CN116096378A - 视网膜变性疾病的治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗或改善有需要的受试者的视网膜变性疾病或病症的方法。在本文所述的一些实施例中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的视黄酸诱导基因I(RIG‑I)抑制剂。

Description

视网膜变性疾病的治疗
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年8月10日提交的美国专利申请号63/063,877的权益，出于所有目的，将其通过援引以其全文并入本文。
序列表
本申请包含按ASCII格式以电子方式提交并且通过援引以其全文特此并入的序列表。所述ASCII副本创建于2021年8月5日，名称为PAT058930-WO-PCT_SL.txt并且大小为21,554字节。
技术领域
本披露涉及通过施用视黄酸诱导基因I(RIG-I)抑制剂来治疗或预防受试者的视网膜变性疾病或病症的方法。本披露还涉及通过施用RIG-I抑制剂来改善受试者视力的方法。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(AMD)是美国和全世界老年人致盲的最常见原因(1)。尽管有针对湿性AMD的抗血管生成药物，但到目前为止，还没有美国食品和药物管理局(FDA)批准的针对中度AMD或地图状萎缩(GA)的治疗方法。
视网膜色素上皮(RPE)包括维持视力所必需的独特上皮细胞。RPE在其顶端侧与光感受器相互作用，在其底侧与布鲁赫膜(Bruch's membrane)和绒毛膜毛细血管相互作用。RPE的损伤与AMD的发病机制有关。衰老和其他累积的遗传和环境风险因素可能导致RPE功能障碍，最终导致细胞死亡，这是AMD的主要病理。然而，导致RPE退化的细胞机制尚不清楚。
慢性炎症事件，例如，补体、Toll样受体(TLR)、核因子κB(NFkB)、炎症小体和I型干扰素(IFN)应答，可能在AMD的发病机制和发展中发挥核心作用(2,3)。然而，促进AMD发展的炎症机制的确切分子性质仍不清楚。脉络膜视网膜界面的免疫状态主要受RPE调节，并且炎症可能同时在RPE变性中起生理作用并在AMD发展中起病理作用。I型干扰素(I型IFN)应答可能是遗传(例如，A/J小鼠)和异常代谢产物积累(例如，Alu-RNA)诱导的啮齿动物视网膜变性模型中的关键调节通路(4,5)。然而，人类患者中负责介导I型IFN应答的一种或多种细胞类型以及细胞产生和应答IFN的机制尚不完全清楚。此外，视网膜中负责I型IFN通路的主要诱导剂和传感器仍未得到确认。
因此，仍然需要开发针对视网膜障碍诸如AMD和GA的有效治疗方法。
发明内容
本披露部分基于RIG-I意外地在核酸诱导的视网膜细胞(例如，视网膜色素上皮细胞)炎症中起关键作用的发现。特别地，本披露基于RIG-I在视网膜细胞(例如，视网膜色素上皮细胞)中介导I型干扰素(例如，干扰素β)应答中起关键作用的发现。本披露还基于抑制RIG-I可提供治疗视网膜变性疾病或病症(例如，AMD或GA)的方法的发现。
因此，在本发明的一个实施例中，本文披露了用于治疗有需要的受试者的视网膜变性疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的视黄酸诱导基因I(RIG-I)抑制剂或其药物组合物。在一些实施例中，所述视网膜变性疾病或病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)。在一些实施例中，所述AMD是早期AMD。在一些实施例中，所述AMD是晚期AMD。在一些实施例中，所述AMD是地图状萎缩(GA)。在一些实施例中，所述AMD是湿性AMD或干性AMD。在一些实施例中，所述视网膜变性疾病或病症是糖尿病性黄斑水肿(DME)。在一些实施例中，所述视网膜变性疾病是异常血管生成、脉络膜新生血管形成(CNV)、视网膜血管通透性、视网膜水肿、糖尿病性视网膜病变(例如，增殖性糖尿病性视网膜病变)、新生血管性(渗出性)年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括与nAMD(新生血管性AMD)相关的CNV、与视网膜缺血、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)或后段新生血管形成相关的后遗症。
在本发明的另一个实施例中，本文披露了用于减少受试者中GA病变的进展(例如，GA病变扩大的进展)的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或其药物组合物。在一个实施例中，本文披露了用于终止受试者GA病变扩大的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或其药物组合物。在一个实施例中，本文披露了用于治疗(例如，减小大小或消除)受试者中GA病变的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或其药物组合物。
在本发明的又一个实施例中，本文披露了用于改善受试者视力的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或其药物组合物。例如，在一些实施例中，披露了用于改善视觉敏锐度、视网膜焦点或中心视力的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或其药物组合物。
在本发明的又一个实施例中，本文披露了用于抑制受试者眼睛中RPE变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或其药物组合物。
在本发明的又一个实施例中，本文披露了用于抑制受试者眼睛中RPE的跨上皮电阻损伤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或其药物组合物。
在本文所述的方法中，所述RIG-I抑制剂可以是小分子化合物、抗体(例如，RIG-I特异性抗体)、RIG-I特异性抗体的抗原结合片段、核酸分子、肽或其衍生物。例如，在本文所述的实施例中，当以治疗有效量施用时，所述RIG-I抑制剂可以是抑制RIG-I活性或RIG-I表达的小分子化合物、抗体、抗体的抗原结合片段、核酸分子或肽。例如，在一些实施例中，本文所述的RIG-I抑制剂可抑制RIG-I基因转录、RIG-I mRNA翻译、RIG-Ⅰ蛋白表达或RIG-I翻译后蛋白修饰。在一些实施例中，本文所述的RIG-I抑制剂可抑制RIG-I酶活性(例如，RIG-IRNA解旋酶活性)、RIG-I核酸传感、RIG-I核酸结合、RIG-I信号转导或RIG-I诱导干扰素表达。
在本发明的一些实施例中，施用RIG-I抑制剂包括施用包含RIG-I抑制剂和药学上可接受的赋形剂的药物配制品。因此，在一些实施例中，本文披露了治疗有需要的受试者的视网膜变性疾病或病症的方法；用于减少受试者GA病变扩大的进展的方法；用于改善受试者视力的方法；用于抑制受试者眼睛RPE变性的方法；以及用于抑制受试者眼睛RPE的跨上皮电阻损伤的方法。在任何前述实施例中，所述方法可包括向所述受试者施用药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的RIG-I抑制剂和药学上可接受的赋形剂。
在本文所述的本发明的一个实施例中，所述RIG-I抑制剂可以是siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA。例如，在本文所述的一个实施例中，所述RIG-I抑制剂是抑制RIG-I表达的siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA。在本文所述的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含与RIG-I核酸序列的一部分互补的siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA。在本文所述的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA，其中所述RIG-I抑制剂的核酸序列的一部分与RIG-I核酸序列的一部分互补。
在本文所述的本发明的一个实施例中，所述RIG-I抑制剂包含成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)***。在一些实施例中，所述CRISPR***有效地抑制RIG-I基因表达。在一些实施例中，所述CRISPR***有效地修饰RIG-I基因序列。例如，在本文所述的一个实施例中，所述RIG-I抑制剂包含RIG-I CRISPRi***。同样在本文所述的一个实施例中，所述RIG-I抑制剂包含RIG-I CRISPR-Cas9***。在所述RIG-I抑制剂包含RIG-I CRISPR***的实施例中，所述RIG-I CRISPR***可以包含sgRNA，例如与RIG-I基因序列的一部分互补的sgRNA。在一个特定实施例中，所述RIG-I CRISPR-Cas9***包含含有序列5’–ACTCACCCTCCCTAAACCAG–3’(SEQ ID NO:1)的sgRNA或其药学上可接受的盐或其衍生物。
在本文所述的本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含RIG-I siRNA(例如，有效结合RIG-I mRNA序列的一部分的siRNA)。在一些实施例中，当与RIG-I mRNA序列结合时，所述RIG-I siRNA抑制所述RIG-I mRNA序列的蛋白质翻译。在一些实施例中，当与RIG-ImRNA序列结合时，所述RIG-I siRNA介导所述RIG-I mRNA序列的降解(例如，RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的所述RIG-I mRNA序列的降解)。在一些实施例中，所述RIG-I siRNA包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：5’–AAGGGAACGATTCCATCACTA–3’(SEQ ID NO:2)、5’–TTCTACAGATTTGCTCTACTA–3’(SEQ ID NO:3)、5’–CTCCTCCTACCCGGCTTTAAA–3’(SEQ ID NO:4)和5’–CAGAATTATCCCAACCGATAT–3’(SEQ ID NO:5)，或其药学上可接受的盐。
在本发明的一些实施例中，所披露的方法包括向需要治疗的患者施用RIG-I抑制剂或其药物组合物的步骤，其中所述RIG-I抑制剂包含肽或编码所述肽的核酸分子。例如，在本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含肽或编码所述肽的核酸分子，其中所述肽选自由以下组成的组：LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro，或其衍生物。在本文所述的一个特定实施例中，所述RIG-I抑制剂包含肽序列GNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFI(SEQ ID NO:6)或其衍生物；或编码SEQ ID NO:6的肽或其衍生物的核酸分子。
在本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂进一步包含载体。例如，在本文所述的实施例中，其中所述RIG-I抑制剂包含编码RIG-I抑制剂的核酸序列(例如，编码如下的核酸序列：抗体或抗体的一部分(例如，抗体重链或抗体轻链)、RIG-I特异性抗体的抗原结合片段或其一部分、核酸分子(例如，shRNA或sgRNA)、肽(例如，SEQ ID NO:6的肽)或CRISPR***或其一部分)，所述RIG-I抑制剂可进一步包含载体。在一些实施例中，所述载体是病毒载体。例如，在一些实施例中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一些实施例中，所述载体是腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体或其衍生物。
在本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含小分子化合物。例如，在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂是选自由以下组成的组的小分子化合物：
Figure BDA0004113405700000061
Figure BDA0004113405700000062
或其药学上可接受的盐。
在本发明的一些实施例中，本文描述了方法，其中所述方法包括向受试者(例如，有需要的受试者)施用RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物的药物组合物。在本文所述的实施例中，所述施用可以通过本领域技术人员认为可接受的任何途径。例如，在本文所述的实施例中，所述RIG-I抑制剂的施用可以是但不限于口服、经皮、外部、肠胃外、注射或吸入途径。在本发明的一些实施例中，所述施用是局部施用于受试者眼睛。因此，在一些实施例中，所述施用是结膜下、玻璃体内、眼周、球后或前房内。在本发明的一些实施例中，所述施用包括使所述受试者的眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触。例如，在一些实施例中，所述施用包括使所述受试者的视网膜细胞，例如，视网膜色素上皮细胞，与所述RIG-I抑制剂接触。
在本文所述的本发明的一些实施例中，施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或其药物组合物有效地产生特定生物学结果。例如，在一些实施例中，施用治疗有效量的RIG-I抑制剂减少特定基因的表达。在一些实施例中，所述施用有效地减少受试者眼细胞中基因表达。例如，在一些实施例中，所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中干扰素刺激基因(ISG)的表达。在一些实施例中，所述施用有效地减少ISG15的表达。在一些实施例中，所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中RIG-I蛋白水平。在一些实施例中，所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中RIG-I mRNA水平。
此外，在本发明的一些实施例中，施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或其药物组合物抑制特定细胞应答。例如，在一些实施例中，所述施用有效地减少受试者眼细胞中IFN应答。在一些实施例中，所述IFN应答是I型IFN应答。因此，在一些实施例中，所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中I型干扰素的表达。在一些实施例中，所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中I型干扰素的分泌。在一些实施例中，所述I型干扰素是IFNβ。
在本发明的一些实施例中，向受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂有效地抑制所述受试者眼细胞中核酸诱导的炎症。例如，在本发明的一些实施例中，向受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂有效地抑制所述受试者眼细胞中RNA诱导的炎症。在一些实施例中，所述炎症由细胞内RNA源(例如，线粒体RNA，例如线粒体双链RNA)诱导。本文还披露了抑制受试者中核酸诱导的(例如，RNA诱导的)炎症的方法，其中所述方法包括向需要治疗的受试者施用RIG-I抑制剂。在一些实施例中，抑制核酸诱导的炎症的方法有效地抑制患者眼睛中核酸诱导的炎症。在一些实施例中，抑制核酸诱导的炎症的方法有效地抑制患者眼细胞中核酸诱导的炎症。在一些实施例中，患者眼睛中所述炎症由细胞内RNA源(例如，线粒体RNA，例如线粒体双链RNA)诱导。在一些实施例中，患者眼细胞中所述炎症由细胞内RNA源(例如，线粒体RNA，例如线粒体双链RNA)诱导。
如上所述，在本文所述的本发明的实施例中，所述方法可包括施用RIG-I抑制剂，其中所述施用包括使所述受试者眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触。此外，如上所述，在本文所述的本发明的实施例中，所述方法可包括施用RIG-I抑制剂，其中所述施用有效地：减少所述受试者眼细胞中干扰素刺激基因(ISG)的表达；减少所述受试者眼细胞中RIG-I蛋白水平；减少所述受试者眼细胞中RIG-I mRNA水平；减少所述受试者眼细胞中IFN应答；减少所述受试者眼细胞中I型干扰素的表达和/或分泌；和/或抑制所述受试者眼细胞中核酸诱导的炎症。在一些实施例中，所述眼细胞是视网膜神经节(RGC)细胞、内核层(INL)细胞、外核层(ONL)细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、脉络膜层细胞或其组合。在特定实施例中，所述眼细胞是RPE细胞。在一些实施例中，所述INL细胞是水平细胞、双极细胞、无长突细胞、丛间神经元或缪勒氏细胞。在一些实施例中，所述ONL细胞是锥形细胞、棒状细胞或感光细胞。
此外，在本发明的一些实施例中，本文所述的方法包括向受试者施用RIG-I抑制剂或其药物组合物，其中所述施用有效地抑制RPE变性(例如，所述受试者眼睛中RPE变性)。在本文所述的方法的一些实施例中，施用RIG-I抑制剂有效地抑制RPE(例如，所述受试者眼睛的RPE)的跨上皮电阻损伤。
在本发明的任何前述实施例中，所述受试者可以是人。在一些实施例中，所述受试者是非人灵长类动物、哺乳动物、家养农场动物(例如，马、牛、猪、山羊、羊)、啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、猫或狗。
在本发明的一些实施例中，本文所述的方法可以在体外(例如，在细胞培养物或组织培养物中)进行。例如，在一些实施例中，本文所述的方法可包括使眼细胞与RIG-I抑制剂接触，其中所述细胞是细胞培养物或组织培养物的细胞。在一些实施例中，本文所述的方法(例如，包括向受试者施用RIG-I抑制剂的方法)可在体内进行。
在本发明的又一方面，本文描述了用于调节细胞(例如，细胞培养物中的细胞或需要治疗的受试者中的细胞)的IFN表达或IFN应答的方法。本发明的方法可包括使所述细胞与RIG-I抑制剂接触的步骤。因此，在一些实施例中，本文披露了用于抑制眼细胞中IFN应答的方法，所述方法包括使所述细胞与RIG-I抑制剂接触。在一些实施例中，本文披露了用于抑制眼细胞中I型IFN表达的方法，所述方法包括使所述细胞与RIG-I抑制剂接触。在一些实施例中，所述I型干扰素是IFNβ。
在本发明的一些实施例中，本文披露了用于抑制眼细胞中核酸诱导的炎症(例如，RNA诱导的炎症)的方法，所述方法包括使所述细胞与RIG-I抑制剂接触。在本发明的一些实施例中，本文披露了用于抑制细胞中RIG-I表达的方法，所述方法包括使所述细胞与RIG-I抑制剂接触。
如上所述，本文所述的本发明的实施例还包括抑制眼细胞中IFN应答的方法、用于抑制眼细胞中I型IFN表达的方法、用于抑制眼细胞中核酸诱导的炎症的方法和用于抑制细胞中RIG-I表达的方法，其中所述方法包括使所述细胞(例如，视网膜细胞)与RIG-I抑制剂接触的步骤。在本发明的上述实施例中，所述眼细胞可以是视网膜神经节(RGC)细胞、内核层(INL)细胞、外核层(ONL)细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞或脉络膜层细胞。在本发明的一些实施例中，所述眼细胞是视网膜神经节(RGC)细胞、INL细胞、ONL细胞、RPE细胞或脉络膜层细胞。在一些实施例中，所述眼细胞是RPE细胞或脉络膜层细胞。在一些实施例中，所述眼细胞是RPE细胞。在一些实施例中，所述INL细胞是水平细胞、双极细胞、无长突细胞、丛间神经元或缪勒氏细胞。在一些实施例中，所述ONL细胞是锥形细胞、棒状细胞或感光细胞。
本文所述的某些实施例中是抑制眼细胞中IFN应答的方法、抑制眼细胞中I型IFN表达的方法、抑制眼细胞中核酸诱导的炎症的方法和抑制细胞中RIG-I表达的方法，其中所述方法包括使所述细胞(例如，视网膜细胞)与包含RIG-I抑制物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物接触的步骤。在本发明的上述实施例中，所述眼细胞可以是视网膜神经节(RGC)细胞、内核层(INL)细胞、外核层(ONL)细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞或脉络膜层细胞。在本发明的一些实施例中，所述眼细胞是视网膜神经节(RGC)细胞、INL细胞、ONL细胞、RPE细胞或脉络膜层细胞。在一些实施例中，所述眼细胞是RPE细胞或脉络膜层细胞。在一些实施例中，所述眼细胞是RPE细胞。在一些实施例中，所述INL细胞是水平细胞、双极细胞、无长突细胞、丛间神经元或缪勒氏细胞。在一些实施例中，所述ONL细胞是锥形细胞、棒状细胞或感光细胞。
如上所述，在本文所述的方法中，所述RIG-I抑制剂可以是小分子化合物、抗体(例如，RIG-I特异性抗体)、RIG-I特异性抗体的抗原结合片段、核酸分子、肽或其衍生物。因此，本文所述的本发明的实施例包括抑制眼细胞中IFN应答的方法、抑制眼细胞中I型IFN表达的方法、抑制眼细胞中核酸诱导的炎症的方法和抑制细胞中RIG-I表达的方法，其中所述方法包括使所述细胞(例如，视网膜细胞)与RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物接触的步骤，其中所述RIG-I抑制剂是例如小分子化合物、抗体(例如，RIG-I特异性抗体)、RIG-I特异性抗体的抗原结合片段、核酸分子、肽或其衍生物。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂是siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA。在本文所述的本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含CRISPR***，例如但不限于RIG-I CRISPRi***或RIG-I CRISPR-Cas9***。在一些实施例中，所述RIG-ICRISPR***包含sgRNA。在特定实施例中，所述RIG-I CRISPR-Cas9***包含含有序列5’–ACTCACCCTCCCTAAACCAG–3’(SEQ ID NO:1)的sgRNA或其药学上可接受的盐或其衍生物。在本文所述的本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含RIG-I siRNA，例如，包含选自由以下组成的组的核苷酸序列的RIG-I siRNA：5’–AAGGGAACGATTCCATCACTA–3’(SEQ ID NO:2)、5’–TTCTACAGATTTGCTCTACTA–3’(SEQ ID NO:3)、5’–CTCCTCCTACCCGGCTTTAAA–3’(SEQID NO:4)和5’–CAGAATTATCCCAACCGATAT–3’(SEQ ID NO:5)，或其药学上可接受的盐。在本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含肽或编码该肽的核酸分子。例如，在本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含肽或编码所述肽的核酸分子，其中所述肽选自由以下组成的组：LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro，或其衍生物。在本文所述的特定实施例中，所述RIG-I抑制剂包含肽序列GNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFI(SEQ ID NO:6)或其衍生物；或编码SEQ ID NO:6的肽或其衍生物的核酸分子。在本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂进一步包含载体，例如，病毒载体，例如，慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体、逆转录病毒载体或其衍生物。
本文所述的本发明的实施例还包括抑制眼细胞中IFN应答的方法、用于抑制眼细胞中I型IFN表达的方法、用于抑制眼细胞中核酸诱导的炎症的方法和用于抑制细胞中RIG-I表达的方法，其中所述方法包括使所述细胞(例如，视网膜细胞)与RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物接触的步骤，其中所述RIG-I抑制剂包含小分子化合物。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂是选自由以下组成的组的小分子化合物：
Figure BDA0004113405700000121
Figure BDA0004113405700000122
或其药学上可接受的盐。
在本文所述的本发明的一些实施例中，使眼细胞(例如，视网膜细胞)与RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物接触产生特定生物学结果。例如，在一些实施例中，使眼细胞与RIG-I抑制剂或其药物组合物接触减少了特定基因的眼细胞表达。例如，在一些实施例中，所述接触有效地减少所述细胞中基因表达。因此，在一些实施例中，所述接触有效地减少所述细胞中干扰素刺激基因(ISG)的表达。在一些实施例中，所述接触有效地减少ISG15的表达。在一些实施例中，所述接触有效地减少所述细胞中RIG-I蛋白水平。在一些实施例中，所述接触有效地减少所述细胞中RIG-I mRNA水平。
在本文所述的本发明的一些实施例中，使眼细胞(例如，视网膜细胞)与RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物接触产生抑制特定细胞反应。例如，在一些实施例中，所述接触有效地减少眼细胞中IFN应答信号传导。在一些实施例中，所述IFN应答信号传导包括I型IFN的表达。因此，在一些实施例中，所述接触有效地减少眼细胞中I型干扰素的表达。在一些实施例中，所述接触有效地减少眼细胞中I型干扰素的分泌。在一些实施例中，所述I型干扰素是IFNβ。
