CN116087401A - 一种水稻靶标性香味物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种水稻靶标性香味物质的检测方法,涉及一种靶标性香味物质的检测方法,是一种精准量化水稻靶标性香味物质的检测分析方法。方法:一、样品处理;二、萃取,萃取后采用自动进样装置将萃取头***到气相色谱‑质谱联用仪进样口;三、气相色谱‑质谱联用进行分析检测。本发明利用顶空固相微萃取技术分离,超纯水作为提取溶剂,富集水稻种子中2‑乙酰‑1‑吡咯啉,使用气相色谱‑质谱联用法检测,分析该目标物,以2,4,6三甲基吡啶为内标,利用标准物质出峰保留时间及离子碎片信息对其定性分析并通过内标物法开展定量分析。本方法具有自动化程度高、操作简单、成本低、效率高、稳定性强等特点,尤其适合于水稻中2‑乙酰‑1‑吡咯啉的精准量化。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶标性香味物质的检测方法。
背景技术
香稻因其优良的香味品质而为人们所喜爱,在国际稻米市场中占有重要地位,其中我国黑龙江省稻花香2号、泰国的茉莉香米以及印度和巴基斯坦的Basmati香米最为消费者的青睐。目前,已发现与香型水稻有关的化合物近300余种,其中2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)因其较低的香味嗅觉阈值被认为是水稻中香米香气的靶标性化合物,香稻含有0.040~0.090mg/kg的2AP是普通稻米含量的10~100倍。国内外开展水稻气味分析已有30余年,对于水稻挥发物的分离和萃取有许多传统方法,如同步蒸馏-萃取法和吸附剂捕集法等,由于这些方法操作复杂,成本过高,对目标化合物干扰较大等问题,无法高效对水稻中2AP含量进行精准定量,这也阻碍了在香稻育种方面性状量化的相关研究开展。随着科学技术的不断发展近几年顶空固相微萃取(HS-SPMS)方法已被广泛应用于食品、药品、大气、作物和土壤中挥发成分的提取,具有自动化程度高,操作简单,成本低等诸多优势。该方法在水稻香味物质定性分析中广泛应用,其中对2AP的检测方法中主要涉及到外标多点发进行检测,这种方法对于精准量化2AP稳定性较差,重复性不强。HS-SPMS在使用过程中会受到萃取头类型、样品量、溶剂、平衡及萃取温度、平衡时间等多种因素影响。此外,色谱柱的填充材料也是影响目标化合物色谱峰形态主要因素。因此为了高效量化水稻中2AP的绝对含量建立高效,精准的检测分析方法并筛选不同因素对其含量检测结果影响至关重要。
发明内容
本发明提供了一种水稻靶标性香味物质的检测方法,是一种精准量化水稻靶标性香味物质的检测分析方法。
本发明水稻靶标性香味物质的检测方法按照以下步骤进行:
一、待测的水稻种子研磨至粉末状作为检测样品,称取3g检测样品置于进样瓶中,加入内标物浓度为0.01μg/mL的2,4,6三甲基吡啶;
二、向步骤一中的进样瓶中加入超纯水进行萃取,萃取后采用自动进样装置将萃取头***到气相色谱-质谱联用仪进样口,250℃解析5min;
三、气相色谱-质谱联用:根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰1吡咯啉进行定性分析,采用内标法进行定量分析;;即完成了水稻靶标性香味物质检测;
其中,标准物质的制备:以超纯水作为溶剂,逐级稀释2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,稀释后浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,再向0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液分别添加浓度为0.01μg/mL的内标物2,4,6三甲基吡啶;绘制标准曲线:将标准物质经顶空处理后,进行气相色谱-质谱联用仪进行检测分析,以待测无色谱峰面积与内标峰面积比值Y为纵坐标,取相应质量浓度X为横坐标进行回归分析,得到标准曲线。
进一步:为了避免主效目标物的挥发,在步骤一中对研磨后的粉末采取即刻封瓶平衡方法。
进一步:所述的步骤一中,在密封瓶口之前,向装入样品的顶空瓶中加入10mL超纯水,本申请超纯水作为提取液可以有效提高目标物的响应值,降低溶剂峰干扰等问题。
进一步:色谱柱选用SDB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm),柱效优于HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)。
进一步:所述仪器型号是气相色谱质谱联用仪(日本岛津):GC2030-GCMSQP2020NX,多功能自动进样器(日本岛津,顶空):AOC 6000。
