CN116103197A - 一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌及其应用 - Google Patents
一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌及其应用。对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)FP13‑03,该菌株已于2022年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.25311。本发明菌株能够根除幽门螺旋杆菌感染者体内的幽门螺旋杆菌,避免用药对身体造成的各种不适症状,同时降低幽门螺旋杆菌的复发率和再感染率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域,具体涉及一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌及其应用。
背景技术
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种螺旋形、能够定植于胃黏膜的微厌氧的革兰氏阴性杆菌,它是感染性口臭、口腔溃疡、慢性活动性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的主要致病因素。1983年幽门螺旋杆菌首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜组织中分离成功,是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类,1994年国际癌症中心正式将幽门螺旋杆菌列为第Ⅰ类人类致癌因子。
该菌的致病机理主要是因为它呈螺旋状,一端带有鞭毛,可以穿过胃腔的酸性环境和黏液层而定居于胃黏膜表面,同时,它能够代谢尿素酶,尿素酶能水解尿素产生氨和二氧化碳,中和菌体周围的酸环境,保护它免遭破坏,此外它还会分泌致病性的毒力因子,如空泡毒素A(VacA)、CagA蛋白、热休克蛋白、脂多糖、Lewis抗原、iceA基因、脂酶、蛋白酶、生长抑制因子等。
如何抑制幽门螺旋杆菌的生长和增殖已成为学者们研究的重点及热点。现有技术通常采用大剂量、多种抗生素同时作用的方式以期杀灭幽门螺旋杆菌,例如:
1、左氧氟沙星三联疗法:PPI(质子泵抑制剂)+左氧氟沙星+阿莫西林,疗程七天。
2、序贯疗法:前五天PPI+阿莫西林;后五天PPI+克拉霉素+甲硝唑。
3、伴同疗法:PPI+克拉霉素+阿莫西林+甲硝唑,5~10天疗程。
4、标准三联疗法:PPI+克拉霉素+阿莫西林或者甲硝唑,7~14天疗程。
5、铋剂四联疗法:铋剂+PPI+两种抗生素(阿莫西林+克拉霉素或阿莫西林+左氧氟沙星或阿莫西林+呋喃唑酮或四环素+甲硝唑/呋喃唑酮),7~14天疗程。
这五种方法虽然使幽门螺旋杆菌的治愈率得到很大的提高,但是仍然存在较多的问题,例如常用的质子泵抑制剂是雷贝拉唑、埃索美拉唑,长期应用容易出现食欲减退、上腹不适、恶心等副作用;铋剂长期口服容易出现便秘等症状;抗生素的应用在杀死病菌的同时也会引起体内菌群紊乱、肝功能受损等问题,同时抗生素的使用还会引起幽门螺旋杆菌的耐药性增强,幽门螺旋杆菌的根除率降低等问题。
近年来,微生态学的兴起和微生态疗法的应用,为幽门螺旋杆菌的治疗提供了新思路。现在出现了一些治疗幽门螺旋杆菌感染的益生菌制剂,这些益生菌制剂大多属于药品系列,如益君康(5×106CFU/片)、复方嗜酸乳杆菌片(0.25×107CFU/片)、乐托尔(1×1010CFU/袋,灭活)、金双歧(0.5×107CFU/片)等。这些益生菌制剂虽然在治疗幽门螺旋杆菌方面有一定的效果,但现有剂型的活菌数大多处于较低水平,其治疗效果有限。此外,这些剂型中用到的益生菌其对抗生素的耐受性没有进行讨论,如果患者需要与抗生素联用,其作用效果可能达不到该益生菌单独使用时的效果,不利于根据患者的病情辨证施治。
发明内容
针对现有治疗幽门螺旋杆菌感染的药物易出现副作用及幽门螺旋杆菌的根除率降低的问题,本发明提供一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌及其应用,能够根除幽门螺旋杆菌感染者体内的幽门螺旋杆菌,避免用药对身体造成的各种不适症状,同时降低幽门螺旋杆菌的复发率和再感染率。
第一方面,本发明提供一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)FP13-03,该菌株已于2022年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCCNo.25311。
第二方面,本发明提供一种上述嗜热链球菌FP13-03在制备对幽门螺旋杆菌有抑制作用的产品中的应用。
进一步的,将嗜热链球菌FP13-03的发酵液冻干得到嗜热链球菌菌粉。
