。

在一些实施方案中，所述检测包含：(a)使该抗KLHL12抗体接触特异于该抗KLHL12抗体的检测探针，和(b)检测该检测探针的特异性结合。

在一些实施方案中，该检测探针包含抗体、抗体特异性结合多肽或抗体的或抗体特异性结合多肽的功能片段。在某些实施方案中，该抗体或其功能片段包含抗IgG。在某些实施方案中，该抗体特异性结合多肽或其功能片段包含蛋白A或蛋白G。

在一些实施方案中，该检测探针包含报告标签。在一些实施方案中，该报告标签是标记物。在一些实施方案中，该标记物选自由荧光团、酶、化学发光部分、放射性部分、有机染料和小分子组成的组。在一些实施方案中，该标记物是荧光标记物。在一些实施方案中，该荧光标记物为藻红蛋白(PE)、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

在一些实施方案中，该报告标签包含配体或颗粒。在一些实施方案中，该配体是生物素。在一些实施方案中，该颗粒包含纳米颗粒。

在一些实施方案中，所检测在固体支持物上进行。在一些实施方案中，该固体支持物选自由珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管组成的组。在一些实施方案中，该珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。在一些实施方案中，该膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)和聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride)组成的组。

附图简述

图1显示了基于对KLHL12蛋白的表位定位的微阵列扫描结果的信号强度分析或信噪比分析，对各种Kelch样12(KLHL12)片段的排序。对具有高信号强度或高信噪比的肽进一步选择、合成和通过几种固相测定法评估，所述固相测定法包含ELISA和基于珠的技术。

图2显示了KLHL12片段P2623-1(正方形)、KLHL12片段P2738-1(三角形)和商业生产的环瓜氨酸化肽(CCP)(菱形)的接受者操作特征(ROC)分析，说明了其分别特异性结合抗KLHL12抗体的能力。P2623-1和P2738-1的氨基酸序列均为SEQ ID NO:1。不同之处在于P2623-1在SEQ ID NO:1的C-末端用生物素标记并结合到Costar高结合微孔板上，而P2938-1在SEQ ID NO:1的N-末端标记并结合到Inova链霉亲合素包被板上。CCP是存在于许多类风湿性关节炎患者中的抗体的抗原。本文使用的CCP包被板获自QUANTA

CCP3IgGELISA试剂盒(Inova Diagnostics,San Diego,CA)。每个标志物的曲线下面积(AUC)示于图例中。

图3显示了KLHL12片段P2623-1(深灰色)，KLHL12片段P2738-1(黑色)和AbnovaKLHL12(浅灰色)的ROC分析，说明了其分别特异性结合抗KLHL12抗体的能力。图3中使用的KLHL12片段P2623-1和P2738-1与图2中使用的相同。Abnova KLHL12是N-末端带有GST标签的全长重组KLHL12蛋白，其商购自Abnova Corporation，中国台湾台北。AUC示于图例的括号中。

图4显示了使用维恩图的抗MIT3、抗HK-1和抗KLHL12抗体测试的重叠。对于样本分组，对抗MIT3抗体测试加入抗HK-1和抗KLHL12抗体测试使原发性胆汁性肝硬化(PBC)检测的灵敏度从对于单独抗MIT3的85.0％提高到对于抗MIT3、抗HK-1和抗KLHL12组合的90.8％。KL-p指检测中使用的KLHL12片段。

图5显示了法国PBC患者分组中自身免疫性肝病相关抗体的频率和重叠。KL-p指检测中使用的KLHL12片段。

图6显示8位MIT3阴性的PBC患者中抗HK-1、抗KLHL12、抗gp210、抗sp100、抗SLA和抗LC1抗体的流行率。KL-p指检测中使用的KLHL12片段。

发明详述

本公开部分基于Kelch样12(KLHL12)表位的发现，其特异于针对KLHL12蛋白的自身抗体并且可用于检测作为原发性胆汁性肝硬化(PBC)指标的抗KLHL12抗体，所述原发性胆汁性肝硬化现也称为原发性胆汁性胆管炎。因此，本公开通过抗KLHL12抗体的特异性检测使PBC受试者受益，所述抗KLHL12抗体指示PBC的存在，包含例如在已知的PBC生物标志物呈血清阴性的受试者中。这些益处进一步使处于风险或早期阶段PBC的受试者能够预防或减少疾病进展和相关症状。

应注意，如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一种”和“该”也包含指代物的复数形式，除非内容另有明确说明。

还应注意，如本说明书和所附权利要求书中所使用的，在提供的数值范围的情况下，应理解该范围包含限定范围的数字。还应理解，所列范围内的每个中间的整数及其分数，例如包含所选中间整数单位或所列范围的下限的每十分之一，都旨在包含在本公开中，除非上下文另有明确规定。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”及其任何变型旨在涵盖非排他性的包含，使得包括、具有或含有元素或元素列表的过程、方法、方法限定的产品或组合物不仅仅只包括那些元素，还可包括其他未明确列出的元素或该过程、方法、方法限定的产品或组合物中固有的元素。

本公开提供了具有KLHL12片段的分离的多肽。该KLHL12片段可具有选自由SEQ IDNO:1-25组成的组中的氨基酸序列，其中该氨基酸序列开始于第一个叙述的氨基酸残基。该分离的KLHL12片段可包含在本文提供的试剂盒中或用于本文提供的方法中。

如本文所用，术语“Kelch样12”或“KLHL12”，也称为Kelch样家族成员12，DKIR、HDKIR、CUL3-相互作用蛋白1、C3IP1和Kelch样蛋白C3IP1，是指作用为Cullin-3泛素连接酶复合体的底物接头以促进泛素化的多肽。参见Rondou et al.,J Biol Chem.,283:11083-11096,(2008)。KLHL12在各种组织中表达，包含肝脏、胰腺、胆囊、结肠、肾上腺组织和小肠等。示例性人KLHL12的核苷酸序列可在GenBank中在GenBank GI号1676325197下找到，并且编码具有GenBank中GenBank GI号733606608下找到的氨基酸序列的示例性人KLHL12。这种KLHL12和其它KLHL12同种型的GenBank GI号可在如下表1中找到，所述表1包含两个序列标识符、GI号和GenBank登录号。GI号和GenBank登录号作为独特标识符并行运行，以访问公开可用数据库中的引用序列。

表1

对于KLHL12，约476个编码单核苷酸多态性(SNP)和至少257个已知的直系同源物已经被鉴定(见，如NCBI Gene ID:59349)。所有此类KLHL12多肽及其变体包含在本文使用的术语"KLHL12"的含义中。

应理解，变体是指与野生型序列相似但至少相差一个核苷酸或氨基酸的核酸或氨基酸序列。野生型核酸或氨基酸序列是指普遍存在于群体中的那些核酸和氨基酸序列，并充当其各自变体的参考。

本公开提供了具有KLHL12片段的分离的多肽，所述KLHL12片段是由抗KLHL12抗体识别的抗原表位，所述抗KLHL12抗体包含抗KLHL12人自身抗体。因此，本公开提供了分离的KLHL12片段，其具有选自CYDPIIDSWEVVTSM(SEQ ID NO:1)、IECYDPIIDSWEVVT(SEQ ID NO:2)、YDPIIDSWEVVTSMG(SEQ ID NO:3)、SIECYDPIIDSWEVV(SEQ ID NO:4)、ECYDPIIDSWEVVTS(SEQ ID NO:5)、VVASGVIYCLGGYDG(SEQ ID NO:6)、GHWTNVTPMATKRSG(SEQ ID NO:7)、AGVALLNDHIYVVGG(SEQ IDNO:8)、ASGVIYCLGGYDGLN(SEQ ID NO:9)、GAGVALLNDHIYVVG(SEQID NO:10)、MGGIMAPKDIMTNTH(SEQ ID NO:11)、GLVVASGVIYCLGGY(SEQ ID NO:12)、SGVIYCLGGYDGLNI(SEQ ID NO:13)、LQYVRMPLLTPRYIT(SEQ ID NO:14)、MTTPRCYVGATVLRG(SEQ IDNO:15)、GLAGATTLGDMIYVS(SEQ ID NO:16)、RIYVIGGYDGRSRLS(SEQ ID NO:17)、ECLDYTADEDGVWYS(SEQ ID NO:18)、GVWYSVAPMNVRRGL(SEQ ID NO:19)、DSWTTVTSMTTPRCY(SEQ IDNO:20)、YNIRTDSWTTVTSMT(SEQ ID NO:21)、GGFDGSRRHTSMERY(SEQ ID NO:22)、RSGAGVALLNDHIYV(SEQ ID NO:23)、LNDHIYVVGGFDGTA(SEQ ID NO:24)或IECYDPIIDSWEVVTSMG(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段开始于第一个叙述的氨基酸序列。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段结束于最后叙述的氨基酸残基。在另外的实施方案中，分离的KLHL12片段开始和结束于叙述的氨基酸残基。

本公开还提供了分离的KLHL12片段，其由选自CYDPIIDSWEVVTSM(SEQ ID NO:1)、IECYDPIIDSWEVVT(SEQ ID NO:2)、YDPIIDSWEVVTSMG(SEQ ID NO:3)、SIECYDPIIDSWEVV(SEQID NO:4)、ECYDPIIDSWEVVTS(SEQ ID NO:5)、VVASGVIYCLGGYDG(SEQ ID NO:6)、GHWTNVTPMATKRSG(SEQ ID NO:7)、AGVALLNDHIYVVGG(SEQ ID NO:8)、ASGVIYCLGGYDGLN(SEQID NO:9)、GAGVALLNDHIYVVG(SEQ ID NO:10)、MGGIMAPKDIMTNTH(SEQ ID NO:11)、GLVVASGVIYCLGGY(SEQ ID NO:12)、SGVIYCLGGYDGLNI(SEQ ID NO:13)、LQYVRMPLLTPRYIT(SEQ ID NO:14)、MTTPRCYVGATVLRG(SEQ ID NO:15)、GLAGATTLGDMIYVS(SEQ ID NO:16)、RIYVIGGYDGRSRLS(SEQ ID NO:17)、ECLDYTADEDGVWYS(SEQ ID NO:18)、GVWYSVAPMNVRRGL(SEQ ID NO:19)、DSWTTVTSMTTPRCY(SEQ ID NO:20)、YNIRTDSWTTVTSMT(SEQ ID NO:21)、GGFDGSRRHTSMERY(SEQ ID NO:22)、RSGAGVALLNDHIYV(SEQ ID NO:23)、LNDHIYVVGGFDGTA(SEQ ID NO:24)或IECYDPIIDSWEVVTSMG(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列组成。