进一步:所述气相色谱参数设定为:升温程序为50℃保持2min,然后以28℃/min升至250℃,保持1min;进样口压力为34.5kPa,进样口温度为170℃;载气为高纯度(大于99.999%)氦气;分流比10:1,进样量为1μL。
进一步:所述的质谱参数设定为:离子源温度230℃;离子化能量为70eV,溶剂延迟5min,接口温度250℃,SIM模式,扫描离子m/z:2-乙酰-1-吡咯啉(43,83,111,69),2,4,6三甲基吡啶(45,79,106,121)。
本发明的有益效果在于:
本发明,采用自动顶空进行装置与气相色谱-质谱联用相结合的检测手段,以2,4,6三甲基吡啶作为内标,采用内标法对样品中2-乙酰-1-吡咯啉进行精准定量分析,在样品提取溶剂方面,创造性地确定了超纯水为最佳提取溶剂,本发明使用质谱仪对目标物离子碎片进行捕获选择超纯水作为提取液可以去除其他离子干扰,有效提高目标物的响应值,降低溶剂峰干扰等问题;色谱柱选择方面,SDP-WAX色谱柱用于检测2-乙酰-1-吡咯啉化合物的特征峰响应强且对称,其柱效显著优于HP-5M色谱柱;顶空萃取平衡时间是严重影响目标化合物提取效率,本发中最优平衡时间为20min,大大的提高了目标化合物的提取效率。本发明明确了科学的顶空处理条件,直接导入气相色谱-质谱分析仪可有效减少因前处理带来的误差,操作简化,无有毒试剂。在此基础上,本发明提供了整体技术方案,采用内标法定量,进一步优化色谱检测条件,保证目标化合物色谱峰获得最大响应值及灵敏度。本发明不仅提供了水稻靶标性香味物质量化检测方法,对于进一步快速开展香稻新品种选育工作提供有效量化表型方法。
本发明针对现有水稻中检测及定量2-乙酰-1-吡咯啉分析方法的不足,将自动顶空进样与气相色谱-质谱结合,降低提取溶剂峰干扰,建立一种高效,精准,简便检测且内标法定量水稻中2-乙酰1-吡咯啉的分析方法。
附图说明
图1为实施例1中检测2-乙酰-1-吡咯啉标准物质及内标的总离子流色谱图;
图2为实施例1中2AP和内标对应质谱图信息图;
图3为实施例1中6个浓度梯度的2AP标准曲线;
图4为实施例2中采用超纯水萃取的样品中目标化合物及内标总离子流色谱图;
图5为实施例2中平衡时间为15min对样品中目标化合物及内标总离子流色谱图;
图6为实施例2中平衡时间为20min对样品中目标化合物及内标总离子流色谱图;
图7为实施例2中平衡时间为30min对样品中目标化合物及内标总离子流色谱图;
图8为实施例3中采用有机溶剂萃取的样品中目标化合物及内标总离子流色谱图;
图9为实施例4中粳稻种子中2-乙酰-1-吡咯啉标准物质及内标的总离子流色谱图;
图10为实施例5中籼稻种子中2-乙酰-1-吡咯啉标准物质及内标的总离子流色谱图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明,以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方案和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
具体实施方式一:本实施方式水稻靶标性香味物质的检测方法按照以下步骤进行:
一、待测的水稻种子研磨至粉末状作为检测样品,称取3g检测样品置于进样瓶中,加入内标物浓度为0.01μg/mL的2,4,6三甲基吡啶;
二、向步骤一中的进样瓶中加入超纯水进行萃取,萃取后采用自动进样装置将萃取头***到气相色谱-质谱联用仪进样口,250℃解析5min;
三、气相色谱-质谱联用:根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰1吡咯啉进行定性分析,采用内标法进行定量分析;;即完成了水稻靶标性香味物质检测;
其中,标准物质的制备:以超纯水作为溶剂,逐级稀释2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,稀释后浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,再向0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液分别添加浓度为0.01μg/mL的内标物2,4,6三甲基吡啶;绘制标准曲线:将标准物质经顶空处理后,进行气相色谱-质谱联用仪进行检测分析,以待测无色谱峰面积与内标峰面积比值Y为纵坐标,取相应质量浓度X为横坐标进行回归分析,得到标准曲线。
本实施方式中为了避免主效目标物的挥发,在步骤一中对研磨后的粉末采取即刻封瓶平衡。
本实施方式所述的步骤一中,在密封瓶口之前,向装入样品的顶空瓶中加入10mL超纯水。本实施方式用超纯水作为提取液可以有效提高目标物的响应值,降低溶剂峰干扰等问题。
本实施方式所述仪器型号是气相色谱质谱联用仪(日本岛津):GC2030-GCMSQP2020NX,多功能自动进样器(日本岛津,顶空):AOC 6000。