在本发明的一些实施例中，使眼细胞(例如，视网膜细胞)与RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物接触有效地抑制眼细胞中核酸诱导的炎症或炎症信号传导。例如，在本发明的一些实施例中，所述接触有效地抑制所述受试者眼细胞中RNA诱导的炎症或炎症信号传导。
在本发明的又一个方面，本文描述了用于减少受试者眼部基因疗法的毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含小分子化合物、抗体、RIG-I抗体的抗原结合片段、核酸分子、肽或其衍生物。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA。
本文描述了用于减少受试者眼部基因疗法的毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中所述RIG-I抑制剂包含CRISPR***。因此，在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含RIG-ICRISPRi***。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含RIG-ICRISPR-Cas9***。例如，在一些实施例中，所述RIG-I CRISPR-Cas9***包含含有序列5’-ACTCACCCTCCCTAAACCAG–3’(SEQ ID NO:1)的sgRNA或其衍生物。
本文还描述了用于减少受试者眼部基因疗法的毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-I siRNA。在一些实施例中，所述RIG-I siRNA包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：5’–AAGGGAACGATTCCATCACTA–3’(SEQ ID NO:2)、5’–TTCTACAGATTTGCTCTACTA–3’(SEQ ID NO:3)、5’–CTCCTCCTACCCGGCTTTAAA–3’(SEQ ID NO:4)和5’–CAGAATTATCCCAACCGATAT–3’(SEQ ID NO:5)。
本文还描述了用于减少受试者眼部基因疗法的毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中所述RIG-I抑制剂包含肽或编码所述肽的核酸分子。例如，在本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含肽或编码所述肽的核酸分子，其中所述肽选自由以下组成的组：LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro，或其衍生物。在本文所述的特定实施例中，所述RIG-I抑制剂包含：肽序列GNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFI(SEQ ID NO:6)或其衍生物；或编码包含SEQID NO:6的序列的肽或其衍生物的核酸分子。在本发明的一些实施例中，所述RIG-I抑制剂进一步包含载体，例如病毒载体，例如，慢病毒载体、腺病毒载体、AAV载体、逆转录病毒载体或其衍生物。
本文所述的本发明的实施例还包括用于减少受试者眼部基因疗法的毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制剂和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中所述RIG-I抑制剂包含小分子化合物。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂是选自由以下组成的组的小分子化合物：
Figure BDA0004113405700000141
Figure BDA0004113405700000142
或其药学上可接受的盐。
在用于减少本文所述的受试者眼部基因疗法的毒性的方法中，可以通过本领域技术人员认为可接受的任何途径向受试者施用RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制剂的药物组合物。例如，在本文所述的实施例中，所述RIG-I抑制剂的施用可以是但不限于口服、经皮、外部、肠胃外、注射或吸入途径。在本发明的一些实施例中，所述施用是局部施用于受试者眼睛。因此，在一些实施例中，所述施用是结膜下、玻璃体内、眼周、球后或前房内。在本发明的一些实施例中，所述施用包括使所述受试者的眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触。例如，在一些实施例中，所述施用包括使所述受试者的视网膜细胞，例如，视网膜色素上皮细胞，与所述RIG-I抑制剂接触。
在本文所述的本发明的一些实施例中，向受试者施用RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物的药物组合物有效地减少所述受试者眼细胞中干扰素刺激基因(ISG)的表达。在一些实施例中，所述ISG是ISG15。在本文所述的本发明的一些实施例中，所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中RIG-I蛋白水平。在本文所述的本发明的一些实施例中，所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中RIG-I mRNA水平。在本文所述的本发明的一些实施例中，所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中IFN应答。在一些实施例中，所述IFN应答是I型IFN应答。在本文所述的本发明的一些实施例中，所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中I型干扰素的表达和/或分泌。例如，在一些实施例中，所述I型干扰素是IFNβ。在一些实施例中，所述施用有效地抑制所述受试者眼细胞中核酸诱导的炎症。
如上所述，在用于减少本文所述的受试者眼部基因疗法的毒性的方法中，向受试者施用RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物的药物组合物可有效地：减少所述受试者眼细胞中干扰素刺激基因(ISG)的表达、减少所述受试者眼细胞中RIG-I蛋白水平、减少所述受试者眼细胞中RIG-I mRNA水平、减少所述受试者眼细胞中IFN应答、减少所述受试者眼细胞中I型干扰素的表达、减少所述受试者眼细胞中I型干扰素的分泌或抑制所述受试者眼细胞中核酸诱导的炎症。在一些实施例中，所述眼细胞是视网膜神经节(RGC)细胞、INL细胞、ONL细胞、RPE细胞、脉络膜层细胞或其组合。在一些实施例中，所述眼细胞是RPE细胞或脉络膜层细胞。在一些实施例中，所述眼细胞是RPE细胞。在一些实施例中，所述INL细胞是水平细胞、双极细胞、无长突细胞、丛间神经元或缪勒氏细胞。在一些实施例中，所述ONL细胞是锥形细胞、棒状细胞或感光细胞。
在用于减少本文所述的受试者眼部基因疗法的毒性的方法中，所述施用RIG-I抑制剂或包含RIG-I抑制物的药物组合物可用于人受试者。
此外，在用于减少本文所述的受试者眼部基因疗法的毒性的方法中，所述基因疗法可包括向所述受试者施用AAV基因疗法载体。例如，在一些实施例中，施用所述基因疗法包括视网膜下注射AAV基因疗法载体。在一些实施例中，所述施用所述RIG-I抑制剂有效地治疗与所述基因疗法毒性相关的黄斑变性(AMD)。在一些实施例中，施用所述RIG-I抑制剂有效地治疗与所述基因疗法毒性相关的地图状萎缩(GA)。在一些实施例中，施用所述RIG-I抑制剂有效地治疗DME。在一些实施例中，施用所述RIG-I抑制剂有效地治疗异常血管生成、脉络膜新生血管(CNV)、视网膜血管通透性、视网膜水肿、糖尿病性视网膜病变(例如，增殖性糖尿病性视网膜病变)、新生血管性(渗出性)年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括与nAMD(新生血管性AMD)相关的CNV，与视网膜缺血、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)或后段新生血管形成相关的后遗症。
附图说明
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图1A和1B是显示GA患者中IFN应答升高的图像。图1A显示使用免疫组化(IHC)观察非AMD(左)对照和GA(右)患者中干扰素调节转录因子3(IRF3)蛋白表达。IRF3(红色)主要在RPE和脉络膜区域表达。图1B显示通过RNAScope观察到的非AMD对照(左)和GA(右)患者中干扰素刺激基因15(ISG15)信使核糖核酸(mRNA)水平的升高。ISG15核糖核酸(RNA)信号(红点)在非AMD对照患者中较低或未检测到，但在GA患者的视网膜神经节细胞(RGC)、外核层(ONL)、内核层(INL)和RPE层中显著升高。比例尺如图所示。n＝4-5名患者/组。
图2A至2E是显示产生的RPE细胞和应答IFN，特别是IFNβ的图。图2A至2C是显示RPE细胞中响应核酸攻击而产生IFN(IFNα1、IFNβ、IFNγ和IFNλ1/3)的图。从ARPE-19细胞中分离总核酸，并且用总核酸转染细胞(图2A，THP1细胞、ARPE-19细胞或iPS-RPE细胞，0.25μg/ml；图2B，ARPE-19细胞，0ng/ml-100ng/ml；和2C，iPS-RPE细胞，0ng/ml-100ng/ml)。IFNβ和IFNλ主要在RPE细胞中产生。图2D至2F是显示RPE细胞响应IFNα1、IFNβ、IFNγ或IFNλ1/2/3刺激的ISG15诱导的图。将媒介物或IFN(图2D，THP1细胞、ARPE-19细胞或iPS-RPE细胞，各100μg/ml；图2E，ARPE-19细胞，0μg/ml-100μg/ml；和2F，iPS-RPE细胞，0μg/ml-100μg/ml)加入细胞，并且细胞主要应答IFNα和IFNβ。*与相关媒介物对照组相比，p<0.05。
图3A是一系列条形图，显示在0.25μg/ml下用所示诱导剂(媒介物、大肠杆菌双链脱氧核糖核酸(dsDNA-EC)、G3-YSD、Poly(dA:dT)、5'三磷酸发夹RNA(3p-hpRNA)或Poly(I:C))刺激细胞(THP-1、THP1环GMP-AMP合成酶(cGAS)敲除(KO)、ARPE-19或诱导的多能干(iPS)-RPE细胞)24小时后的ISG15诱导。图3B是显示ARPE-19细胞中IFNβ释放的热图，其中激活IFN通路的关键节点被小干扰RNA(siRNA；参见横轴)敲除，并且用指定的核酸刺激(参见纵轴；各0.25μg/ml)。在核酸刺激后24小时测量IFNβ释放。为了筛选目的，在汇合后10天培养ARPE-19细胞。
图4A和4B是一系列条形图，显示在0.25μg/ml下，用指定的诱导剂(媒介物、dsDNA-EC、G3-YSD、Poly(dA:dT)、Poly(I:C)、3p-hpRNA或ARPE19核酸(ARPE19-NA))刺激细胞(ARPE19-Cas9、对照指导RNA(gRNA)或RIG-I gRNA)24小时后测量的IFNβ(图4A)或IL6(图4B)释放。*与相应处理组相比，p<0.05。
图5A是一系列视网膜图像，显示使用RNAScope观察到的非AMD对照(左)和GA(右)患者中RIG-I mRNA(红点)的表达。图5B是一系列图像，显示使用IHC测量的非AMD对照组(左)和GA(右)患者中RIG-I蛋白(红色)的表达。比例尺如图所示。n＝4-5名患者/组。
图6A是一系列免疫印迹，显示在基础和刺激(0.25μg/ml DNA或RNA)条件下，RPE细胞(THP1、THP1 cGAS KO、ARPE19或iPS-RPE)中检测cGAS、ISG15和β肌动蛋白。图6B是显示在基础和刺激(0.25μg/ml DNA或RNA)条件下通过ELISA在RPE细胞(THP1、THP1 cGAS KO、ARPE19或iPS-RPE)中检测cGAS的柱状图。使用THP-1和THP-1-cGAS KO细胞验证cGAS抗体。图6C是一系列免疫印迹，显示在用氯化钠(0M、0.5M、1M或2M NaCl)处理以从染色体中分离蛋白质的指定细胞类型(THP1、THP1 cGAS KO、ARPE19或iPS-RPE)的细胞核中检测cGAS和组蛋白H3。组蛋白H3被用作阳性对照。*与媒介物对照组相比，p<0.05。#与WT和cGAS KO THP1之间的相应治疗组相比，p<0.05。
图7A至7C是显示如在24孔板中跨膜培养的iPS-RPE细胞中测量的在不同条件下作为刺激后时间(x轴)的函数的跨上皮电阻(TER，y轴)的图。用IFNβ处理(图7A)或用RNA而不是DNA转染(图7B)减少了TER，并且抗IFNβ恢复了IFNβ诱导的(图7A)和RNA诱导的屏障功能丧失(图7C)。图7D为条形图，显示了在图7A至7C所示条件下处理24小时后的归一化TER。*p<0.05。
图8是一系列图，显示AMD 1级和4级患者视网膜RNAseq结果分析的单个ISG的表达。*p<0.05；NS，无显著差异。
图9A至9D提供了IHC和RNAScope测定中使用的KO细胞系和抗体验证的结果。使用THP1 Dual/THP1 Dual KO IRF3细胞(图9A至9B)和A549 Dual/A549 Dual KO-RIG-I细胞(图9C至9D)验证IRF3(图9A至9B)或RIG-I(图9C至9D)抗体的免疫印迹或IHC。图9E显示IHC免疫球蛋白G(IgG)阴性对照的图像。图9F显示用靶向细菌基因DapB的探针染色的视网膜图像，所述探针被用作RNAScope的阴性对照。IgG/IHC和DapB/RNAscope未观察到信号。
图10A是显示经qPCR验证的各种siRNA的mRNA敲除效率的图。在大多数测试的siRNA中观察到约70％的抑制。图10B是Cas9病毒载体pNGx_LV_c010的示意图。图10C是anti-flag免疫印迹，显示在转导的ARPE-19细胞中flag标记的Cas9蛋白的表达。图10D是抗RIG-I/DDX58免疫印迹，显示在用靶向DDX58/RIG-I的gRNA转导的ARPE-19-Cas9细胞中缺乏可检测的DDX58蛋白。
具体实施方式
本披露部分基于RIG-I(DDX58)作为在RPE细胞中启动I型IFN应答的关键传感器的鉴定。如本文所披露的，诸位发明人发现RNA传感器RIG-I/DDX58在RPE细胞中表达，并且检测RPE细胞中的细胞内核酸(例如，核糖核酸(RNA))。本披露还基于发现I型IFN应答在RPE细胞中响应于核酸刺激(例如，RNA刺激)而起作用。因此，诸位发明人惊奇地发现RIG-I抑制剂是有效地减少IFN应答的候选药物。此外，诸位发明人发现RIG-I抑制剂是预防、治疗和延缓视网膜变性的有希望的候选药物。诸位发明人还发现，RIG-I抑制剂是预防、治疗和延缓AMD和GA的有希望的候选药物。此外，诸位发明人还发现，RIG-I抑制剂是改善年龄相关性黄斑变性(AMD)或地图状萎缩(GA)患者视力的有希望的候选药物。
本文提供的实例表明，I型IFN应答通路在GA供体的RPE细胞中被激活。实例的数据表明RPE细胞感测RNA，并且RNA解旋酶RIG-I(DDX58)被鉴定为启动RPE中核酸检测应答机制的关键传感器。实例的数据还表明，RPE细胞感测DNA诱导剂poly(dA:dT)，据报道，其通过RIG-I经由RNA聚合酶III转录的RNA媒介物间接激活IFN通路(11，12)。RPE细胞中另一种核酸传感器cGAS蛋白水平低于检测限。数据表明，RPE内在核酸传感通路偏向RNA传感，而来自其他细胞的外源因素可能有助于视网膜中DNA传感。例如，参见实例1至6。
实例还证明了人类患者样品中I型IFN应答与视网膜变性之间的相关性。RPE既对诱导剂产生干扰素β(IFNβ)，又对IFNβ有应答，导致下游信号传导，包括ISG15诱导。RPE细胞对大多数DNA刺激没有应答，但对RNA有应答。在某些情况下，与RNA刺激相比，RPE细胞对poly(dA:dT)的应答相对较弱。此外，IFNβ处理和RNA转染干扰了RPE屏障功能。参见，例如实例2和5。
I型IFN***在宿主防御中起着关键作用，尤其是在传染病中。I型IFN应答被认为在具有无菌炎症组分的慢性疾病中起作用，特别是自身免疫性疾病和衰老相关疾病，诸如***性红斑狼疮、多发性硬化症、干燥综合征、动脉粥样硬化和阿尔茨海默病(18-22)。如实例所示，在人供体眼睛样品的RPE层中观察到IFN通路的主要调节因子IRF3，表明RPE细胞中存在IFN产生的机制。此外，核心ISG之一ISG15在GA患者中显著上调，表明视网膜中I型IFN反应增加。参见，例如实例1至3。因此，实例中提供的数据表明，I型IFN通路参与AMD和GA(年龄相关性变性疾病)的发病机制。
有许多先天性受体负责感应核苷酸并且激活I型IFN通路。据报道，Toll样受体(TLR)，特别是TLR3，识别细胞外和细胞内配体，以启动RPE中IFN应答，TLR3 412Phe变体显示对GA的保护作用(24-26)。TLR3识别摒弃响应受损组织释放的外源双链RNA(dsRNA)，以及双链RNA poly(I:C)的合成类似物，以触发下游I型IFN信号传导(13)。然而，在下面提供的实例中，TLR信号传导通路成员(例如，TLR3、MYD88和TRIF)的敲除不影响细胞内核酸传感和IFN产生，而RIG-I通路敲除显示抑制作用，将RIG-I鉴定为RPE细胞中细胞内RNA的主要传感器。
人RIG-I由DDX58编码，是dsRNA解旋酶，在RNA传感中发挥重要作用。出乎意料的是，本文所述的实例表明，与先前的报告(13)相比，RIG-I(而不是TLR3)是RPE细胞中poly(I:C)诱导的I型IFN应答的主要传感器。TLR3和RIG-I对于启动poly(I:C)诱导的、NFκB依赖性细胞因子从RPE细胞释放可能很重要(参见图4B)。然而，如本文所披露的，RIG-I是RPE中启动I型IFN应答的关键传感器(图4A)。
虽然已知I型IFN的产生是由病毒和细菌感染导致的，但也可能是由慢性无菌炎症导致的。例如，内源性核酸可以在细胞功能障碍期间异常释放到胞浆中，并且被相应的传感器识别。因此，不同的炎症介质通过特定的信号传导通路起作用(27，28)。虽然DNA和RNA都可以激活IFN通路，但以下实例表明，在视网膜特有的RPE细胞中，RNA而不是DNA(RNA媒介物作用DNA种类poly(dA:dT)除外)诱导IFN应答。AMD患者可能有几种潜在的核酸诱导剂来源。线粒体功能障碍是AMD患者观察到的主要特征之一(29)。来自失调线粒体的线粒体DNA(mtDNA)释放通过cGAS STING通路触发I型IFN应答(28)。线粒体双链RNA(mtdsRNA)也可以通过RIG-I和RIG-I样受体MDA5触发I型IFN应答(27)。此外，据报道，在AMD患者中存在DICER失调和Alu RNA积累，假设这种积累可能导致线粒体功能障碍、mtDNA释放以及通过cGASSTING通路启动IFN反应(4)。
本披露部分基于cGAS不参与RPE细胞中RNA传感的意外发现。如本文所述，多种方法无法确认RPE细胞中任何可检测的cGAS表达，包括基础cGAS的表达和RNA处理诱导后的表达。因此，本文披露的结果表明，积累的RNA而不是DNA通过RNA传感器RIG-I直接激活RPE细胞中的I型IFN应答。
虽然cGAS先前已被证明在介导核酸诱导的炎症应答通路中发挥作用，但本发明的诸位发明人发现cGAS在介导RPE细胞中核酸诱导的炎症应答中没有明显作用。此外，诸位发明人已经证明RIG-I在RPE细胞中稳定表达，并且RIG-I可以意外地介导RPE细胞中核酸诱导的(例如，RNA诱导的)炎症应答。不希望受到理论的束缚，RPE细胞可能通过RIG-I直接对Alu-RNA做出应答，RIG-I向专业炎症细胞(例如，巨噬细胞和/或小胶质细胞)发出信号，以cGAS依赖的方式放大这种应答。巨噬细胞和小胶质细胞也可能通过cGAS/STING通路引发视网膜损伤，然后激活或引发RPE细胞对RIG-I识别的RNA诱导剂更敏感，从而导致RPE细胞激活和损伤。然而，本文所述的实例表明RIG-I直接检测RPE细胞中的核酸积累并且诱导炎症应答(例如，I型IFN应答)。
定义
除非另有定义，否则本文所用的技术和科学术语均具有与本披露所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本披露的实践或测试，但是以下描述了合适的方法和材料。本文所提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过援引并入。本文引用的参考文献不被视为要求保护的披露的现有技术。在冲突的情况下，则以包括定义在内的本说明书为准。此外，这些材料、方法和实例仅仅是说明性的，而并不旨在进行限制。
如本文所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指代物，除非内容另外明确地说明。因此，例如，提及含有“化合物”的组合物可包括两种或多种化合物的混合物。还应注意，除非内容另有明确规定，否则“或”一词的含义通常包括“和/或”。
术语“患者”和“受试者”在本文中可互换使用，并且可以指哺乳动物，包括但不限于人类、非人灵长类动物(例如，黑猩猩)、兽医动物(例如，猫、狗、牛、马、羊、猪等)或实验动物模型(例如，小鼠、兔子、大鼠)。在一些实施例中，受试者是人。
术语“治疗(treat、treating和treatment)”疾病、状态、障碍或病症(统称为“疾病”)包括减轻、减少、调节、预防或消除，从而改善病症、疾病、障碍等。例如，治疗可包括：(1)预防、延迟或减少受试者可能患有、易患或处于疾病风险的疾病状态或至少一种临床或亚临床症状的发生率和/或可能性，无论受试者是否被诊断或表现出任何此类症状；(2)缓解疾病状态，例如，导致疾病状态或其临床症状的暂时或永久消退；(3)减少或减轻疾病状态的症状；或(4)抑制或导致疾病或疾病状态的消退，例如，阻止、减少或延迟疾病或病症或其至少一种临床或亚临床症状的发展或发作，或疾病或任何此类症状的全部或部分复发。治疗对受试者的益处在统计学上是显著的，或至少可以通过定量方法观察到。在本文所述的一些实施例中，治疗方法包括向患有视网膜变性疾病或病症(例如，AMD(例如，早期AMD、晚期AMD、GA、湿性AMD或干性AMD)、DME、异常血管生成、CNV、视网膜血管通透性、视网膜水肿、糖尿病性视网膜病变(例如，增殖性糖尿病性视网膜病变)、新生血管性(渗出性)AMD，包括与nAMD(新生血管性AMD)相关的CNV、与视网膜缺血、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)或后段新生血管形成相关的后遗症))的患者施用所述RIG-I抑制剂或其药物组合物。
如本文所用，“预防(preventing或prevent)”描述减少或消除疾病、病症或障碍的症状或并发症的发作。术语“预防”用于与病症(如AMD)相关时，是本领域公认的，指的是方法、化合物、组合物或装置，所述方法、化合物或装置减少受试者(例如，相对于未接受所述组合物的受试者)的疾病体征和/或症状的发生频率或延迟其发生。
通过“减少(reduce)”或其他形式的词，如“reduced”或“reduction”，意味着降低事件或特征(例如，血管泄漏)。可以理解，这通常与一些标准或预期值有关，换句话说，它是相对的，但并不总是需要参考标准或相对值。
就本披露的方法旨在预防疾病而言，应当理解，术语“预防”并不要求完全阻止疾病状态。相反，如本文所用，术语预防是指本领域技术人员识别易患障碍的患者或人群的能力，使得本披露的化合物的施用可以在疾病发作之前发生。所述术语并不意味着疾病状态可以完全避免。
术语“改善症状(ameliorating a symptom)”或其他形式的词(如“ameliorate asymptom”)，在本文中用于表示在施用治疗剂之前和/或之后，施用本披露的治疗剂减轻患者的疾病或障碍的一种或多种症状和/或减少、抑制或消除与疾病或障碍相关的特定症状。
在一些实施例中，所述疾病或病症是视网膜变性疾病或病症，例如，但不限于，AMD或GA。在一些实施例中，治疗导致炎症减少、干扰素应答减少、GA病变的进展减少、GA病变的大小减小、眼睛中液体减少、显示眼部病理改善的眼部成像特征、眼睛病理的改善、视力的改善或其各种组合。在一些实施例中，本文所述的治疗方法(例如，治疗有需要的患者的方法)有效地减少炎症(例如，RNA诱导的炎症，例如，RNA诱导的眼(包括，例如，视网膜)炎症)、减少干扰素(例如，I型IFN，例如，IFNβ)应答、减少GA病变的进展、减小GA病变的大小、减少眼睛中液体的量(例如，过量液体)、改善眼睛疾病(例如，AMD或GA)病理、眼睛疾病(例如，AMD或GA)病理中的眼部成像的改善特征、改善视力、抑制RPE变性、抑制RPE跨上皮抵抗损伤、抑制RIG-I表达或活性、抑制I型IFN(例如，IFNβ)分泌、抑制I型IFN(例如，IFNβ)表达、抑制I型干扰素(例如，IFNβ)应答或其各种组合。
本文所用术语“需要治疗”是指需要或将受益于用本文所述的化合物或组合物或本文所述的方法治疗的受试者。在一些实施例中，需要治疗的受试者是指医生或其他护理者做出的受试者需要治疗或将从治疗中受益的判断。这种判断可以基于医生或护理者专业领域内的各种因素。
除非另有规定，术语“核酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括DNA和RNA物种。
术语“治疗有效量”、“有效量”和“有效的量”在本文中可互换使用，指单独或作为药物组合物的一部分的生物或药物活性剂的量，当以单剂量或作为一系列剂量的一部分向受试者施用时，其对受试者中疾病、疾病状态、障碍或病症的症状的方面或特征具有可检测的积极影响。例如，可通过一个或多个单位剂量的本文所述活性剂以任何合适的配制品或剂型、通过任何合适的施用途径提供有效量。可以通过测量相关的生理效应来确定治疗有效量，并且可以结合给药方案和受试者病症的诊断分析来调整。
“药学上可接受”是指在生物学上或其他方面不受欢迎的材料，即，所述材料可以与相关活性化合物一起施用给个体，而不会引起临床上不可接受的生物学效应，或以有害的方式与包含该材料的药物组合物的任何其他组分相互作用。
如本文所用，“药学上可接受的载剂”是指适用于与人和动物的组织(例如，眼组织，例如视网膜组织)接触使用的缓冲液、载剂和赋形剂，没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，符合合理的益处/风险比。在与配制品的其他成分相容并且对接受者无害的意义上，所述一种或多种载剂应是“可接受的”。药学上可接受的载剂包括与药物施用相容的缓冲液、溶剂、分散介质、包衣、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用作药物活性物质的用途是本领域中已知的。在某些实施例中，所述药物组合物经眼、外部、注射、局部、全身、结膜下、玻璃体内、眼周、球后、体腔内或肠胃外施用。