上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:1对应于人KLHL12同种型1的第577-591位氨基酸，所述人KLHL12同种型1的序列可在GenBank中GenBank GI号733606608下找到。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:2对应于人KLHL12同种型1的第575-589位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:3对应于人KLHL12同种型1的第578-592位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:4对应于人KLHL12同种型1的第574-588位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:5对应于人KLHL12同种型1的576-590位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:6对应于人KLHL12同种型1的第460-474位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:7对应于人KLHL12同种型1第489-503位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:8对应于人KLHL12同种型1第504-518位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:9对应于人KLHL12同种型1第462-476位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:10对应于人KLHL12同种型1第503-517位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:11对应于人KLHL12同种型1第39-53位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:12对应于人KLHL12同种型1第458-472位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:13对应于人KLHL12同种型1第463-477位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:14对应于人KLHL12同种型1第257-271位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:15对应于人KLHL12同种型1第544-558位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ IDNO:16对应于人KLHL12同种型1第408-422位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQID NO:17对应于人KLHL12同种型1第368-382位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:18对应于人KLHL12同种型1第385-399位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:19对应于人KLHL12同种型1第395-409位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:20对应于人KLHL12同种型1第536-550位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:21对应于人KLHL12同种型1第531-545位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:22对应于人KLHL12同种型1第423-437位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:23对应于人KLHL12同种型1第501-515位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:24对应于人KLHL12同种型1第509-523位氨基酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:25对应于人KLHL12同种型1第575-592位氨基酸。

上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:1的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1779-1823位核苷酸，所述智人KLHL12转录物变体1的序列可在GenBank中GenBank GI号1676325197下找到。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:2的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1773-1817位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:3的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1782-1826位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:4的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1770-1814位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:5的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1776-1820位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:6的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1428-1472位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:7的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1515-1559位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:8的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1560-1604位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ IDNO:9的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1434-1478位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:10的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1557-1601位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:11的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第165-209位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:12的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1422-1466位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:13的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1437-1481位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:14的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第819-863位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:15的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1680-1724位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:16的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1272-1316位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:17的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1152-1196位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:18的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1203-1247位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:19的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1233-1277位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:20的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1656-1700位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:21的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1641-1685位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:22的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1317-1361位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:23的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1551-1595位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQ ID NO:24的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1575-1619位核苷酸。上述示例性分离的KLHL12片段的SEQID NO:25的核苷酸序列对应于智人KLHL12转录物变体1的第1773-1826位核苷酸。

应注意，“多肽”可以包含具有2-30个氨基酸(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25或30个氨基酸)的短寡肽以及更长的氨基酸链，如30个以上氨基酸、50个以上氨基酸、100个以上氨基酸、150个以上氨基酸、200个以上氨基酸、300个以上氨基酸、400个以上氨基酸、500个以上氨基酸或600个以上氨基酸。本文中这种短寡肽被称为KLHL12片段。

本文中公开的分离的KLHL12片段小于全长KLHL12。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段具有全长KLHL12的部分氨基酸序列，可包含全长KLHL12的5个及以上、6个及以上、7个及以上、8个及以上、9个及以上、10个及以上、11个及以上、12个及以上、13个及以上、14个及以上、15个及以上、16个及以上、17个及以上、18个及以上、19个及以上、20个及以上、21个及以上、22个及以上、23个及以上、24个及以上、25个及以上的连续氨基酸。

在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段可以是任何哺乳动物来源的。在另外的实施方案中，该分离的KLHL12片段可以是人类来源的。

如本文所用，当术语“分离的”用于提及多肽时，意在指所述多肽可以部分地或实质地从组分的复杂混合物中分离。复杂混合物可以包含，例如化学合成、重组表达或天然表达多肽的来源。部分分离包含从一种或多种组分中分离，而实质分离包含例如从多肽的来源的许多、大多数或基本上所有组分中分离。

如本文所公开的，部分分离可通过本文提供的方法和组合物实现。在一些实施方案中，部分分离的KLHL12片段可以用捕获探针进行。在一些实施方案中，捕获探针是特异于KLHL12片段的多肽或其功能片段。在一些实施方案中，捕获探针是抗KLHL12抗体。如本文所举例的，实质分离可以通过本领域已知的方法实现。在一些实施方案中，分离的KLHL12片段通过提取、沉淀和溶解的过程是基本上纯化的。

分离的KLHL12片段可以化学合成、重组合成或分离自例如体液或组织的天然来源。用于表达和分离化学合成多肽、重组多肽或来自天然来源的多肽的示例性方法在本领域是众所周知的，并且可以发现描述于Scopes R.K.,Protein Purification–Principlesand Practice,Springer Advanced Texts in Chemistry,第3版(1994)；Simpson R.J.etal.,Basic Methods in Protein Purification and Analysis:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第1版(2008)；Green M.R.and Sambrook J.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,第4版(2012)；Jensen K.J.et al.,Peptide Synthesis and Applications(Methods inMolecular Biology),Humana Press，第2版(2013)。

重组多肽可以在细菌细胞(例如大肠杆菌)、酵母细胞(例如酿酒酵母)、昆虫细胞(例如Sf9)中，在哺乳动物细胞(例如CHO)和其他细胞中表达和纯化。重组多肽可以作为包含用于蛋白检测的标签或亲和纯化标签(His标签、GST标签、Myc标签)、包含可切割标签(如包含TEV-切割位点的标签)的融合蛋白进行表达和纯化。本领域技术人员将认识到，从细胞、组织或体液中纯化多肽的方法在本领域是众所周知的。

从天然来源纯化或分离的多肽是指从其天然表达的来源中分离和纯化多肽。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段可以来自生物体的细胞、组织或体液。在一些实施方案中，该细胞、组织或体液可以包含例如来自本公开的生物体的全血、血浆、血清、痰液或胆汁。该分离的KLHL12片段同样可以来自本文描述和提供的任何生物样本。

在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段是使用例如Jensen,K.J.(同上)中描述的方法进行化学合成的。

在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段可以是天然KLHL12的片段。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段可以是变性的或未折叠的KLHL12的片段。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段可以包含非天然氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸可以在α-氨基-基团处被甲基化，以产生具有甲基化骨架的多肽。在一些实施方案中，该非天然氨基酸可以是R-氨基酸。在一些实施方案中，该非天然氨基酸可以包含染料(例如，荧光染料)或亲和标签。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段可以包含化学修饰。化学修饰可以包含例如用生物素、荧光染料的化学修饰。本领域技术人员会认识到，将非天然氨基酸引入多肽以及对多肽进行化学修饰的方法在本领域是众所周知的。

在一些实施方案中，分离的、化学合成的或重组的KLHL12片段可以是多个本文公开的KLHL12片段。应注意的是，术语“多个”是指两个或更多个成员的群体，如多肽成员或其他提及的分子。在一些实施方案中，多个成员中的两个或更多个成员可以是相同的成员。例如，多个多肽可以包含两个或更多个具有相同氨基酸序列的多肽成员。作为示例，具有相同氨基酸序列的多个成员可以包含SEQ ID NO:1-25的任何一个分离的KLHL12片段中的两个或更多个。在一些实施方案中，多个成员中的两个或更多个成员可以是不同的成员。例如，多个多肽可以包含两个或更多个具有不同氨基酸序列的多肽成员。作为示例，具有不同氨基酸序列的多个成员可以包含SEQ ID NO:1-25的至少两个或更多个分离的KLHL12片段。多个可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100或更多个不同成员。多个也可以包含200、300、400、500、1000、5000或10000或更多个不同的成员。例如，多个包括在上述示例性的多个成员之间的所有整数。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段可以是来自本公开的生物体的多个KLHL12片段。

如本文所用，术语“固体支持物”、“固体表面”和其他语法上的等同物是指适合于或可被修饰以适合于本公开的分离的KLHL12片段附着的任何材料。例如，可能的材料包含玻璃及改性或功能化的玻璃、塑料(包含丙烯酸、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、聚氨酯、Teflon^TM等)、顺磁材料、氧化钍溶胶(thoria sol)、碳石墨、氧化钛、乳胶或交联葡聚糖如Sepharose、纤维素多糖、尼龙或硝酸纤维素、陶瓷、树脂、包含硅和改性硅的二氧化硅或二氧化硅基材料、碳金属、无机玻璃、光纤束和各种其他聚合物。作为示例，本公开的固体支持物可包含多孔板，如96孔、384孔或1536孔板。在其他示例中，固体支持物可以位于流动池或流动池装置(例如，Biacore^TM芯片或蛋白质芯片上的流动池)内。本文提供的示例性固体支持物也可用于本公开的方法和试剂盒。

在一些实施方案中，该固体支持物可以是珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、孔和试管。珠包含球或颗粒。本文所述的“球”或“颗粒”或语法上的等同物是指微米或纳米维度的小的、离散的、非平面的颗粒。球可以包含例如微球。例如，颗粒可以包含纳米颗粒。在一些实施方案中，该珠可以是球形的，在其他实施方案中，该珠是不规则的。替代地或另外地，该珠可以是多孔的。该珠的尺寸范围从纳米到毫米，在一些实施方案中，优选约0.2至约200微米的珠。在其他实施方案中，珠的尺寸范围从约0.5到约5微米。在一些实施方案中，可以使用小于0.2微米和大于200微米的珠。在一些实施方案中，该固体支持物可以包含表面上的孔或凹陷阵列。如本领域已知的，这可以用各种技术来制造，包含光刻术、冲压技术、成型技术和微蚀技术。正如本领域技术人员所了解的那样，所使用的技术将取决于阵列基材的组分和形状。

在一些实施方案中，该固体支持物可以包含适合于以有序模式固定纯化蛋白的图案化表面(例如，蛋白质芯片)。“图案化表面”是指固体支持物的外露层中或外露层上不同区域的排列。例如，区域的一个或多个可以是存在一种或多种纯化蛋白的特征。特征可以被不存在纯化蛋白质的间隙区分开。在一些实施方案中，图案可以是行和列中特征的x-y形式。在一些实施方案中，图案可以是特征和/或间隙区的重复排列。在一些实施方案中，图案可以是特征和/或间隙区的随机排列。可用于本文所述方法和组合物的示例性图案表面在美国专利申请公开No.2008/0280785A1、美国专利申请公开2004/0253640A1、美国专利申请公开No.2003/0153013A1和国际公开No.WO 2009/039170A2中有描述。

在一些实施方案中，固体支持物可以具有附着在其表面的分离的KLHL12片段。以含有选自SEQ ID NO:1-25组成的组中的氨基酸序列示例的任何分离的KLHL12片段可以附着在固体支持物上。在一些实施方案中，任何分离的KLHL12片段可以通过接头分子固定化在固体支持物上。在一些实施方案中，所要求的是分子，如任何分离的KLHL12片段，在期望使用该支持物的条件下，例如在需要抗体结合或检测的应用中，保持固定化或附着在支持物上。应该注意的是，术语“固定化”与“附着”可互换使用，这两个术语都旨在包含共价和非共价附着，除非明确或通过上下文另行说明。