本实施方式色谱柱选用SDB-WAX(30m×0.25mm×0.25μm),柱效优于HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤三中气相色谱-质谱联用中气相色谱参数设定为:升温程序为50℃保持2min,然后以28℃/min升至250℃,保持1min;进样口压力为34.5kPa,进样口温度为170℃;载气为高纯度大于99.999%的氦气;分流比10:1,进样量为1μL。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一不同的是:步骤三中气相色谱-质谱联用中质谱参数设定为:离子源温度230℃;离子化能量为70eV,溶剂延迟5min,接口温度250℃,SIM模式,扫描离子m/z。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
在本实施方式设定的参数条件下得到的分析结果:2-乙酰-1-吡咯啉(43,83,111,69),2,4,6三甲基吡啶(45,79,106,121)。
实施例1:水稻靶标性香味物质的检测方法,即建立一种精准量化水稻靶标性香味物质的检测分析方法,包括以下步骤:
一、待测的水稻种子研磨至粉末状作为检测样品,称取3g检测样品置于进样瓶中,加入内标物浓度为0.01μg/mL的2,4,6三甲基吡啶;
二、向步骤一中的进样瓶中加入超纯水萃取,萃取后采用自动进样装置将萃取头***到气相色谱-质谱联用仪进样口,250℃解析5min;
三、气相色谱-质谱联用:根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰1吡咯啉进行定性分析,采用内标法进行定量分析,即完成了水稻靶标性香味物质检测;
其中,标准物质的制备:以超纯水作为溶剂,逐级稀释2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,稀释后浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,在向0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液分别添加浓度为0.01μg/mL的内标物2,4,6三甲基吡啶;绘制标准曲线:将标准物质经顶空处理后,进行气相色谱-质谱联用仪进行检测分析,以待测无色谱峰面积与内标峰面积比值Y为纵坐标,取相应质量浓度X为横坐标进行回归分析,得到标准曲线。
气相色谱参数设定为:升温程序为50℃保持2min,然后以28℃/min升至250℃,保持1min;进样口压力为34.5kPa,进样口温度为170℃;载气为高纯度(大于99.999%)氦气;分流比10:1,进样量为1μL。
质谱参数设定为:离子源温度230℃;离子化能量为70eV,溶剂延迟5min,接口温度250℃,SIM模式,扫描离子m/z:2-乙酰-1-吡咯啉(43,83,111,69),2,4,6三甲基吡啶(45,79,106,121)。
实验结果如图1、图2、图3所示,图1是2-乙酰-1-吡咯啉标准物质及内标的总离子流色谱图,由图1可以看出2AP出峰保留时间为11.32min,内标出峰保留时间为15.32min,2AP和内标对应质谱图信息如图2所示,图2中a是2AP,b是2,4,6三甲基吡啶;6个浓度梯度的2AP标准曲线见图3,回归方程计算公式为y=3.775954e-005x+3.513792e-005,R2=0.9998。
实施例2:对稻花香水稻种子进行检测,具体方法为:
一、待测的水稻种子研磨至粉末状作为检测样品,称取3g检测样品置于进样瓶中,加入内标物浓度为0.01μg/mL的2,4,6三甲基吡啶;其中
二、向步骤一中的进样瓶中加入超纯水萃取,在相同温度(80℃)下设定三个不同平衡时间,分别为15min,20min和30min,均萃取30min,萃取完立即将萃取头***到气相色谱-质谱联用仪进样口,250℃解析5min;所述的气相色谱质谱联用仪(日本岛津):GC2030-GCMS QP2020NX,多功能自动进样器(日本岛津,顶空):AOC 6000;
三、气相色谱-质谱(GC-MS)分析:根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰1吡咯啉进行定性分析,采用内标法进行定量分析,具体根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰1吡咯啉进行定性分析,采用内标法进行定量分析,计算公式为:2AP含量/(μg/kg)=(A1/A2)×(M1/M2)×1000,其中:A1为待测物质峰面积;A2为内标物峰面积;M1为内标物质量/μg;M2为样品质量/g;
