CN116098289A - 含dha的米糠基载体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种含DHA的米糠基载体的制备方法，包括以下步骤：S10、将米糠研磨并过筛后，浸泡，得到米糠混合液。S20、将所述米糠混合液打浆并均质后，抽滤得到滤液；S30、向所述滤液中加入纤维素酶和果胶酶酶解后，离心得到上层奶油膏状物质；S40、将所述上层奶油膏状物质洗涤并冻干，得到米糠油基；S50、将所述米糠油基溶于水形成水相，将含DHA的鱼油溶于油中形成油相，将所述水相和所述油相混匀，得到初乳；S60、将所述初乳旋蒸、均质并静置后，得到含DHA的米糠基载体。以米糠中的天然成分作为载体的稳定剂，避免了合成类乳化剂的使用，拓宽了米糠资源的应用范围。制备流程不繁琐，有机溶剂残留较少，天然环保。
Description
技术领域
本发明涉及食品技术领域，特别涉及一种含DHA的米糠基载体的制备方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)是一种主要从鱼油中提取的ω-3型多不饱和脂肪酸。DHA主要存在于动物的甘油磷脂中，在人体中多存在于视网膜和大脑皮层，在体内代谢过程中可由α-亚麻酸生成，但生成量较低，主要通过食物补充。研究表明，DHA具有众多益生功能，包括促进脑神经细胞发育、降血脂、延缓衰老、增强记忆功能等,引起了众多学者及研究人员的广泛关注。然而，DHA作为不饱和脂肪酸，其基团上共有6个双键，这使得DHA不稳定，极易被氧化。同时，光、热、pH等因素也会对DHA的性质造成影响，使得其生理活性下降。这些缺陷极大限制了DHA的应用。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种含DHA的米糠基载体的制备方法，旨在制备一种含DHA的米糠基载体，提高DHA的生物利用度。
为实现上述目的，本发明提出一种含DHA的米糠基载体的制备方法，包括以下步骤：
S10、将米糠研磨并过筛后，浸泡，得到米糠混合液。
S20、将所述米糠混合液打浆并均质后，抽滤得到滤液；
S30、向所述滤液中加入纤维素酶和果胶酶酶解后，离心得到上层奶油膏状物质；
S40、将所述上层奶油膏状物质洗涤并冻干，得到米糠油基；
S50、将所述米糠油基溶于水形成水相，将含DHA的鱼油溶于油中形成油相，将所述水相和所述油相混匀，得到初乳；
S60、将所述初乳旋蒸、均质并静置后，得到含DHA的米糠基载体。
可选地，步骤S10包括：
将米糠研磨并过筛后，加入磷酸缓冲液浸泡，得到米糠混合液。
可选地，在步骤S20中，所述均质的转速为3500～10500rpm。
可选地，在步骤S30中，所述纤维素酶和果胶酶的质量之和为所述滤液质量的1％～3％。
可选地，在步骤S30中，所述酶解的时间为2～6h。
可选地，在步骤S30中，所述酶解的温度为40～60℃。
可选地，步骤S40包括：
S41、将所述上层奶油膏状物质用洗涤液洗涤后，离心收集上层物质，所述洗涤液包括中链甘油三酯、葡萄糖和氯化钾；
S42、将所述上层物质冻干，得到米糠油基。
可选地，在步骤S40中，所述冻干的温度为-60℃～-40℃。
可选地，在步骤S50中，所述水相和所述油相的质量之比为90:10～95:5。
可选地，在步骤S60中，
所述均质的功率为240～600w；和/或，
所述均质的时间为5～10min。