如本文所用，术语“抗体”可与免疫球蛋白(Ig)互换使用，是指B细胞或其重组等价物的多肽产物，能够与特定的分子抗原结合，由两条重链和两条轻链组成。每条链的每个氨基末端部分包含可变区域，赋予其结合特异性。参见Borrebaeck(编),AntibodyEngineering,Second Edition,Oxford University Press.(1995)；Kuby,Immunology,第三版,W.H.Freeman and Company,New York(1997)。该术语包含自身抗体和在本文所公开的方法和试剂盒中用作检测探针的抗体。抗体可以表现出它与单一的分子种类结合的特异性结合亲和力，或其选择性与一个以上的相关分子种类结合的泛特异性结合。在本公开的背景下，可被本公开的抗体结合的特异性分子抗原包含例如具有SEQ ID NO:1-25的KLHL12片段中的任何一个或抗KLHL12抗体，其包含例如对具有SEQ ID NO:1-25的KLHL12片段中的任何一个或多个具有特异性的抗KLHL12抗体。本公开的抗体可以源自任何哺乳动物，包含小鼠、兔、山羊、鸡、驴等。此外，一级或二抗可以是单克隆的、多克隆的、嵌合的或人源化的。本文提供的抗体也可用于本公开的方法和试剂盒中。

如本文所用，当提及自身抗体时，术语“抗KLHL12抗体”意指对一个或多个具有SEQID NO:1-25的KLHL12片段具有特异性或泛特异性的自身抗体。抗KLHL12抗体可以包含任何抗体类别(IgG、IgM、IgD、IgA和IgE)和子类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或其功能片段。在一些实施方案中，抗KLHL12抗体包含针对人KLHL12的自身抗体。

应当理解，术语“自身抗体”是指针对产生自身抗体的受试者的组织成分的免疫球蛋白。该术语旨在包含由受试者的免疫***产生的抗体，其针对受试者自身的多肽或抗原的一种或多种。因此，当免疫***不能全部或部分地区分自身和非自身组织成分时，受试者的免疫***就会产生自身抗体。如本文提供的，示例性的自身抗体包含本文所述的抗KLHL12抗体。

如本文所用，术语“信噪比”是指一种蛋白质对其靶标的特异性结合亲和力与该蛋白质对非靶标的非特异性结合亲和力之间的比率。本领域技术人员会认识到，测量蛋白质之间的结合亲和力的方法在本领域是众所周知的。在一些实施方案中，分离的KLHL12片段与抗KLHL12抗体(包含抗KLHL12自身抗体)之间的结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

本公开提供了一种用于诊断PBC的试剂盒。该试剂盒可包含本公开的一个或多个分离的KLHL12片段。示例性的分离的KLHL12片段包含本文公开标签可在下文表2中找到的SEQ ID NO:1-25。在一些实施方案中，分离的KLHL12片段开始于第一个叙述的氨基酸序列。在一些实施方案中，分离的KLHL12片段结束于最后一个叙述的氨基酸残基。在其他的实施方案中，分离的KLHL12片段既开始于也结束于叙述的氨基酸残基。分离的KLHL12片段可以是化学合成的、重组合成的，或从天然来源中分离出的，如本文公开的。分离的KLHL12片段可以特异性结合抗KLHL12抗体，包含抗KLHL12自身抗体，其中所述结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

该试剂盒可以包含对抗KLHL12抗体具有特异性的检测探针。如本文所用，术语“检测探针”是指能够与靶标特异性结合的结合剂。例如，此类结合剂包含抗体和抗体特异性结合多肽。本文提供的检测探针也可用于本公开的方法中。

抗体包含全长抗体以及功能片段，如下面举例的那些。如本文所用，当用于提及抗体时，术语“功能片段”意指包含重链或轻链多肽的抗体的一部分，所述重链或轻链多肽保留衍生片段的抗体的部分或全部的结合活性。这种功能片段可以包含例如，Fd、Fv、Fab、F(ab′)、F(ab)₂、F(ab′)₂、单链Fv(scFv)、双抗体、三抗体、四抗体(tetrabody)和微抗体，可以发现它们记载于例如Harlow and Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,New York(1989)；Myers(ed.),Molec.Biology and Biotechnology:AComprehensive Desk Reference,New York:VCH Publisher,Inc.；Huston et al.,CellBiophysics,22:189-224(1993)；Plückthun and Skerra,Meth.Enzymol.,178:497-515(1989)and in Day,E.D.,Advanced Immunochemistry,第二版,Wiley-Liss,Inc.,NewYork,NY(1990)。本文提供的抗体功能片段可用于本公开的方法和组合物中。

本文提供了抗体特异性结合多肽，并且包含任何能够特异性识别抗体及其功能片段的多肽。示例性的抗体特异性结合多肽包含IgG结合蛋白、受体、嵌合受体以及从随机或组合文库的筛选中确定的结合多肽。本公开的示例性抗体特异性结合多肽包含KLHL12或其抗原性片段或IgG结合蛋白。示例性的IgG结合蛋白包含蛋白A和蛋白G。本公开的抗体特异性结合多肽可以通过本文所述的方法或本领域已知的方法获得或合成，包含例如化学合成、从天然来源纯化或重组制备。因此，本文所述的抗体特异性结合多肽可以是哺乳动物的，包含小鼠、兔、山羊、鸡、驴等。本文提供的所有此类抗体特异性结合多肽都可用于本公开的方法和组合物中。

当提及与靶标的特异性结合时，本公开的检测探针可以直接与靶标结合，或可以通过间接手段使其对靶标为特异的。例如，与抗KLHL12抗体直接结合的检测探针包含KLHL12或本文公开的任何分离的KLHL12片段。直接结合剂还包含例如特异性识别KLHL12的抗体或其他抗体特异性结合多肽：抗KLHL12抗体复合物以及抗体，或其他特异性结合抗KLHL12抗体的抗体特异性结合多肽。本公开的可以通过间接手段使得对靶标具有特异性的检测探针可以包含例如抗Ig或其他与Ig结合的抗体特异性结合多肽。此类抗体和抗体特异性结合多肽可以通过以下方法使得其对抗KLHL12抗体具有特异性，例如，通过用本文所述的分离的KLHL12片段捕获抗KLHL12抗体，并在加入抗Ig或其他结合Ig的抗体特异性结合多肽之前洗去非抗KLHL12 Ig。分离或分离这种结合复合物以实现与靶标的特异性结合的许多其他配置在本领域中是众所周知的，并且所有这些都可以作为间接手段使用以使检测探针对靶标具有特异性。因此，“对抗KLHL12抗体具有特异性的检测探针”包含例如KLHL12，KLHL12：抗KLHL12抗体复合物结合剂、抗KLHL12抗体结合剂和Ig结合剂。

因而，在一些实施方案中，对抗KLHL12抗体具有特异性的抗体是山羊抗人IgG或其功能片段。在一些实施方案中，对抗KLHL12抗体具有特异性的结合多肽是蛋白A或蛋白G或其功能片段。

该检测探针可以包含报告标签。如本文所用，术语“报告标签”是指能够产生指示生物标志物检测的信号的分子。本公开中的示例性生物标志物包含抗KLHL12抗体。报告标签可以通过非共价或共价交联附着或缀合到例如检测探针上。报告标签与检测探针的非共价和共价固定化可以通过本领域已知的任何手段进行，包含例如Dennler et al.,“Antibody conjugates:from heterogeneous populations to defined reagents,”Antibodies.4:197-224(2015)。报告标签产生各种信号，这取决于报告标签的类型。本领域技术人员了解到，报告标签涵盖多种标记物。

如本文所用，术语“标记物”指的是发出信号并且可用作分析物检测的读数或测量的分子实体。存在各种类别的标记物。这些类别的示例包含荧光团、酶、化学发光部分、放射活性部分、有机染料、小分子、多肽或其功能片段。荧光团的示例包含荧光染料，如藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine,TRITC)、BODIPY和

染料。荧光染料还可以包含荧光共振能量转移(FRET)染料或时间分辨(TR)-FRET染料。荧光团标记物还包含荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)和青色荧光蛋白(CFP)。酶标记物的示例包含碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)。当3,3′5,5′-四甲基联苯胺(TMB)、3,3′-二氨基联苯胺(DAB)或2,2′-氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)中的任何一种底物作用于HRP时，会产生彩色(发色)或光(化学发光)信号。放射活性标记物包含例如碳-14或氚。小分子标记物包含生物素、树脂如琼脂糖珠和荧光标记的磁珠或纳米颗粒，如胶体金。多肽或功能片段标记物包含Avidin、Streptavidin或NeutrAvidin，其对生物素具有亲和力。多肽或功能片段标记物还包含血凝素(HA)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或c-myc。本文提供的报告标签和标记物也可用于本公开的方法中。

本公开的标记物可以与本文鉴定的任何检测探针缀合。缀合可以包含上述的非共价或共价交联。在一些配置中，与检测探针缀合的标记物需要额外底物或上述的结合剂。例如，与检测探针缀合的HRP标记物需要上述的底物以检测检测探针。本领域内已知有许多其他用于标记物的配置。本公开包含本文所例举的和/或本领域已知的所有标记物配置。在一些实施方案中，标记物配置可包含与分离的KLHL12片段缀合的PE，KLHL12：抗KLHL12抗体复合物结合剂，抗KLHL12抗体结合剂或Ig结合剂，该分离的KLHL12片段具有选自由SEQ IDNO:1-25组成的组中的氨基酸序列。

该试剂盒可以包含固体支持物。示例性的固体支持物包含本文所公开的珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管。在一些实施方案中，所述珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。在一些实施方案中，所述膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(PVDF)和聚偏二氟乙烯组成的组。以包含选自由SEQ ID NO:1-25组成的组中的氨基酸序列为例的任何分离的KLHL12片段都可以附着到本文公开的固体支持物上。

该试剂盒可以包含对照。如本文所用，“对照”是指用于与抗KLHL12抗体的存在或数量未知的测试样品进行比较的阳性或阴性标准品。试剂盒可以包含阳性对照。在一些实施方案中，阳性对照可以是含有可检测量的抗KLHL12抗体或其功能片段或高于阈值的水平的样品。在一些实施方案中，阳性对照可以从抗KLHL12抗体水平高于阈值的患病受试者获得。此外或替代地，阳性对照可以包含特异于使用本文所述的任何方法在体外合成的分离的KLHL12片段的抗体或其功能片段，该分离的KLHL12片段具有选自由SEQ ID NOS:1-25组成的组中的氨基酸序列。该抗体或其功能片段可选自单克隆或多克隆抗体。在其他实施方案中，该试剂盒可以包含阴性对照。阴性对照可以是不含可检测量的抗KLHL12抗体或其功能片段，或低于阈值的水平的样品。在一些实施方案中，阴性对照可以从健康的对照个体获得，或可以在体外合成。例如，阴性对照可以包含水或缓冲液。