术语“约”是指在本领域普通技术人员确定的特定变量或值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定变量或值，例如，测量***的限制。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在可接受的标准偏差内。或者，“约”可以表示给定变量或值的高达±20％，优选高达±10％，更优选高达±5％，更优选仍高达±1％的范围，同样根据相关领域的实践。
如果本披露的方面或实施例被描述为“包含(comprising)”或其多种形式(例如，包含(comprises))、特征，则实施例也被设想为“由”或“基本上由”特征组成。
如本文所用，在蛋白质、寡核苷酸、多肽或核酸分子的上下文中，术语“衍生物”或“衍生自”是指：(a)与作为其衍生物的多肽或核酸分子具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的多肽或核酸分子；(b)与编码作为其衍生物的多肽的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的多肽；(c)相对于作为其衍生物的多肽或核酸分子含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个突变(例如，添加、缺失和/或取代)的多肽或核酸分子；或(d)包含来自多肽或核酸分子的约或至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500或1000个连续氨基酸或核苷酸的多肽或核酸分子的片段。
可以使用本领域技术人员已知的任何方法来确定百分比序列同一性。在具体实施例中，使用序列分析软件包的“最佳拟合”或“缺口”程序(第10版；Genetics ComputerGroup,Inc.，威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学生物技术中心(University of WisconsinBiotechnology Center,Madison,Wisconsin))来确定百分比同一性。已经描述了关于杂交条件(例如，高、中等和典型严格条件)的信息，参见，例如，美国专利申请公开号US 2005/0048549(例如，第72-73段)。
本文中使用的术语“载体”、“克隆载体”、“重组载体”和“表达载体”是指可以将DNA或RNA序列(例如，外源基因)引入宿主细胞，从而对宿主进行遗传修饰并且促进所引入序列的表达(例如，转录和翻译)的媒介物。载体包括质粒、合成的RNA和DNA分子、噬菌体、病毒等。在某些实施例中，所述载体是病毒载体，诸如但不限于腺病毒、腺相关、α病毒、疱疹、慢病毒、逆转录病毒或痘苗载体。在一些实施例中，所述载体是慢病毒运载体。
如本文所用，术语“抑制剂”是指与未经处理的细胞或用不抑制处理的细胞或组织的化合物处理的细胞相比，干扰(例如，抑制、减少、消除或阻止)靶分子或靶化合物或靶过程的物质，诸如炎症应答(例如，抑制促进炎症蛋白分泌的活性信号传导途径，从而诱导炎症)。在一些实施例中，抑制剂是小分子、蛋白质、融合蛋白、肽、多核苷酸(例如，反义、Crispr指导RNA、siRNA、微小RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)、Dicer底物短干扰RNA(DsiRNA)、长小干扰RNA(IsiRNA)、单链siRNA(ss-siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、内源性短干扰RNA(endo-siRNA)、不对称siRNA(asiRNA))、核苷酸、适体、亲和体或任何进行中的分子的衍生物或片段。在一些实施例中，本文所述的抑制剂是特异性结合蛋白质或肽的抗体或抗原结合抗体片段，例如，特异性结合RIG-I的抗体或抗原结合抗体片段。在一些实施例中，所述抗体是全人抗体或人源化抗体。在一些实施例中，所述抗原结合抗体片段选自由以下组成的组：Fab片段、F(ab')2片段和scFv片段。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含包括编码例如，蛋白质、融合蛋白、肽、多核苷酸、核苷酸或任何进行中的分子的衍生物或片段的核苷酸序列的载体。
如本文所用，“RIG-I”(也称为DDX58、RIG1；RIGI；RLR-1；和SGMRT2)可替换地是指NCBI基因ID号23586的基因序列或由NCBI基因ID号23586的基因序列编码的核苷酸或蛋白质序列、或其同源物。由RIG-I编码的核苷酸序列包括，例如，以下NCBI参考序列的RIG-ImRNA序列：NM_014314.4(SEQ ID NO:12)。由RIG-I编码的蛋白质序列包括，例如，以下NCBI参考序列的RIG-I蛋白质序列：NP_055129.2(SEQ ID NO:13)。
RIG-I抑制剂可以是RIG-I拮抗剂。靶基因的抑制可导致所述基因的转录减少和所述细胞中从所述靶基因转录的mRNA水平减少。所述靶基因或靶蛋白或肽的抑制也会导致编码所述靶蛋白或多肽的mRNA的翻译受阻。如本文所述，所述抑制剂可包含小分子化合物、肽、核酸分子或其组合。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂增加细胞中RIG-I mRNA降解或RIG-I蛋白降解的速率。在一些实施例中，所述抑制剂敲掉或敲除RIG-I基因表达。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA。在一些实施例中，RIG-I抑制剂可包括酶或调节蛋白，诸如但不限于LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro，或其衍生物。在一些实施例中，RIG-I抑制剂是CRISPR***(例如，RIG-I-CRISPR-Cas9***或RIG-I CRISPRi***)。
在一些实施例中，本文所述的RIG-I抑制剂可以是RIG-I抑制剂，例如，国际专利公开号WO 2013/016278中披露的RIG-I抑制剂肽，其通过援引并入本文。例如，在一些实施例中，本文所述的方法包括接触细胞或施用包含SEQ ID NO:6(GNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFI)的肽序列或其衍生物的RIG-I抑制剂；或编码SEQ ID NO:6的肽或其衍生物的核酸分子。在一些实施例中，本文所述的方法包括接触细胞或施用包含人线粒体抗病毒信号传导(MAVS)蛋白多肽片段的RIG-I抑制剂。例如，在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂是包含由UniProtKB鉴定号Q7Z434(SEQ ID NO:7)鉴定的人MAVS蛋白的一个或多个以下氨基酸组的多肽：10-77、15-77、20-77、25-77、30-77、35-77、40-77、45-77、50-77、10-73、15-73、20-73、25-73、30-73、35-73、40-73、45-73或50-73。
本文中使用的术语和表达被用作描述性术语，而不是限制性的，并且这些术语和表达的使用不排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，并且在所要求保护的技术的范围内可以进行各种修改。
除非另有说明，否则本披露的实践采用统计分析、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术，这些技术在本领域实践人员的技术范围内。此类工具和技术详细描述于，例如，Sambrook等人(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.[分子克隆：实验室手册]第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]:冷泉港,纽约(Cold Spring Harbor,New York)；Ausubel等人编辑(2005)Current Protocols in Molecular Biology.[分子生物学实验指南]John Wiley andSons,Inc.:新泽西州霍博肯市(Hoboken,NJ)；Bonifacino等人编辑(2005)CurrentProtocols in Cell Biology.[细胞生物学实验指南]John Wiley and Sons,Inc.:新泽西州霍博肯市；Coligan等人编辑(2005)Current Protocols in Immunology[免疫学实验指南],John Wiley and Sons,Inc.:新泽西州霍博肯市；Coico等人编辑(2005)CurrentProtocols in Microbiology[微生物学实验指南],John Wiley and Sons,Inc.:新泽西州霍博肯市；Coligan等人编辑(2005)Current Protocols in Protein Science[蛋白质科学实验指南],John Wiley and Sons,Inc.:新泽西州霍博肯市；和Enna等人编辑(2005)Current Protocols in Pharmacology[药理学实验指南],John Wiley and Sons,Inc.:新泽西州霍博肯市。例如，在以下中说明了另外的技术：美国专利号7,912,698和美国专利申请公开号2011/0202322和2011/0307437。
本发明的方法
在一个方面，本发明提供了用于治疗有需要的受试者的视网膜变性疾病或病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的视黄酸诱导基因I(RIG-I)抑制剂。
在另一方面，本发明提供了用于改善受试者视力的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述RIG-I抑制剂。
在进一步的方面，本发明提供了用于减少受试者GA病变扩大的进展的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的所述RIG-I抑制剂。
在一些实施例中，本发明提供了用于向受试者施用RIG-I抑制剂以预防视网膜变性疾病发展的方法。在一些实施例中，所述受试者有患视网膜变性疾病的风险。在一些实施例中，所述受试者具有发展视网膜变性疾病的遗传倾向。
在各种实施例中，所述视网膜变性疾病或病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)。所述AMD可以是地图状萎缩(GA)。视网膜变性疾病的其他非限制性实例包括视网膜色素变性、糖尿病性黄斑变性(DME)、黄斑营养不良、遗传性黄斑变性、遗传性视网膜变性、异常血管生成、脉络膜新生血管(CNV)、视网膜血管通透性、视网膜水肿、糖尿病性视网膜病变(例如，增殖性糖尿病性视网膜病变)、新生血管性(渗出性)年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括与nAMD(新生血管性AMD)相关的CNV、与视网膜缺血、视网膜中央静脉阻塞(CRVO)和后段新生血管形成相关的后遗症。
在一些实施例中，所述受试者具有由视网膜撕裂、视网膜脱离、糖尿病性视网膜病变或视网膜前膜导致的视力受损。在一些实施例中，所述受试者具有由眼部自身免疫疾病或慢性炎症(任选的慢性无菌炎症)导致的视力受损。
在各种实施例中，所述RIG-I抑制剂以有效地减少所述受试者眼细胞中IFN应答的量施用。所述眼细胞可以是视网膜神经节(RGC)细胞、内核层(INL)细胞、外核层(ONL)细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、脉络膜层细胞或其组合。在一些实施例中，所述眼细胞是RPE细胞或脉络膜细胞。在一些实施例中，所述眼细胞是RPE细胞。在一些实施例中，所述INL细胞是水平细胞、双极细胞、无长突细胞、丛间神经元或缪勒氏细胞。在一些实施例中，所述ONL细胞是锥形细胞、棒状细胞或感光细胞。
所述IFN应答可以是I型IFN应答。I型IFN应答可测量为干扰素刺激基因(ISG)的表达或增强表达、ISG编码的肽的存在或水平升高、RIG-I的表达或水平升高、RIG-I蛋白的存在或水平升高或其各种组合。可以通过定量或检测从基因转录的细胞中mRNA的水平来测量基因的表达，例如通过qRT-PCR、DNA微阵列、原位杂交、northern印迹、RNA Seq和本领域已知的各种其他技术。可以通过本领域已知的各种技术中的任何一种来测量蛋白水平，例如通过免疫印迹、蛋白质组学或质谱法。在各种实施例中，当从基因转录的mRNA在细胞内处于可检测水平时，认为基因由细胞表达。基因表达的增强或升高可以定义为大于在健康细胞中测量的表达。蛋白水平的升高可以定义为高于健康细胞中测量的水平。健康细胞可以从没有发展风险和/或没有发展成眼睛疾病(任选地视网膜变性疾病)的受试者获得或响应于所述受试者。
在一些实施例中，所述IFN应答被测量为ISG或RIG-I的表达，其水平约为或至少约比健康细胞中观察到的水平高1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.75、3、4、5、6、7、8、9或10倍。在一些实施例中，所述IFN应答被测量为RIG-I蛋白或ISG蛋白的存在，其水平约为或至少约比健康细胞中观察到的水平高1.01、1.02、1.03、1.04、1.05、1.06、1.07、1.08、1.09、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.75、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
在各种实施例中，施用所述RIG-I抑制剂导致所述眼细胞中ISG的表达减少。在一些实施例中，所述ISG是ISG15。在一些实施例中，施用所述RIG-I抑制剂导致所述眼细胞中RIG-I蛋白水平减少。在一些实施例中，施用所述RIG-I抑制剂导致所述眼细胞中RIG-ImRNA水平减少。在一些实施例中，施用所述RIG-I抑制剂导致所述受试者视力改善。在一些实施例中，施用所述RIG-I抑制剂导致所述受试者视网膜退行性疾病的进展逆转或减缓。
RIG-I抑制剂
所述RIG-I抑制剂可包含小分子化合物、抗体、RIG-I抗体的抗原结合片段、核酸分子、肽或其衍生物。在各种实施例中，所述RIG-I抑制剂敲掉和/或敲除RIG-I。所述RIG-I抑制剂可包含有效用于RNA干扰(RNAi)技术的分子。所述RIG-I抑制剂可包含siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA/DNA、三螺旋形成分子或sgRNA。
几种不同类型的分子可以有效地用于RNAi技术中。小干扰RNA(siRNA)，有时被称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类20-25个核苷酸长的双链RNA分子，在生物学中发挥多种作用。最值得注意的是，siRNA参与RNA干扰(RNAi)通路，其中所述siRNA干扰特定基因的表达。除了在所述RNAi通路中的作用外，siRNA也在RNAi相关途径中发挥作用，例如，作为抗病毒机制或形成基因组的染色质结构。合成siRNA已被证明能够在哺乳动物细胞中诱导RNAi。
微小RNA(miRNA)是一类相关的基因调控小RNA，通常长度为21nt-23nt。它们通常不同于siRNA，因为它们是由单链RNA前体加工而成的，并且只显示出与mRNA靶标的部分互补。初步研究表明，miRNA在转录后调节细胞质中P-体的翻译抑制水平的基因表达。然而，miRNA也可以像siRNA一样指导mRNA切割。这在植物中通常是这样的，其中靶位点通常与所述miRNA高度互补。虽然植物mRNA的靶位点可以在5′UTR、开放阅读框和3′UTR中找到，但在动物中，3′UTR是主要靶标。miRNA首先被转录为初级微小RNA(pri-miRNA)的一部分。然后，Drosha在Pasha/DGCR8(＝微处理器复合体)的帮助下将其处理成前miRNA。然后通过exportin-5将ca.75nt前miRNA导出到细胞质中，然后通过Dicer将其切割成21nt-23nt的siRNA样分子。在某些情况下，可以在pri-miRNA上发现多个miRNA。
短发夹RNA(shRNA)是另一种可用于影响RNAi的RNA。这是一个RNA序列，它会产生一个紧密的发夹弯，可以用来沉默基因表达。shRNA由RNA聚合酶III转录。
短干扰RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)被广泛用于沉默各种基因，以沉默基因执行的功能。由于利用多种来源开发了现成shRNA和siRNA基因沉默构建体库，利用RNAi沉默特定基因变得越来越容易。例如，RNAi Codex由shRNA相关信息数据库和相关网站组成，已被开发为公开可用shRNA资源的门户。RNAi Codex目前保存着来自Hannon-Elledge shRNA库的数据，并且允许使用生物学家友好的基因名称来获取shRNA构建体的信息，这些构建体可以沉默感兴趣的基因。它被设计为在每个构建体的数据可用时保存用户提供的注释和出版物。Olson等人(Nucleic Acids Res.[核酸研究]34(数据库专辑):D153-D157,2006，通过援引并入)提供了关于RNAi Codex特征的详细描述，并且解释了该工具的使用。所有这些信息可用于帮助设计针对RIG-I的多种siRNA或shRNA。
在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含RIG-I siRNA。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含RIG-I shRNA。适合用于本发明的RIG-I siRNA或RIG-I shRNA分子的非限制性实例包括以下中描述的那些：He,T.等人2019.Life Sci.[生命科学]131:116570；Kang,YG.等人2019.Nucleic Acid Ther.[核酸治疗学]29:291-299；Li,L.等人2018.Neurosci.Lett.[神经科学通讯]672:46-52；Raicevic,G.等人2017.Sci Rep.[科学报告]7:2896；Liu,Y.等人2016.Journal of virology[病毒学杂志]；Li,P.等人2016.Nature medicine.[自然医学]22:807-11；Yu,L.等人2016.Biomed Res Int.[国际生物医学研究]2016:9872138；Chiang,C.等人2015.Journal of virology.[病毒学杂志]89:8011-25；Webster Marketon,JI.等人2014；Virology.[病毒学]449:62-9,Harashima,N.等人2014；Mol.Cancer.[分子癌症]13:217；和Goulet,ML.等人2013.PLoS pathogens.[公共科学图书馆·病原体]9:e1003298，所有这些通过援引并入本文以提供RIG-I shRNA和RIG-I shRNA序列的实例。在本文所述的实施例中，所述RIG-I siRNA可包含5’–AAGGGAACGATTCCATCACTA–3’(SEQ ID NO:2)、5’–TTCTACAGATTTGCTCTACTA–3’(SEQ ID NO:3)、5’–CTCCTCCTACCCGGCTTTAAA–3’(SEQ ID NO:4)或5’–CAGAATTATCCCAACCGATAT–3’(SEQID NO:5)的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂是核酶。设计用于催化切割靶mRNA转录物的核酶分子也可用于阻止RIG-I的翻译。因此，在另一个实施例中，本发明的组合物包含特异性针对RIG-I mRNA的核酶。核酶是酶促RNA分子，能够催化RNA的特异性切割。(有关综述，请参见Rossi,Current Biology[当代生物学]4:469-471,1994)。核酶作用的机制包括核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，随后发生核仁内裂解事件。核酶分子的组合物优选包括与靶mRNA互补的一个或多个序列，以及负责mRNA切割的已知催化序列或功能等同的序列(参见，例如，美国专利号5,093,246，将其通过援引以其全文并入本文)。
在位点特异性识别序列上切割mRNA的核酶可用于破坏靶mRNA。此外，锤头状核酶在与所述靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区域决定的位置切割mRNA。在一些实施例中，所述靶mRNA具有以下两个碱基的序列：5′-UG-3′。锤头状核酶的构建和生产在Haseloff和Gerlach,Nature[自然]334:585-591,1988中有更全面的描述；并且参见PCT申请号WO89/05852，将其内容通过援引并入本文。锤头状核酶序列可以嵌入稳定的RNA中，诸如转移RNA(tRNA)，以提高体内切割效率(Perriman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],92:6175-79,1995；de Feyter和Gaudron,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法],第74卷,第43章,“Expressing Ribozymes in Plants,[植物中表达核糖酶]”Turner,P.C编辑,Humana出版社,托托瓦,新泽西州)。特别地，RNA聚合酶III介导的tRNA融合核酶的表达是本领域已知的(参见，Kawasaki等人,Nature[自然]393:284-9,1998；Kuwabara等人,Nature Biotechnol.[自然生物技术]16:961-5,1998；和Kuwabara等人,Mol.Cell.[分子细胞学]2:617-27,1998；Koseki等人,J Virol[病毒学杂志]73:1868-77,1999；Kuwabara等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]96:1886-91,1999；Tanabe等人,Nature[自然]406:473-4,2000)。在给定的靶序列内通常存在许多潜在的锤头状核酶切割位点。在一些实施例中，所述核酶被工程化，使得切割识别位点位于所述靶mRNA的5′端附近，以提高效率并且最小化非功能性mRNA转录物的细胞内积累。此外，使用位于编码例如长和短形式靶标的C末端氨基酸结构域的不同部分的靶序列中的任何切割识别位点将允许选择性靶向一种或另一种形式的靶标，并且因此对一种形式靶基因产物具有选择性作用。
基因靶向核酶包含与两个区域互补的杂交区域，每个区域为靶mRNA(诸如所述RIG-I基因中表示的序列的mRNA)的长度上的至少5个核苷酸，并且优选每个为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸。此外，核酶具有高度特异性的内核糖核酸酶活性，其可自动催化切割有义mRNA。本发明扩展到与编码RIG-I的有义mRNA杂交的核酶，从而与所述有义mRNA进行杂交并且将其切割，使得其不再能够被翻译成合成功能性多肽产物。
在本发明的方法中用作所述RIG-I抑制剂的核酶还包括RNA内核糖核酸酶(以下称为“Cech型核酶”)，诸如天然存在于嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中的核酶(称为IVS或L-19IVS RNA)，Thomas Cech及其合作者已对其进行了广泛描述(Zaug等人,Science[科学]224:574-578,1984；Zaug等人,Science[科学]231:470-475,1986；Zaug等人,Nature[自然]324:429-433,1986；由University Patents Inc.发布的国际专利申请号WO88/04300；Been等人,Cell[细胞]47:207-216,1986)。所述Cech型核酶具有八个碱基对活性位点，所述位点与靶RNA序列杂交，然后发生所述靶RNA的切割。本发明包括靶向存在于靶基因或核酸序列中的八个碱基对活性位点序列的那些Cech型核酶。
核酶可由修饰的寡核苷酸组成(例如，为了提高稳定性、靶向性等)，并且应递送至体内表达所述靶基因的细胞。在一些实施例中，核酶的递送方法涉及在强组成型pol III或pol II启动子的控制下使用“编码”核酶的DNA构建体，从而转染的细胞将产生足够量的核酶以破坏内源性靶信息并且抑制翻译。由于与反义分子不同，核酶具有催化作用，因此需要较低的细胞内浓度才能提高效率。
在某些实施例中，核酶可通过首先鉴定足以引起RNAi有效敲除的序列部分来设计。然后可以将相同的序列部分结合到核酶中。核酶或RNAi的基因靶向部分可以是靶核酸(如RIG-I基因)的至少5个并且优选6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个连续核苷酸的基本相同序列。在长的靶RNA链中，大量的靶位点是核酶无法接近的，因为它们隐藏在二级或三级结构中(Birikh等人,Eur J Biochem[欧洲生物化学杂志]245:1-16,1997)。为了克服靶RNA可及性的问题，通常使用计算机生成的二级结构预测来识别最可能是单链或具有“开放”构型的靶标(参见Jaeger等人,Methods Enzymol[酶学方法]183:281-306,1989)。其他方法利用***方法预测二级结构，这涉及评估大量候选杂交寡核苷酸分子(参见Milner等人,Nat Biotechnol[自然生物技术]15:537-41,1997；和Patzel和Sczakiel,Nat Biotechnol[自然生物技术]16:64-8,1998)。此外，美国专利号6,251,588(将其内容特此并入本文)描述了用于评估寡核苷酸探针序列以便预测与靶核酸序列杂交的可能性的方法。在一些实施例中，本发明的方法提供了使用此类方法选择预测为单链的靶mRNA序列的优选片段，并且进一步提供了相同或基本相同的靶mRNA片段的机会利用，在本发明的RNAi寡核苷酸和核酶的设计中，所述靶mRNA序列任选地包含靶mRNA的约10-20个连续核苷酸。
在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含反义核酸。在一些实施例中，分离的“反义”核酸可用于抑制RIG-I的表达，例如，通过抑制RIG-I核酸的转录和/或翻译。所述反义核酸可以通过常规碱基对互补结合，或者，例如，在结合到DNA双链体的情况下，通过双螺旋主槽中的特异性相互作用结合。通常，这些方法指的是本领域中通常使用的技术范围，并且包括依赖于与寡核苷酸序列的特异性结合的任何方法。