本发明提供的技术方案中，制备一种含DHA的米糠基载体，提高DHA的生物利用度。利用米糠中的天然成分代替传统工业乳化剂作为乳液稳定剂，有助于避免工业乳化剂可能带来的致癌性和过敏反应。米糠中的部分油性固体颗粒可以在两种不相溶液体(通常用油相和水相表示)之间的界面上吸附并积累，以稳定液滴并防止液滴聚结，并表现出更稳定的性能和更低的毒性，使乳液在体内更为安全，以达到对包埋营养物的缓控释作用，提高包埋物的生物利用度。以米糠中的天然成分作为载体的稳定剂，避免了合成类乳化剂的使用，拓宽了米糠资源的应用范围。制备流程不繁琐，有机溶剂残留较少，天然环保。开发出了一种纳米级DHA型载体，为DHA鱼油在保健食品领域的应用以及DHA的吸收机制研究提供基础性依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例含DHA的米糠基载体的制备方法的流程图；
图2为本发明实施例1制得的含DHA的米糠基载体的粒径分布图；
图3为本发明实施例1制得的含DHA的米糠基载体的形态图；
图4为本发明实施例1制得的含DHA的米糠基载体的稳定性示意图；
图5为本发明实施例1制得的含DHA的米糠基载体的亮度示意图；
图6为本发明实施例1制得的含DHA的米糠基载体的细胞毒性实验结果图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)是一种主要从鱼油中提取的ω-3型多不饱和脂肪酸。DHA主要存在于动物的甘油磷脂中，在人体中多存在于视网膜和大脑皮层，在体内代谢过程中可由α-亚麻酸生成，但生成量较低，主要通过食物补充。研究表明，DHA具有众多益生功能，包括促进脑神经细胞发育、降血脂、延缓衰老、增强记忆功能等,引起了众多学者及研究人员的广泛关注。然而，DHA作为不饱和脂肪酸，其基团上共有6个双键，这使得DHA不稳定，极易被氧化。同时，光、热、pH等因素也会对DHA的性质造成影响，使得其生理活性下降。这些缺陷极大限制了DHA的应用。
鉴于此，本发明提出一种含DHA的米糠基载体的制备方法，旨在制备一种含DHA的米糠基载体，提高DHA的生物利用度。
请参阅图1，本发明提出的含DHA的米糠基载体的制备方法，包括以下步骤：
S10、将米糠研磨并过筛后，浸泡，得到米糠混合液。
优选地，步骤S10包括：
将米糠研磨并过筛后，加入磷酸缓冲液浸泡，得到米糠混合液。
具体操作时，研磨：将米糠用磨粉机进行磨粉，使其颗粒变小，粒度均匀。
过筛：将经磨粉后的米糠过60目筛(孔径0.15mm)，去除米糠中的杂质、碎米等组分。
浸泡：向过筛后的米糠按1:10的料液比加入磷酸缓冲液(phosphate bufferedsaline,PBS,pH＝7.0),维持米糠体系中组分的pH稳定性，混匀后浸泡过夜。
S20、将所述米糠混合液打浆并均质后，抽滤得到滤液。
在本发明实施例中，具体操作时，打浆：将米糠混合液倒入打浆机中进行打浆，破坏米糠的细胞壁与纤维层，使其内源物释放出来。打浆机的功率设置为1500w，工作时间为1.5min。
均质：将磨浆后的米糠液转移至500mL烧杯中，使用均质机对米糠液进行均质，进一步破坏米糠的植物性组织，充分释放内源性成分。均质机的工作速率3500～10500rpm，最优方案为7000rpm，下同，工作时间为5min。
抽滤：将均质后的米糠液使用抽滤机进行抽滤，定性滤纸规格为12.5cm，收集下层滤液备用。
S30、向所述滤液中加入纤维素酶和果胶酶酶解后，离心得到上层奶油膏状物质。
在本发明实施例中，具体操作时，酶解：将收集到的滤液转移至500mL烧杯中，调节组分pH至4，向其中加入纤维素酶和果胶酶(纤维素酶和果胶酶的质量比1:1，所述纤维素酶和果胶酶的质量之和为所述滤液质量的1％～3％，优选为2％，)酶解的时间为2～6h，优选酶解4h，酶解温度为40～60℃。优选为55℃。
离心：将酶解完毕的米糠液使用冷冻离心机离心，离心温度为4℃，离心时间为30min，离心功率为10000rpm。离心完毕后收集离心管上层奶油膏状物质。