该试剂盒可以包含一种或多种辅助试剂。如本文所用，“辅助试剂”是指对进行本公开的组合物或方法的预期目的有用的物质、混合物、材料或成分。示例性的辅助试剂包含缀合试剂、缓冲液、说明书、仪器等。本领域技术人员认识到，存在各种类型的孵育、洗涤、检测和封闭缓冲液。本文提供的试剂也可用于本公开的方法中。

在一些实施方案中，本公开的试剂盒的试剂可以包含本领域中已知的任何缀合试剂，包含共价和非共价缀合试剂。共价缀合试剂可以包含任何可用于将本公开的多肽共价固定化在表面上的化学或生物试剂。共价缀合试剂可以包含羧基-至-胺基反应基团，例如，碳二亚胺如EDC或DCC，胺基反应基团如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或亚胺酯，巯氢基反应交联剂如马来酰亚胺、卤代乙酰基或二硫化吡啶，羰基反应***联剂基团如酰肼或烷氧基胺，光反应***联剂如芳基叠氮化物或二嗪，或化学选择性连接基团如Staudinger反应对。非共价固定化试剂可包含任何可用于将本公开的多肽非共价固定化在表面上的化学或生物试剂，如亲和标签如生物素或捕获试剂如链霉亲合素或抗标记物抗体如抗His6或抗Myc抗体。

本公开的试剂盒可以包含缀合试剂的组合。此类组合包含例如EDC和NHS，其可用于例如将本公开的蛋白质固定化在表面上，例如羧基化右旋糖苷基质(例如在BIAcore^TMCM5芯片或基于右旋糖苷的珠上)。缀合试剂的组合可以作为预混合的试剂组合储存，或组合中的一个或多个缀合试剂与其他缀合试剂分开储存。

在其他实施方案中，该试剂盒的试剂可以包含诸如包被缓冲液的试剂。包被缓冲液可以包含碳酸钠-氢氧化钠或磷酸盐。在一些实施方案中，包被缓冲液可以是0.1M的NaHCO₃(例如，约pH 9.6)。

在一些实施方案中，该试剂盒的试剂可以包含洗涤缓冲液。洗涤缓冲液可以包含基于三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的缓冲液，如Tris缓冲盐水(TBS)或磷酸盐缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)。洗涤缓冲液可以由洗涤剂组成，所述洗涤剂如离子或非离子洗涤剂。在一些实施方案中，该洗涤缓冲液可以是pH7.4的PBS缓冲液，包含约0.05％的

20。在其他实施方案中，洗涤缓冲液可以是BIO-FLASH^TM特殊洗涤液(Inova Diagnostics,Inc.,San Diego,CA)。

在一些实施方案中，该试剂盒的试剂可以包含稀释缓冲液。本领域中已知的任何稀释缓冲液都可以包含在本公开的试剂盒中。典型的稀释缓冲液包含载体蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)和洗涤剂，如

20。在一些实施方案中，该稀释缓冲液可以是约pH 7.4的PBS，包含约1％的BSA和约0.05％的

20。

在一些实施方案中，试剂可以包含检测或测定缓冲液。本领域中已知的任何检测或测定缓冲液都可以包含在本公开的试剂盒中。检测或测定缓冲液可以是比色检测或测定缓冲液、荧光检测或测定缓冲液或化学发光检测或测定缓冲液。比色检测或测定缓冲液包含PNPP(对硝基苯磷酸酯)、ABTS(2,2′-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))或OPD(邻苯二胺)。荧光检测或测定缓冲液包含QuantaBlu^TM或QuantaRed^TM(Thermo Scientific,Waltham，MA)。化学发光检测或测定缓冲液可以包含鲁米诺(luminol)或萤光素。检测或测定缓冲液还可以包含触发剂如H₂O₂和示踪剂如异鲁米诺(isoluminol)-缀合物。在一些实施方案中，检测试剂可以包含一种或多种BIO-FLASH^TM触发剂溶液(Inova Diagnostics,Inc.,San Diego,CA)。在一些实施方案中，本公开的试剂盒的试剂可以包含可用于校准或测试的溶液。

在一些实施方案中，该试剂盒的试剂可以包含停止液。本领域中已知的任何停止液都可以包含在本公开的试剂盒中。本公开的停止液终止或延迟检测试剂和相应检测信号的进一步形成。停止液可以包含例如低pH缓冲液(例如，甘氨酸缓冲液，pH 2.0)、离液剂(chaotrophic agents)(例如，氯化胍、十二烷基硫酸钠(SDS))或还原剂(例如，二硫苏糖醇、β-疏基乙醇)等。

在一些实施方案中，本公开的试剂盒的试剂可以包含清洁剂。清洁剂可以包含本领域中已知的任何清洁试剂。在一些实施方案中，该清洁剂可以是由自动检测***的制造商推荐的清洁剂。在一些实施方案中，该清洗剂可以包含BIO-FLASH^TM***冲洗液或BIO-FLASH^TM***清洗溶液(Inova Diagnostics,Inc.,San Diego,CA)。

在一些实施方案中，本公开的试剂盒可以包含自动检测***的仪器。自动检测***可以包含任何制造商的***。在一些实施方案中，该自动检测***可以包含例如BIO-FLASH^TM、

4000、

3000、

160、

240、

2和DS2^TM(Inova Diagnostics,Inc.,SanDiego,CA)。在一些实施方案中，该自动检测***可以包含，例如，BEST 2000^TM、ELx50WASHER、ELx800 READER和Autoblot S20^TM(Biokit,Barcelona,Spain)。在其他实施方案中，该试剂盒的仪器可以是检测仪器。检测仪器可以包含本领域的任何检测仪器。检测仪器能够检测或测量本公开的报告标签的标记物。因此，检测仪器能够检测或测量荧光、发光、化学发光或吸光度、反射率、透射率、双折射率或折射率指标。在一些实施方案中，检测仪器可以包含共聚焦和非共聚焦显微术、微板阅读器和流式细胞仪等。

在一些实施方案中，本公开提供的试剂盒可以包含适合于收集下文所述生物样本的组件。组件可以包含收集管、柱、注射器和针等。在一些实施方案中，该试剂盒可以包含使用该试剂盒的组分的说明书。说明书可以是任何形式，在试剂盒的内部或外部。说明书提供有关方案和分析技术的细节。

本公开的试剂盒的组件可以处于不同的物理状态。例如，部分或所有的组件可以是冻干的或在水溶液中或冷冻的。这些组件包含分离的KLHL12片段、检测探针和辅助试剂。

本公开的试剂盒可以针对特定的检测技术进行修改。在一些实施方案中，试剂盒可以针对本文所举例的检测技术修改。例如，在一些实施方案中，该试剂盒可以是FIA试剂盒、CIA试剂盒、RIA试剂盒、多重免疫测定试剂盒、蛋白质/肽阵列免疫测定试剂盒、SPRIA试剂盒、IIF试剂盒、ELISA、PMAT试剂盒或点印迹试剂盒。在一些实施方案中，该ELSA试剂盒可以包含洗涤缓冲液、样品稀释液、二抗-酶缀合物、检测试剂和终止液。在一些实施方案中，点印迹试剂盒可以包含洗涤缓冲液、样品稀释液、二抗-酶缀合物、检测试剂和终止液。在一些实施方案中，该CIA试剂盒可以包含洗涤缓冲液、样品稀释液、示踪剂(例如，异鲁米诺-缀合物)和触发剂(例如，H₂O₂)。在一些实施方案中，多重试剂盒可以包含洗涤缓冲液、样品稀释液和二抗-酶缀合物。在一些实施方案中，该试剂盒可以针对Luminex平台修改，并且包含例如

珠。

试剂盒可用于诊断PBC，通过提供检测与分离的KLHL12片段结合的抗KLHL12抗体的手段。试剂盒可以通过本文公开的任何方法(见下文)检测抗KLHL12抗体。KLHL12：抗KLHL12抗体复合物或其抗原片段可以具有1比1或1比超过1的抗KLHL12抗体的化学计量学。在一些实施方案中，复合物可以具有每个分离的KLHL12片段的一个抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，所述复合物可以具有每个分离的KLHL12片段上的两个抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，所述复合物可以具有每个分离的KLHL12片段上的超过两个抗KLHL12抗体。用于测量两个抗原的结合化学计量学的方法在本领域是众所周知的，并且包含例如等温滴定量热法(ITC)和超离心法。

在一些实施方案中，KLHL12：抗KLHL12抗体复合物或其抗原片段可以是具有相同化学计量学的多个复合物。例如，多个复合物中的所有复合物具有每个分离的KLHL12片段上的一个抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，KLHL12：抗KLHL12抗体复合物或其抗原片段可以是具有不同化学计量学的多个复合物。例如，多个复合物中的一些复合物可以具有每个分离的KLHL12片段上的一个抗KLHL12抗体，并且多个复合物中的其他一些复合物可以具有每个分离的KLHL12片段上的超过一个的抗KLHL12抗体。

在一些实施方案中，分离的KLHL12片段可以被抗KLHL12抗体以更高的亲和力结合。在一些实施方案中，抗KLHL12抗体的结合位点可以被抗KLHL12抗体以2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、8倍以上、10倍以上、15倍以上、20倍以上、25倍以上、50倍以上、100倍以上、300倍以上、1000倍以上、3000倍以上、10000倍以上、30000倍以上或100000倍以上的亲和力结合。更大的结合亲和力通过在对KLHL12：抗KLHL12抗体复合物的较低解离常数(K_D)或对相应的抗KLHL12抗体和KLHL12的较高缔合常数(K_A)证明。在一些实施方案中，对KLHL12：抗KLHL12抗体复合物的解离常数(K_D)可以小于1mM、小于300nM、小于100nM、小于30nM、小于10nM、小于3nM、小于1nM、小于300pM、小于100pM、小于30pM、小于10pM、小于3pM或小于1pM。用于测量抗体与抗原的结合亲和力的方法在本领域是众所周知的，并且包含ELISA、等温滴定量热法(ITC)和表面等离子体共振(SPR)。

本公开提供了诊断PBC的方法，包含在对已知PBC抗体呈血清阴性的受试者中。这种方法包含：(a)使来自疑似患有PBC的受试者(包含对已知PBC抗体呈血清阴性的受试者)的生物样本与本文所述的分离的KLHL12片段接触，和(b)检测该生物样本中抗KLHL12抗体的存在，其中结合的抗KLHL12抗体的存在指示PBC。