例如，本发明的反义构建体可以作为载体递送，当在细胞中转录时，产生与编码RIG-I多肽的细胞mRNA的至少一个独特部分互补的RNA。或者，所述反义构建体是寡核苷酸探针，其在体外产生，并且当被引入细所述胞时，通过与靶核酸的mRNA和/或基因组序列杂交而导致表达抑制。此类寡核苷酸探针可以是修饰的寡核苷酸，其对内源性核酸酶(例如，核酸外切酶和/或核酸内切酶)具有抗性，因此在体内稳定。用作反义寡核苷酸的示例性核酸分子是DNA的磷酰胺盐、硫代磷酸盐和甲基膦酸盐类似物(也参见美国专利号5,176,996；5,264,564；和5,256,775)。此外，构建用于反义疗法的低聚物的一般方法已被综述，例如，Van der Krol等人,BioTechniques[生物技术]6:958-976,1988；和Stein等人,Cancer Res[癌症研究]48:2659-2668,1988。
关于反义DNA，在一些实施例中，优选源自翻译起始位点(例如，靶基因的-10和+10区域之间)的寡核苷酸。反义方法涉及设计与编码RIG-I蛋白的mRNA互补的寡核苷酸(DNA或RNA)。所述反义寡核苷酸将与mRNA转录物结合并且阻止翻译。不需要绝对互补。在双链反义核酸的情况下，因此可以检测双链体DNA的单链，或者可以检测三链体的形成。杂交的能力将取决于互补程度和所述反义核酸的长度。通常，杂交核酸的长度越长，与它可能包含的RNA的碱基错配越多，并且仍然形成稳定的双链体(或三链体，视情况而定)。本领域技术人员可以通过使用标准程序确定杂交复合物的熔点来确定可容忍的错配程度。
与mRNA的5′端互补的寡核苷酸，例如，5′非翻译序列，直到并包括AUG起始密码子，可以最有效地抑制翻译。然而，与mRNA的3′非翻译序列互补的序列已被证明在抑制mRNA翻译方面也有效(Wagner,Nature[自然]372:333,1994)。因此，与基因的5′或3′非翻译、非编码区互补的寡核苷酸可以用于反义方法来抑制该mRNA的翻译。与所述mRNA的5′非翻译区互补的寡核苷酸可包括AUG起始密码子的补体。根据本发明，还可以使用与mRNA编码区互补的反义寡核苷酸。无论被设计为与mRNA的5′、3′或编码区杂交，反义核酸的长度可以是至少6个核苷酸，长度任选至少约100个核苷酸和/或小于约150、50、25、17或10个核苷酸。
在一些实施例中，首先进行体外研究以定量反义寡核苷酸抑制基因表达的能力。这些研究可以利用对照来区分反义基因抑制和寡核苷酸的非特异性生物学效应。这些研究可以将靶RNA或蛋白质的水平与内部对照RNA或蛋白质的水平进行比较。使用反义寡核苷酸获得的结果可以与使用对照寡核苷酸获得的那些结果进行比较。所述对照寡核苷酸可以具有与测试寡核苷酸大致相同的长度，并且所述寡核苷酸的核苷酸序列与反义序列的差异不超过阻止与靶序列的特异性杂交所必需的程度。
所述反义寡核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修饰版本。所述寡核苷酸可以在碱基部分、糖部分或磷酸盐骨架处进行修饰，例如，以提高分子的稳定性、杂交等。所述寡核苷酸可包括其他附加基团，诸如肽(例如，用于靶向宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的试剂(参见，例如，Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]86:6553-6556,1989；Lemaitre等人,Proc.Natl.Acad.Sci.[国家科学院院刊]84:648-652,1987；PCT公开号WO88/09810)或血脑屏障(参见，例如，PCT公开号WO89/10134)、杂交触发切割剂(参见，例如，Krol等人,BioTechniques[生物技术]6:958-976,1988)或***剂(参见，例如，Zon,Pharm.Res.[药学评论]5:539-549,1988)。为此，所述寡核苷酸可与另一分子偶联，例如，肽、杂交触发交联剂、转运剂、杂交触发切割剂等。
所述反义寡核苷酸可包含至少一个修饰的碱基部分，其选自但不限于由以下组成的组：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w以及2,6-二氨基嘌呤。
所述反义寡核苷酸还可包含至少一种修饰的糖部分，其选自但不限于由以下组成的组：***糖、2-氟***糖、木酮糖和己糖。所述反义寡核苷酸还可以包含中性肽样骨架。此类分子被称为肽核酸(PNA)-寡聚体，并且例如在以下中所述：Perry-O'Keefe等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]93:14670,1996,和Eglom等人,Nature[自然]365:566,1993。PNA低聚物的一个优点是，由于DNA的中性骨架，它们能够基本上独立于培养基的离子强度而与互补DNA结合。在又一个实施例中，所述反义寡核苷酸包含至少一种修饰的磷酸主链，所述修饰的磷酸骨架选自由以下组成的组：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺、酰胺磷酸酯、二酰胺磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛或其类似物。
在又一个实施例中，所述反义寡核苷酸是α异头寡核苷酸。α异头寡核苷酸与互补RNA形成特定的双链杂交，其中与通常的反平行方向相反，所述链彼此平行(Gautier等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究]15:6625-6641,1987)。所述寡核苷酸是2′-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究]15:6131-6148,1987)，或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]215:327-330,1987)。
虽然可以使用与编码区RIG-I mRNA序列互补的反义核苷酸，但也可以使用与转录的非翻译区互补的那些。
在一些实施例中，可通过靶向与基因调控区(即，启动子和/或增强子)互补的脱氧核糖核苷酸序列来减少RIG-I基因表达，以形成三螺旋结构，阻止体内靶细胞中基因的转录(一般参见Helene,Anticancer Drug Des.[抗癌药物设计]6(6):569-84,1991；Helene等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年鉴],660:27-36,1992；和Maher,Bioassays[生物测定]14(12):807-15,1992)。
在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含三螺旋形成分子。用于抑制转录的三螺旋形成的核酸分子可以是单链的，并且由脱氧核糖核苷酸组成。这些寡核苷酸的碱基组成应通过胡斯坦碱基配对规则促进三螺旋的形成，这通常需要在双链体的一条链上存在大量的嘌呤或嘧啶。核苷酸序列可能是基于嘧啶的，这将导致TAT和CGC三联体穿过三个相关的三螺旋链。富含嘧啶的分子在与该链平行的方向上为双链体的单链的富含嘌呤的区域提供碱基互补。此外，可以选择富含嘌呤的核酸分子，例如，含有一段G残基。这些分子可以与富含GC对的DNA双链体形成三重螺旋，其中大多数嘌呤残基位于靶向双链体的单链上，从而在三链体中三条链上产生CGC三联体。
可以通过创建所谓的“折返”核酸分子来增加三螺旋形成的潜在靶序列。折返分子以交替的5′-3′、3′-5′方式合成，使得它们首先与双链体的一条链碱基配对，然后与另一条链进行碱基配对，从而消除了在双链体的某条链上存在相当大范围的嘌呤或嘧啶的必要性。
在某些实施例中，所述反义寡核苷酸是吗啉反义。吗啉是合成分子，是天然核酸结构重新设计的产物。通常长度为25个碱基，它们通过标准核酸碱基配对与RNA的互补序列结合。在结构上，吗啉和DNA的区别在于，虽然吗啉具有标准的核酸碱基，但这些碱基与吗啉环而不是脱氧核糖环结合，并且通过磷酸二酰胺基团而不是磷酸盐连接。用不带电的磷酸二酰胺基团取代阴离子磷酸盐消除了通常生理pH范围内的电离，因此生物体或细胞中的吗啉是不带电的分子。吗啉不是嵌合寡聚体；吗啉的整个骨架由这些修饰的亚基构成。吗啉最常用作单链寡聚体，尽管吗啉链和互补DNA链的异二聚体可与阳离子胞浆递送试剂组合使用。
与许多反义结构类型(例如，硫代磷酸酯)不同，吗啉不降解其靶RNA分子。相反，吗啉通过“立体阻断”作用，与RNA内的靶序列结合，并且简单地阻碍可能与所述RNA相互作用的分子。吗啉寡聚体通常用于研究特定mRNA转录物在胚胎中的作用，诸如斑马鱼、非洲爪蛙(非洲爪蟾)、小鸡和海胆的产生变形胚胎的卵或胚胎。通过适当的胞浆递送***，吗啉在细胞培养物中是有效的。
结合到信使RNA(mRNA)的5′-非翻译区，吗啉可以干扰核糖体起始复合物从5′帽到起始密码子的进展。这阻止了靶转录物编码区的翻译(称为“敲除”基因表达)。一些吗啉化合物如此有效地抑制了表达，以至于在预先存在的蛋白质降解后，通过免疫印迹检测不到靶蛋白。
吗啉还可以干扰前mRNA处理步骤，通常是通过阻止剪接导向的snRNP复合物在前RNA链上的内含子边界处与其靶标结合。阻止U1(在供***点)或U2/U5(在聚嘧啶部分和受***点)结合可导致修饰剪接，通常导致成熟mRNA中的外显子被排除。靶向一些剪接靶点导致内含子内含物，而隐性剪接位点的激活可能导致部分内含物或排除。U11/U12snRNP的靶标也可以被阻断。剪接修饰可以方便地通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)进行测定，并且被视为RT-PCR产物凝胶电泳后的带移。
吗啉还被用于阻断miRNA活性、核酶活性、内含子剪接沉默子和剪接增强子。U2和U12-snRNP功能已被吗啉抑制。针对蛋白质编码区内“光滑”mRNA序列的吗啉可诱导翻译移码。吗啉对这些靶标的活性表明，吗啉可以用作阻断蛋白质或核酸与mRNA相互作用的通用工具。
在一些实施例中，本发明提供了利用DNA核酸酶进行基因编辑/克隆的方法和组合物。CRISPR复合物、转录激活剂样效应核酸酶(TALENs)、锌指核酸酶(ZFNs)和FokI限制酶是一些序列特异性核酸酶，已被用作基因编辑工具。这些酶能够通过与设计用于识别感兴趣序列的指导区的相互作用将其核酸酶活性靶向所需的靶位点。在一些实施例中，本披露教导了基于CRISPR的基因编辑方法。
基于CRISPR的体内编辑原理主要依赖于天然细胞DNA修复***。由核酸酶引入的双链dsDNA断裂可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)或单链退火(SSA)或微同源末端连接(MMEJ)来修复。
HDR依赖于包含与DNA切割靶位点周围区域同源的序列的模板DNA。细胞修复蛋白利用外源供应或内源性DNA序列与DNA断裂周围位点之间的同源性来修复dsDNA断裂，用所述模板DNA上的序列替换断裂。然而，未能整合所述模板DNA可导致NHEJ、MMEJ或SSA。NHEJ、MMEJ和SSA是容易出错的过程，通常伴随着在靶位点***或删除核苷酸(indel)，由于移码突变或过早终止密码子的***，导致基因组靶区域的基因敲除(沉默)。Cpf1介导的编辑也可以通过内切酶产生的悬突的传统杂交，然后进行连接来发挥作用。
CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)和CRISPR相关(cas)核酸内切酶最初被发现是细菌和古菌进化的适应性免疫***，以防止病毒和质粒入侵。细菌中自然存在的CRISPR/Cas***由一个或多个Cas基因和一个或更多个CRISPR阵列组成，这些CRISPR阵列由从先前遇到的病毒和质粒(称为间隔区)获得的基因组靶向序列分离的碱基序列的短回文重复序列组成。(Wiedenheft,B.,等人Nature[自然].2012；482:331；Bhaya,D.,等人,Annu.Rev.Genet.[遗传学年鉴]2011；45:231；和Terms,M.P.等人,Curr.Opin.Microbiol.2011；14:321)。拥有一个或多个CRISPR基因座的细菌和古菌通过在CRISPR阵列的近端将外源序列(原间隔区)的短片段整合到宿主染色体中来响应病毒或质粒的攻击。CRISPR基因座的转录产生CRISPR衍生RNA(crRNA)文库，其包含与先前遇到的入侵核酸互补的序列(Haurwitz,R.E.,等人,Science[科学].2012:329；1355；Gesner,E.M.,等人,Nat.Struct.Mol.Biol.[自然结构与分子生物学]2001:18；688；Jinek,M.,等人,Science[科学].2012:337；816-21)。crRNA通过与靶DNA的互补碱基配对进行靶识别，通过Cas蛋白引导外源序列的切割。(Jinek等人2012“A Programmable dual-RNA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity.[自适应细菌免疫中的可编程双RNA指导DNA内切酶]”Science[科学].2012:337；816-821)。
至少有五种主要CRISPR***类型(I型、II型、III型、IV型和V型)和至少16种不同的亚型(Makarova,K.S.,等人,Nat Rev Microbiol.[自然评论微生物学]2015.Nat.Rev.Microbiol.[自然评论微生物学]13,722-736)。CRISPR***也根据其效应蛋白进行分类。1类***具有多亚基crRNA效应复合物，而在2类***中，效应复合物的所有功能由单个蛋白质(例如，Cas9或Cpf1)实现。在一些实施例中，本披露教导使用II型和/或V型单亚单位效应***。因此，在一些实施例中，本披露教导使用2类CRISPR***。
在一些实施例中，本披露教导了使用II型CRISPR***进行基因编辑的方法。在一些实施例中，所述II型CRISPR***(CRISPR-Cas9)使用Cas9酶。II型***依赖于i)单个核酸内切酶蛋白，ii)反式crRNA(tracrRNA)，以及iii)crRNA，其中crRNA的5′端的约20个核苷酸(nt)部分与靶核酸互补。CRISPR crRNA链中与其靶DNA原间隔区互补的区域在此称为“指导序列”(sgRNA)。
Cas9核酸内切酶产生钝端DNA断裂，并且通过crRNA和tracrRNA寡聚体的组合被招募到靶DNA，通过RNA CRISPR复合物的互补杂交连接核酸内切酶。
在一些实施例中，crRNA/核酸内切酶复合物的DNA识别需要与位于靶DNA的3′部分中的原间隔区相邻基序(PAM)(例如，5′-NGG-3′)进行额外的互补碱基配对，所述原间隔区位于靶原间隔区下游。(Jinek,M.,等人,Science.[科学]2012:337；816-821)。在一些实施例中，Cas9识别的PAM基序因不同的Cas9蛋白而不同。
在一些实施例中，本领域技术人员可以理解，本文披露的Cas9可以是衍生自或分离自任何来源的任何变体。在其他实施例中，本披露的Cas9肽可以包括文献中描述的一种或多种突变，包括但不限于以下描述的功能突变：Fonfara等人Nucleic Acids Res.[核酸研究]2014年2月；42(4):2577-90；Nishimasu H.等人Cell.[细胞]2014年2月27日；156(5):935-49；Jinek M.等人Science.[科学]2012 337:816-21；和Jinek M.等人Science.[科学]2014年3月14日；343(6176)；也参见美国专利申请序列号13/842,859，于2013年3月15日提交，将其通过援引并入本文；进一步参见美国专利号8,697,359；8,771,945；8,795,965；8,865,406；8,871,445；8,889,356；8,895,308；8,906,616；8,932,814；8,945,839；8,993,233；和8,999,641，将其通过援引全部特此并入。因此，在一些实施例中，本文披露的***和方法可用于具有双链核酸酶活性的野生型Cas9蛋白、充当单链内切酶的Cas9突变体或具有修饰的核酸酶活性的其他突变体。
本披露进一步设想使用催化失活的Cas9突变体，如下文进一步详细描述的。在一些实施例中，术语“催化失活的(catalytically inactivated或catalyticallyinactive)”CRISPR是指其中DNA酶催化结构域是非功能性(即，酶不再切割DNA)的CRISPR蛋白。因此，在一些实施例中，本披露教导dCas9突变体。减少或消除Cas9中核酸酶的突变的非限制性列表包括：D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986或A987、或Cas9同系物或同源物中相应位置的突变。一种或多种突变可包括用任何天然(例如，丙氨酸)或非天然氨基酸取代或缺失。示例性核酸酶缺陷的dCas9蛋白是Cas9D10A和H840A(Jinek等人,Science.[科学]2012年8月17日；337(6096):816-21；Qi等人,Cell.[细胞]2013年2月28日；152(5):1173-83)。
在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含RIG-I CRISPR-Cas9***。所述RIG-ICRISPR-Cas9***可包含sgRNA。在一些实施例中，所述sgRNA包含序列ACTCACCCTCCCTAAACCAG(SEQ ID NO:1)或其衍生物。在一些实施例中，所述sgRNA包含与SEQID NO:1具有约或至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在其他实施例中，本披露教导了使用V型CRISPR***进行基因编辑的方法。在一些实施例中，本披露教导了使用来自Prevotella和Francisella 1(Cpf1)的CRISPR的方法。
本披露的Cpf1 CRISPR***包含i)单个内切核酸酶蛋白，和ii)crRNA，其中crRNA的3′端的一部分包含与靶核酸互补的指导序列。在该***中，Cpf1核酸酶被crRNA直接招募到靶DNA(参见图1B中的实心三角形箭头)。在一些实施例中，Cpf1的指导序列必须为至少12nt、13nt、14nt、15nt或16nt，以实现可检测的DNA切割，并且至少为14nt、15nt、16nt、17nt或18nt，以达到有效的DNA切割。
本披露的Cpf1***与Cas9在许多方面不同。首先，与Cas9不同，Cpf1不需要单独的tracrRNA进行切割。在一些实施例中，Cpf1 crRNA可以短至约42-44个碱基长，其中23nt-25nt是指导序列，并且19nt是组成型直接重复序列。相比之下，Cas9 tracrRNA和crRNA合成序列的组合长度为约100个碱基。在一些实施例中，本披露将Cpf1的crRNA称为“指导RNA”。
第二，Cpf1偏爱位于其靶标上游5′的“TTN”PAM基序。这与Cas9***靶DNA 3′上的“NGG”PAM基序形成对比。在一些实施例中，直接在指导序列之前的尿嘧啶碱基不能被取代(Zetsche,B.等人2015.“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class2CRISPR-Cas System[Cpf1是2类CRISPR-Cas***的单个RNA指导的核酸内切酶]”Cell[细胞]163,759-771，出于所有目的，将其通过援引以其全文特此并入)。
第三，Cpf1的切割位点错开约3-5个碱基，从而产生“粘性末端”(Kim等人,2016.“Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1endonucleases in humancells[全基因组分析揭示了人细胞中Cpf1内切酶的特异性]”,2016年6月6日在线发表)。这些具有约3nt-5nt悬突的粘性末端被认为有助于NHEJ介导的连接，并且改进具有匹配末端的DNA片段的基因编辑。所述切割位点位于靶DNA的3′端，远离PAM所在的5′端。切割位置通常跟随非杂交链上的第18个碱基和与crRNA杂交的互补链上相应的第23个碱基。
第四，在Cpf1复合物中，“种子”区域位于指导序列的前5nt内。Cpf1 crRNA种子区域对突变高度敏感，甚至该区域中的单碱基取代也会显著减少切割活性(参见Zetsche B.等人2015“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2CRISPR-CasSystem[Cpf1是2类CRISPR Cas***的单个RNA指导的核酸内切酶]”Cell[细胞]163,759-771)。关键的是，与Cas9 CRISPR靶标不同，Cpf1***的切割位点和种子区域不重叠。关于设计Cpf1 crRNA靶向寡核苷酸的其他指南，请访问(Zetsche B.等人2015.“Cpf1 Is aSingle RNA-Guided Endonuclease of a Class 2CRISPR-Cas System[Cpf1是2类CRISPR-Cas***的单个RNA指导的核酸内切酶]”Cell[细胞]163,759-771)。
本领域技术人员将理解，本文披露的Cpf1可以是衍生自或分离自任何来源的任何变体。
本披露进一步设想使用催化失活的Cpf1突变体，如下文进一步详细描述的。因此，在一些实施例中，本披露教导dCpf1突变体。在一些实施例中，本披露的dCpf1包含：ddCpf1(Zhang等人“Multiplex gene regulation by CRISPR ddCpf1[通过CRISPR-ddCpf1进行多重基因调控]”Cell Discovery 3[细胞发现3],文章编号17018(2017)；弗朗西丝菌(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))、毛螺菌科细菌(UniProtKB-A0A182DWE3(A0A182DWE3_9FIRM))和氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)(UniProtKB-U2UMQ6(CPF1 ACISB))。在一些实施例中，本披露的dCpf1是通过突变催化结构域AsCpf1而产生的(D908A Yamano,T.,Nishimasu,H.,Zetsche,B.,Hirano,H.,Slaymaker,I.M.,Li,Y.,Fedorova,I.,Nakane,T.,Makarova,K.S.,Koonin,E.V.等人(2016)Crystal Structure of Cpf1 in Complexwith Guide RNA and Target DNA.[Cpf1与指导RNA和靶DNA复合物的晶体结构]Cell[细胞],165,949-962。
在一些实施例中，本披露教导了通过CRISPRi(CRISPR干扰)调节基因表达的方法。在一些实施例中，目前披露的技术利用催化失活(即，核酸酶失活)的CRISPR内切核酸酶，其已突变以不再产生双DNA链断裂，但仍能够通过其相应的指导RNA与DNA靶位点结合。在一些实施例中，本披露将这些催化失活的CRISPR酶称为“死CRISPR”或“dCRISPR”酶。“死”修饰物也可用于特定CRISPR酶，诸如死Cas9(dCas9)或死Cpf1(dCpf1)。
不希望受任何一种理论的约束，该技术的dCRISPR酶可以通过经由指导RNA将催化失活的dCRISPR酶招募到靶DNA序列来发挥作用，从而允许所述dCRISPR酶与宿主细胞的特定基因的转录机制相互作用。
在一些实施例中，本披露的CRISPRi方法利用dCRISPR酶占据转录所需的靶DNA序列，从而阻断靶基因的转录(L.S.Qi等人,“Repurposing CRISPR as an RNA-GuidedPlatform for Sequence-Specific Control of Gene Expression.[将CRISPR重新用作RNA指导的平台，用于基因表达的序列特异性对照]”Cell.[细胞]152,1173-1183(2013)；还参见L.A.Gilbert等人,“CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation ofTranscription in Eukaryotes.[CRISPR介导的模块化RNA指导的真核生物转录调控]”Cell.[细胞]154,442-451(2013))。在其他实施例中，本披露的CRISPRi方法利用翻译融合的dCRISPR酶，或以其他方式连接到一个或多个转录抑制结构域，或替代地利用能够将转录抑制结构域招募到靶位点的修饰的指导RNA(例如，如下文所述，通过适体连接)。
在其他实施例中，目前披露的发明还设想利用dCRISPR酶并且指导RNA来招募其他调节因子以靶向DNA位点。如上所述，除了招募转录阻遏结构域外，本披露的dCRISPR酶和指导RNA可以被修饰，以招募具有DNA甲基化、染色质重塑、泛素化、苏酰化等活性的蛋白质。因此，在一些实施例中，本披露的dCRISPR酶和指导RNA可以被修饰以招募具有甲基转移酶活性、去甲基化酶活性、脱氨基化活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性、糖苷酶活性、乙酰转移酶活性、去乙酰化酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素化活性、腺苷酸化活性、去烯基化活性、苏酰化活性、去酰化活性、肉豆蔻酰化活性、重塑活性、蛋白酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂解酶活性、异构酶活性、合酶活性、合成酶活性、脱肉豆蔻酰活性、胞苷脱氨酶活性及其任何组合的因子。
所述RIG-I抑制剂可包含RIG-I CRISPRi。
在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含肽或编码所述肽的核酸分子，其中所述肽是TLR3 412Phe变体、LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro，或其组合和/或衍生物。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含抗RIG抗体或其片段。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含结合RIG-I的肽。在各种实施例中，所述RIG-I抑制剂包含编码所述肽的核酸分子。在各种实施例中，所述核酸分子编码与TLR3 412Phe变体、LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro具有约或至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的肽。在一些实施例中，所述核酸分子编码TLR3 412Phe变体、LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro的片段。在各种实施例中，所述片段的长度为约、至少约或小于约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000个氨基酸。