S40、将所述上层奶油膏状物质洗涤并冻干，得到米糠油基。
优选地，步骤S40包括：
S41、将所述上层奶油膏状物质用洗涤液洗涤后，离心收集上层物质，所述洗涤液包括中链甘油三酯、葡萄糖和氯化钾；
S42、将所述上层物质冻干，得到米糠油基。
优选地，在步骤S40中，所述冻干的温度为-60℃～-40℃。
具体操作时，洗涤：向收集的奶油膏状物质按料液比1:1加入PBS(含0.1％中链甘油三酯，0.6mol/L葡萄糖，0.5mol/L氯化钾，pH＝7.0)充分洗涤。之后继续冷冻离心，收集离心管上层奶油膏状物质。离心洗涤步骤重复3次，之后收集洗涤后的奶油膏状物质，向其中加入0.1％的NaN3，防止染菌。
冻干：将奶油膏状物质置于冷冻干燥机中冻干，工作温度为-60～-40℃，冻干时间为3天。冻干完毕后收集油状黏性固体颗粒，即为米糠油基。
S50、将所述米糠油基溶于水形成水相，将含DHA的鱼油溶于油中形成油相，将所述水相和所述油相混匀，得到初乳。
优选地，在步骤S50中，所述水相和所述油相的质量之比为90:10～95:5。
具体地，油相溶解：将鱼油(含12％的DHA)溶解于正己烷中，混合均匀，形成油相。
初乳制备：将米糠油基用水溶解，稀释成质量分数为2％的溶液，于高速分散机中混合均匀形成水相，高速分散机的功率为3500rpm/min,工作时间为5min。将水相置于超声波提取机中，并逐滴向水相中缓慢加入含DHA的油相(水油质量比为90:10～95:5，优选地，水：油＝92:8)，在超声波处理的条件下使其混合均匀，形成初乳。
S60、将所述初乳旋蒸、均质并静置后，得到含DHA的米糠基载体。
优选地，在步骤S60中，
所述均质的功率为240～600w；和/或，
所述均质的时间为5～10min。
具体地，旋蒸：将制备好的初乳转移至旋转蒸发仪蒸发瓶中，通过旋转蒸发操作除去体系中的正己烷，使载体乳液进一步浓缩。旋蒸温度为60℃，转速为100rpm。
均质：将浓缩好的载体置于细胞破碎仪中进一步均质剪切。均质剪切操作于冰水浴条件下进行，以确保DHA的稳定。破碎仪的功率优选为480w(功率范围为240～600w)，工作时间优选为7min(工作时间为5～10min)，探头型号为12，处理样品量>12mL，工作间隔时间设定为1s。破碎仪工作阶段时刻注意外层冰水浴的温度，若温度高于40℃即换新冰水浴。
冷却静置：将乳化完毕的载体乳液于25℃水浴条件下静置冷却至室温。
成品：制备完毕的载体均一稳定，具有一定的黏性，该乳液呈乳白色，含有一定的DHA气味，泡沫较少或基本没有。
米糠是稻谷先经初加工得到糙米后，再经一系列碾白操作后得到的碾下物。米糠通常由种皮、果皮、糊粉层、外胚乳等组成，并常混有大米胚芽和碎米，是稻谷加工的主要副产品。米糠产量约占稻谷总量的6％，而营养成分可占稻谷营养的60％左右，包括蛋白质、膳食纤维、碳水化合物、脂肪等。但米糠在加工过程中会混进少量的稻壳和一定量的灰尘和微生物，不适宜于直接作为食品原料。长期以来，我国把米糠主要作为畜禽饲料，用于鸡、猪、鸭、鹅、水产等饲养，限制了米糠在其他产业的发展。
纳米载体是将营养物或药物输送到机体环境中或特定靶组织的传递***，是人们目前关注的热点之一。许多脂溶性物质稳定性低、气味差，导致营养成分难以充分利用。纳米乳液是纳米载体的其中一类，乳液可以通过小分子乳化剂和一些大分子物质来稳定油水界面，故常被应用于生物制药、药物输送、食品产业、精细化工和化妆品等诸多领域，在包载营养物质的同时也可以稳定其性质，更好的发挥营养及生理学特性。
部分植物和动物成分是天然乳液稳定剂的基本来源，因为它们的可自然降解、良好的生态效益、在自然界中易获得且对健康无害等性质使其作为食品天然乳液稳定剂具有很大的优势。