其中,标准物质的制备:以超纯水作为溶剂,逐级稀释2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,稀释后浓度为0.1、0.2、0.5、1.0,2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,在向0.1、0.2、0.5、1.0,2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液分别添加浓度为0.01μg/mL的内标物2,4,6三甲基吡啶;绘制标准曲线:将标准物质经顶空处理后,进行气相色谱-质谱联用仪进行检测分析,以待测无色谱峰面积与内标峰面积比值Y为纵坐标,取相应质量浓度X为横坐标进行回归分析,得到标准曲线。
气相色谱参数设定为:升温程序为50℃保持2min,然后以28℃/min升至250℃,保持1min;进样口压力为34.5kPa,进样口温度为170℃;载气为高纯度(大于99.999%)氦气;分流比10:1,进样量为1μL。
质谱参数设定为:离子源温度230℃;离子化能量为70eV,溶剂延迟5min,接口温度250℃,SIM模式,扫描离子m/z:2-乙酰-1-吡咯啉(43,83,111,69),2,4,6三甲基吡啶(45,79,106,121)。
四、结果
图4本实施例步骤二中采用超纯水萃取的样品中目标化合物及内标总离子流色谱图;图5、图6和图7是本实施例步骤二中分别采用15min,20min和30min三个不同平衡时间对样品中目标化合物及内标总离子流色谱图。从图5、图6和图7可以看出,通过公式计算后三种不同平衡时间对稻花香种子中2AP含量分析存在一定差异,15min平衡时间获得2AP含量为1.97±0.02(ug/g),20min平衡时间获得2AP含量为2.17±0.01(ug/g),30min平衡时间获得2AP含量为1.86±0.04(ug/g),其中20min的平衡时间可显著促进样品中目标化合物提取效率便于检测。
实施例3本实施例中步骤二中采用的有机溶剂(无水乙醇与二氯甲烷等体积混合)进行萃取,在80℃条件下设定平衡时间为20min,萃取30min。
图8本实施例采用有机溶剂萃取的样品中目标化合物及内标总离子流色谱图,通过图4和图8可以看出超纯水作为检测2AP萃取溶剂可以显著提高目标物的响应值,同时降低杂质峰干扰,便于目标物的定性和定量。
实施例4:利用本发明的方法检测粳稻香型稻水稻靶标性香味物质,具体方法如下:
1.材料与仪器设备
1.1材料:粳稻香型稻种子。
1.2仪器与设备:气相色谱质谱联用仪(日本岛津):GC2030-GCMS QP2020NX,多功能自动进样器(日本岛津,顶空):AOC 6000。
2.实验方法与内容
2.1水稻种子的前处理
收集新鲜水稻种子,去种皮,迅速研磨至粉末状态,称取3g样品即刻置于总体积为15mL的顶空进样瓶中,加入内标,密封瓶口;
2.2GC-MS检测分析
2.2.1固相微萃取及前处理流程;将内装有样品的顶空进样瓶分别加入10mL超纯水、,并在相同温度下(80℃)平衡时间为20min,萃取30min,萃取完立即将萃取头***到气相色谱-质谱联用仪进样口,250℃解析5min;
2.2.2气相色谱参数设定为:升温程序为50℃保持2min,然后以28℃/min升至250℃,保持1min;进样口压力为34.5kPa,进样口温度为170℃;载气为高纯度(大于99.999%)氦气;分流比10:1,进样量为1μL。
2.2.3质谱参数设定为:离子源温度230℃;离子化能量为70eV,溶剂延迟5min,接口温度250℃,SIM模式,扫描离子m/z:2-乙酰-1-吡咯啉(43,83,111,69),2,4,6三甲基吡啶(45,79,106,121)。
2.2.4.目标代谢物的定性定量方法:根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰1吡咯啉进行定性分析,采用内标法进行定量分析,计算公式为:2AP含量/(μg/kg)=(A1/A2)×(M1/M2)×1000,其中:A1为待测物质峰面积;A2为内标物峰面积;M1为内标物质量/μg;M2为样品质量/g。
3.结果图9是本实施例中应用于粳稻香型稻中对2AP含量检测分析结果,含量为2.17±0.01(ug/g)。
实施例4:一种精准量化水稻靶标性香味物质的检测分析方法,包括一下步骤:
1.材料与仪器设备
1.1材料:籼稻香型稻种子。
1.2仪器与设备:
气相色谱质谱联用仪(日本岛津):GC2030-GCMS QP2020NX,多功能自动进样器(日本岛津,顶空):AOC 6000。
2.实验方法与内容
2.1水稻种子的前处理
收集新鲜水稻种子,去种皮,迅速研磨至粉末状态,称取3g样品即刻置于总体积为15mL的顶空进样瓶中,加入内标,密封瓶口;
2.2GC-MS检测分析
2.2.1固相微萃取及前处理流程;将内装有样品的顶空进样瓶分别加入10mL超纯水,在80℃条件下平衡时间为20min,萃取30min,萃取完立即将萃取头***到气相色谱-质谱联用仪进样口,250℃解析5min;
