CN116086919B - 一种肺癌和/或胰腺癌样本的染色方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

一种肺癌和/或胰腺癌样本的染色方法及试剂盒，染色方法包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对待测的肺癌和/或胰腺癌样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：OX40、CD3、FOXP3、CD4、CD8、panCK。本发明可以对单张切片进行多重免疫荧光实验，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，显著提高单张组织样本的利用率，尤其是珍贵样本。

Description

一种肺癌和/或胰腺癌样本的染色方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及荧光检测技术领域，具体涉及一种肺癌和/或胰腺癌样本的染色方法及试剂盒。
背景技术
肺癌(Lung cancer)是起源于肺部支气管粘膜或腺体的呼吸***恶性肿瘤。肺癌的组织病理学分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类；具有发病率和死亡率较高特点，严重威胁患者的生命健康和生活质量。其发病机制较为复杂，受环境、物理、化学及生物遗传等因素影响，早期肺癌患者临床症状较为隐匿，大部分到晚期时已经发生转移。目前主要采取直接杀灭肿瘤组织来治疗，如手术、放疗和化疗等，对机体造成较大损伤。随着肺癌免疫治疗方法的研究，通过利用人体自身免疫***来杀伤肿瘤细胞，开发癌症治疗中肿瘤标志物的研究已经成为重点。肿瘤标志物是肿瘤发生和增值过程中，肿瘤细胞合成、释放或机体应对肿瘤细胞反应进而产生的物质，从组织、血液和体液中均可以检测到，当超出正常检测阈值时，可以预示肿瘤的存在，开发不同肿瘤标志物，建立快速的检测方法，对于准确高效诊断肺癌和进行个体化治疗具有重大意义。
免疫染色技术包括：IHC(Immunohistochemistry，免疫组织化学)、ICC(Immunocytochemistry，免疫细胞化学)和IF(Immunofluorescence，免疫荧光法)。其中IHC/IF检测是通过使用抗体和荧光检测来研究***固定及石蜡包埋(formalinfixation and paraffin embedding,FFPE)的样本中目标蛋白在固定细胞或组织中的定位、相对表达和激活状态。在肿瘤分子检测技术逐渐成熟的今天，相关研究与临床决策的信息基础也开始更加注重对于肿瘤微环境的覆盖。肿瘤微环境的复杂性要求单张组织样本切片产出多重信息，提高对于样本切片特别是珍贵样本的利用率。最近一种新的多标记免疫组织化学染色/免疫荧光染色(multiplex immunohistochemist ry/immunofluorescence,mIHC/IF)技术允许在单一组织切片上同时检测多个抗体，并对细胞组成、细胞功能和细胞-细胞相互作用进行全面研究。该技术克服了常规免疫组织化学IHC技术存在的诸多局限性，包括观察者间的变异性高，每张组织切片仅能标记一个标志物。目前，mIHC/mIF已在国内外研究中得到广泛应用，利用该技术实现对肿瘤免疫微环境(Tumor immunemicroenvironment,TIME)下的特异性免疫细胞群的研究，有助于肺癌等患者临床预后判断及疗效预测，已经成为最具应用前景的技术。mIHC/mIF为开展高重复性、高效、高性价比的组织研究提供了高通量多重染色技术和标准化的定量分析。该技术在转化研究和临床实践中，尤其是肿瘤免疫治疗中极具应用价值。
然而，对于肺癌及胰腺癌样本，现有的方法还无法实现多重免疫荧光染色即检测。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供一种肺癌和/或胰腺癌样本的染色方法，包括：
染色步骤，包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对待测的肺癌和/或胰腺癌样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：
OX40、CD3、FOXP3、CD4、CD8、panCK。
根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的染色方法获得的样本或图像。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种图像分析方法，包括：对第二方面所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到样本的生物标记物数值。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于检测肺癌和/或胰腺癌样本的试剂盒，包括如下抗体：