本发明提供的技术方案中，制备一种含DHA的米糠基载体，提高DHA的生物利用度。利用米糠中的天然成分代替传统工业乳化剂作为乳液稳定剂，有助于避免工业乳化剂可能带来的致癌性和过敏反应。米糠中的部分油性固体颗粒可以在两种不相溶液体(通常用油相和水相表示)之间的界面上吸附并积累，以稳定液滴并防止液滴聚结，并表现出更稳定的性能和更低的毒性，使乳液在体内更为安全，以达到对包埋营养物的缓控释作用，提高包埋物的生物利用度。以米糠中的天然成分作为载体的稳定剂，避免了合成类乳化剂的使用，拓宽了米糠资源的应用范围。制备流程不繁琐，有机溶剂残留较少，天然环保。开发出了一种纳米级DHA型载体，为DHA鱼油在保健食品领域的应用以及DHA的吸收机制研究提供基础性依据。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
研磨：将米糠用磨粉机进行磨粉，使其颗粒变小，粒度均匀。
过筛：将经磨粉后的米糠过60目筛(孔径0.15mm)，去除米糠中的杂质、碎米等组分。
浸泡：向过筛后的米糠按1:10的料液比加入磷酸缓冲液(phosphate bufferedsaline,PBS,pH＝7.0),维持米糠体系中组分的pH稳定性，混匀后浸泡过夜。
打浆：将米糠混合液倒入打浆机中进行打浆，破坏米糠的细胞壁与纤维层，使其内源物释放出来。打浆机的功率设置为1500w，工作时间为1.5min。
均质：将磨浆后的米糠液转移至500mL烧杯中，使用均质机对米糠液进行均质，进一步破坏米糠的植物性组织，充分释放内源性成分。均质机的工作速率为7000rpm，下同，工作时间为5min。
抽滤：将均质后的米糠液使用抽滤机进行抽滤，定性滤纸规格为12.5cm，收集下层滤液备用。
酶解：将收集到的滤液转移至500mL烧杯中，调节组分pH至4，向其中加入纤维素酶和果胶酶(纤维素酶和果胶酶的质量比1:1，所述纤维素酶和果胶酶的质量之和为所述滤液质量的2％，)酶解的时间为4h，酶解温度为55℃。
离心：将酶解完毕的米糠液使用冷冻离心机离心，离心温度为4℃，离心时间为30min，离心功率为10000rpm。离心完毕后收集离心管上层奶油膏状物质。
洗涤：向收集的奶油膏状物质按料液比1:1加入PBS(含0.1％中链甘油三酯，0.6mol/L葡萄糖，0.5mol/L氯化钾，pH＝7.0)充分洗涤。之后继续冷冻离心，收集离心管上层奶油膏状物质。离心洗涤步骤重复3次，之后收集洗涤后的奶油膏状物质，向其中加入0.1％的NaN3，防止染菌。
冻干：将奶油膏状物质置于冷冻干燥机中冻干，工作温度为-50℃，冻干时间为3天。冻干完毕后收集油状黏性固体颗粒，即为米糠油基。
油相溶解：将鱼油(含12％的DHA)溶解于正己烷中，混合均匀，形成油相。
初乳制备：将米糠油基用水溶解，稀释成质量分数为2％的溶液，于高速分散机中混合均匀形成水相，高速分散机的功率为3500rpm/min,工作时间为5min。将水相置于超声波提取机中，并逐滴向水相中缓慢加入含DHA的油相(水油质量比为，水：油＝92:8)，在超声波处理的条件下使其混合均匀，形成初乳。
旋蒸：将制备好的初乳转移至旋转蒸发仪蒸发瓶中，通过旋转蒸发操作除去体系中的正己烷，使载体乳液进一步浓缩。旋蒸温度为60℃，转速为100rpm。
均质：将浓缩好的载体置于细胞破碎仪中进一步均质剪切。均质剪切操作于冰水浴条件下进行，以确保DHA的稳定。破碎仪的功率为480w，工作时间为7min，探头型号为12，处理样品量>12mL，工作间隔时间设定为1s。破碎仪工作阶段时刻注意外层冰水浴的温度，若温度高于40℃即换新冰水浴。
冷却静置：将乳化完毕的载体乳液于25℃水浴条件下静置冷却至室温。