在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂包含抗体(例如，RIG-I抗体)或RIG-I抗体的抗原结合片段。本领域已知的RIG-I抗体包括例如RIG-I单克隆抗体克隆ABM40B5(目录号MBS668020；MyBioSource.com,美国圣地亚哥(San Diego,USA))；RIG-I单克隆抗体克隆ABM4H29(目录号MBS668173；MyBioSource.com,美国圣地亚哥)；RIG-I单克隆抗体克隆D-12(目录号sc-376845；美国圣地亚哥圣克鲁斯生物科学公司(Santa Cruz Biosciences,Santa Cruz,USA))；RIG-I单克隆抗体克隆OTI6C1(目录号LS-C174703；美国西雅图(Seattle,USA)LifeSpan BioSciences)；小鼠IgG抗-DDX58抗体(目录号125746-50ug；美国塞勒姆美国生物公司(United States Biological,Salem,USA))；RIG-I单克隆抗体克隆4G1B6(目录号MA5-31715；Thermo Fisher Scientific[赛默飞世尔科技公司],美国沃尔瑟姆(Waltham,USA))；RIG-I单克隆抗体克隆6C1(目录号VMA00463；伯乐公司(Bio-Rad)，美国赫拉克勒斯市(Hercules,USA))；和RIG-I单克隆抗体克隆Alme-1(目录号V LS-C344928-100；LSBio,美国西雅图)。
在一些实施例中，使用载体将所述RIG-I抑制剂引入眼细胞。例如，在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂是由载体的核苷酸序列编码的多核苷酸、肽、多肽或蛋白质。在一些实施例中，所述载体是慢病毒运载体。所述抑制剂可置于强pol III或pol II启动子的控制下。在一些实施例中，用所述载体转导或转染眼细胞。所述载体可以是表达载体。在一些实施例中，所述载体保持游离。在一些实施例中，所述载体变得染色体整合，任选地使用CRISPR***。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂被染色体整合到眼细胞的基因组中，任选地使用CRISPR***。所述载体可以通过本领域标准的重组DNA技术方法构建。载体可以是质粒、病毒或本领域已知的其他载体，用于在哺乳动物细胞中复制和表达。编码反义RNA的序列的表达可以通过在哺乳动物、优选人细胞中起作用的本领域已知的任何启动子进行。此类启动子可以是诱导型或组成型。此类启动子包括但不限于：SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon,Nature[自然]290:304-310,1981)、包含在Rous肉瘤病毒3′长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等人,Cell[细胞]22:787-797,1980)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]78:1441-1445,1981)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等人,Nature[自然]296:39-42,1982)等。任何类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体均可用于制备重组DNA构建体，其可直接引入组织部位。
施用
在一些实施例中，施用所述RIG-I抑制剂包括使受试者眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触。在各种实施例中，使所述受试者眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触包括用所述抑制剂或编码所述抑制剂的核酸分子转导或转染所述眼细胞。在一些实施例中，使所述受试者眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触包括引入所述RIG-I抑制剂或使所述RIG-I抑制剂在所述眼细胞内转录或表达。在一些实施例中，使所述受试者眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触包括向所述受试者施用所述RIG-I抑制剂并且使所述RIG-I抑制剂进入所述眼细胞。在一些实施例中，使所述受试者眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触包括使所述眼细胞外表面或附属物与所述RIG-I抑制剂物理接触。
本发明的方法可利用许多合适的施用模式来递送包含本文所述方法的RIG-I抑制剂的配制品。在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂作为药物组合物施用。在各种实施例中，本发明提供包含所述RIG-I抑制剂的药物组合物。可以通过局部或全身施用将所述RIG-I抑制剂递送到身体的受影响区域。合适配制品和其他载剂描述于Remington“The Science andPractice of Pharmacy[药学的科学与实践]”(第20版,Lippincott Williams&Wilkins,马里兰州巴尔的摩(Baltimore MD))，其教导通过援引以其全文并入。
在一些实施例中，全身施用所述RIG-I抑制剂。可以设想，有效的治疗可以包括通过口服施用、外部施用、通过注射、鼻内、直肠、经皮、通过浸渍或涂覆的装置(诸如眼***物或植入物)或离子电渗以及其他施用途径来施用所述RIG-I抑制剂。在一些实施例中，本发明提供了用于向受试者施用的药物组合物，其包含：(i)有效量的RIG-I抑制剂；和(ii)适于口服施用的药物赋形剂。在一些实施例中，所述组合物进一步包含：(iii)有效量的第二治疗剂。对于通过注射施用，所述药物组合物可以肌肉注射、动脉内注射、皮下注射或静脉注射。可以采用泵机构在预选的时间段内施用所述药物组合物。
在一些实施例中，非全身施用所述RIG-I抑制剂。在一些实施例中，将所述RIG-I抑制剂局部施用于所述受试者的眼睛，例如，外部施用于所述眼睛表面。对于本发明的一些实施例，期望局部递送所述RIG-I抑制剂，因此可以在眼周、眼内、结膜下、球后或前房内进行注射。
在一些实施例中，以单剂量施用所述RIG-I抑制剂。当RIG-I抑制剂与另一种物质共同施用治疗急性病症时，也可使用单剂量RIG-I。
在一些实施例中，所述RIG-I抑制剂(单独或与其他药物组合)以多剂量施用。在另一个实施例中，所述RIG-I抑制剂和另一种治疗物质一起施用。
只要需要，本发明的药物组合物的施用可以持续。在一些实施例中，本发明的组合物施用超过1、2、3、4、5、6、7、14或28天。在一些实施例中，本发明的药物组合物施用少于28、14、7、6、5、4、3、2或1天。在一些实施例中，本发明的药物组合物在持续基础上长期施用。
本发明方法中所述RIG-I抑制剂的给药可通过常规实验发现。示例性剂量可为约、至少约或不超过约10μg至约5g。每日剂量范围可取决于所述RIG-I抑制剂的形式，例如，本文所述的施用途径。
配制品
本发明的RIG-I抑制剂可以配制成无菌溶液或悬浮液，在本领域公知的合适媒介物中。合适配制品和其他载剂描述于Remington“The Science and Practice of Pharmacy[药学的科学与实践]”(第20版,Lippincott Williams&Wilkins,马里兰州巴尔的摩)，其教导通过援引以其全文并入。
对于可注射配制品，所述媒介物可选自本领域已知的合适的那些，包括水溶液或油悬浮液或乳剂，其中含有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油，以及甘草素、甘露醇、葡萄糖或无菌水溶液，以及类似的药物媒介物。
可以调节RIG-I抑制剂的浓度、缓冲溶液的pH值和等渗性，以与静脉注射相容，这是本领域公知的。
口服配制品可以是片剂、胶囊、***片、丸剂、薄片、口香糖、锭剂、水溶液或悬浮液、油性悬浮液、糖浆、酏剂或分散性粉末或颗粒等，并且可以以本领域已知的任何方式制备。口服配制品也可能含有甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。片剂形式的药学上可接受的赋形剂可包含无毒成分，诸如惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠等。
在口服片剂的情况下，通常使用的载剂包括乳糖和玉米淀粉，并且通常添加润滑剂诸如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的载剂包括乳糖和玉米淀粉。载剂和赋形剂的其他非限制性实例包括牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油、胶质和二醇。
可用于形成本发明的药物组合物和剂型的表面活性剂包括但不限于亲水性表面活性剂、亲脂性表面活性剂及其混合物。也就是说，可以使用亲水性表面活性剂的混合物，可以使用亲脂性表面活性剂混合物，或者可以使用至少一种亲水性表面活性剂和至少一种亲脂性表面活化剂的混合物。
当配制用于口服施用的本发明化合物时，可能需要利用胃滞留配制品来增强胃肠道(GI)的吸收。在胃中保留数小时的配制品可以缓慢释放本发明的化合物，并且提供在本发明的一些实施例中可能优选的持续释放。此类胃滞留配制品的披露内容见Klausner,E.A.；Lavy,E.；Barta,M.；Cserepes,E.；Friedman,M.；Hoffman,A.2003“Novelgastroretentive dosage forms:evaluation of gastroretentivity and its effecton levodopa in humans.[新型胃滞留剂型：评价胃滞留性及其对人左旋多巴的影响]”Pharm.Res.[药物研究]20,1466-73,Hoffman,A.；Stepensky,D.；Lavy,E.；Eyal,S.Klausner,E.；Friedman,M.2004“Pharmacokinetic and pharmacodynamic aspects ofgastroretentive dosage forms[胃滞留剂型的药代动力学和药效学方面]”Int.J.Pharm.[国际药学杂志]11,141-53,Streubel,A.；Siepmann,J.；Bodmeier,R.；2006“Gastroretentive drug delivery systems[胃滞留药物递送***]”Expert Opin.DrugDeliver.[药物递送专家观点]3,217-3,和Chavanpatil,M.D.；Jain,P.；Chaudhari,S.；Shear,R.；Vavia,P.R.“Novel sustained release,swellable and bioadhesivegastroretentive drug delivery system for olfoxacin[新型持续释放、可溶胀和生物粘附的氧氟沙星胃滞留药物递送***]”Int.J.Pharm.[国际药学杂志]2006年3月24日电子出版。可膨胀、漂浮和生物粘附技术可用于最大化本发明化合物的吸收。
对于经皮施用，可以使用本领域已知的任何合适的配制品，作为溶液、悬浮液、凝胶、粉末、奶油、油、固体、基于二甲基亚砜(DMSO)的溶液或脂质体配制品，用于贴剂或本领域公知的其他递送***。所述药物组合物还可包含合适的固相或凝胶相载剂或赋形剂，其是允许增加治疗分子穿过皮肤角质层渗透屏障的渗透或帮助递送治疗分子的化合物。这些渗透增强分子中有许多是外用配制品领域培训人员已知的。此类载剂和赋形剂的实例包括但不限于保湿剂(例如，尿素)、二醇(例如，丙二醇)、醇(例如，乙醇)、脂肪酸(例如，油酸)、表面活性剂(例如，肉豆蔻酸异丙酯和十二烷基硫酸钠)、吡咯烷酮、单月桂酸甘油酯、亚砜、萜烯(例如，薄荷醇)、胺、酰胺、烷烃、链烷醇、水、碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物诸如聚乙二醇。用于递送药剂的经皮贴剂的构建和使用在本领域中是众所周知的。参见，例如，美国专利号5,023,252、4,992,445和5,001,139。此类贴片可用于连续、脉动或按需递送药剂。
对于外部施用，眼科领域中使用的用于外部眼施用的所有配制品(例如，滴眼液、***物、眼罩、浸渍隐形眼镜、泵送***、基于二甲基亚砜(DMSO)的溶液悬浮液、脂质体和眼膏)和皮肤科和耳鼻喉科领域中的所有外用配制品(例如，软膏、乳膏、凝胶、粉末、药膏、洗剂、结晶形式、泡沫和喷雾)都可以如本领域已知的那样使用。此外，可以使用用于外部施用至鼻腔的皮肤和粘膜的所有合适的配制品来递送本发明的化合物。本发明的药物组合物可以是用于外部或口服施用的脂质体配制品，其在本领域中已知适用于本发明的目的。
可用于形成本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、葵花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂或其混合物。另外的润滑剂包括，例如，类硅硅胶、合成二氧化硅的凝结气溶胶或其混合物。润滑剂可以任选地以小于所述药物组合物的约1重量％的量加入。
可以制备用于眼睛施用的各种配制品。例如，可以通过在无菌水溶液诸如生理盐水、缓冲溶液等中配制RIG-I抑制剂，或通过在使用前混合待溶解的粉末药物组合物来制备眼液或眼药水。如本领域已知的，可以选择其他媒介物，包括但不限于：平衡盐溶液、盐水溶液、水溶性聚醚诸如聚乙二醇、聚乙烯诸如聚乙烯醇和聚维酮、纤维素衍生物诸如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、石油衍生物诸如矿物油和白凡士林、动物脂肪诸如羊毛脂、丙烯酸聚合物诸如羧聚甲基凝胶、植物脂肪诸如花生油和多糖诸如葡聚糖、以及糖胺聚糖诸如透明质酸钠。如果需要，可以添加通常用于眼药水的添加剂。此类添加剂包括等渗剂(例如，氯化钠等)、缓冲剂(例如，硼酸、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠等)、防腐剂(例如，苯扎氯铵、苯扎氯胺、氯丁醇等)、增稠剂(例如，糖类诸如乳糖、甘露醇、麦芽糖等；例如，透明质酸或其盐，诸如透明质酸钠、透明质酸钾等；例如，粘多糖诸如硫酸软骨素等；例如，聚丙烯酸钠、羧乙烯基聚合物、交联聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素或本领域技术人员已知的其他试剂)。
所述药物组合物的组分的溶解度可通过所述药物组合物中的表面活性剂或其他合适的共溶剂来增强。此类共溶剂包括聚山梨醇酯20、60和80、Pluronic F68、F-84和P-103、环糊精或本领域技术人员已知的其他试剂。此类共溶剂可以约0.01重量％至2重量％的水平使用。
本发明的药物组合物可以配制成不含防腐剂的无菌单位剂量类型。
本发明的药物组合物可以多剂量形式包装。防腐剂可用于预防使用过程中的微生物污染。合适的防腐剂的非限制性实例包括：苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、乙二胺四乙酸二钠、山梨酸、Onamer M或本领域技术人员已知的其他试剂。在某些眼科产品中，此类防腐剂可以0.004％至0.02％的水平使用。在本申请的药物组合物中，防腐剂(如苯扎氯铵)可以0.001重量％至小于0.01重量％，例如0.001重量％至0.008重量％，或约0.005重量％的水平使用。已经发现，0.005％的苯扎氯铵浓度可能足以保护药物组合物免受微生物攻击。
所述RIG-I抑制剂的施用量和施用次数根据患者的性别、年龄和体重、待治疗的症状、期望的治疗效果、施用途径和治疗时间而不同。在一些实施例中，向所述受试者施用1、2、3、4或5次所述RIG-I抑制剂。所述RIG-I抑制剂可每只眼睛每天施用数次，或每天施用一次。
本发明的配制品还可以进一步包括其他药理活性成分，只要它们不违背本发明的目的。在多种活性成分的组合中，考虑到它们的效果和安全性，它们各自的含量可以适当地增加或减少。
试剂盒
本发明还提供了试剂盒。所述试剂盒包括合适包装中本发明的RIG-I抑制剂，以及可包括使用说明、临床研究讨论、副作用列表等的书面材料。所述试剂盒可进一步包含与本发明的RIG-I抑制剂共同施用的另一种治疗剂。在一些实施例中，本发明的治疗剂和RIG-I抑制剂在试剂盒内单独容器中作为单独的组合物提供。在一些实施例中，本发明的治疗剂和RIG-I抑制剂作为所述试剂盒中容器内的单一组合物提供。使用的合适的包装和附加物品(例如，注射器、以最小化暴露于空气的箔包装、分配器等)是本领域已知的并且可以包括在试剂盒中。
实例
本发明还通过以下实例进行描述和证明。在说明书中任何地方使用这些和其他实例是说明性的，并且绝不限制本发明或任何示例性术语的范围和含义。同样，本发明不限于在实施例中描述的任何特定优选实施例。本领域技术人员在阅读本说明书后，本发明的许多修改和变化可能是显而易见的，并且可以在不背离本发明的精神或范围的情况下进行此类变化。本发明仅受所附权利要求的限制，包括这些权利要求所享有的等同权利的全部范围。
实例1：人AMD供体眼睛中I型IFN应答升高
为了确定I型IFN应答信号传导途径的组分是否存在于眼组织中，并且研究基因表达与疾病病理的相关性，分析了来自GA患者和非AMD对照患者的超新鲜人供体眼睛。分析视网膜切片中IFN调节因子3(IRF3)的表达，据信其与IFN刺激应答元件(ISRE)结合，以诱导IFN基因的转录(6，7)。视网膜组织切片的免疫组化(IHC)分析表明，IRF3在正常人供体眼眼睛的RPE和脉络膜层中表达(图1A)。IRF3在这些组织层中的表达表明RPE细胞和脉络膜细胞可产生IFN。
RNAScope被用于进一步研究哪些细胞对IFN有应答。简而言之，根据制造商的说明，使用
Figure BDA0004113405700000561
2.5LS-试剂盒-RED(Advanced Cell Diagnostics，加利福尼亚州海沃德(Hayward,CA))和ISG15(NM_467748)特异性探针对***固定石蜡包埋的视网膜样品进行原位杂交。ISG15是干扰素刺激基因(ISG)(8-10)，在GA患者的大多数眼细胞中高度表达，包括RGC、ONL、INL和RPE细胞(图1B)。在非AMD对照患者供体眼睛中未观察到ISG15表达(图1B)。这些结果表明，所述IFN应答在GA患者视网膜组织中被激活，但在非AMD患者的眼组织中未被激活。表1提供了患者信息。
表1.用于IHC和RNAScope的患者信息。
患者ID 年龄 性别 黄斑病理
供体1 67 M 当量浓度
供体2 73 M 当量浓度
供体3 83 F 当量浓度
供体4 78 M 当量浓度
供体5 84 M 当量浓度
供体6 93 F GA
供体7 94 F GA
供体8 90 M GA
供体9 85 F GA
实例2：RPE细胞既能产生IFN，也能对IFN进行应答
由于在来自人供体RPE细胞中观察到IFN应答信号传导组分和IFN刺激基因mRNA表达，因此对RPE细胞进行评估，以表征RPE细胞中IFN应答机制及其对眼部病理的贡献。为了评估各种刺激的效果，将ARPE-19(自发产生的RPE细胞系)和来自多个供体的诱导多能干(iPS)衍生RPE细胞与THP-1细胞(用作对照细胞系的人单核细胞系)一起用于体外实验。为了测试这些细胞中IFN信号传导的机制，测试了核酸转染诱导的IFN产生和下游IFN信号传导标记物。评估了三种主要类型的IFN应答：I型(例如，IFNα和IFNβ)、II型(例如，IFNγ)和III型(例如，IFNλ)。为了表征IFN产生，使用包括DNA和RNA的总细胞核酸(NA)提取的转染来刺激细胞，以避免对单个传感器的任何偏见。用0.25μg/ml NA(图2A)或0ng/ml NA、0.1ng/ml NA和1ng/ml NA，10ng/ml NA或100ng/ml NA的NA转染细胞(图2B和2C)。转染后24小时，使用Meso Scale Discovery板(Meso Scale Diagnostics，马里兰州洛克维尔(Rockville,MD))通过ELISA检测细胞提取物中的IFN表达。简而言之，使用细胞裂解缓冲液(CST#9803)提取裂解物，并且补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。使用IFNβ(R&D#DY814)、IFNα1(abcam#ab215408)、IFNγ(R&D#DY285B)和IFNλ1/3(R&D#DY1598B)的抗体对，在384孔板中测量裂解物或条件培养基。IFN根据制造商说明测量IFN蛋白水平，并且在Meso Sector S 600成像仪上检测。在NA转染的RPE细胞和THP-1细胞中检测IFNβ和IFNλ(图2A至2C)。
为了测试IFN是否可诱导IFN应答，如果可以，哪些IFN可以诱导IFN应答，用不同的IFN(IFNα1、IFNβ、IFNγ或IFNλ1/2/3)处理细胞，并且测量ISG15诱导。用不同的IFN类型分别以100ng/ml(图2D)或0ng/ml IFN、0.1ng/ml IFN、1ng/ml IFN、10ng/ml IFN或100ng/mlIFN处理细胞(图2E和2F)。如上所述，在治疗24小时后，使用ISG15的抗体对(R&D#AF4845，#A-830)通过ELISA检测ISG15的表达。在用不同的IFN类型处理后，RPE细胞系和THP-1细胞应答具有下游ISG15激活的I型IFN刺激(图2D-2E)。总之，这些数据表明RPE细胞含有产生IFN的必要组分，即IFNβ和λ，并且通过激活下游IFN信号传导对IFN刺激(主要是IFNβ刺激)做出应答。
实例3：RIG-I作为RPE细胞内RNA主要传感器的鉴定
在显示RPE细胞能够产生和应答IFN后，研究了IFN诱导刺激的识别机制。为了选择合适的诱导剂用于进一步评估，用媒介物或不同的核酸(dsDNA-EC、G3-YSD、Poly(dA:dT)、3p-hpRNA或Poly(I:C)；各自0.25μg/ml)攻击RPE细胞和THP-1细胞24小时。如上所述，通过ELISA检测ISG15的表达。THP-1细胞通过产生ISG15对多种DNA和RNA刺激作出应答，而cGASKO THP-1细胞(InvivoGen，美国圣地亚哥)对任何DNA诱导剂均无反应，但poly(dA:dT)除外(图3A)。值得注意的是，据报道，poly(dA:dT)通过RIG-I经由RNA聚合酶III转录的RNA媒介物间接激活IFN通路(11，12)。令人惊讶的是，ARPE-19和iPS-RPE细胞都对RNA诱导剂有应答，但对DNA诱导剂没有应答(图3A)，这表明RPE细胞几乎没有或根本没有能力感测和对DNA或不通过RNA媒介物激活IFN的DNA有应答。
为了鉴定响应RPE细胞内核酸诱导剂的IFN通路激活的传感器，进行了靶向ARPE-19细胞中IFN通路关键节点的体外siRNA敲除筛选。使用Qiagen(Hilden，德国)或Dharmacon(Lafayette，CO)对siRNA进行敲除。阴性对照siRNA(对照)购自Qiagen。使用Dharmafect 4(Dharmacon)在ARPE-19细胞中转染siRNA。用1pmol siRNA/96孔培养皿转染细胞。使用实时逆转录(RT)-PCR验证敲除效率。
不同的核酸，包括市售的DNA/RNA模拟物(poly(I:C)；3p-hpRNA)或从细胞中分离的总核酸含量(NA)或纯化的线粒体(mtNA)作为诱导剂在用siRNA转染的ARPE-19细胞中以0.25μg/ml进行测试。在核酸刺激后24小时，使用IFNβ人组织培养试剂盒(MesoscaleDiscovery，马里兰州洛克维尔)测量ARPE-19细胞的IFNβ释放。转录调节因子IRF3的敲除被用作阳性对照。IRF3敲低显著抑制了核酸刺激诱导的IFNβ生成(图3B)。有趣的是，在测试的多种NA传感机制中，除了IRF3之外，在RIG-I和MAVS敲除组中观察到IFNβ产生的最显著减少(图3B)。这些结果表明，RIG-I–MAVS–IRF3通路是RPE细胞感知细胞内刺激的关键途径。
在ARPE-19细胞中使用CRISPR/Cas9 KO实验进一步验证了RIG-I作为细胞内核酸传感器的重要性。产生了稳定表达Cas9的ARPE-19细胞系(ARPE19-Cas9)以及对照gRNA和RIG-I gRNA转导的细胞系。通过慢病毒感染ARPE-19-Cas9细胞中的sgRNA表达产生ARPE-19对照gRNA和ARPE-19RIG-I gRNA细胞。靶向DDX58/RIG-I的sgRNA序列为5’-ACTCACCCTCCCTAAACCAG–3’(SEQ ID NO:1)。使用的对照sgRNA序列为：5’–GTAGCGAACGTGTCCGGCGT–3’(SEQ ID NO:8)、5’–GACCGGAACGATCTCGCGTA–3’(SEQ ID NO:9)、5’-GGCAGTCGTTCGGTTGATAT–3’(SEQ ID NO:10)和5’-GCTTGAGCACATACGCGAAT–3’(SEQ IDNO:11)。ARPE19-Cas9细胞显示出与亲代ARPE-19细胞相似的核酸感应谱，如IFNβ产生所确定的(图4A)。此外，与亲代细胞相比，对照gRNA转导的细胞显示出相似的核酸感应谱，但RIG-I gRNA转导的细胞的IFNβ分泌应答在响应所有测试的核酸种类时被完全消除(图4A)。用0.25μg/ml核酸刺激所有细胞24小时，然后用ELISA测量IFNβ分泌。这些结果证实了RIG-I是体外RPE细胞中I型IFN反应性的关键传感器。
除了I型IFN应答外，核酸传感还可以激活NFκB依赖性细胞因子释放。在核酸刺激24小时后，在ARPE19-Cas9、对照gRNA和RIG-I gRNA细胞系培养物中测量IL-6分泌，以评估RPE细胞中核酸诱导的NFκB激活。用0.25μg/ml核酸刺激所有细胞24小时，然后用ELISA测量IL-6分泌。有趣的是，与IFN应答相反，poly(I:C)诱导的IL-6释放在ARPE-19-RIG-I KO中仅部分减少(图4B)，这表明另一种RNA传感器(例如，TLR3)在poly(I:C)在RPE细胞中诱导的细胞因子释放中起作用，与先前的报告一致(13)。此外，在ARPE-19细胞中观察到对poly(dA:dT)的轻微应答(图3A)，可能类似于THP-1-Dual KO-cGAS细胞，其中poly(dA:dT)可以被识别并且通过RIG-I间接启动下游信号传导。这与poly(dA:dT)在ARPE-19-RIG-I KO细胞中不诱导下游信号传导产生IFNβ的结果一致(图4A)。