相比于健康对照个体，受试者内存在增加的抗KLHL12抗体可以表明PBC的存在或正在发展PBC的风险。因此，KLHL12的自身抗体的可测量的增加用来诊断PBC。用于检测抗KLHL12抗体水平和与对照的比较的示例性方法在本文中提供，并在下文进一步描述。

在一些实施方案中，检测抗KLHL12抗体的水平。在其他实施方案中，KLHL12:抗KLHL12抗体复合物可以使用本文所述的组合物和方法形成，并且可以检测复合物中的抗KLHL12抗体。

在一些实施方案中，与健康对照个体相比，检测到增加的抗KLHL12抗体水平指示具有PBC的受试者。在一些实施方案中，使用本文提供的组合物和方法诊断PBC后，可以基于与PBC发病或存在相关的各种症状进一步证实PBC的存在。与PBC相关的临床症状包含例如疲劳、瘙痒、肖格伦氏综合征(sicca syndrome)和上腹部不适。见Norman et al.,LiverInt.,35(2):642-651(2015)；Onofrio et al,.Gastroenterol Hepatol(N Y),15(3):145-154(2019)。

在一些实施方案中，与健康对照个体相比，检测到增加的抗KLHL12抗体水平表明受试者处于发展PBC的临床症状的风险。在一些实施方案中，受试者可以在从确定抗KLHL12抗体水平升高开始的不到3个月、不到6个月、不到9个月、不到12个月、不到18个月、不到2年、不到3年、不到4年、不到5年、不到6年、不到7年、不到8年、不到9年、不到10年、不到12年、不到14年或不到16年内处于发展PBC的临床症状风险。

在一些实施方案中，与健康对照个体相比，增加的抗KLHL12抗体水平的存在表明在确定抗KLHL12抗体增加后的5年内，受试者有大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于25％、大于30％、大于35％、大于40％、大于45％、大于50％、大于60％、大于70％或大于80％或大于90％的可能性发展PBC临床症状。在一些实施方案中，增加的抗KLHL12抗体水平的存在可以表明，与健康对照个体相比，受试者有大于2倍、大于3倍、大于4倍、大于5倍、大于6倍、大于7倍、大于8倍、大于9倍或大于10倍的可能性发展PBC临床症状。

如本文所用，术语“受试者”、“生物体”、“个体”或“患者”被用作同义词并且是可互换的，并指脊椎动物哺乳动物。哺乳动物包含人类，灵长类动物如猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩，猫，狗，兔，农场动物如牛、马、山羊、绵羊和猪以及啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。作为示例，本公开的受试者可以包含健康受试者、无症状受试者和患病受试者。

如本文所用，受试者可以“疑似患有PBC”，如通过本领域众所周知的某些风险因素的存在来确定。此类风险因素包含例如遗传倾向、个人疾病史、生活方式因素、环境因素和诊断指标等。

在一些实施方案中，可以根据本领域众所周知的某些风险因素的存在来怀疑受试者患有PBC。处于患有或发展PBC的风险的受试者可以具有对发展PBC的遗传倾向，或具有PBC或其他自身免疫性疾病的家族史。该受试者可以暴露于某些生活方式因素(如吸烟)或促进PBC发展的环境因素。该受试者可以表现出PBC的临床疾病表现。该受试者可以是正在接受临床检查以诊断PBC或评估发展PBC风险的患者。

在一些实施方案中，受试者在其体液或组织中可以具有抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，与正常健康受试者相比，受试者在其体液或组织中可以具有升高的抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，与正常健康受试者相比，该受试者在其体液或组织中不会有升高的抗KLHL12抗体。

在一些实施方案中，该受试者可以是未治疗的。在一些实施方案中，该受试者可以正在接受PBC的治疗(例如，药物治疗)。在一些实施方案中，该受试者可以处于缓解期。在一些实施方案中，缓解可以是药物诱导的。在一些实施方案中，所述缓解可以是无药物的。

在一些实施方案中，该受试者可以是PBC的动物模型。在一些实施方案中，该动物模型可以是PBC的小鼠、兔或灵长类动物模型。在一些实施方案中，该动物模型可以涉及通过用KLHL12免疫或接种动物来诱导抗KLHL12抗体反应。

如本文所用，受试者可以是“对已知的PBC自身抗体呈血清阴性”，如在血液测试中未能检测到已知的PBC自身抗体的存在而确定。

在一些实施方案中，已知的PBC抗体可以是抗线粒体抗体(AMA)、抗核抗体(ANA)、抗多核点(MND)自身抗体、抗核体(NB)自身抗体、抗己糖激酶1(HK1)抗体和抗KLHL12抗体。在一些实施方案中，所述已知的PBC抗体可以是M2线粒体自身抗体、gp230自身抗体、核蛋白p62自身抗体、核纤层蛋白B受体自身抗体、早幼粒细胞白血病蛋白(PML)自身抗体、抗sp100(Speckled)抗体、抗gp210、抗着丝粒、抗97/VCP。抗嗜酸性粒细胞过氧化物酶(抗EPO)、丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(PDC-E2)自身抗体、分支/链2-酮-酸脱氢酶复合体E2亚单位(BCOADC-E2)自身抗体、2-酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚单位(OGDC-E2)自身抗体和NDP52自身抗体。

在一些实施方案中，该受试者可以是无症状的。无症状受试者包含基本没有发展PBC的风险或只有低发展PBC的风险(例如，无症状患者在接下来的五年期间会发展成PBC的概率为小于10％、小于5％、小于3％或小于1％)的健康受试者。无症状受试者还包含具有高风险发展PBC(例如，有大于50％、大于70％、大于90％或大于95％概率，无症状患者在接下来的五年期间会发展成PBC)的健康受试者。无症状受试者还包含患病的受试者，他们可以表现出轻微的PBC早期诊断指标，但在其他方面没有疾病或不适。

应注意，本文术语“健康对照个体”、“健康受试者”和语法等同物可互换使用，指的是不具有超过基线或超过已知或确定代表非PBC受试者的标准的增加的抗KLHL12抗体的受试者。

在一些实施方案中，该健康受试者可以从未患过某种疾病。在一些实施方案中，该健康受试者可以是先前患病的。在一些实施方案中，该健康受试者可以正在接受常规医疗检查。在一些实施方案中，该健康受试者可以是例如临床试验的对照组成员。在一些实施方案中，该健康受试者可以处于感染疾病的风险，如由本领域众所周知的某些风险因素的存在确定。此类风险因素包含但不限于：遗传倾向、个人疾病史、家族疾病史、生活方式因素、环境因素和诊断指标等。

确定或界定受试者为非PBC受试者的基线或标准是参考区间。在诊断或健康相关领域，该参考区间是在可以作为健康对照个体的参考受试者中观察到的数值范围，其由特定的百分位数指定。该参考区间可以是本领域技术人员确定的任何数值范围。见CLSI，“Howto define and determine reference intervals in the clinical laboratory:approved guideline，”C28:A2(2000)。在某些情况下，该参考区间可以是严格的，或是不太严格的，这取决于测量的具体分析物或所研究的疾病。本领域技术人员将理解在确定参考区间时使用的适当的严格程度。因此，在一些实施方案中，该参考区间可以设定为第95百分位数。为了提高特异性和降低灵敏度，例如提高严格程度，可以使用更高的截止值，如第96个百分位数或第97个百分位数或第98个百分位数或第99个百分位数。

在本公开中，如果抗KLHL12抗体水平相对于健康对照受试者的抗KLHL12抗体水平至少高于第95百分位数，则可认为受试者中的抗KLHL12抗体增加。在其他实施方案中，如果抗KLHL12抗体水平高于第96、第97、第98或第99百分位数，则可认为受试者中的抗KLHL12抗体增加。具有的抗KLHL12抗体水平达到或超过所公开的任何参考区间的本公开的受试者认为是患有PBC。

在一些实施方案中，抗KLHL12抗体的存在可以基于对信号与健康受试者中背景的比较。在一些实施方案中，抗KLHL12抗体的存在可以相对于在健康受试者群体中观察到的平均或中值抗KLHL12抗体水平增加或减少。在一些实施方案中，抗KLHL12抗体可以不存在于健康受试者中。在一些实施方案中，不能检测到高于用于确定抗KLHL12抗体水平的相应测定的噪音的抗KLHL12抗体水平。在一些实施方案中，如果可以检测到高于用于确定抗KLHL12抗体水平的相应测定的噪音的抗KLHL12抗体水平，则可以认为抗KLHL12抗体存在于样品中。在一些实施方案中，如果抗KLHL12抗体检测测定中的信号高于噪音如对照样品的平均或均值信号的至少两个标准差，则可以认为抗KLHL12抗体在样品中增加。在一些实施方案中，如果抗KLHL12抗体的水平超过预定的阈值水平，可以认为抗KLHL12抗体存在于样品中。抗KLHL12抗体的阈值水平可以由本领域技术人员如临床医生根据各种因素来确定，如根据临床试验的具体目标或某种抗KLHL12抗体水平的诊断和预后意义或另一种不涉及抗KLHL12抗体水平检测的PBC诊断测试的结果。

抗KLHL12抗体可以在从受试者获得的各种不同的生物样本中检测。如本文所用，术语“生物样本”是指来自生物体身体的能够用于诊断和分析的任何样品。作为示例，生物样本可以包含液体样本如全血、血浆、血清、滑液、羊水、痰液、胸水、腹水、中央脊液、尿液、胆汁、唾液或泪水。生物样本还可以包含固体组织样本，如肝脏生检、骨髓、口腔或其他固体或半固体的细胞聚集。在本公开的背景下，从受试者获得的生物样本可以任何样本，其含有或疑似含有自身抗体，以及包含来自其中可以检测到抗KLHL12抗体的受试者的任何材料。

本公开的生物样本可以获自含有或被疑似含有抗KLHL12抗体的任何受试者。本公开的生物样本也可以获自不具有或疑似不具有抗KLHL12抗体的任何受试者。因此，在一些实施方案中，生物样本可以获自有症状受试者、无症状受试者和抗KLHL12抗体阴性的受试者。在进一步的实施方案中，该生物样本可以获自哺乳动物如人类，灵长类动物如猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩，猫，狗，兔，农场动物如牛、马、山羊、绵羊和猪以及啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。

本公开的生物样本可以即时收集和处理，或其可以在以后日期时收集、冷冻和处理。该生物样本还可以包含来自本文所述受试者之一的多个样本。在一些实施方案中，多个生物样本可以在12小时以上、1天以上、2天以上、3天以上、4天以上、5天以上、6天以上、7天以上、10天以上、14天以上、3周以上、1个月以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上、5个月以上、6个月以上、9个月以上、12个月以上、18个月以上、24个月以上、30个月以上、3年以上、4年以上或5年以上的过程中定期收集。