成品：制备完毕的载体均一稳定，具有一定的黏性，该乳液呈乳白色，含有一定的DHA气味，泡沫较少或基本没有。
实施例2
研磨：将米糠用磨粉机进行磨粉，使其颗粒变小，粒度均匀。
过筛：将经磨粉后的米糠过60目筛(孔径0.15mm)，去除米糠中的杂质、碎米等组分。
浸泡：向过筛后的米糠按1:10的料液比加入磷酸缓冲液(phosphate bufferedsaline,PBS,pH＝7.0),维持米糠体系中组分的pH稳定性，混匀后浸泡过夜。
打浆：将米糠混合液倒入打浆机中进行打浆，破坏米糠的细胞壁与纤维层，使其内源物释放出来。打浆机的功率设置为1500w，工作时间为1.5min。
均质：将磨浆后的米糠液转移至500mL烧杯中，使用均质机对米糠液进行均质，进一步破坏米糠的植物性组织，充分释放内源性成分。均质机的工作速率3500rpm，下同，工作时间为5min。
抽滤：将均质后的米糠液使用抽滤机进行抽滤，定性滤纸规格为12.5cm，收集下层滤液备用。
酶解：将收集到的滤液转移至500mL烧杯中，调节组分pH至4，向其中加入纤维素酶和果胶酶(纤维素酶和果胶酶的质量比1:1，所述纤维素酶和果胶酶的质量之和为所述滤液质量的1％)酶解的时间为2h，酶解温度为40℃。
离心：将酶解完毕的米糠液使用冷冻离心机离心，离心温度为4℃，离心时间为30min，离心功率为10000rpm。离心完毕后收集离心管上层奶油膏状物质。
洗涤：向收集的奶油膏状物质按料液比1:1加入PBS(含0.1％中链甘油三酯，0.6mol/L葡萄糖，0.5mol/L氯化钾，pH＝7.0)充分洗涤。之后继续冷冻离心，收集离心管上层奶油膏状物质。离心洗涤步骤重复3次，之后收集洗涤后的奶油膏状物质，向其中加入0.1％的NaN3，防止染菌。
冻干：将奶油膏状物质置于冷冻干燥机中冻干，工作温度为-60℃，冻干时间为3天。冻干完毕后收集油状黏性固体颗粒，即为米糠油基。
油相溶解：将鱼油(含12％的DHA)溶解于正己烷中，混合均匀，形成油相。
初乳制备：将米糠油基用水溶解，稀释成质量分数为2％的溶液，于高速分散机中混合均匀形成水相，高速分散机的功率为3500rpm/min,工作时间为5min。将水相置于超声波提取机中，并逐滴向水相中缓慢加入含DHA的油相(水油质量比为90:10)，在超声波处理的条件下使其混合均匀，形成初乳。
旋蒸：将制备好的初乳转移至旋转蒸发仪蒸发瓶中，通过旋转蒸发操作除去体系中的正己烷，使载体乳液进一步浓缩。旋蒸温度为60℃，转速为100rpm。
均质：将浓缩好的载体置于细胞破碎仪中进一步均质剪切。均质剪切操作于冰水浴条件下进行，以确保DHA的稳定。破碎仪的功率为240w，工作时间为5min，探头型号为12，处理样品量>12mL，工作间隔时间设定为1s。破碎仪工作阶段时刻注意外层冰水浴的温度，若温度高于40℃即换新冰水浴。
冷却静置：将乳化完毕的载体乳液于25℃水浴条件下静置冷却至室温。
成品：制备完毕的载体均一稳定，具有一定的黏性，该乳液呈乳白色，含有一定的DHA气味，泡沫较少或基本没有。
实施例3
研磨：将米糠用磨粉机进行磨粉，使其颗粒变小，粒度均匀。
过筛：将经磨粉后的米糠过60目筛(孔径0.15mm)，去除米糠中的杂质、碎米等组分。
浸泡：向过筛后的米糠按1:10的料液比加入磷酸缓冲液(phosphate bufferedsaline,PBS,pH＝7.0),维持米糠体系中组分的pH稳定性，混匀后浸泡过夜。
打浆：将米糠混合液倒入打浆机中进行打浆，破坏米糠的细胞壁与纤维层，使其内源物释放出来。打浆机的功率设置为1500w，工作时间为1.5min。
均质：将磨浆后的米糠液转移至500mL烧杯中，使用均质机对米糠液进行均质，进一步破坏米糠的植物性组织，充分释放内源性成分。均质机的工作速率10500rpm，下同，工作时间为5min。