2.2.2气相色谱参数设定为:升温程序为50℃保持2min,然后以28℃/min升至250℃,保持1min;进样口压力为34.5kPa,进样口温度为170℃;载气为高纯度(大于99.999%)氦气;分流比10:1,进样量为1μL。
2.2.3质谱参数设定为:离子源温度230℃;离子化能量为70eV,溶剂延迟5min,接口温度250℃,SIM模式,扫描离子m/z:2-乙酰-1-吡咯啉(43,83,111,69),2,4,6三甲基吡啶(45,79,106,121)。
2.2.4.目标代谢物的定性定量方法:根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰1吡咯啉进行定性分析,采用内标法进行定量分析,计算公式为:2AP含量/(μg/kg)=(A1/A2)×(M1/M2)×1000,其中:A1为待测物质峰面积;A2为内标物峰面积;M1为内标物质量/μg;M2为样品质量/g。
3.结果图10是本实施例中应用于籼稻香型稻中对2AP含量检测分析结果,含量为2.95±0.01(ug/g)。
Claims (3)
1.一种水稻靶标性香味物质的检测方法,其特征在于水稻靶标性香味物质的检测方法按照以下步骤进行:
一、待测的水稻种子研磨至粉末状作为检测样品,称取3g检测样品置于进样瓶中,加入内标物浓度为0.01μg/mL的2,4,6三甲基吡啶;
二、向步骤一中的进样瓶中加入超纯水进行萃取,萃取后采用自动进样装置将萃取头***到气相色谱-质谱联用仪进样口,250℃解析5min;
三、气相色谱-质谱联用:根据标准物质出峰时间及响应值对水稻种子中2-乙酰-1-吡咯啉进行定性分析,采用内标法进行定量分析;即完成了水稻靶标性香味物质检测;
其中,标准物质的制备:以超纯水作为溶剂,逐级稀释2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,稀释后浓度为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液,再向0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的2-乙酰-1-吡咯啉标准溶液分别添加浓度为0.01μg/mL的内标物2,4,6三甲基吡啶;
绘制标准曲线:将标准物质经顶空处理后,进行气相色谱-质谱联用仪进行检测分析,以待测无色谱峰面积与内标峰面积比值Y为纵坐标,取相应质量浓度X为横坐标进行回归分析,得到标准曲线。
2.根据权利要求1所述的一种水稻靶标性香味物质的检测方法,其特征在于步骤三中气相色谱-质谱联用中气相色谱参数设定为:升温程序为50℃保持2min,然后以28℃/min升至250℃,保持1min;进样口压力为34.5kPa,进样口温度为170℃;载气为高纯度大于99.999%的氦气;分流比10:1,进样量为1μL。
3.根据权利要求1所述的一种水稻靶标性香味物质的检测方法,其特征在于步骤三中气相色谱-质谱联用中质谱参数设定为:离子源温度230℃;离子化能量为70eV,溶剂延迟5min,接口温度250℃,SIM模式,扫描离子m/z。
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CN (1) | CN116087401A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117169383A (zh) * | 2023-09-08 | 2023-12-05 | 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) | 一种测定烤烟中糯米香特征组分2-乙酰基-1-吡咯啉含量的方法 |
CN117434186A (zh) * | 2023-12-22 | 2024-01-23 | 中国市政工程华北设计研究总院有限公司 | 一种携污雨水复杂臭味气体组成的同步识别与量化方法 |
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2023
- 2023-02-27 CN CN202310168098.0A patent/CN116087401A/zh active Pending
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN117169383A (zh) * | 2023-09-08 | 2023-12-05 | 中国农业科学院烟草研究所(中国烟草总公司青州烟草研究所) | 一种测定烤烟中糯米香特征组分2-乙酰基-1-吡咯啉含量的方法 |
CN117434186A (zh) * | 2023-12-22 | 2024-01-23 | 中国市政工程华北设计研究总院有限公司 | 一种携污雨水复杂臭味气体组成的同步识别与量化方法 |
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