进一步的,冻干过程分两阶段加入冻干保护剂,其中在菌株发酵后、离心前向发酵液中加入无菌的麦芽糊精;在离心结束后,向菌泥乳浊液中依次加入低聚异麦芽糖、甘露醇和脱脂奶粉。
进一步的,以发酵液体积计,麦芽糊精的终浓度为2g/L。
进一步的,以发酵液体积计,低聚异麦芽糖的终浓度为1.15g/L,甘露醇的终浓度为1.15g/L,脱脂奶粉的终浓度为3g/L。
进一步的,嗜热链球菌菌粉中FP13-03的活菌数为4.0×1011CFU/g。
进一步的,产品中嗜热链球菌FP13-03的活菌数为5.0×109CFU/g或1.0×1010CFU/g。
本发明的有益效果在于:
本发明提供的嗜热链球菌FP13-03具有胃肠道存活率高、肠道定植能力强等特点,能够抑制并杀死幽门螺旋杆菌,并且能够有效降低幽门螺旋杆菌的复发率和再感染率。本发明在使用时可以避免因使用药物而导致的身体各种不良反应,彻底根除患者体内的幽门螺旋杆菌,同时降低幽门螺旋杆菌的复发率和再感染率。本发明还通过抗生素的抗性筛选,为该菌剂的多种应用方式提供了可能。此外,本发明还对该菌剂的用法和用量做了优化,避免了因菌剂使用不当对身体造成的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
实施例1嗜热链球菌FP13-03的筛选
1、菌株的分离、纯化与保藏
①菌株的分离
从青州西股采集到的母乳样品中各取1mL分别加入到装有9mL生理盐水的试管中,然后用生理盐水进行10倍梯度稀释,取合适的稀释梯度涂布于MRS固体培养基平板上,37℃培养48h后,根据MRS固体培养基平板上单菌落的形态、颜色及显微镜镜检形态,选取其中的10个单菌落进行纯化。
②菌株的纯化
采用划线方法对上述10个单菌落进行纯化,经过两次划线后,将最后一次划线平板上的单菌落进行保藏操作。
③菌株的保藏
将上述得到的单菌落接种于MRS液体培养基中,37℃静置培养24h后,分装于5mL离心管中,5000rpm离心5min,弃去上清液,然后向离心管中加入1mL25%浓度的甘油,摇匀后放入-18℃冰箱中保藏,并将其分别编号为FP13-01、FP13-02、FP13-03、FP13-04、FP13-05、FP13-06、FP13-07、FP13-08、FP13-09、FP13-010。
2、幽门螺旋杆菌菌种及其培养液的制备
本发明采用的是幽门螺旋杆菌临床菌株,该临床菌株取自幽门螺旋杆菌感染阳性患者的胃黏膜组织,经鉴定其涂片革兰氏染色、氧化酶、接触酶和尿素酶均为阳性。
将装有幽门螺旋杆菌的甘油管从冰箱中取出,涂布于含有8%脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂培养基平板上,在37℃、微氧(5%O2、10%CO2、85%N2)的条件下培养2~3d,挑取单菌落并在含有8%脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂培养基平板上纯化两次后,挑取单菌落接种于幽门螺旋杆菌液体培养基中,在37℃、微氧(5%O2、10%CO2、85%N2)的条件下静置培养2~3d后,在8000rpm/min、4℃条件下离心15min,收集沉淀,用新鲜的幽门螺旋杆菌液体培养基洗涤沉淀两次后,重悬幽门螺旋杆菌菌体使其活菌浓度达到109CFU/mL。
3、菌株对幽门螺旋杆菌的抑制效果
①益生菌发酵液的制备
将得到的十株菌甘油管接种到MRS液体培养基中,37℃静置培养24h后,得到发酵液待用。
②抑菌圈试验
取200μL幽门螺旋杆菌的菌悬液涂布于含有8%脱纤维羊血的哥伦比亚血琼脂培养基平板上,然后在该平板上放入已灭菌的牛津杯,并分别向牛津杯中加入已灭菌的空白MRS液体培养基及十株菌的发酵液各100μL。在37℃、微氧(5%O2、10%CO2、85%N2)的条件下静置培养2~3d后,用游标卡尺测量抑菌圈的直径,其结果如下表1所示。
表1各菌株对幽门螺旋杆菌的抑制作用
可以看出,FP13-03菌株对幽门螺旋杆菌的抑制作用最强,且明显高于其他菌株,所以选择用FP13-03菌株进行后续试验。
4、菌株鉴定
①菌落特征
FP13-03菌株在MRS固体培养基中生长的菌落形态为底部略带微黄色,表面多为乳白色,边缘不整齐,表面较光滑、湿润,中间凸起,菌落较适中。
②显微镜下形态
FP13-03菌株其革兰氏染色呈阳性,形态为圆形或椭圆形,直径0.7~0.9μm,成对或链状排列,无芽孢和鞭毛,无运动性。
③生理生化鉴定
FP13-03菌株的生理生化鉴定如下表2所示。
表2FP13-03菌株的生理生化鉴定结果
检测指标 | 生化反应 |
运动性 | - |
葡萄糖水解 | + |
半乳糖水解 | + |
乳糖水解 | + |
蔗糖水解 | + |
淀粉水解 | + |
过氧化氢酶试验 | - |
明胶液化试验 | - |
吲哚试验 | - |
V-P试验 | + |
注:表中“+”代表阳性反应,“-”代表阴性反应。
④16S rDNA鉴定
将FP13-03菌株的甘油管送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,其结果为:
GGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTAGAACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGTTGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGCTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGAAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTCAGTTGGGCACTCTAGCGAGACTGCCGGTAATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGAGTTGCGAGTCGGTGACGGCGAGCTAATCTCTTAAAGCCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGT。
将结果在GenBank数据库中进行BLAST比较,将该FP13-03菌株被鉴定为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。
将该嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)FP13-03送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.25311,保藏日期为2022年7月15日。
实施例2嗜热链球菌FP13-03的胃酸和胆盐的耐受性试验
1、菌株的胃酸耐受性试验
①人工胃液的配制:向MRS液体培养基中加入10%的盐酸,使其pH分别为1.5、2.0、2.5和3.0,然后向各组中加入胃蛋白酶,使胃蛋白酶终浓度为10g/L,充分溶解后,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,待用。
②FP13-03菌株发酵液的制备:将FP13-03菌株的甘油管接种到MRS液体培养基中,37℃静置培养24h后,待用。
③按照FP13-03菌株发酵液与不同pH值的人工胃液为1:9(V/V)的比例将两者混合,置于37℃培养箱中静置培养,然后于0h、1h、2h和3h时分别取样,检测混合液中FP13-03菌的活菌数。其结果如下表3所示。
表3人工胃液中FP13-03菌株在不同时间点的活菌数(单位:CFU/mL)
胃酸pH值 | 0h | 1h | 2h | 3h |
pH3.0 | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.95×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.92×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.86×10<sup>8</sup>]]> |
pH2.5 | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.92×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.87×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.76×10<sup>8</sup>]]> |
pH2.0 | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.89×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.80×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.73×10<sup>8</sup>]]> |
pH1.5 | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.87×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.78×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.70×10<sup>8</sup>]]> |
由上表3可知,在人工胃液中经过3h后,FP13-03菌株在pH1.5、pH2.0、pH2.5和pH3.0中的存活率分别为:85%、86.5%、88%、93%。由此看见,FP13-03菌株具有良好的胃酸耐受性。
2、菌株的胆盐耐受性试验
①胆盐溶液的配制:向MRS液体培养基中加入牛胆汁粉,使其质量分数分别为0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%,然后向各组中加入胰蛋白酶至终浓度1.0g/L,充分溶解后,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,待用。