抗OX40单克隆抗体、抗CD3单克隆抗体、抗FOXP3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗panCK单克隆抗体。
依据上述实施例的一种肺癌和/或胰腺癌样本的染色方法及试剂盒，本发明可以对单张切片进行多重免疫荧光实验，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，显著提高单张组织样本的利用率，尤其是珍贵样本。
在一实施例中，本发明的方法及试剂盒可用于对肺癌和胰腺癌免疫微环境的TILs进行分析，具有优异的准确性和精密度。
在一实施例中，本发明便于观察靶标蛋白质的相互作用和共生定位，对组织样本的需求量显著降低；且能够应用于自动化染色机，显著提高准确度和可重复性，简便高效。
附图说明
图1为实施例1中的检测流程示意图；
图2.1为CD3抗体：抗体稀释液＝1:500的染色结果图；
图2.2为CD3抗体：抗体稀释液＝1:800的染色结果图；
图2.3为CD3抗体：抗体稀释液＝1:1000的染色结果图；
图3.1为CD3抗体修复的IHC染色结果；
图3.2～3.4分别为抗体修复第1、3、5次的染色结果图；
图4为CD3抗体的不同修复次数的MIF以及SNR(信噪比)结果；
图5为CD4抗体的染料配对MIF以及SNR(信噪比)结果；
图6为CD4抗体的不同修复次数的MIF以及SNR结果；
图7为CD8抗体的染料配对MIF以及SNR结果；
图8为CD8抗体的不同修复次数的MIF以及SNR结果；
图9.1为21R5148SLZB扁桃体样本的染色结果；
图9.2为21R7214SLZB***样本染色结果；
图10.1为OX40抗体染料配对的IHC染色结果；
图10.2～10.4分别为OX40抗体的通道480、620、690的染色结果；
图10.5为OX40抗体染料配对的MIF以及SNR结果；
图11.1为OX40抗体修复的IHC染色结果；
图11.2～11.4分别为抗体修复第1、3、5次的染色结果；
图11.5为OX40抗体的不同修复次数的MIF以及SNR结果；
图12为FOXP3染料配对的MIF以及SNR结果；
图13为FOXP3抗体不同修复次数的MIF以及SNR结果；
图14为panCK染料配对的MIF以及SNR结果；
图15为panCK抗体不同修复次数的MIF以及SNR结果；
图16为扁桃体样本(21R5148SLZB)的染色结果；
图17为扁桃体样本21R5148SLZD-1的mIF条件染色结果；
图18为胰腺癌样本2104370FZZA-11的mIF条件染色结果；
图19为肺癌样本2100996FZZA的mIF条件染色结果；
图20为肺癌样本的染色结果(20X)；
图21为肺癌和胰腺癌样本中，IHC和mIF检测的阳性细胞密度相关性分析结果；
图22为肺癌和胰腺癌样本中，IHC和mIF检测的阳性细胞比例相关性分析结果；
图23为肺癌和胰腺癌样本中重复实验的染色结果(200X)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
本文中，“室温”是指23±2℃，亦称常温。
CD3：别名OKT3，全T细胞标记，免疫球蛋白超家族成员，识别T细胞的常用抗体，由delt、epsilon、gamma、zeta等链组成的复合体。在病理中的应用为T细胞淋巴瘤的诊断，为T细胞最特异的抗体，信号定位在胞膜和胞浆。CD3，T细胞表面标记，主要功能是促进细胞毒性T细胞(CD8+ T细胞)和辅助T细胞(CD4+ T细胞)的活化，并最终帮助形成获得性免疫反应。
CD4：别名OKT4，辅助T细胞标志物。多数巨噬细胞、滤泡树状细胞、Langerhans细胞也阳性。在病理学中的应用为T细胞淋巴细胞的诊断和分类，信号定位在胞膜。CD4，CD4+ T细胞，属于淋巴细胞分类中的辅助T细胞，直接反应机体免疫力功能的强弱，CD4+ T细胞是HIV感染过程中的主要靶点。
CD8：是一种白细胞分化抗原，用以辅助T细胞受体(TCR)识别抗原并参与T细胞活化信号的转导。表达CD8的T细胞(CD8+T细胞)通常在活化后分化为细胞毒性T细胞，能够特异性地杀伤靶细胞,信号定位在胞膜。CD8，CD8+ T细胞，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。对某些病毒、肿瘤细胞等抗原物质具有杀伤作用，与自然杀伤细胞构成机体抗病毒、抗肿瘤免疫的重要防线。
FOXP3：Treg的主要调节因子，Foxp3是控制Treg细胞发育和功能的关键转录因子之一。Treg细胞的免疫抑制除了可以帮助机体避免自身免疫性疾病，在某些肿瘤中，它也可以使机体对肿瘤细胞产生抗原耐受，从而使肿瘤细胞逃脱机体的免疫杀伤作用。关于如何对Treg细胞进行检测分析，目前,公认的区分Treg细胞的表面标记物为：CD4+CD25+FoxP3+或CD4+CD25+CD127低表达。FoxP3是Treg细胞发育成熟和发挥功能的必要因素，是目前Treg细胞最敏感的标记，但检测FoxP3需要对细胞进行破膜，如后续实验需要上样细胞且细胞保持完整，可以CD4+CD25+CD127低表达作为Treg标志，CD127位于Treg细胞表面。