为了研究GA患者样品中RIG-I的表达，分别使用RNAscope和IHC测量RIG-I mRNA和蛋白水平的表达。观察到RIG-I mRNA表达较低，但在对照人供体的视网膜组织中可检测到，并且在GA患者眼睛中相对上调，特别是在视网膜神经节细胞(RGC)、内核层(INL)、外核层(ONL)和RPE层中(图5A)，这与RIG-I作为众所周知的哺乳动物ISG一致(14)。与转录水平相反，令人惊讶的是，在GA患者和年龄匹配的对照中，仅在RPE和脉络膜层中观察到RIG-I蛋白(图5B)，这表明转录后机制可能参与调节非RPE细胞类型中RIG-I的表达。有趣的是，与对照组患者相比，GA患者RPE细胞中的RIG-I蛋白水平仍然增强(图5B)，进一步支持RIG-I在RPE细胞中的关键作用。
实例4：RPE细胞中未检测到cGAS表达
虽然据报道，DNA传感器cGAS在感知Alu-RNA诱导的RPE变性中发挥了主要作用(4)，但令人惊讶的是RPE细胞无法感知DNA(图3A)，并且cGAS不参与感知mtNA(图3B)。为了进一步证实，体外评估了THP1、THP1 cGAS KO、ARPE19和iPS-RPE细胞中cGAS表达和功能。使用用于免疫印迹的cGAS抗体测量cGAS的表达(CST#15102；Cell Signaling Technology；美国马萨诸塞州丹弗斯(Danvers,MA,USA))，使用THP1 Dual KO cGAS细胞进行验证(图6A)。还使用SuperSignalTMWest Femto最大灵敏度基质(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific)；美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)测量ISG15表达。通过免疫印迹(CST#5125)测定β-肌动蛋白。细胞要么不受刺激，要么用0.25μg/ml的DNA或RNA刺激。令人惊讶的是，在没有核酸刺激的情况下，在ARPE-19或iPS-RPE细胞中均未检测到cGAS蛋白(图6A)。通过ELISA观察到类似的模式，其中在THP-1细胞中检测到cGAS，但在阴性对照THP1-Dual KO-cGAS细胞中未检测到，并且在ARPE-19或iPS-RPE细胞中未发现(图6B)。对于ELISA，使用抗体对检测cGAS(Cayman#23853，Cayman Chemical，美国密歇根州安娜堡(Ann Arbor,MI,USA)；和CST#66546，Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯(Danvers,MA,USA))。这些结果表明，在RPE细胞中核酸刺激后，cGAS蛋白的基础表达低于免疫印迹或ELISA的检测极限。
此外，先前的报告表明，cGAS可能在I型IFN应答期间作为ISG被诱导(15，16)。然而，当DNA或RNA用于体外刺激THP1、THP1cGAS KO、ARPE19和iPS-RPE细胞时，在ARPE-19或iPS-RPE细胞中均未观察到cGAS表达(图6A和6B)。
此外，据报道，cGAS蛋白可能主要存在于细胞核中，与基因组DNA相互作用，并可能被基因组DNA隔离(17)。为了测试这种可能性，在提取总核蛋白后，越来越多的高剂量盐被用于分离蛋白质和基因组DNA。组蛋白被用作对照，以显示高剂量氯化钠处理后染色质结合蛋白被释放。然而，在氯化钠处理之后，ARPE19或iPS-RPE细胞中未检测到cGAS(图6C)。这些观察证实了RPE细胞对DNA刺激没有应答(图3A)，排除了RPE中非常低水平的cGAS活性的可能性。
此外，cGAS基因表达水平使用布洛德研究所(剑桥，马萨诸塞州)的单细胞门户网站进行可视化。cGAS主要在髓细胞和血管细胞中表达，但不在RPE中表达。本分析中使用的RNA序列数据在Orozco,L.D.等人“Integration of eQTL and a Single-Cell Atlas inthe Human Eye Identifies Causal Genes for Age-Related Macular Degeneration,[在人眼中整合eQTL和单细胞图谱确定年龄相关性黄斑变性的因果基因]”Cell Reports[细胞通讯],30:1246-1259.e6(2020)中进行了描述。
实例5：IFN应答通过RIG-I而非cGAS改变RPE屏障功能
为了评估IFN对RPE屏障功能的影响，在iPS-RPE细胞的3D培养物中测量了跨上皮电阻(TER)。简而言之，通过使用cellZscope 2(NanoAnalytics GmbH，Münster，德国)每15分钟监测一次TER来评估RPE细胞的屏障功能。确定特定时间(Ωcm2)下单个单层的电阻值，减去空白过滤器和培养基产生的背景电阻(0％)，并且在刺激前标准化为基线电阻(100％)。
当用IFNβ处理细胞时，屏障功能受损，而用抗IFNβ抗体联合治疗能够预防IFNβ诱导的损伤(图7A和7D)。此外，RNA而非DNA的转染导致TER损伤(图7B和7D)。此外，与抗IFNβ抗体联合治疗可预防RNA诱导的损伤或TER(图7C和7D)。这些结果进一步支持了RPE细胞中IFN应答是通过RNA而不是DNA的传感器诱导的这一发现。
实例6：RNAseq数据分析
对最近发表的RNAseq数据集(23)的分析显示，AMD晚期ISG较高(图8)。具体而言，分析了AMD 1级和4级患者的RIG-I、GBP4、IFI16、IFIT2、ISG15、OAS1、PARP12和SP110水平。晚期AMD患者组织中ISG的显著增加进一步表明GA患者中出现I型IFN应答增加。
材料与方法
除非在具体实例中另有描述，否则使用以下材料和方法。
人样品
从Lions Eye Bank收集超新鲜(死后<6小时)人供体眼睛，包括地图状萎缩(GA)和非AMD对照患者。
免疫组化(IHC)和RNAScope
对于IHC，将眼睛在10％中性缓冲***中固定2天。将眼睛嵌入石蜡中，通过视神经连续切片，厚度为5μm，并且根据制造商的说明使用Leica Bond RX进行抗体染色。用Aperio AT2扫描仪拍摄20倍和40倍图像。分别使用THP-1-Dual和THP-1-Dal KO-IRF3细胞、A549 Dual和A549 Dual-KO-RIG-I细胞(InvivoGen，加利福尼亚州圣地亚哥；图9A-D)验证IRF3(Abcam-ab68481，艾博抗公司(Abcam)，英国剑桥(Cambridge,United Kingdom))和RIG-I(LsBIO LS-C344928，LifeSpan BioSciences,华盛顿州西雅图(San Diego,CA))抗体的特异性。IgG抗体用作阴性对照(图9E)。
对于RNAscope，根据制造商的说明，使用
Figure BDA0004113405700000631
2.5LS-试剂盒-RED(Advanced Cell Diagnostics，加利福尼亚州海沃德(Hayward,CA))和ISG15(NM_467748)或RIG-I(NM_550268)特异性探针对***固定石蜡包埋的视网膜样品进行原位杂交。PPIB和DapB(高级细胞诊断)探针分别用作阳性对照(数据未显示)和阴性对照(图9F)。
细胞培养物
ARPE-19购自ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯(Manassas,VA)；CRL-2302)。在37℃和5％CO2下，将ARPE-19在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)(西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)，密苏里州圣路易斯市(St.Louis,MO))和1％青霉素/链霉素(Gibco BRL，纽约州格兰德岛(Grand Island,NY))的DMEM/F12(Gibco Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德市(Carlsbad,CA))中培养。除非另有规定，否则在接种后至少3周培养细胞以形成成熟的单层。
iCell-RPE是iPS衍生的RPE细胞系，购自FUJIFILM Cellular Dynamics(威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))，并且在图中表示。iPS-RPE结果通过至少2-3个不同的供体进一步验证。细胞在37℃和5％ CO2的Lonza RtEGM培养基(龙沙公司(Lonza)，瑞士巴塞尔(Basel,Switzerland))中培养。iPS-RPE细胞在组织培养处理板上培养，或在Falcon跨膜***物上培养，用于极化(康宁公司(Corning)，纽约州康宁(Corning,NY)；353095)。接种后至少3周培养细胞以形成成熟的单层。
THP1-Dual、THP1-Dual KO-IRF3和THP-1-Dual KO-cGAS细胞以及A549-Dual和A549-Dual KO-RIG-I细胞购自InvivoGen，并且按照制造商的方案制备和培养细胞。通过免疫印迹验证KO细胞系(图9A和9C)。
通过ARPE-19细胞的慢病毒转导产生稳定表达Cas9基因(ARPE19-Cas9)的ARPE-19。使用TransIT-293转染试剂(MirusBio，威斯康星州麦迪逊(Madison,WI))从与内部慢病毒载体pNGx_LV_c010(39)和慢病毒包装质粒混合物(Cellecta，加利福尼亚州山景城(Mountain View,CA)；#CPCP-K2A)共转染的HEK-293T细胞(ATCC)的上清液中收获病毒。用125μg/mL HygromycinB(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德市)选择ARPE19-Cas9细胞，并且使用Anti-FLAG一级抗体(西格玛奥德里奇#F1804)通过免疫印迹验证Cas9表达。使用内部慢病毒载体pNGx_LV_g003，通过慢病毒感染在ARPE-19-Cas9细胞中的sgRNA表达产生ARPE-19RIG-I KO细胞(39)。靶向DDX58/RIG-I的sgRNA序列为5’–ACTCACCCTCCCTAAACCAG–3’(SEQ ID NO:1)。对照sgRNA序列为：5’–GTAGCGAACGTGTCCGGCGT–3’(SEQ ID NO:8)、5’–GACCGGAACGATCTCGCGTA–3’(SEQ ID NO:9)、5’-GGCAGTCGTTCGGTTGATAT–3’(SEQ ID NO:10)和5’-GCTTGAGCACATACGCGAAT–3’(SEQ ID NO:11)。通过免疫印迹验证了敲除(图10D)。
试剂
IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNλ1/2/3购自R&D Systems(明尼苏达州明尼阿波利斯(Minneapolis,MN))。dsDNA-EC、YSD、polydA:dT、poly(I:C)-LMW、3p-hpRNA购自InvivoGen。根据制造商说明，使用核酸分离试剂盒(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)从ARPE-19中分离总核酸(NA)。通过使用哺乳动物细胞线粒体分离试剂盒(赛默飞世尔科技公司)分离ARPE-19线粒体，然后使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen)从线粒体制剂中分离核酸，制备富含线粒体的总核酸(mtNA)。应用抗IFNβ抗体(InvivoGen)中和IFNβ。
免疫印迹和酶联免疫吸附测定(ELISA)
收获培养上清液，根据制造商的方案，使用补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(赛默飞世尔科技公司)的RIPA细胞裂解缓冲液(Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯(Danvers,MA))提取全细胞裂解物。使用前，所有样品均存储在-80℃。
对于免疫印迹，将样品(30μg蛋白质)溶解在样品缓冲液(英杰公司)中，并且在100℃下煮沸5分钟。然后通过CriterionTMTGXTM预制凝胶电泳分离和电转移到硝化纤维素膜上(伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯市(Hercules,CA))。使用MagicMarkTMXP WesternProtein Standard(英杰公司)作为分子量指示剂。使用在Tris缓冲盐水和Tween20(TBST)中的5％牛奶封闭膜1h。用TBST洗涤三次后，将膜与购自Cell Signaling Technology的一级抗体(包括cGAS(CST#15102)、IRF3(CST#11904)、RIG-I(CST#3743)、组蛋白H3(CST#4499)、β-肌动蛋白(CST#5125)和GAPDH(CST#8884))以1:1000稀释度孵育过夜。用TBST洗涤三次后，用二级抗体孵育膜(抗兔IgG-HRP连接抗体，1:1000稀释；Cell SignalingTechnology)1小时。使用SuperSignalTM West Femto最大灵敏度基质(赛默飞世尔科技公司)检测免疫反应蛋白，并且在FluorChem M(ProteinSimple，加利福尼亚州圣何塞(SanJose,CA))上成像。
对于ELISA，使用Meso Scale Discovery板(Meso Scale Diagnostics，马里兰州洛克维尔)进行测定。使用细胞裂解缓冲液(CST#9803)提取裂解物，并且补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。使用ISG15(R&D#AF4845，#A-830)、IFNβ(R&D#DY814)、IFNα1(abcam#ab215408)、IFNγ(R&D#DY285B)、IFNλ1/3(R&D#DY1598B)和cGAS(Cayman#23853，CST#66546)的抗体对，在384孔板中测量裂解物或条件培养基。根据制造商说明测量蛋白水平，并且在MesoSector S 600成像仪上检测。
RNA干扰
使用Qiagen(德国希尔登(Hilden,Germany))或Dharmacon(科罗拉多州拉斐特(Lafayette,CO))小干扰RNA(siRNA)对I型IFN通路的关键节点进行RNA干扰。AllStars和阴性对照siRNA购自Qiagen，并且用作阴性对照。根据制造商的说明，使用Dharmafect 4(Dharmacon)在ARPE-19细胞中转染siRNA。用1pmol/96孔培养皿转染细胞，通过IFNβ人组织培养试剂盒(Mesoscale Discovery，马里兰州洛克维尔)测量IFNβ释放。使用实时逆转录(RT)-PCR验证了敲除效率(图10A)。
实时RT-PCR
使用TurboCapture 96mRNA试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从用指定siRNA处理的ARPE-19细胞中分离信使RNA，并且使用高容量cDNA逆转录试剂盒(美国应用生物***公司(Applied Biosystems)，加利福尼亚州福斯特市(Foster City,CA))逆转录RNA。使用靶向感兴趣的基因的FAM标记的Taqman探针和靶向β-肌动蛋白的VIC标记的Takman探针作为对照(美国应用生物***公司)进行实时PCR。根据制造商的说明，在ViiA7***(美国应用生物***公司)上使用Taqman Universal PCR Master Mix进行反应。
跨上皮电阻(TER)
通过cellZscope 2(NanoAnalytics GmbH，Münster，德国)每15分钟监测一次TER来评估RPE细胞的屏障功能。确定特定时间(Ωcm2)下单个单层的电阻值，减去空白过滤器和培养基产生的背景电阻(0％)，并且在刺激前标准化为基线电阻(100％)。
数据分析
通过ELISA测量的蛋白水平以绝对量表示，并且通过qPCR测定的基因水平通过β-肌动蛋白归一化。进行了三次独立实验，每个实验中三次，并且给出了值(平均值±S.D.)。使用学生t检验对两组进行比较。使用方差分析和事后纽曼-科伊尔斯检验进行多次比较。差异在p<0.05时被认为是显著的。
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***
本发明在范围上不受本文所述的具体实施例的限制。实际上，根据上述说明和附图，除了本文所述的那些修改之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。还应理解，所有值都是近似值，并且提供用于说明。
除非另外指明，否则本文的数值范围的列举仅旨在用作分别指代落入所述范围内的每个单独值和每个端点的简写方法，并且每个单独值和端点都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独叙述一样。
本申请中引用了专利、专利申请、出版物、产品描述和协议，出于所有目的，其披露内容通过援引以其全文并入本文。
                               序列表
<110> 诺华股份有限公司
<120> 视网膜变性疾病的治疗
<130> PAT058930-WO-PCT
<140>
<141>
<150> 63/063,877
<151> 2020-08-10
<160> 13
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列：合成寡核苷酸描述”
<400> 1
actcaccctc cctaaaccag                                                  20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列：合成寡核苷酸描述”
<400> 2
aagggaacga ttccatcact a                                                21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列：合成寡核苷酸描述”
<400> 3
ttctacagat ttgctctact a                                                21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列：合成寡核苷酸描述”
<400> 4
ctcctcctac ccggctttaa a                                                21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列：合成寡核苷酸描述”
<400> 5
cagaattatc ccaaccgata t                                                21
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Gly Asn Arg Asp Thr Leu Trp His Leu Phe Asn Thr Leu Gln Arg Arg
1               5                   10                  15
Pro Gly Trp Val Glu Tyr Phe Ile
            20
<210> 7
<211> 540
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Met Pro Phe Ala Glu Asp Lys Thr Tyr Lys Tyr Ile Cys Arg Asn Phe
1               5                   10                  15
Ser Asn Phe Cys Asn Val Asp Val Val Glu Ile Leu Pro Tyr Leu Pro
            20                  25                  30
Cys Leu Thr Ala Arg Asp Gln Asp Arg Leu Arg Ala Thr Cys Thr Leu
        35                  40                  45
Ser Gly Asn Arg Asp Thr Leu Trp His Leu Phe Asn Thr Leu Gln Arg
    50                  55                  60
Arg Pro Gly Trp Val Glu Tyr Phe Ile Ala Ala Leu Arg Gly Cys Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Asp Leu Ala Asp Glu Val Ala Ser Val Tyr Gln Ser Tyr Gln
                85                  90                  95
Pro Arg Thr Ser Asp Arg Pro Pro Asp Pro Leu Glu Pro Pro Ser Leu
            100                 105                 110
Pro Ala Glu Arg Pro Gly Pro Pro Thr Pro Ala Ala Ala His Ser Ile
        115                 120                 125
Pro Tyr Asn Ser Cys Arg Glu Lys Glu Pro Ser Tyr Pro Met Pro Val
    130                 135                 140
Gln Glu Thr Gln Ala Pro Glu Ser Pro Gly Glu Asn Ser Glu Gln Ala
145                 150                 155                 160
Leu Gln Thr Leu Ser Pro Arg Ala Ile Pro Arg Asn Pro Asp Gly Gly
                165                 170                 175
Pro Leu Glu Ser Ser Ser Asp Leu Ala Ala Leu Ser Pro Leu Thr Ser
            180                 185                 190
Ser Gly His Gln Glu Gln Asp Thr Glu Leu Gly Ser Thr His Thr Ala
        195                 200                 205
Gly Ala Thr Ser Ser Leu Thr Pro Ser Arg Gly Pro Val Ser Pro Ser
    210                 215                 220
Val Ser Phe Gln Pro Leu Ala Arg Ser Thr Pro Arg Ala Ser Arg Leu
225                 230                 235                 240
Pro Gly Pro Thr Gly Ser Val Val Ser Thr Gly Thr Ser Phe Ser Ser
                245                 250                 255
Ser Ser Pro Gly Leu Ala Ser Ala Gly Ala Ala Glu Gly Lys Gln Gly
            260                 265                 270
Ala Glu Ser Asp Gln Ala Glu Pro Ile Ile Cys Ser Ser Gly Ala Glu
        275                 280                 285
Ala Pro Ala Asn Ser Leu Pro Ser Lys Val Pro Thr Thr Leu Met Pro
    290                 295                 300
Val Asn Thr Val Ala Leu Lys Val Pro Ala Asn Pro Ala Ser Val Ser
305                 310                 315                 320
Thr Val Pro Ser Lys Leu Pro Thr Ser Ser Lys Pro Pro Gly Ala Val
                325                 330                 335
Pro Ser Asn Ala Leu Thr Asn Pro Ala Pro Ser Lys Leu Pro Ile Asn
            340                 345                 350
Ser Thr Arg Ala Gly Met Val Pro Ser Lys Val Pro Thr Ser Met Val
        355                 360                 365
Leu Thr Lys Val Ser Ala Ser Thr Val Pro Thr Asp Gly Ser Ser Arg
    370                 375                 380
Asn Glu Glu Thr Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Gly Ala Thr Gly Gly
385                 390                 395                 400