本公开的生物样本可以是全血、血清、血浆或痰液。在一些实施方案中，本公开的生物样本可以是组织生检，如肝脏生检。肝脏生检可以是小于10mm、小于11mm、小于12mm、小于13mm、小于14mm、小于15mm、小于16mm、小于17mm、小于18mm、小于19mm、小于20mm、小于21mm、小于22mm、小于21mm、小于23mm、小于24mm或小于25mm的长度。除本文所披露的长度外，肝脏生检还可包含至少4个肝门三联征(portal triad)、至少5个肝门三联征、至少6个肝门三联征、至少7个肝门三联征、至少8个肝门三联征、至少9个肝门三联征、至少10个肝门三联征或至少11个肝门三联征。

本文提供的方法可以包含本公开的一个或多个分离的KLHL12片段。示例性的分离的KLHL12片段包含本文公开的SEQ ID NO:1-25，并可在下文表2中找到。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段开始于第一个叙述的氨基酸序列。在一些实施方案中，该分离的KLHL12片段结束于最后一个叙述的氨基酸残基。在其他的实施方案中，该分离的KLHL12片段既开始于也结束于所叙述的氨基酸残基。该分离的KLHL12片段可以是化学合成、重组合成或分离自天然来源，如本文所公开。该分离的KLHL12片段可以特异性地结合抗KLHL12抗体，包含抗KLHL12自身抗体，其中结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

在一些实施方案中，可以通过使生物样本与本文公开的1个或更多、2个或更多、3个或更多、4个或更多、5个或更多、6个或更多、7个或更多、8个或更多、9个或更多、10个或更多、11个或更多、12个或更多、13个或更多、14个或更多、15个或更多，或16个或更多分离的KLHL12片段接触进行本文所述的方法。在一些实施方案中，1个或更多分离的KLHL12片段与本文公开的任何固体支持物缀合。在另外的实施方案中，1个或更多分离的KLHL12片段不与本文公开的任何固体支持物缀合。

检测结合的抗KLHL12抗体的存在包含将抗KLHL12抗体与特异于抗KLHL12抗体的检测探针接触，并检测检测探针的特异性结合。

方法的检测探针可以包含上述的任何检测探针。简而言之，方法的检测探针可以包含抗体和抗体特异性结合多肽或抗体的或抗体特异性结合多肽的功能片段。因此，特异于抗KLHL12抗体的检测探针包含例如分离的KLHL12片段，KLHL12：抗KLHL12抗体复合物结合剂、抗KLHL12抗体结合剂和Ig结合剂。

在一些实施方案中，特异于抗KLHL12抗体的抗体是山羊抗人IgG或其功能片段。在一些实施方案中，特异于抗KLHL12抗体的结合多肽是蛋白A或蛋白G或其功能片段。

如本文提供并且如关于本公开的试剂盒例示，本公开的方法可以包含报告标签。报告标签的功能是产生用于检测生物标志物的信号。在一些实施方案中，该报告标签包含配体或颗粒。在一些实施方案中，该配体是生物素。在一些实施方案中，该颗粒包含纳米颗粒。报告标签可以通过非共价或共价交联附着在例如本文中使用的任何检测探针上。如关于本公开的试剂盒例示，本公开的方法可以包含本文描述或举例的任何标记物。例如，试剂盒的标记物可以包含荧光团、酶、化学发光部分、放射活性部分、有机染料、小分子、多肽或其功能片段。在一些实施方案中，该试剂盒的标记物包含荧光标记物。在一些实施例中，该荧光标记物是PE、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。在一些实施方案中，本公开的标记物与本公开的检测探针缀合，如上文例示。

如本文提供的，本公开的受试者中的PBC可以通过检测结合的抗KLHL12抗体的存在来确定。用于检测、测量和/或量化本公开的标记物所产生的信号的方法在本领域是众所周知的，并且包含检测荧光、发光、化学发光或吸光度、反射率、透射率、双折射或折射率指标。光学方法包含成像方法，如共聚焦和非共聚焦显微术，以及非成像方法如微板阅读器。在一些实施方案中，检测生物样品中的抗KLHL12抗体的方法可以包含生物样品中的荧光、比色或吸光度信号的可视化、量化或两者都进行。

在本公开的一些实施方案中，抗KLHL12抗体的存在可以通过免疫测定法检测。进行免疫测定和生物物理学蛋白质相互作用测定的方法和方案在本领域是众所周知的。例如，见Wild D.，The Immunoassay Handbook，Elsevier Science，4^th Edition(2013)；FuH.，Protein-Protein Interactions，Humana Press，4^th Edition(2004)。示例性的免疫测定包含荧光免疫吸附测定(FIA)、化学发光免疫测定(CIA)、放射免疫测定(RIA)、多重免疫测定、蛋白质/肽阵列免疫测定。固相放射免疫测定(SPRIA)、间接免疫荧光测定(IIF)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于颗粒的多分析物测试(PMAT)或点印迹测定。

在一些实施方案中，该ELISA可以是夹心ELISA。在一些实施方案中，该夹心ELISA可以包含将本公开的分离的KLHL12片段固定化于固体支持物上的初始步骤，如本文公开。例如，分离的KLHL12片段可以固定化在微滴定孔板或比色皿的壁上。在一些实施方案中，将来自受试者的样品与分离的KLHL12片段接触可以包含使样品暴露于分离的KLHL12片段。

在一些实施方案中，该ELISA可以是直接ELISA。在一些实施方案中，该直接ELISA可以包含将分离的KLHL12片段固定化在本文公开的任何固体支持物上的初始步骤。例如，分离的KLHL12片段可以固定化在微滴定板孔或比色皿的壁上。在一些实施方案中，将来自受试者的样品与分离的KLHL12片段接触可以包含将患者样品中含有的抗KLHL12抗体暴露于固定化的分离的KLHL12片段。本文(见上文)和本领域公开的任何一种免疫测定法都可用于或修改为用于本文公开的任何方法。

如本文所用，术语“基于颗粒的多分析物测试(PMAT)”意指允许在单一检测中同时测量两个或更多个分析物的免疫测定。例如，在PMAT中，同时使用不同类型的颗粒，每种类型具有固定化在其颗粒表面上的对于特定分子种类的特异性结合伴侣。在溶液中，要检测的分析物分子结合于相应颗粒类型上的其结合伴侣。然后，通过添加二级标志物来光学检测键，该标志物标记多重检测的所有颗粒结合的分析物分子。PMAT可以使用本领域已知的各种形式进行，如流式细胞仪、捕获夹心免疫测定法或竞争性免疫测定法。例如，使用双激光的流基检测仪器，分析物级份如自身抗体的结合可以通过二级标志物的荧光来检测。在一些实施方案中，PMAT颗粒可以是珠。在实施PMAT时，可以鉴定一种或多种与自身免疫性疾病特异性相关的自身抗体的存在，并且患者可以诊断为具有与PMAT鉴定的自身抗体特异性相关的自身免疫性疾病。

在一些实施方案中，点印迹或线免疫测定法(LIA)可用于检测生物样本中的抗KLHL12抗体。点印迹的方法和方案在本领域是众所周知的，包含估算多肽浓度。见JointProteomicS Laboratory(JPSL)of the Ludwig Institute for Cancer Research，Estimating protein concentration by dot blotting of multiple samples，ColdSpring Harbor Protocols，New York(2006)。

免疫测定可以进一步包含封闭步骤、洗涤步骤以及额外或替代地洗脱步骤。封闭步骤可以包含使免疫测定的固体支持物在封闭缓冲液中接触足够的时间和温度以实现阻断。在上文中鉴定示例性的封闭缓冲液。洗涤步骤包含将免疫测定的固体支持物与洗涤缓冲液接触，以去除多肽与固体支持物的非特异性结合。上文描述示例性的洗涤缓冲液。洗脱缓冲液可以包含本领域已知的或本文公开的各种洗脱缓冲液中的任何一种。洗脱缓冲液包含例如pH值在2.5和3之间的0.1M甘氨酸：HCl溶液。多肽复合物可以从免疫测定的固体支持物中洗脱，以助于检测和测量例如KLHL12：抗KLHL12抗体复合物。

检测在固体支持物上进行。示例性的固体支持物包含本文所披露的珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管。在一些实施例中，珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。在一些实施方案中，膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)和聚偏二氟乙烯组成的组。

序列

表2中的序列是本文所述的分离的KLHL12片段的说明性氨基酸序列。

表2

实施例I

通过KLHL12蛋白的表位作图选择KLHL12片段候选者

此实施例说明了通过KLHL12蛋白的表位定位选择KLHL12片段候选者的过程。

利用两个血清合并物进行表位定位。第一合并物由含有抗KLHL12抗体的血清组成，并且第二合并物由来自抗KLHL12抗体阴性的***性红斑狼疮(SLE)患者的血清组成。使用两个合并物对在固相基质(PEPperPRINT GmbH，德国海德堡)上合成的定制顺序重叠的KLHL12片段进行表位定位。

将KLHL12蛋白(NCBI Gene ID：59349)的序列在C-末端和N-末端用中性GSGSGSG(SEQ ID NO:26)接头延长，以避免截短的KLHL12片段。将该延长的KLHL12蛋白序列翻译成15个氨基酸的KLHL12片段，其具有14个氨基酸的肽-肽重叠。一式两份打印所产生的KLHL12片段，并由额外的控制肽(YPYDVPDYAG(SEQ ID NO:27))框定。将微阵列的一个副本(包含所产生的KLHL12片段和对照肽两者)随后与含有抗KLHL12抗体的血清合并物一起孵育。将微阵列的另一个副本与抗KLHL12抗体阴性的血清合并物一起孵育。

两个微阵列中每个点的信号强度由成像仪器进行量化。图1中显示的具有高信号强度或高信噪比的点表明KLHL12片段候选者，以供进一步分析。将那些KLHL12片段候选者合成并通过几种固相测定法进行评估，包含ELISA和基于珠的技术。

此实施例说明，***地筛选和评估本文公开的具有特异性结合抗KLHL12抗体的能力的KLHL12片段。

实施例Ⅱ

分离的KLHL12片段在PBC患者血清试样中检测抗KLHL12抗体的性能

此实施例说明了分离的KLHL12片段在PBC患者血清试样中检测抗KLHL12抗体的能力。

将由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成的KLHL12片段在C-末端(对于P2623-1)或N-末端(对于P2738-1)用生物素标记。使用标准的Inova专有的方案和材料，将标记的KLHL12片段以5μg/ml进一步包被到Costar高结合力微孔板(对于P2623-1)或Inova链霉亲合素包被板(对于P2738-1)上。