OX40：OX40(TNFRSF4,CD134)是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的一员，可调节T细胞活性和免疫应答。OX40蛋白包含四个半胱氨酸富集结构域、一个跨膜结构域和一个含有QEE基序的细胞浆尾区。OX40主要在激活的CD4+和CD8+ T细胞中表达，而OX40配体(OX40L,TNFSF4,CD252)则主要在激活的抗原呈递细胞中表达。OX40结合OX40L会导致TNF受体相关因子(TRAF)的募集，从而形成TCR非依赖型信号转导复合体。该复合体的一个组分(PKCθ)可激活NF-κB通路。通过Akt进行OX40信号转导还会直接增强TCR信号转导。研究表明，OX40L-OX40通路与炎症和自身免疫疾病有关。其他研究表明，OX40激动剂会增强多种癌症类型中的抗肿瘤免疫。OX40与肿瘤在肿瘤微环境中，免疫激活可导致OX40表达。可增强效应T细胞的活化和增殖，并制Tregs，从而导致复杂的抗肿瘤免疫反应。肿瘤浸润性T细胞表达OX40，注射Anti-OX40抗体或OX40L.Fc融合蛋白能有效抑制荷瘤小鼠模型的肿瘤生长。目前，多种Anti-OX40抗体或OX40L.Fc融合蛋白正在用于针对转移性癌症的临床试验。为了增加抗OX40的效果，在适当的时间将OX40途径与其他可能互补的免疫途径结合，可能是更有效激活抗肿瘤免疫应答的关键策略，目前正有许多对不同的联合疗法的研究。
panCK：细胞角蛋白是由至少29种不同蛋白质组成的一组，是上皮细胞和绒毛细胞的特征。细胞角蛋白1、4、5、6和8是II型中性到碱性亚家族成员。单克隆抗细胞角蛋白是上皮细胞分化的特异性标记物，已广泛用于肿瘤的鉴定和分类。单克隆抗泛细胞角蛋白是一种广泛反应性试剂，可以识别存在于大多数人类上皮组织中的抗原表位。它有助于正常细胞、化生细胞和肿瘤细胞的分型。不同组分之间的协同作用导致染色扩增。这使得细胞的识别成为可能，否则这些细胞只能被少量染色。这种混合物有助于区分癌和非上皮性肿瘤，如肉瘤、淋巴瘤和神经肿瘤。它还有助于检测***、骨髓和其他组织的微转移，并确定低分化肿瘤的来源。细胞角蛋白有两种类型:酸性的I型细胞角蛋白和碱性或中性的II型细胞角蛋白。细胞角蛋白通常成对出现，包括1型细胞角蛋白和2型细胞角蛋白。通常II型细胞角蛋白比I型细胞角蛋白大8kD。信号定位在胞质。
OX40主要在激活的CD4+和CD8+ T细胞中表达；FoxP3是Treg细胞发育成熟和发挥功能的必要因素，是目前Treg细胞最敏感的标记；CD4是辅助T细胞标志物；CD8是一种白细胞分化抗原，用以辅助T细胞受体(TCR)识别抗原并参与T细胞活化信号的转导；CD3是全T细胞标记，免疫球蛋白超家族成员，识别T细胞的常用抗体；panCK是上皮源性肿瘤标志物。
本发明提供用于检测肿瘤组织中T细胞免疫检查点的mIF Panel；同时进行抗体开发，最终确认目标marker为：CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3、panCK。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种肺癌和/或胰腺癌样本的染色方法，包括：
染色步骤，包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对待测的肺癌和/或胰腺癌样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：
OX40、CD3、FOXP3、CD4、CD8、panCK。样本可以是取自单独患有肺癌的受试者的样本，也可以是取自单独患有胰腺癌的受试者的样本，也可以是取自同时患有肺癌、胰腺癌的受试者的样本。
该染色方法获得是的染色的样本，属于中间结果，而非最终结果，因此，不属于疾病的诊断方法。
在一实施例中，染色步骤中，使用的染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致。
在一实施例中，染色步骤中，抗原对应的一抗与染色剂按如下方式依次配对染色：
抗OX40单克隆抗体配对Opal 690，抗CD3单克隆抗体配对Opal 620，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗panCK单克隆抗体配对Opal 780。
在一实施例中，染色步骤中，包括按照抗原顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色(即染料孵育)、去除抗体。每一轮对一种抗原进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体。
在一实施例中，染色步骤中，二抗孵育时使用的二抗标记有辣根过氧化物酶。
在一实施例中，染色步骤中，对前5种抗原完成染色后，使用封闭液对样本进行封闭，然后对第6种抗原依次进行一抗孵育、二抗孵育、信号放大染色、去除抗体、使用对应的染色剂进行染色、使用核染色剂进行染色，获得染色后的样本。