Ser Ser Ala Trp Leu Asp Ser Ser Ser Glu Asn Arg Gly Leu Gly Ser
                405                 410                 415
Glu Leu Ser Lys Pro Gly Val Leu Ala Ser Gln Val Asp Ser Pro Phe
            420                 425                 430
Ser Gly Cys Phe Glu Asp Leu Ala Ile Ser Ala Ser Thr Ser Leu Gly
        435                 440                 445
Met Gly Pro Cys His Gly Pro Glu Glu Asn Glu Tyr Lys Ser Glu Gly
    450                 455                 460
Thr Phe Gly Ile His Val Ala Glu Asn Pro Ser Ile Gln Leu Leu Glu
465                 470                 475                 480
Gly Asn Pro Gly Pro Pro Ala Asp Pro Asp Gly Gly Pro Arg Pro Gln
                485                 490                 495
Ala Asp Arg Lys Phe Gln Glu Arg Glu Val Pro Cys His Arg Pro Ser
            500                 505                 510
Pro Gly Ala Leu Trp Leu Gln Val Ala Val Thr Gly Val Leu Val Val
        515                 520                 525
Thr Leu Leu Val Val Leu Tyr Arg Arg Arg Leu His
    530                 535                 540
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列：合成寡核苷酸描述”
<400> 8
gtagcgaacg tgtccggcgt                                                  20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列：合成寡核苷酸描述”
<400> 9
gaccggaacg atctcgcgta                                                  20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列：合成寡核苷酸描述”
<400> 10
ggcagtcgtt cggttgatat                                                  20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列：合成寡核苷酸描述”
<400> 11
gcttgagcac atacgcgaat                                                  20
<210> 12
<211> 4628
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
gaacgtagct agctgcaagc agaggccggc atgaccaccg agcagcgacg cagcctgcaa      60
gccttccagg attatatccg gaagaccctg gaccctacct acatcctgag ctacatggcc     120
ccctggttta gggaggaaga ggtgcagtat attcaggctg agaaaaacaa caagggccca     180
atggaggctg ccacactttt tctcaagttc ctgttggagc tccaggagga aggctggttc     240
cgtggctttt tggatgccct agaccatgca ggttattctg gactttatga agccattgaa     300
agttgggatt tcaaaaaaat tgaaaagttg gaggagtata gattactttt aaaacgttta     360
caaccagaat ttaaaaccag aattatccca accgatatca tttctgatct gtctgaatgt     420
ttaattaatc aggaatgtga agaaattcta cagatttgct ctactaaggg gatgatggca     480
ggtgcagaga aattggtgga atgccttctc agatcagaca aggaaaactg gcccaaaact     540
ttgaaacttg ctttggagaa agaaaggaac aagttcagtg aactgtggat tgtagagaaa     600
ggtataaaag atgttgaaac agaagatctt gaggataaga tggaaacttc tgacatacag     660
attttctacc aagaagatcc agaatgccag aatcttagtg agaattcatg tccaccttca     720
gaagtgtctg atacaaactt gtacagccca tttaaaccaa gaaattacca attagagctt     780
gctttgcctg ctatgaaagg aaaaaacaca ataatatgtg ctcctacagg ttgtggaaaa     840
acctttgttt cactgcttat atgtgaacat catcttaaaa aattcccaca aggacaaaag     900
gggaaagttg tcttttttgc gaatcagatc ccagtgtatg aacagcagaa atctgtattc     960
tcaaaatact ttgaaagaca tgggtataga gttacaggca tttctggagc aacagctgag    1020
aatgtcccag tggaacagat tgttgagaac aatgacatca tcattttaac tccacagatt    1080
cttgtgaaca accttaaaaa gggaacgatt ccatcactat ccatctttac tttgatgata    1140
tttgatgaat gccacaacac tagtaaacaa cacccgtaca atatgatcat gtttaattat    1200
ctagatcaga aacttggagg atcttcaggc ccactgcccc aggtcattgg gctgactgcc    1260
tcggttggtg ttggggatgc caaaaacaca gatgaagcct tggattatat ctgcaagctg    1320
tgtgcttctc ttgatgcgtc agtgatagca acagtcaaac acaatctgga ggaactggag    1380
caagttgttt ataagcccca gaagtttttc aggaaagtgg aatcacggat tagcgacaaa    1440
tttaaataca tcatagctca gctgatgagg gacacagaga gtctggcaaa gagaatctgc    1500
aaagacctcg aaaacttatc tcaaattcaa aatagggaat ttggaacaca gaaatatgaa    1560
caatggattg ttacagttca gaaagcatgc atggtgttcc agatgccaga caaagatgaa    1620
gagagcagga tttgtaaagc cctgttttta tacacttcac atttgcggaa atataatgat    1680
gccctcatta tcagtgagca tgcacgaatg aaagatgctc tggattactt gaaagacttc    1740
ttcagcaatg tccgagcagc aggattcgat gagattgagc aagatcttac tcagagattt    1800
gaagaaaagc tgcaggaact agaaagtgtt tccagggatc ccagcaatga gaatcctaaa    1860
cttgaagacc tctgcttcat cttacaagaa gagtaccact taaacccaga gacaataaca    1920
attctctttg tgaaaaccag agcacttgtg gacgctttaa aaaattggat tgaaggaaat    1980
cctaaactca gttttctaaa acctggcata ttgactggac gtggcaaaac aaatcagaac    2040
acaggaatga ccctcccggc acagaagtgt atattggatg cattcaaagc cagtggagat    2100
cacaatattc tgattgccac ctcagttgct gatgaaggca ttgacattgc acagtgcaat    2160
cttgtcatcc tttatgagta tgtgggcaat gtcatcaaaa tgatccaaac cagaggcaga    2220
ggaagagcaa gaggtagcaa gtgcttcctt ctgactagta atgctggtgt aattgaaaaa    2280
gaacaaataa acatgtacaa agaaaaaatg atgaatgact ctattttacg ccttcagaca    2340
tgggacgaag cagtatttag ggaaaagatt ctgcatatac agactcatga aaaattcatc    2400
agagatagtc aagaaaaacc aaaacctgta cctgataagg aaaataaaaa actgctctgc    2460
agaaagtgca aagccttggc atgttacaca gctgacgtaa gagtgataga ggaatgccat    2520
tacactgtgc ttggagatgc ttttaaggaa tgctttgtga gtagaccaca tcccaagcca    2580
aagcagtttt caagttttga aaaaagagca aagatattct gtgcccgaca gaactgcagc    2640
catgactggg gaatccatgt gaagtacaag acatttgaga ttccagttat aaaaattgaa    2700
agttttgtgg tggaggatat tgcaactgga gttcagacac tgtactcgaa gtggaaggac    2760
tttcattttg agaagatacc atttgatcca gcagaaatgt ccaaatgata tcaggtcctc    2820
aatcttcagc tacagggaat gagtaacttt gagtggagaa gaaacaaaca tagtgggtat    2880
aatcatggat cgcttgtacc cctgtgaaaa tatatttttt aaaaatatct ttagcagttt    2940
gtactatatt atatatgcaa agcacaaatg agtgaatcac agcactgagt attttgtagg    3000
ccaacagagc tcatagtact tgggaaaaat taaaaagcct catttctagc cttcttttta    3060
gagtcaactg ccaacaaaca cacagtaatc actctgtaca cactgggata gatgaatgaa    3120
tggaatgttg ggaattttta tctccctttg tctccttaac ctactgtaaa ctggcttttg    3180
cccttaacaa tctactgaaa ttgttctttt gaaggttacc agtgactctg gttgccaaat    3240
ccactgggca cttcttaacc ttctatttga cctctgcgca tttggccctg ttgagcactc    3300
ttcttgaagc tctccctggg cttctctctc ttctagttct attctagtct ttttttattg    3360
agtcctcctc tttgctgatc ccttccaagg gttcaatata tatacatgta tatactgtac    3420
atatgtatat gtaactaata tacatacata caggtatgta tatgtaatgg ttatatgtac    3480
tcatgttcct ggtgtagcaa cgtgtggtat ggctacacag agaacatgag aacataaagc    3540
catttttatg cttactacta aaagctgtcc actgtagagt tgctgtatgt agcaatgtgt    3600
atccactcta cagtggtcag cttttagtag agagcataaa aatgataaaa tacttcttga    3660
aaacttagtt tactatacat cttgccctat taatatgttc tcttaacgtg tgccattgtt    3720
ctctttgacc attttcctat aatgatgttg atgttcaaca cctggactga atgtctgttc    3780
tcagatccct tggatgttac agatgaggca gtctgactgt cctttctact tgaaagatta    3840
gaatatgtat ccaaatggca ttcacgtgtc acttagcaag gtttgctgat gcttcaaaga    3900
gcttagtttg cggtttcctg gacgtggaaa caagtatctg agttccctgg agatcaacgg    3960
gatgaggtgt tacagctgcc tccctcttca tgcaatctgg tgagcagtgg tgcaggcggg    4020
gagccagaga aacttgccag ttatataact tctctttggc ttttcttcat ctgtaaaaca    4080
aggataatac tgaactgtaa gggttagtgg agagttttta attaaaagaa tgtgtgaaaa    4140
gtacatgaca cagtagttgc ttgataatag ttactagtag tagtattctt actaagaccc    4200
aatacaaatg gattatttaa accaagttta tgagttggtt ttttttcatt ttctatttgt    4260
attttattaa gagtgtcttt tcttatgtga ttttttttaa ttgctatttg atatggtttg    4320
gctatatgtc cccacccaaa tctcatcttg aattataatc cccatgtgtc aagggaggga    4380
cctgacggga ggtgattgga tcacgggggc agttgtcccc atgctgttct tgggatagtg    4440
agttagttct catgagatct gatggtttta taagtgtttg acaattcctc ctttacacac    4500
actctctctc tcatctgctg ccatgtaaga cttgcctgct tccccttctg ccatgattgt    4560
aagtttcctg aggcctcctc agccatgtgg aactgtgaat ctattaagcc tcttttcttt    4620
ataaatga                                                             4628
<210> 13
<211> 925
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Thr Thr Glu Gln Arg Arg Ser Leu Gln Ala Phe Gln Asp Tyr Ile
1               5                   10                  15
Arg Lys Thr Leu Asp Pro Thr Tyr Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp
            20                  25                  30
Phe Arg Glu Glu Glu Val Gln Tyr Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys
        35                  40                  45
Gly Pro Met Glu Ala Ala Thr Leu Phe Leu Lys Phe Leu Leu Glu Leu
    50                  55                  60
Gln Glu Glu Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asp His Ala
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ser Gly Leu Tyr Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Lys Lys
                85                  90                  95
Ile Glu Lys Leu Glu Glu Tyr Arg Leu Leu Leu Lys Arg Leu Gln Pro
            100                 105                 110
Glu Phe Lys Thr Arg Ile Ile Pro Thr Asp Ile Ile Ser Asp Leu Ser
        115                 120                 125
Glu Cys Leu Ile Asn Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser
    130                 135                 140
Thr Lys Gly Met Met Ala Gly Ala Glu Lys Leu Val Glu Cys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Thr Leu Lys Leu Ala Leu Glu
                165                 170                 175
Lys Glu Arg Asn Lys Phe Ser Glu Leu Trp Ile Val Glu Lys Gly Ile
            180                 185                 190
Lys Asp Val Glu Thr Glu Asp Leu Glu Asp Lys Met Glu Thr Ser Asp
        195                 200                 205
Ile Gln Ile Phe Tyr Gln Glu Asp Pro Glu Cys Gln Asn Leu Ser Glu
    210                 215                 220
Asn Ser Cys Pro Pro Ser Glu Val Ser Asp Thr Asn Leu Tyr Ser Pro
225                 230                 235                 240
Phe Lys Pro Arg Asn Tyr Gln Leu Glu Leu Ala Leu Pro Ala Met Lys
                245                 250                 255
Gly Lys Asn Thr Ile Ile Cys Ala Pro Thr Gly Cys Gly Lys Thr Phe
            260                 265                 270
Val Ser Leu Leu Ile Cys Glu His His Leu Lys Lys Phe Pro Gln Gly
        275                 280                 285
Gln Lys Gly Lys Val Val Phe Phe Ala Asn Gln Ile Pro Val Tyr Glu
    290                 295                 300
Gln Gln Lys Ser Val Phe Ser Lys Tyr Phe Glu Arg His Gly Tyr Arg
305                 310                 315                 320
Val Thr Gly Ile Ser Gly Ala Thr Ala Glu Asn Val Pro Val Glu Gln
                325                 330                 335
Ile Val Glu Asn Asn Asp Ile Ile Ile Leu Thr Pro Gln Ile Leu Val
            340                 345                 350
Asn Asn Leu Lys Lys Gly Thr Ile Pro Ser Leu Ser Ile Phe Thr Leu
        355                 360                 365
Met Ile Phe Asp Glu Cys His Asn Thr Ser Lys Gln His Pro Tyr Asn
    370                 375                 380
Met Ile Met Phe Asn Tyr Leu Asp Gln Lys Leu Gly Gly Ser Ser Gly
385                 390                 395                 400
Pro Leu Pro Gln Val Ile Gly Leu Thr Ala Ser Val Gly Val Gly Asp
                405                 410                 415
Ala Lys Asn Thr Asp Glu Ala Leu Asp Tyr Ile Cys Lys Leu Cys Ala
            420                 425                 430
Ser Leu Asp Ala Ser Val Ile Ala Thr Val Lys His Asn Leu Glu Glu
        435                 440                 445
Leu Glu Gln Val Val Tyr Lys Pro Gln Lys Phe Phe Arg Lys Val Glu
    450                 455                 460
Ser Arg Ile Ser Asp Lys Phe Lys Tyr Ile Ile Ala Gln Leu Met Arg
465                 470                 475                 480
Asp Thr Glu Ser Leu Ala Lys Arg Ile Cys Lys Asp Leu Glu Asn Leu
                485                 490                 495
Ser Gln Ile Gln Asn Arg Glu Phe Gly Thr Gln Lys Tyr Glu Gln Trp
            500                 505                 510
Ile Val Thr Val Gln Lys Ala Cys Met Val Phe Gln Met Pro Asp Lys
        515                 520                 525
Asp Glu Glu Ser Arg Ile Cys Lys Ala Leu Phe Leu Tyr Thr Ser His
    530                 535                 540
Leu Arg Lys Tyr Asn Asp Ala Leu Ile Ile Ser Glu His Ala Arg Met
545                 550                 555                 560