血清试样中的抗KLHL12抗体的检测通过以下进行：(1)将该血清试样在辣根过氧化物酶(HR)样品稀释液中做1:101的稀释，(2)施加100μl稀释后的试样到每个孔中，(3)将该稀释后的试样与含有固定化KLHL12片段的孔在室温下一起孵育30分钟。孵育结束后，孔用200-300μl HRP洗涤液清洗3次，以洗去未结合的抗KLHL12抗体。然后每个孔与100μl HRP缀合的山羊-抗人IgG在室温下孵育30分钟。孵育结束后，用200-300μl HRP洗涤液清洗3次，以洗去未结合的HRP缀合的山羊-抗人IgG。然后每个孔与100μl TMB(3,3′,5,5；-四甲基联苯胺)色原一起孵育30分钟。该反应通过加入100μl的0.1NH₂SO₄终止液来停止。在450/620nm处用分光光度法测量显色的强度以评估反应性。

为了说明来自PBC患者的血清试样对KLHL12片段的优先反应性，也对该血清试样对环瓜氨酸化肽(CCP)的反应性进行了测试，环瓜氨酸化肽是存在于许多类风湿性关节炎(RA)患者中的抗体的靶标。本文使用的CCP包被板获得自QUANTA

CCP3 IgG ELISA试剂盒(Inova Diagnostics,San Diego,CA)。结果的接受者操作特征(ROC)分析清楚地显示了来自PBC患者的血清试样与KLHL12片段的优先结合。相比之下，来自PBC患者的血清试样显示出可忽略不计的与RA相关抗原CCP的结合。见图2。

为了说明KLHL12片段在来自PBC患者的血清试样中检测抗KLHL12抗体的有效性，该血清试样对N-末端带有GST标签的全长重组KLHL12蛋白的反应性也进行了测试。该KLHL12蛋白商购自Abnova Corporation，中国台湾台北。结果的接受者操作特征(ROC)分析清楚地显示，该KLHL12片段与该全长KLHL12蛋白同样有效地结合在来自PBC患者的血清试样中的抗KLHL12抗体。见图3。

收集了来自西班牙巴塞罗那医院门诊(Hospital Clinic of Barcelona)肝脏科的254名PBC患者和来自法国巴黎Saint-Antoine医院的40名PBC患者的血清试样。对收集的试样使用QUANTA

ELISA试剂盒(Inova Diagnostics,San Diego,CA)进行了抗KLHL12抗体的流行率的测试。所用的KLHL12片段的氨基酸序列是IECYDPIIDSWEVVTSMG(SEQ IDNO:25)，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列和在C-末端的另外三个氨基酸组成。该KLHL12片段在C-末端用生物素标记。

抗KLHL12抗体在22.8％的西班牙PBC患者分组和20％的法国PBC患者分组中呈阳性，表明KLHL12片段在来自不同地域的PBC患者的血清试样中检测抗KLHL12抗体。

此实施例表明，本文公开的KLHL12片段可以通过在PBC患者血清试样中检测抗KLHL12抗体来诊断PBC。

实施例III

使用分离的KLHL12片段来提高诊断PBC的灵敏度

本实施例说明，添加使用本文公开的KLHL12片段的抗KLHL12抗体检测可以提高诊断PBC的灵敏度。本实施例中使用的KLHL12片段的氨基酸序列是IECYDPIIDSWEVVTSMG(SEQID NO:25)，其是由SEQ ID NO:2的氨基酸序列和在C-末端的另外三个氨基酸组成。该KLHL12片段在C-末端用生物素标记。

在五个专家临床地点(西班牙巴塞罗那；西班牙萨拉曼卡；加拿大卡尔加里；加拿大埃德蒙顿；波兰华沙)收集了总共487名具有临床记录的PBC的或根据欧洲肝脏研究协会(EASL)指南诊断为PBC/AIH重叠的患者的血清试样。对收集的试样使用QUANTA

ELISA试剂盒(Inova Diagnostics,San Diego,CA)进行针对己糖激酶1(HK-1)和KLHL12的抗体的存在的测试。所有血清试样还进行了抗MIT3自身抗体的测试。

对于样本分组，对抗MIT3抗体检测增加抗HK-1和抗KLHL12抗体检测将检测PBC的灵敏度从对于单独抗MIT3的85.0％提高到对于抗MIT3、抗HK-1和抗KLHL12组合的90.8％。见图4。

此实施例表明，本文公开的KLHL12片段可用于提高诊断PBC的灵敏度。

实施例IV

使用分离的KLHL12片段来提高诊断PBC的临床可信度本实施例说明，添加使用本文公开的KLHL12片段的抗KLHL12抗体检测可以提高诊断PBC的临床可信度。本实施例中使用的KLHL12片段的氨基酸序列是IECYDPIIDSWEVVTSMG(SEQ ID NO:25)，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列和C-末端的另外三个氨基酸组成。该KLHL12片段在C-末端用生物素标记。

这里测试的血清试样来自上文实施例II所述的法国巴黎Saint-Antoine医院的40名PBC患者。使用

肝脏试剂(Research Use Only,Inova Diagnostics,SanDiego，CA)对该试样检测了针对MIT3、LKM-1、SLA、LC-1、sp100、gp210、HK-1和KLHL12的抗体的存在。

在40名PBC患者中检测的自身免疫性肝病相关的生物标志物的频率和重叠显示于图5。抗KLHL12抗体显示为与其他PBC特异性生物标志物一起存在。此外，在MIT3阴性的PBC患者中，25％(2/8)呈抗KLHL12抗体以及抗gp210和抗HK-1抗体呈阳性。见图6。

本实施例说明，可以包含本文公开的KLHL12片段作为多分析物测试的组成。此类包含增加了诊断PBC的临床可信度。

序列表

<110> 依诺瓦诊断公司

<120> 用于诊断原发性胆汁性肝硬化的组合物和方法

<130> P22H77639A

<140>

<141>

<150> US 63/135,469

<151> 2021-01-08

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 1

Cys Tyr Asp Pro Ile Ile Asp Ser Trp Glu Val Val Thr Ser Met

1               5                   10                  15

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 2

Ile Glu Cys Tyr Asp Pro Ile Ile Asp Ser Trp Glu Val Val Thr

1               5                   10                  15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 3

Tyr Asp Pro Ile Ile Asp Ser Trp Glu Val Val Thr Ser Met Gly

1               5                   10                  15

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 4

Ser Ile Glu Cys Tyr Asp Pro Ile Ile Asp Ser Trp Glu Val Val

1               5                   10                  15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 5

Glu Cys Tyr Asp Pro Ile Ile Asp Ser Trp Glu Val Val Thr Ser

1               5                   10                  15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 6

Val Val Ala Ser Gly Val Ile Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Gly

1               5                   10                  15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 7

Gly His Trp Thr Asn Val Thr Pro Met Ala Thr Lys Arg Ser Gly

1               5                   10                  15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 8

Ala Gly Val Ala Leu Leu Asn Asp His Ile Tyr Val Val Gly Gly

1               5                   10                  15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 9

Ala Ser Gly Val Ile Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Asn

1               5                   10                  15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 10

Gly Ala Gly Val Ala Leu Leu Asn Asp His Ile Tyr Val Val Gly

1               5                   10                  15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 11

Met Gly Gly Ile Met Ala Pro Lys Asp Ile Met Thr Asn Thr His

1               5                   10                  15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 12

Gly Leu Val Val Ala Ser Gly Val Ile Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr

1               5                   10                  15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 13

Ser Gly Val Ile Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Gly Leu Asn Ile

1               5                   10                  15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 14

Leu Gln Tyr Val Arg Met Pro Leu Leu Thr Pro Arg Tyr Ile Thr

1               5                   10                  15

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 15

Met Thr Thr Pro Arg Cys Tyr Val Gly Ala Thr Val Leu Arg Gly

1               5                   10                  15

<210> 16

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 16

Gly Leu Ala Gly Ala Thr Thr Leu Gly Asp Met Ile Tyr Val Ser

1               5                   10                  15

<210> 17

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 17

Arg Ile Tyr Val Ile Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Ser Arg Leu Ser

1               5                   10                  15

<210> 18

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 18

Glu Cys Leu Asp Tyr Thr Ala Asp Glu Asp Gly Val Trp Tyr Ser

1               5                   10                  15

<210> 19

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 19

Gly Val Trp Tyr Ser Val Ala Pro Met Asn Val Arg Arg Gly Leu

1               5                   10                  15

<210> 20

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 20

Asp Ser Trp Thr Thr Val Thr Ser Met Thr Thr Pro Arg Cys Tyr

1               5                   10                  15

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 21

Tyr Asn Ile Arg Thr Asp Ser Trp Thr Thr Val Thr Ser Met Thr

1               5                   10                  15

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 22

Gly Gly Phe Asp Gly Ser Arg Arg His Thr Ser Met Glu Arg Tyr

1               5                   10                  15

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 23

Arg Ser Gly Ala Gly Val Ala Leu Leu Asn Asp His Ile Tyr Val

1               5                   10                  15

<210> 24

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 24

Leu Asn Asp His Ile Tyr Val Val Gly Gly Phe Asp Gly Thr Ala

1               5                   10                  15

<210> 25

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> KLHL12片段

<400> 25

Ile Glu Cys Tyr Asp Pro Ile Ile Asp Ser Trp Glu Val Val Thr Ser

1               5                   10                  15

Met Gly

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 26

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1               5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照肽

<400> 27

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly

1               5                   10

Claims (100)

1.分离的多肽，其包含Kelch样12(KLHL12)片段，该片段包含选自由SEQ ID NO:1-25组成的组的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列开始于第一个叙述的氨基酸残基。

2.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述KLHL12片段包含15-622个氨基酸残基。

3.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述KLHL12片段包含15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。

4.如权利要求1所述的分离的多肽，其中所述KLHL12片段为15个氨基酸残基。

5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的多肽，其中通过方法获得所述KLHL12片段，所述方法包括从天然来源中分离、化学合成或重组表达。

6.如权利要求1-5中任一项所述的分离的多肽，其还包含固体支持物。

7.如权利要求6所述的分离的多肽，其中所述固体支持物选自由珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管组成的组。

8.如权利要求7所述的分离的多肽，其中所述珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。

9.如权利要求7所述的分离的多肽，其中所述膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(PVDF)和聚偏二氟乙烯组成的组。

10.如权利要求1-9中任一项所述的分离的多肽，其中所述KLHL12片段特异性结合抗KLHL12抗体。

11.如权利要求10所述的分离的多肽，其中所述抗KLHL12抗体包含自身抗体。

12.如权利要求10-11中任一项所述的分离的多肽，其中所述结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

13.试剂盒，包含：

(a)一个或多个分离的多肽，其包含Kelch样12(KLHL12)片段，该片段具有选自由SEQID NO:1-25组成的组的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列开始于第一个叙述的氨基酸残基；和

(b)特异于抗KLHL12抗体的检测探针。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述KLHL12片段包含15-622个氨基酸残基。