在一实施例中，染色步骤中，信号放大染色时，使用的染色剂包含Opal TSA-DIG染料。
在一实施例中，染色步骤中，所述核染色剂包括但不限于DAPI(即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，CAS登录号：47165-04-8)。
在一实施例中，染色步骤中，所述样本包括癌组织切片。
在一实施例中，还包括成像步骤，包括对染色后的样本进行连续光谱成像，获得对应的染色图像。染色图像为中间结果，而非最终结果，因此，不属于疾病的诊断方法。
在一实施例中，还包括检测步骤，对染色图像检测。检测结果通常可以是生物标记物数值的分析结果，该结果仅仅是中间结果，而非最终结果，因此，不属于疾病的诊断方法。
根据第二方面，在一实施例中，提供第一方面任意一项所述的染色方法获得的样本或图像。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种图像分析方法，包括：对第二方面所述图像的目标区域的荧光表达数据进行生物标记物分析计算，得到样本的生物标记物数值。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种用于检测肺癌和/或胰腺癌样本的试剂盒，包括如下抗体：
抗OX40单克隆抗体、抗CD3单克隆抗体、抗FOXP3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗panCK单克隆抗体。
在一实施例中，还包括染色剂，染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致。
在一实施例中，所述染色剂包括荧光染色剂。
在一实施例中，所述染色剂包括：
Opal 690、Opal 620、Opal 570、Opal 520、Opal 480、Opal 780。
在一实施例中，抗体与染色剂的配对关系如下：
抗OX40单克隆抗体配对Opal 690，抗CD3单克隆抗体配对Opal 620，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗panCK单克隆抗体配对Opal 780。
在一实施例中，还包括荧光染料Opal TSA-DIG。
在一实施例中，所述试剂盒还包含抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、封闭液、抗荧光淬灭剂中的至少一种。
在一实施例中，提供一种用于肺癌和胰腺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及染色方法。
在一实施例中，本发明提供的试剂盒包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂、荧光染料；所述组合一抗试剂包括兔抗人CD3单克隆抗体、兔抗人CD4单克隆抗体、鼠抗人CD8单克隆抗体、兔抗人OX40单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人panCK单克隆抗体；所述组合二抗试剂包括HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗鼠抗兔混合物。该试剂盒能够在一张组织样本切片上同时呈现六个抗原靶标的表达情况，便于观察靶标蛋白质的相互作用和共生定位，对组织样本的需求量显著降低；且该试剂盒能够应用于自动化染色机，显著提高准确度和可重复性，简便高效。
在一实施例中，提供一种针对肺癌和胰腺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及染色方法。本发明通过多重免疫荧光技术开发了一种检测试剂盒，并利用图像识别***(如inForm v2.3、HALO病理图像分析***等)获得组织和细胞表型信息以及相应靶标的荧光强度信息等，对肺癌和胰腺癌免疫微环境的TILs进行分析，验证了该试剂盒检测的准确性和精密度，符合科研检测要求。本发明主要解决了肿瘤免疫治疗疗效评估缺乏足够生物标志物，以及如何使肿瘤免疫微环境相关指标能够在更大规模更大范围内对免疫治疗疗效进行评估的技术问题；同时很好地解决在临床病理工作以及科学研究中通过多重免疫荧光技术进行肿瘤免疫微环境分析的需求，高效辅助医生和科研人员完成免疫组化多重标记后的各项免疫组化指标的分析。
在一实施例中，该试剂盒能够在一张组织切片上同时表达六个抗体，此试剂盒可以为病理医生提供更多的靶标蛋白质信息和共定位情况，可以大大提高染色效率，节约样本；同时可以避免手工染色带来的重复性低、时间长等问题；该试剂盒可以应用于全自动染片机，具有广泛的应用前景。
实施例1
本实施例提供了一种用于肺癌和胰腺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒，包括如下组分：过氧化物酶封闭剂、一抗试剂、二抗试剂、荧光染料；所述组合一抗试剂包括兔抗人CD3单克隆抗体、兔抗人CD4单克隆抗体、鼠抗人CD8单克隆抗体、兔抗人OX40单克隆抗体、兔抗人FOXP3单克隆抗体、兔抗人panCK单克隆抗体；所述组合二抗试剂包括HRP标记的抗鼠抗兔混合物。全自动多色免疫荧光检测涉及的关键物料如表1。