②FP13-03菌株发酵液的制备:将FP13-03菌株的甘油管接种到MRS液体培养基中,37℃静置培养24h后,待用。
③按照FP13-03菌株发酵液与不同质量分数的胆盐溶液为1:9(V/V)的比例将两者混合,置于37℃培养箱中静置培养,然后于0h、2h、4h和6h时分别取样,检测混合液中FP13-03菌的活菌数。其结果如下表4所示。
表4胆盐溶液中FP13-03菌株在不同时间点的活菌数(单位:CFU/mL)
胆盐浓度 | 0h | 2h | 4h | 6h |
0.0% | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[2.01×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[2.04×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[2.10×10<sup>8</sup>]]> |
0.1% | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[2.01×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[2.02×10<sup>8</sup>]]> |
0.2% | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.99×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.97×10<sup>8</sup>]]> |
0.3% | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.99×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.98×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.97×10<sup>8</sup>]]> |
0.4% | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.99×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.97×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.96×10<sup>8</sup>]]> |
0.5% | <![CDATA[2.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.98×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.96×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[1.95×10<sup>8</sup>]]> |
由上表可知,FP13-03菌株在最高的胆盐浓度(质量分数为0.5%)处理6h后,其存活率仍高达97.5%,由此可见,该菌对胆盐具有较高的耐受性,在肠道中的存活率高,能够更持久的发挥作用。
实施例3嗜热链球菌FP13-03的抗生素的耐受性试验
向MRS液体培养基中分别加入左氧氟沙星、四环素、克拉霉素和阿莫西林使其终浓度分别为0mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.15mg/L,充分溶解后,用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌,然后分别接入FP13-03菌株的甘油管一支,37℃静置培养12h后取样,测菌数,其检测结果如下表5所示。
表5FP13-03菌株在不同浓度抗生素中的活菌数(单位:CFU/mL)
抗生素浓度 | 左氧氟沙星 | 四环素 | 克拉霉素 | 阿莫西林 |
0mg/L | <![CDATA[5.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[5.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[5.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[5.0×10<sup>8</sup>]]> |
0.05mg/L | <![CDATA[4.0×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[4.3×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[3.9×10<sup>8</sup>]]> | <![CDATA[4.2×10<sup>8</sup>]]> |