抽滤：将均质后的米糠液使用抽滤机进行抽滤，定性滤纸规格为12.5cm，收集下层滤液备用。
酶解：将收集到的滤液转移至500mL烧杯中，调节组分pH至4，向其中加入纤维素酶和果胶酶(纤维素酶和果胶酶的质量比1:1，所述纤维素酶和果胶酶的质量之和为所述滤液质量的3％)酶解的时间为6h，酶解温度为60℃。
离心：将酶解完毕的米糠液使用冷冻离心机离心，离心温度为4℃，离心时间为30min，离心功率为10000rpm。离心完毕后收集离心管上层奶油膏状物质。
洗涤：向收集的奶油膏状物质按料液比1:1加入PBS(含0.1％中链甘油三酯，0.6mol/L葡萄糖，0.5mol/L氯化钾，pH＝7.0)充分洗涤。之后继续冷冻离心，收集离心管上层奶油膏状物质。离心洗涤步骤重复3次，之后收集洗涤后的奶油膏状物质，向其中加入0.1％的NaN3，防止染菌。
冻干：将奶油膏状物质置于冷冻干燥机中冻干，工作温度为-40℃，冻干时间为3天。冻干完毕后收集油状黏性固体颗粒，即为米糠油基。
油相溶解：将鱼油(含12％的DHA)溶解于正己烷中，混合均匀，形成油相。
初乳制备：将米糠油基用水溶解，稀释成质量分数为2％的溶液，于高速分散机中混合均匀形成水相，高速分散机的功率为3500rpm/min,工作时间为5min。将水相置于超声波提取机中，并逐滴向水相中缓慢加入含DHA的油相(水油质量比为95:5)，在超声波处理的条件下使其混合均匀，形成初乳。
旋蒸：将制备好的初乳转移至旋转蒸发仪蒸发瓶中，通过旋转蒸发操作除去体系中的正己烷，使载体乳液进一步浓缩。旋蒸温度为60℃，转速为100rpm。
均质：将浓缩好的载体置于细胞破碎仪中进一步均质剪切。均质剪切操作于冰水浴条件下进行，以确保DHA的稳定。破碎仪的功率为600w，工作时间为10min，探头型号为12，处理样品量>12mL，工作间隔时间设定为1s。破碎仪工作阶段时刻注意外层冰水浴的温度，若温度高于40℃即换新冰水浴。
冷却静置：将乳化完毕的载体乳液于25℃水浴条件下静置冷却至室温。
成品：制备完毕的载体均一稳定，具有一定的黏性，该乳液呈乳白色，含有一定的DHA气味，泡沫较少或基本没有。
实施例4
研磨：将米糠用磨粉机进行磨粉，使其颗粒变小，粒度均匀。
过筛：将经磨粉后的米糠过60目筛(孔径0.15mm)，去除米糠中的杂质、碎米等组分。
浸泡：向过筛后的米糠按1:10的料液比加入磷酸缓冲液(phosphate bufferedsaline,PBS,pH＝7.0),维持米糠体系中组分的pH稳定性，混匀后浸泡过夜。
打浆：将米糠混合液倒入打浆机中进行打浆，破坏米糠的细胞壁与纤维层，使其内源物释放出来。打浆机的功率设置为1500w，工作时间为1.5min。
均质：将磨浆后的米糠液转移至500mL烧杯中，使用均质机对米糠液进行均质，进一步破坏米糠的植物性组织，充分释放内源性成分。均质机的工作速率5000rpm，下同，工作时间为5min。
抽滤：将均质后的米糠液使用抽滤机进行抽滤，定性滤纸规格为12.5cm，收集下层滤液备用。
酶解：将收集到的滤液转移至500mL烧杯中，调节组分pH至4，向其中加入纤维素酶和果胶酶(纤维素酶和果胶酶的质量比1:1，所述纤维素酶和果胶酶的质量之和为所述滤液质量的2％，)酶解的时间为2～6h，优选酶解4h，酶解温度为50℃。
离心：将酶解完毕的米糠液使用冷冻离心机离心，离心温度为4℃，离心时间为30min，离心功率为10000rpm。离心完毕后收集离心管上层奶油膏状物质。
洗涤：向收集的奶油膏状物质按料液比1:1加入PBS(含0.1％中链甘油三酯，0.6mol/L葡萄糖，0.5mol/L氯化钾，pH＝7.0)充分洗涤。之后继续冷冻离心，收集离心管上层奶油膏状物质。离心洗涤步骤重复3次，之后收集洗涤后的奶油膏状物质，向其中加入0.1％的NaN3，防止染菌。