表1关键物料清单
获取来自于每一受试者的肺癌和胰腺癌组织样本，制备成组织切片，对所述肺癌和胰腺癌组织样本进行多重免疫组化染色处理(如Leica公司Bond RX自动化染色仪器)，再通过成像扫描仪器(如Akoya公司Vectra Polaris光谱型定量病理分析***)获取相应的免疫组化显微全景图。
适用于全自动免疫组化染色机，染色程序见下表。
表2 6种染料的mIF染色程序
表3 6种染料的mIF阴参样本染色程序
本实施例通过性能验证实验，准确性和精密度均合格。通过病理学家对样本H&E染色结果判读，样本符合质控要求；染色结果判读亚细胞定位正确(CD3、CD4、CD8、OX40信号定位在细胞膜，panCK信号定位在细胞质，FOXP3信号定位在细胞核)；准确度验证结果显示阳性细胞密度以及比例相关性系数均大于0.6，满足验收标准。精密度验证结果显示，当阳性细胞密度(Overall Density)大于100/mm2时，C.V.平均值分布约为0.08至0.2；当阳性细胞密度小于100/mm2时，C.V.平均值分布约为0.17至0.38，满足验收标准。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步描述，本发明检测样本为肺癌和胰腺癌样本，但并不局限于此，仅开发期间以肺癌和胰腺癌样本为开发对象，并选用肺癌和胰腺癌样本进行了性能验证实验。
如图1所示为检测流程示意图，具体步骤如下：
一、制备用于肺癌和胰腺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒
该实施例提供了一种用于肺癌和胰腺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒，开发过程如下：
在方法学开发实验中，对每个抗体进行优化。抗体包括：CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3、panCK。
前期进行了抗体测试，以及实验条件的摸索，包括抗体特性初步验证、抗体浓度摸索、抗体染料配对、抗体修复次数摸索、mIF实验预实验等环节，最终确定了具体的抗体和实验条件。
mIF条件的确定包括：共染色、通道的选择，染色轮次选择、整体染色效果。
具体步骤如下：
(1)抗体验证实验：采用IHC实验，确认抗体是否可以用；并初步明确阳参样本；
(2)一抗浓度摸索实验：结合抗体说明书推荐的浓度，进行适当的浓度调整，设置2-3个浓度，开展IHC实验摸索一抗浓度。例如：抗体Anti-CD68(KP1)-Abcam，推荐抗体浓度为1：100，可以设置1：50、1：100、1：200开展IHC实验；
(3)抗体酸碱修复实验：结合抗体说明书推荐的修复条件，确认ER1或者ER2，基于常用条件95℃、20min，开展IHC实验，根据实验结果进行调整。例如：将ER1调整为ER2；条件参数可调整为95℃，20min；95℃，40min；95℃，80min。
(4)抗体染料配对实验：Panel(CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3、panCK)为六标七色mIF实验，计划使用480、520、570、620、690、780通道，结合抗体说明书以及相关参考文献推荐配对通道，对不同抗体进行3-7个通道的抗体染料配对IF实验；对实验结果进行荧光强度统计，并计算信噪比，确认该抗体较优配对通道。例如：抗体Anti-CD68(KP1)-Abcam，可以设置与480、520、570、620、650、690、780等7个不同通道进行IF配对实验，结果显示650、780、570通道信噪比较高，后续mIF实验条件优化中，优先选择这3个通道进行该抗体染料的配对。
前期实验中，对于染色顺序，首先是抗体修复次数性能的摸索，对于较少修复次数展现较好的染色效果的抗体，先染色；对于较多修复次数展现较好染色效果的抗体，在panel中后染色；其中通过计算信噪比作为衡量依据。另在mIF条件摸索中也进行多次调试，最终确定染色条件。
对于染色配对选择，抗体开发过程中，我们都进行了3-8不等的染色通道IF测试，并通过计算信噪比来衡量通道选择的优先顺序；后在后续mIF实验中进行多次调整，避免串色，以及较好展现染色阳性效果，确定染色条件。
(5)抗原修复次数实验：Panel(CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3、panCK)为六标七色mIF实验，抗原修复7次，最后一次为DAPI染色；对不同抗体进行1-6次抗原修复后进行IF实验，选择1、3、5轮次进行修复实验；对实验结果进行荧光强度统计，并计算信噪比，确认该抗体较优修复轮次。例如：抗体Anti-CD68(KP1)-Abcam，分别设置1、3、5轮次修复后孵一抗进行修复次数的IF实验，根据信噪比结果，后续mIF实验条件优化中，将该抗体安排在较优修复轮次中开展实验。