0.10mg/L | <![CDATA[5.0×10<sup>6</sup>]]> | <![CDATA[6×10<sup>6</sup>]]> | <![CDATA[4.6×10<sup>6</sup>]]> | <![CDATA[5.7×10<sup>6</sup><!-- 6 -->]]> |
0.15mg/L | - | - | - | - |
由上表5可知,FP13-03菌株对治疗幽门螺旋杆菌过程中用到的抗生素具有一定的抗性,但抗生素浓度过高时会抑制该菌的生长,这不仅为不同患者的个性化用药提供了可能,也保证了该菌在应用时的安全性。
同时,本发明通过拮抗试验探索了FP13-03菌株对肠道其它益生菌(乳双歧杆菌、长双歧杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等菌株)的拮抗作用,试验结果表明,该菌对肠道其它益生菌无拮抗作用,这不仅保证了该菌不会抑制肠道其它益生菌的生长,而且还为多种益生菌的联合应用提供了可能。
实施例4嗜热链球菌FP13-03的安全性毒理学评价
采用雌雄小鼠急性毒性试验、小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠***畸形试验、Ames试验和大鼠30天喂养试验等对嗜热链球菌FP13-03进行安全性试验研究。结果急性经口毒性试验表明,嗜热链球菌FP13-03对雌雄小鼠的急性经口LD50均大于22000mg/kg,以急性毒性半数致死量毒性分级,属无毒级物质。小鼠骨髓细胞微核试验、小鼠***畸形试验、Ames试验结果均为阴性。30天喂养试验结果表明,大鼠生长情况良好,血液学检查、生物化学检查、主要脏体以及组织学检查结果与对照组相比,差异均无统计学意义。由此可知,嗜热链球菌FP13-03未见遗传毒性,使用嗜热链球菌FP13-03是安全可靠的。
实施例5含嗜热链球菌FP13-03的产品的制备
取经过MRS固体培养基两次活化后的菌种,接种于MRS液体培养基中,37℃培养24h后,接种于发酵培养基中,36℃培养24h,得到嗜热链球菌FP13-03活菌数为1.2×1010CFU/mL的发酵液;向发酵液中加入无菌的麦芽糊精作为第一冻干保护剂,使其终浓度为2g/L,搅拌均匀后离心得到菌泥乳浊液;向菌泥乳浊液中先依次加入低聚异麦芽糖、甘露醇,使低聚异麦芽糖得终浓度为1.15g/L(按照发酵液体积计算),甘露醇的终浓度为1.15g/L(按照发酵液体积计算),待低聚异麦芽糖和甘露醇充分溶解并搅拌均匀后,再加入脱脂奶粉,使其终浓度为3g/L(按照发酵液体积计算),然后采用冷冻干燥法(预冻温度-42℃维持2h,升华干燥温度-16℃维持37h,解析干燥温度20℃维持5h)获得菌粉原粉。同时,控制冻干条件不变,将发酵液直接离心后冷冻干燥作为对照。
通过涂布计数可知,不加冻干保护剂冻干后的菌数为1.0×1011CFU/g,而加入冻干保护剂后其冻干菌数为4.0×1011CFU/g,与不加保护剂相比,加入冻干保护剂后可以使冻干过程中菌体的成活率提升至原来的4倍。
取适量菌粉进行幽门螺旋杆菌抑制效果试验和胃酸及胆盐耐受性试验,试验结果显示,加入冻干保护剂后,不影响嗜热链球菌FP13-03菌株对幽门螺旋杆菌的抑制作用,甚至在加入冻干保护剂后,嗜热链球菌FP130-03菌株对胃酸及胆盐的耐受性均略有增强。
将冻干过程中加入冻干保护剂的产品置于冷库中保藏12个月后,其有效活菌数的衰退率为5.7%,而未加冻干保护剂的产品在冷库中保藏12个月后,其有效活菌数的衰退率为11.3%。
由此可见,在冻干过程中添加冷冻保护剂不仅能在冻干过程中保护菌体免受伤害,还能在菌剂贮藏过程中对菌剂起到保护作用。
实施例6嗜热链球菌FP13-03的临床效果验证
临床随机选择到医院就诊的,经胃镜、组织学检查及14C尿素呼气试验确诊为幽门螺旋杆菌阳性的120例患者为研究对象,在患者完全了解试验目的并且完全自愿的情况下展开试验。同时综合考虑患者的年龄、性别、病程、病情及原发疾病等因素后,将120例研究对象平均分为4组。
第一组采用铋剂四联疗法,其具体实施方式为:阿莫西林每天2次,每次1g;克拉霉素为每天2次,每次0.25g;胶体果胶铋为每天4次,每次150mg;奥美拉唑为每天2次,每次20mg。7d作为一个疗程,观察幽门螺旋杆菌的治疗情况。
第二组为饭前口服5.0×109CFU/g的嗜热链球菌FP13-03菌剂组,其具体实施方式为:首先用麦芽糊精将嗜热链球菌FP13-03菌剂稀释成5.0×109CFU/g,然后将其分装成2g/包的小包。患者在餐前1h口服1包,早晚各1包。7d作为一个疗程,观察幽门螺旋杆菌的治疗情况。
第三组为饭后口服5.0×109CFU/g的嗜热链球菌FP13-03菌剂组,其具体实施方式为:首先用麦芽糊精将嗜热链球菌FP13-03菌剂稀释成5.0×109CFU/g,然后将其分装成2g/包的小包。患者在餐后1h口服1包,早晚各1包。7d作为一个疗程,观察幽门螺旋杆菌的治疗情况。