冻干：将奶油膏状物质置于冷冻干燥机中冻干，工作温度为-40℃，冻干时间为3天。冻干完毕后收集油状黏性固体颗粒，即为米糠油基。
油相溶解：将鱼油(含12％的DHA)溶解于正己烷中，混合均匀，形成油相。
初乳制备：将米糠油基用水溶解，稀释成质量分数为2％的溶液，于高速分散机中混合均匀形成水相，高速分散机的功率为3500rpm/min,工作时间为5min。将水相置于超声波提取机中，并逐滴向水相中缓慢加入含DHA的油相(水油质量比为90:10)，在超声波处理的条件下使其混合均匀，形成初乳。
旋蒸：将制备好的初乳转移至旋转蒸发仪蒸发瓶中，通过旋转蒸发操作除去体系中的正己烷，使载体乳液进一步浓缩。旋蒸温度为60℃，转速为100rpm。
均质：将浓缩好的载体置于细胞破碎仪中进一步均质剪切。均质剪切操作于冰水浴条件下进行，以确保DHA的稳定。破碎仪的功率为500w，工作时间优选为8min，探头型号为12，处理样品量>12mL，工作间隔时间设定为1s。破碎仪工作阶段时刻注意外层冰水浴的温度，若温度高于40℃即换新冰水浴。
冷却静置：将乳化完毕的载体乳液于25℃水浴条件下静置冷却至室温。
成品：制备完毕的载体均一稳定，具有一定的黏性，该乳液呈乳白色，含有一定的DHA气味，泡沫较少或基本没有。
以实施例1为例说明本发明制得的含DHA的米糠基载体的有益效果，将实施例1得到的含DHA的米糠基载体进行如下操作：
1、采用马尔文激光粒度仪对载体的粒径进行了表征，结果如图2所示。
由图1可知，含DHA的米糠基载体的粒径分布图中只有一个单峰，大约在300nm附近，且并未出现其他峰，表明所制备的含DHA的米糠基载体粒径较小，在油水体系中分布均匀。
2、采用光学显微镜对于载体的形态进行了观察，结果如图3所示。
如图3所示，含DHA的米糠基载体乳液稳定一致，呈乳白色。在光学显微镜下，含DHA的米糠基载体呈圆形，在体系中的液滴大小基本一致，表明制备的含DHA的米糠基载体在乳液中分布均匀，这与粒径的结果一致。
3、采用稳定性分析仪对于载体的稳定性进行了分析，结果如图4所示。
含DHA的米糠基载体的稳定性以Turbiscan稳定性指数(Turbiscan stabilityindex,TSI)表示,TSI值越大，代表载体乳液体系越不稳定。图4中表示了含DHA的米糠基载体在室温条件下放置三小时的TSI值变化情况，可以看出，三小时放置后含DHA的米糠基载体乳液的TSI值为1.98，表明该含DHA的米糠基载体具有良好的稳定性。
4、采用色差仪对于乳液的色差进行了测定，结果如图5所示。
色差仪的测定结果用L、a、b值表示，代表物体颜色的色度值，也就是该颜色的色空间坐标。L值代表明暗度(黑白)，a值代表红绿色，b值代表黄蓝色。其中，L是正值，说明样品比标准板偏亮；如果是负值，说明偏暗；a值如果显示是正值，说明样板比标准偏红，如果负值，说明偏绿；b值如果是正值，说明样板比标准偏黄，如果负值，说明偏蓝。由图5可知，制备好的含DHA的米糠基载体具有更高的亮度，同时相比于色差仪的标准测试条件，颜色趋向于绿色和蓝色。由于鱼油为黄色，该结果表明了DHA已被成功载入乳液中；制备好的含DHA的米糠基载体偏白，具有更优的感官特性。
5、将新制备好的含DHA的米糠基载体稀释成不同浓度，并添加至对数生长期的HepG-2肝癌细胞中，观察含DHA的米糠基载体对于细胞毒性的影响，结果如图6所示。
如图6所示，随着含DHA的米糠基载体浓度的增加，HepG-2细胞的存活率呈现下降趋势。ω-3型脂肪酸及其衍生物会刺激肿瘤细胞，引起肿瘤细胞内的氧化应激，诱导细胞凋亡。该结论表明以米糠油基为载体包埋DHA可以充分发挥DHA的抗癌效果，提高DHA的生物利用度。