15.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述KLHL12片段包含15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。

16.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述KLHL12片段为15个氨基酸残基。

17.如权利要求13-16中任一项所述的试剂盒，其中所述KLHL12片段特异性结合抗KLHL12抗体。

18.如权利要求17所述的试剂盒，其中所述抗KLHL12抗体包含自身抗体。

19.如权利要求17-18中任一项所述的试剂盒，其中所述结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

20.如权利要求13-19中任一项所述的试剂盒，其中通过方法获得所述一个或多个分离的多肽，所述方法包含从天然来源分离、化学合成或重组表达。

21.如权利要求13-20中任一项所述的试剂盒，其中所述检测探针包含抗体、抗体特异性结合多肽或抗体的或抗体特异性结合多肽的功能片段。

22.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述抗体或其功能片段包含抗IgG。

23.如权利要求21所述的试剂盒，其中所述抗体特异性结合多肽或其功能片段包含蛋白A或蛋白G。

24.如权利要求13-23中任一项所述的试剂盒，其中所述检测探针还包含报告标签。

25.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述报告标签是标记物。

26.如权利要求25所述的试剂盒，其中所述标记物选自由荧光团、酶、化学发光部分、放射活性部分、有机染料和小分子组成的组。

27.如权利要求25-26中任一项所述的试剂盒，其中所述标记物是荧光标记物。

28.如权利要求27所述的试剂盒，其中所述荧光标记物是藻红蛋白(PE)、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

29.如权利要求24所述的试剂盒，其中所述报告标签包含配体或颗粒。

30.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述配体是生物素。

31.如权利要求29所述的试剂盒，其中所述颗粒包含纳米颗粒。

32.如权利要求13-31中任一项所述的试剂盒，其进一步包含固体支持物、对照或辅助试剂。

33.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述固体支持物选自由珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管组成的组。

34.如权利要求33所述的试剂盒，其中所述珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。

35.如权利要求33所述的分离的多肽，其中所述膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(PVDF)和聚偏二氟乙烯组成的组。

36.如权利要求13-35中任一项所述的试剂盒，其中所述一个或多个分离的多肽缀合到所述固体支持物。

37.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述对照包含特异于分离的多肽的抗体或其功能片段，所述分离的多肽具有选自由SEQ ID NO:1-25组成的组的氨基酸序列。

38.如权利要求37所述的试剂盒，其中所述抗体或其功能片段选自单克隆或多克隆抗体。

39.如权利要求32所述的试剂盒，其中所述辅助试剂选自由孵育缓冲液、洗涤缓冲液、检测缓冲液和检测仪器组成的组。

40.诊断原发性胆汁性肝硬化(PBC)的方法，其包括：

(a)使来自疑似患有PBC的受试者的生物样本接触一个或多个包含Kelch样12(KLHL12)片段的分离的多肽，所述片段具有选自由SEQ IDNO:1-25组成的组的氨基酸序列，和

(b)检测所述生物样本中抗KLHL12抗体的存在，其中结合的抗KLHL12抗体的存在指示PBC。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述KLHL12片段包含15-622个氨基酸残基。

42.如权利要求40的方法，其中所述KLHL12片段包含15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。

43.如权利要求40所述的方法，其中所述KLHL12片段为15个氨基酸残基。

44.如权利要求40-43中任一项所述的方法，其中所述KLHL12片段的氨基酸序列开始于第一个叙述的氨基酸残基。

45.如权利要求40-44中任一项的方法，其中所述KLHL12片段特异性结合抗KLHL12抗体。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述抗KLHL12抗体包含自身抗体。

47.如权利要求45-46中任一项所述的方法，其中所述结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

48.如权利要求40-47中任一项所述的方法，其中通过方法获得所述一个或多个分离的多肽，所述方法包括从天然来源分离、化学合成或重组表达。

49.如权利要求40-48中任一项所述的方法，其中所述生物样本包含全血、血浆、血清、痰液或胆汁。

50.如权利要求40-49中任一项所述的方法，其中所述生物样本包含血清、血浆或痰液。

51.如权利要求40-50中任一项所述的方法，其中所述检测包含免疫测定。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述免疫测定选自由荧光免疫吸附测定(FIA)、化学发光免疫测定(CIA)、放射免疫测定(RIA)、多重免疫测定、蛋白质/肽阵列免疫测定、固相放射免疫测定(SPRIA)、间接免疫荧光测定(IIF)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于颗粒的多分析物测试(PMAT)或点印迹测定组成的组。

53.如权利要求40-52中任一项所述的方法，其中所述检测包含：

(a)使所述抗KLHL12抗体接触特异于所述抗KLHL12抗体的检测探针，和

(b)检测所述检测探针的特异性结合。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述检测探针包含抗体、抗体特异性结合多肽或抗体的或抗体特异性结合多肽的功能片段。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述抗体或其功能片段包含抗IgG。

56.如权利要求54所述的方法，其中所述抗体特异性结合多肽或其功能片段包含蛋白A或蛋白G。

57.如权利要求53-56中任一项所述的方法，其中所述检测探针包含报告标签。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述报告标签是标记物。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述标记物选自由荧光团、酶、化学发光部分、放射活性部分、有机染料和小分子组成的组。

60.如权利要求58-59中任一项所述的方法，其中所述标记物是荧光标记物。

61.如权利要求60所述的方法，所述荧光标记物是藻红蛋白(PE)、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

62.如权利要求57所述的方法，其中所述报告标签包含配体或颗粒。

63.如权利要求62所述的方法，其中所述配体是生物素。

64.如权利要求62所述的方法，其中所述颗粒包含纳米颗粒。

65.如权利要求40-64中任一项所述的方法，其中所述检测在固体支持物上进行。

66.如权利要求65所述的方法，其中所述固体支持物选自由珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管组成的组。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。

68.如权利要求66所述的方法，其中所述膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(PVDF)和聚偏二氟乙烯组成的组。

69.在对已知PBC自身抗体呈血清阴性的受试者中鉴定具有原发性胆汁性肝硬化(PBC)的患者的方法，其包括：

(a)将来自对已知PBC自身抗体呈血清阴性的受试者的生物样本与一个或多个包含KLHL12片段的分离的多肽接触，所述片段具有选自由SEQ IDNO:1-25组成的组的氨基酸序列，和

(b)检测所述生物样本中与所述一个或多个分离的多肽结合的抗KLHL12抗体的存在，其中结合的抗KLHL12抗体的存在指示PBC。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者是无症状的。

71.如权利要求69-70中任一项所述的方法，其中所述已知PBC自身抗体选自由抗线粒体抗体(AMA)、抗核抗体(ANA)、抗多核点(MND)自身抗体、抗核体(NB)自身抗体、抗己糖激酶1(HK1)抗体和抗KLHL12抗体组成的组。

72.如权利要求69-71中任一项所述的方法，其中所述已知PBC自身抗体选自由M2线粒体自身抗体、gp230自身抗体、核孔蛋白p62自身抗体、核纤层蛋白B受体自身抗体、早幼粒细胞白血病蛋白(PML)自身抗体、抗sp100(斑点型)抗体、抗gp210、抗着丝粒、抗97/VCP、抗嗜酸性粒细胞过氧化物酶(抗EPO)、丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(PDC-E2)自身抗体、分支/链2-酮-酸脱氢酶复合体E2亚单位(BCOADC-E2)自身抗体、2-酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚单位(OGDC-E2)自身抗体和NDP52自身抗体组成的组。

73.如权利要求69所述的方法，其中所述KLHL12片段包含15-622个氨基酸残基。

74.如权利要求69所述的方法，其中所述KLHL12片段包含15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸残基。

75.如权利要求69所述的方法，其中所述KLHL12片段为15个氨基酸残基。

76.如权利要求69-75中任一项所述的方法，其中所述KLHL12片段的氨基酸序列开始于第一个叙述的氨基酸残基。

77.如权利要求69-76中任一项所述的方法，其中所述KLHL12片段特异性结合抗KLHL12抗体。

78.如权利要求77所述的方法，其中所述抗KLHL12抗体包含自身抗体。

79.如权利要求77-78中任一项所述的方法，其中所述结合表现出25或更低的信噪比的标准分(ZS)。

80.如权利要求69-79中任一项的方法，其中通过方法获得所述一个或多个分离的多肽，所述方法包括从天然来源分离、化学合成或重组表达。

81.如权利要求69-80中任一项所述的方法，其中所述生物样本包含全血、血浆、血清、痰液或胆汁。

82.如权利要求69-81中任一项所述的方法，其中所述生物样本包含血清、血浆或痰液。

83.如权利要求69-82中任一项的方法，其中所述检测包含免疫测定。

84.如权利要求83的方法，其中所述免疫测定选自由荧光免疫吸附测定(FIA)、化学发光免疫测定(CIA)、放射免疫测定(RIA)、多重免疫测定、蛋白质/肽阵列免疫测定、固相放射免疫测定(SPRIA)、间接免疫荧光测定(IIF)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于颗粒的多分析物测试(PMAT)或点印迹测定组成的组。

85.如权利要求69-84中任一项所述的方法，其中所述检测包含：

(a)使所述抗KLHL12抗体接触特异于所述抗KLHL12抗体的检测探针，和

(b)检测所述检测探针的特异性结合。

86.如权利要求85所述的方法，其中所述检测探针包含抗体、抗体特异性结合多肽或抗体的或抗体特异性结合多肽的功能片段。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述抗体或其功能片段包含抗IgG。

88.如权利要求86所述的方法，其中所述抗体特异性结合多肽或其功能片段包含蛋白A或蛋白G。

89.如权利要求85-88中任一项所述的方法，其中所述检测探针包含报告标签。

90.如权利要求89所述的方法，其中所述报告标签是标记物。

91.如权利要求90所述的方法，其中所述标记物选自由荧光团、酶、化学发光部分、放射活性部分、有机染料和小分子组成的组。

92.如权利要求90-91中任一项所述的方法，其中所述标记物是荧光标记物。

93.如权利要求92所述的方法，其中所述荧光标记物是藻红蛋白(PE)、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。

94.如权利要求89所述的方法，其中所述报告标签包含配体或颗粒。

95.如权利要求94所述的方法，其中所述配体是生物素。

96.如权利要求94所述的方法，其中所述颗粒包含纳米颗粒。

97.如权利要求69-96中任一项所述的方法，其中所述检测在固体支持物上进行。

98.如权利要求97所述的方法，其中所述固体支持物选自由珠、球、颗粒、膜、芯片、载玻片、板、孔和试管组成的组。

99.如权利要求98所述的方法，其中所述珠、球或颗粒包含微米或纳米维度。

100.如权利要求98所述的方法，其中所述膜选自由硝化纤维素、尼龙、聚偏氟乙烯(PVDF)和聚偏二氟乙烯组成的组。

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