第四组为饭后口服1.0×1010CFU/g的嗜热链球菌FP13-03菌剂组,其具体实施方式为:首先用麦芽糊精将嗜热链球菌FP13-03菌剂稀释成1.0×1010CFU/g,然后将其分装成2g/包的小包。患者在餐后1h口服1包,早晚各1包。7d作为一个疗程,观察幽门螺旋杆菌的治疗情况。
本发明中的治愈标准为:临床症状、体征全部消失,胃镜、组织学检查及14C尿素呼气试验均Hp阴性,且在转阴性后3个月内没有复发和再感染的症状。
试验过程中不同组别对幽门螺旋杆菌的累计治愈率如下表6所示。
表6幽门螺旋杆菌累计治愈率(单位:%)
组别 | 第一疗程 | 第二疗程 | 第三疗程 | 第四疗程 |
第一组 | 20.0 | 40.0 | 66.7 | 90.0 |
第二组 | 23.3 | 46.7 | 76.7 | 96.7 |
第三组 | 26.7 | 63.3 | 90.0 | 100.0 |
第四组 | 33.3 | 70.0 | 93.3 | 100.0 |
由上表6分析可知,嗜热链球菌FP13-03菌剂在清除患者体内的幽门螺旋杆菌方面要优于铋剂四联疗法,其主要表现在嗜热链球菌FP13-03菌剂不仅作用迅速,而且根除率高。从产品的应用方式来看,饭后服用比饭前服用的作用效果要好;从产品所含菌数来看,增加该菌剂的菌数对幽门螺旋杆菌的治疗效果影响不大。因此,可将含5.0×109CFU/g的嗜热链球菌FP13-03的产品作为治疗菌剂,并于饭后1h口服2g,每天服用2次,作为该产品治疗幽门螺旋杆菌的标准用法。
试验过程中不同组别不良反应的出现情况如下表7所示。
表7不良反应总发生率(单位:%)
组别 | 腹痛腹泻 | 恶心呕吐 | 头疼头晕 | 失眠乏力 |
第一组 | 33.3 | 36.7 | 30.0 | 43.3 |
第二组 | 10.0 | 13.3 | 10.0 | 10.0 |
第三组 | 6.7 | 3.3 | 3.3 | 3.3 |
第四组 | 3.3 | 3.3 | 3.3 | 3.3 |
由上表可知,服用含嗜热链球菌FP13-03的产品能够明显降低治疗过程中不良反应的发生率;并且从不良反应的发生率可以看出,饭前服用的效果不如饭后服用的效果好,并且随着产品中活菌数的增加,其不良反应的发生率未发生明显的改变。此外,在疗程结束后,所有受试对象均没有出现过敏等类似症状,这表明本发明的菌剂是安全的,不存在毒副作用。
综上,含嗜热链球菌FP13-03的产品在治疗幽门螺旋杆菌感染时不仅疗效好而且能最大限度的减少不良反应的发生,因此该菌剂在治疗幽门螺旋杆菌感染方面具有广阔的应用前景。
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述,但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下,本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换,而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种对幽门螺旋杆菌有抑制作用的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)FP13-03,其特征在于,已于2022年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为CGMCC No.25311。
2.一种如权利要求1所述的嗜热链球菌FP13-03在制备对幽门螺旋杆菌有抑制作用的产品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,将嗜热链球菌FP13-03的发酵液冻干得到嗜热链球菌菌粉。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,冻干过程分两阶段加入冻干保护剂,其中在菌株发酵后、离心前向发酵液中加入无菌的麦芽糊精;在离心结束后,向菌泥乳浊液中依次加入低聚异麦芽糖、甘露醇和脱脂奶粉。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,以发酵液体积计,麦芽糊精的终浓度为2g/L。
6.如权利要求4所述的应用,其特征在于,以发酵液体积计,低聚异麦芽糖的终浓度为1.15g/L,甘露醇的终浓度为1.15g/L,脱脂奶粉的终浓度为3g/L。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于,嗜热链球菌菌粉中FP13-03的活菌数为4.0×1011CFU/g。
8.如权利要求2所述的应用,其特征在于,产品中嗜热链球菌FP13-03的活菌数为5.0×109CFU/g或1.0×1010CFU/g。
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