综上可知，本发明制备的含DHA的米糠基载体，提高DHA的生物利用度。利用米糠中的天然成分代替传统工业乳化剂作为乳液稳定剂，有助于避免工业乳化剂可能带来的致癌性和过敏反应。米糠中的部分油性固体颗粒可以在两种不相溶液体(通常用油相和水相表示)之间的界面上吸附并积累，以稳定液滴并防止液滴聚结，并表现出更稳定的性能和更低的毒性，使乳液在体内更为安全，以达到对包埋营养物的缓控释作用，提高包埋物的生物利用度。以米糠中的天然成分作为载体的稳定剂，避免了合成类乳化剂的使用，拓宽了米糠资源的应用范围。制备流程不繁琐，有机溶剂残留较少，天然环保。开发出了一种纳米级DHA型载体，为DHA鱼油在保健食品领域的应用以及DHA的吸收机制研究提供基础性依据。
以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S10、将米糠研磨并过筛后，浸泡，得到米糠混合液；
S20、将所述米糠混合液打浆并均质后，抽滤得到滤液；
S30、向所述滤液中加入纤维素酶和果胶酶酶解后，离心得到上层奶油膏状物质；
S40、将所述上层奶油膏状物质洗涤并冻干，得到米糠油基；
S50、将所述米糠油基溶于水形成水相，将含DHA的鱼油溶于油中形成油相，将所述水相和所述油相混匀，得到初乳；
S60、将所述初乳旋蒸、均质并静置后，得到含DHA的米糠基载体。
2.如权利要求1所述的含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，步骤S10包括：
将米糠研磨并过筛后，加入磷酸缓冲液浸泡，得到米糠混合液。
3.如权利要求1所述的含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，在步骤S20中，所述均质的转速为3500～10500rpm。
4.如权利要求1所述的含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，在步骤S30中，所述纤维素酶和果胶酶的质量之和为所述滤液质量的1％～3％。
5.如权利要求1所述的含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，在步骤S30中，所述酶解的时间为2～6h。
6.如权利要求1所述的含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，在步骤S30中，所述酶解的温度为40～60℃。
7.如权利要求1所述的含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，步骤S40包括：
S41、将所述上层奶油膏状物质用洗涤液洗涤后，离心收集上层物质，所述洗涤液包括中链甘油三酯、葡萄糖和氯化钾；
S42、将所述上层物质冻干，得到米糠油基。
8.如权利要求1所述的含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，在步骤S40中，所述冻干的温度为-60℃～-40℃。
9.如权利要求1所述的含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，在步骤S50中，所述水相和所述油相的质量之比为90:10～95:5。
10.如权利要求1所述的含DHA的米糠基载体的制备方法，其特征在于，在步骤S60中，
所述均质的功率为240～600w；和/或，
所述均质的时间为5～10min。
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