Lys Asp Ala Leu Asp Tyr Leu Lys Asp Phe Phe Ser Asn Val Arg Ala
                565                 570                 575
Ala Gly Phe Asp Glu Ile Glu Gln Asp Leu Thr Gln Arg Phe Glu Glu
            580                 585                 590
Lys Leu Gln Glu Leu Glu Ser Val Ser Arg Asp Pro Ser Asn Glu Asn
        595                 600                 605
Pro Lys Leu Glu Asp Leu Cys Phe Ile Leu Gln Glu Glu Tyr His Leu
    610                 615                 620
Asn Pro Glu Thr Ile Thr Ile Leu Phe Val Lys Thr Arg Ala Leu Val
625                 630                 635                 640
Asp Ala Leu Lys Asn Trp Ile Glu Gly Asn Pro Lys Leu Ser Phe Leu
                645                 650                 655
Lys Pro Gly Ile Leu Thr Gly Arg Gly Lys Thr Asn Gln Asn Thr Gly
            660                 665                 670
Met Thr Leu Pro Ala Gln Lys Cys Ile Leu Asp Ala Phe Lys Ala Ser
        675                 680                 685
Gly Asp His Asn Ile Leu Ile Ala Thr Ser Val Ala Asp Glu Gly Ile
    690                 695                 700
Asp Ile Ala Gln Cys Asn Leu Val Ile Leu Tyr Glu Tyr Val Gly Asn
705                 710                 715                 720
Val Ile Lys Met Ile Gln Thr Arg Gly Arg Gly Arg Ala Arg Gly Ser
                725                 730                 735
Lys Cys Phe Leu Leu Thr Ser Asn Ala Gly Val Ile Glu Lys Glu Gln
            740                 745                 750
Ile Asn Met Tyr Lys Glu Lys Met Met Asn Asp Ser Ile Leu Arg Leu
        755                 760                 765
Gln Thr Trp Asp Glu Ala Val Phe Arg Glu Lys Ile Leu His Ile Gln
    770                 775                 780
Thr His Glu Lys Phe Ile Arg Asp Ser Gln Glu Lys Pro Lys Pro Val
785                 790                 795                 800
Pro Asp Lys Glu Asn Lys Lys Leu Leu Cys Arg Lys Cys Lys Ala Leu
                805                 810                 815
Ala Cys Tyr Thr Ala Asp Val Arg Val Ile Glu Glu Cys His Tyr Thr
            820                 825                 830
Val Leu Gly Asp Ala Phe Lys Glu Cys Phe Val Ser Arg Pro His Pro
        835                 840                 845
Lys Pro Lys Gln Phe Ser Ser Phe Glu Lys Arg Ala Lys Ile Phe Cys
    850                 855                 860
Ala Arg Gln Asn Cys Ser His Asp Trp Gly Ile His Val Lys Tyr Lys
865                 870                 875                 880
Thr Phe Glu Ile Pro Val Ile Lys Ile Glu Ser Phe Val Val Glu Asp
                885                 890                 895
Ile Ala Thr Gly Val Gln Thr Leu Tyr Ser Lys Trp Lys Asp Phe His
            900                 905                 910
Phe Glu Lys Ile Pro Phe Asp Pro Ala Glu Met Ser Lys
        915                 920                 925

Claims (107)

1.一种用于治疗有需要的受试者的视网膜变性疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的视黄酸诱导基因I(RIG-I)抑制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述视网膜变性疾病或病症是年龄相关性黄斑变性(AMD)。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述AMD是地图状萎缩(GA)。
4.一种用于减少受试者GA病变扩大的进展的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂。
5.一种用于改善受试者视力的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂。
6.一种用于抑制受试者眼睛中RPE变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂。
7.一种用于抑制受试者眼睛中RPE的跨上皮电阻损伤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含小分子化合物、抗体、RIG-I特异性抗体的抗原结合片段、核酸分子、肽、或其衍生物。
9.如权利要求1至8所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-I CRISPRi***。
11.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-I CRISPR-Cas9***。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述RIG-I CRISPR-Cas9***包含含有序列5’–ACTCACCCTCCCTAAACCAG–3’(SEQ ID NO:1)的sgRNA或其衍生物。
13.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-I siRNA。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述RIG-I siRNA包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：5’–AAGGGAACGATTCCATCACTA–3’(SEQ ID NO:2)、5’–TTCTACAGATTTGCTCTACTA–3’(SEQ IDNO:3)、5’–CTCCTCCTACCCGGCTTTAAA–3’(SEQ ID NO:4)和5’–CAGAATTATCCCAACCGATAT–3’(SEQ ID NO:5)。
15.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含肽或编码所述肽的核酸分子，其中所述肽选自由以下组成的组：LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro，或其衍生物。
16.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含SEQ ID NO:6(GNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFI)的肽序列或其衍生物；或编码SEQ ID NO:6的肽或其衍生物的核酸分子。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂进一步包含载体。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述载体是病毒载体，任选地是慢病毒载体。
19.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述小分子化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0004113405690000021
Figure FDA0004113405690000031
或其药学上可接受的盐。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述施用是口服、经皮、外部、肠胃外、注射或吸入。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述施用是局部施用于所述受试者眼睛。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述施用是结膜下、玻璃体内、眼周、球后或前房内。
23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述施用包括使所述受试者的眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触。
24.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中干扰素刺激基因(ISG)的表达。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述ISG是ISG15。
26.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中RIG-I蛋白水平。
27.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中RIG-I mRNA水平。
28.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中IFN应答。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述IFN应答是I型IFN应答。
30.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中I型干扰素的表达和/或分泌。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述I型干扰素是IFNβ。
32.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述施用有效地抑制所述受试者眼细胞中核酸诱导的炎症。
33.如权利要求23至32中任一项所述的方法，其中所述眼细胞是视网膜神经节(RGC)细胞、内核层(INL)细胞、外核层(ONL)细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、脉络膜层细胞或其组合。
34.如权利要求23至32中任一项所述的方法，其中所述眼细胞是RPE细胞。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述INL细胞是水平细胞、双极细胞、无长突细胞、丛间神经元、缪勒氏细胞或其组合。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述ONL细胞是锥形细胞、棒状细胞、感光细胞或其组合。
37.如权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述施用有效地抑制RPE变性。
38.如权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述施用有效地抑制所述RPE的跨上皮电阻损伤。
39.如权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
40.一种用于抑制眼细胞中IFN应答的方法，所述方法包括使所述细胞与RIG-I抑制剂接触。
41.一种用于抑制眼细胞中I型IFN的表达和/或分泌的方法，所述方法包括使所述细胞与RIG-I抑制剂接触。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述I型干扰素是IFNβ。
43.一种用于抑制眼细胞中核酸诱导的炎症的方法，所述方法包括使所述细胞与RIG-I抑制剂接触。
44.一种用于抑制细胞中RIG-I表达的方法，所述方法包括：使所述细胞与RIG-I抑制剂接触。
45.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述眼细胞是视网膜神经节(RGC)细胞、内核层(INL)细胞、外核层(ONL)细胞、视网膜色素上皮(RPE)细胞、脉络膜层细胞或其组合。
46.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述眼细胞是视网膜神经节(RGC)细胞、INL细胞、ONL细胞、RPE细胞、脉络膜层细胞或其组合。
47.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述眼细胞是RPE细胞、脉络膜层细胞或其组合。
48.如权利要求40至44中任一项所述的方法，其中所述眼细胞是RPE细胞。
49.如权利要求46所述的方法，其中所述INL细胞是水平细胞、双极细胞、无长突细胞、丛间神经元、缪勒氏细胞或其组合。
50.如权利要求46所述的方法，其中所述ONL细胞是锥形细胞、棒状细胞、感光细胞或其组合。
51.如权利要求40至50中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含小分子化合物、抗体、RIG-I抗体的抗原结合片段、核酸分子、肽、或其衍生物。
52.如权利要求40至51中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA。
53.如权利要求40至52中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-ICRISPRi***。
54.如权利要求40至52中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-ICRISPR-Cas9***。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述RIG-I CRISPR-Cas9***包含含有序列5’–ACTCACCCTCCCTAAACCAG–3’(SEQ ID NO:1)的sgRNA或其衍生物。
56.如权利要求40至52中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-I siRNA。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述RIG-I siRNA包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：5’–AAGGGAACGATTCCATCACTA–3’(SEQ ID NO:2)、5’–TTCTACAGATTTGCTCTACTA–3’(SEQ IDNO:3)、5’–CTCCTCCTACCCGGCTTTAAA–3’(SEQ ID NO:4)和5’–CAGAATTATCCCAACCGATAT–3’(SEQ ID NO:5)。
58.如权利要求40至51中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含肽或编码所述肽的核酸分子，其中所述肽选自由以下组成的组：LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro，或其衍生物。
59.如权利要求40至51中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含SEQ ID NO:6(GNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFI)的肽序列或其衍生物；或编码SEQ ID NO:6的肽或其衍生物的核酸分子。
60.如权利要求40至59中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂进一步包含载体。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述载体是病毒载体，任选地是慢病毒载体。
62.如权利要求40至51中任一项所述的方法，其中所述小分子化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0004113405690000061
Figure FDA0004113405690000062
或其药学上可接受的盐。
63.如权利要求40至62中任一项所述的方法，其中所述接触有效地减少所述眼细胞中干扰素刺激基因(ISG)的表达。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述ISG是ISG15。
65.如权利要求40至64中任一项所述的方法，其中所述接触有效地减少所述眼细胞中RIG-I蛋白水平。
66.如权利要求40至65中任一项所述的方法，其中所述接触有效地减少所述眼细胞中RIG-I mRNA水平。
67.如权利要求40至66中任一项所述的方法，其中所述接触有效地减少所述眼细胞中IFN应答信号传导。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述IFN应答信号传导包括I型干扰素的表达。
69.如权利要求40至68中任一项所述的方法，其中所述接触有效地减少所述眼细胞中I型干扰素的表达和/或分泌。
70.如权利要求68或69所述的方法，其中所述I型干扰素是IFNβ。
71.如权利要求40至70中任一项所述的方法，其中所述接触有效地抑制所述眼细胞中核酸诱导的炎症信号传导。
72.一种用于减少受试者眼部基因疗法的毒性的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的RIG-I抑制剂。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含小分子化合物、抗体、RIG-I抗体的抗原结合片段、核酸分子、肽、或其衍生物。
74.如权利要求72或权利要求73所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含siRNA、miRNA、shRNA、核酶、吗啉、反义RNA、三螺旋形成分子或sgRNA。
75.如权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-ICRISPRi***。
76.如权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-ICRISPR-Cas9***。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述RIG-I CRISPR-Cas9***包含含有序列5’-ACTCACCCTCCCTAAACCAG–3’(SEQ ID NO:1)的sgRNA或其衍生物。
78.如权利要求72至74中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含RIG-I siRNA。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述RIG-I siRNA包含选自由以下组成的组的核苷酸序列：5’–AAGGGAACGATTCCATCACTA–3’(SEQ ID NO:2)、5’–TTCTACAGATTTGCTCTACTA–3’(SEQ IDNO:3)、5’–CTCCTCCTACCCGGCTTTAAA–3’(SEQ ID NO:4)和5’–CAGAATTATCCCAACCGATAT–3’(SEQ ID NO:5)。
80.如权利要求72或73所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含肽或编码所述肽的核酸分子，其中所述肽选自由以下组成的组：LGP2、RNF125、RNF122、c-Cbl、A20、USP3、USP21、USP25、USP15、ARL16、ATG5-ATG12、NOD2、FAT10、SEC14L1、VP35和3Cpro，或其衍生物。
81.如权利要求72或73所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂包含SEQ ID NO:6(GNRDTLWHLFNTLQRRPGWVEYFI)的肽序列或其衍生物；或编码SEQ ID NO:6的肽或其衍生物的核酸分子。
82.如权利要求72至81中任一项所述的方法，其中所述RIG-I抑制剂进一步包含载体。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述载体是病毒载体，任选地是慢病毒载体。
84.如权利要求72或73所述的方法，其中所述小分子化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0004113405690000081
Figure FDA0004113405690000091
或其药学上可接受的盐。
85.如权利要求72至84中任一项所述的方法，其中所述施用是口服、经皮、外部、肠胃外、注射或吸入。
86.如权利要求85所述的方法，其中所述施用是局部施用于所述受试者眼睛。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述施用是结膜下、玻璃体内、眼周、球后或前房内。
88.如权利要求72至87中任一项所述的方法，其中所述施用包括使所述受试者的眼细胞与所述RIG-I抑制剂接触。
89.如权利要求72至87中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中干扰素刺激基因(ISG)的表达。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述ISG是ISG15。
91.如权利要求72至87中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中RIG-I蛋白水平。
92.如权利要求72至87中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中RIG-I mRNA水平。
93.如权利要求72至87中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中IFN应答。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述IFN应答是I型IFN应答。
95.如权利要求72至87中任一项所述的方法，其中所述施用有效地减少所述受试者眼细胞中I型干扰素的表达和/或分泌。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述I型干扰素是IFNβ。
97.如权利要求72至87中任一项所述的方法，其中所述施用有效地抑制所述受试者眼细胞中核酸诱导的炎症。
98.如权利要求88至97中任一项所述的方法，其中所述眼细胞是视网膜神经节(RGC)细胞、INL细胞、ONL细胞、RPE细胞、脉络膜层细胞或其组合。
99.如权利要求88至97中任一项所述的方法，其中所述眼细胞是RPE细胞或脉络膜层细胞。
100.如权利要求88至97中任一项所述的方法，其中所述眼细胞是RPE细胞。
101.如权利要求98所述的方法，其中所述INL细胞是水平细胞、双极细胞、无长突细胞、丛间神经元或缪勒氏细胞。
102.如权利要求98所述的方法，其中所述ONL细胞是锥形细胞、棒状细胞或感光细胞。
103.如权利要求72至102中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
104.如权利要求72至103中任一项所述的方法，其中所述基因疗法包括向所述受试者施用AAV基因疗法载体。
105.如权利要求72至104中任一项所述的方法，其中所述基因疗法包括视网膜下注射AAV基因疗法载体。
106.如权利要求72至105中任一项所述的方法，其中所述施用有效地治疗与所述基因疗法毒性相关的黄斑变性(AMD)。
107.如权利要求72至105中任一项所述的方法，其中所述施用有效地治疗与所述基因疗法毒性相关的地图状萎缩(GA)。
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