(6)mIF预实验：根据上述实验结果，归纳总结抗体特性，确定一抗浓度、酸碱修复条件、抗体配对染料和抗原修复轮次，初步明确mIF实验条件；根据实验结果优化mIF条件，直至达到无非特异性染色，光谱拆分无串染等效果。
A、各抗体的筛选过程如下：
1.CD3抗体浓度：抗体为重组Anti-CD3 epsilon抗体[CAL54](ab237707)-Abcam。
抗体稀释比例摸索：图2.1为CD3抗体：抗体稀释液＝1:500的染色结果图，图2.2为CD3抗体：抗体稀释液＝1:800的染色结果图，图2.3为CD3抗体：抗体稀释液＝1:1000的染色结果图。
抗体修复次数：21R4111SLZA，染色结果如图3.1～3.4所示，图3.2～3.4分别为抗体修复第1、3、5次的染色结果，MIF以及SNR(信噪比)结果如表4和图4所示。
表4
抗体 570曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
CD3 1次、3次、5次：58.72 5次>3次>1次 5次>3次>1次 都可以
2.CD4抗体浓度：抗体为重组Anti-CD4抗体[EPR6855](ab133616)-Abcam，稀释比例为1：500、1：1000、1：2000。
CD4染料配对：MIF以及SNR结果如表5和图5所示。
表5
CD4抗体修复次数：MIF以及SNR结果如表6和图6所示。
表6
抗体 570曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
CD4 1次:226.17、3次:24.47、5次：25.71 3次>5次 3次>5次 3
3.CD8抗体浓度：
CD8 Monoclonal Antibody(4B11)(MA1-80231)-Thermo Fisher Scientific，稀释比例为1:50、1：100、1：200。
重组Anti-CD8 alpha抗体[EP1150Y](ab93278)-Abcam，稀释比例为1：2000、1：4000、1：8000。
CD8染料配对：MIF以及SNR结果如表7和图7所示。
表7
CD8抗体修复次数：MIF以及SNR结果如表8和图8所示。
表8
抗体 570曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
CD8 1次:4.23、3次:5.54、5次：3.3 5次>3次>1次 5次>3次>1次 3、5
4.OX40抗体浓度：选用21R5148SLZB扁桃体、21R7214SLZB***样本。
孵育条件如下：
表9
图9.1为21R5148SLZB扁桃体样本的染色结果，图9.2为21R7214SLZB***样本染色结果，可见，染色效果较好，可以做抗体染料配对实验。
OX40抗体染料配对：21R5148SLZB扁桃体样本。图10.1为IHC染色结果，图10.2～10.4分别为通道480、620、690的染色结果。图10.5为MIF以及SNR结果。
表10
抗体 曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
OX40 480:7.52、620:38.11、690:24.76 480>690>620 620>690>480 480>690>620
OX40抗体修复次数：21R5148SLZB扁桃体样本。图11.1为IHC染色结果，图11.2～11.4分别为抗体修复第1、3、5次的染色结果。图11.5为MIF以及SNR结果。
表11
抗体 曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
OX40 1次、3次、5次：7.6 3次>5次>1次 3次>1次>5次 都可以
5.FOXP3抗体浓度：
FoxP3(D6O8R)Rabbit mAb(12653S)-Cell Signaling Technology，稀释比例为1:800。
Anti-FOXP3 antibody[EPR22102-37](ab215206)-Abcam，稀释比例为1：25、1：50、1：250。
FOXP3染料配对：图12为MIF以及SNR结果。
表12
抗体 曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
FoxP3 480:5.01、570、690:54.57 480>670>690 480>570>690 480、570
FOXP3抗体修复次数：图13为MIF以及SNR结果。
表13
抗体 570曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
FoxP3 1次:70.8、3次:69.8、5次:69.8 5次>3次>1次 3次>5次>1次 3>5
6.panCK抗体浓度：
Anti-pan Cytokeratin antibody[KRT/1877R](ab234297)-Abcam，稀释比例为1：200、1：400。
pan-Cytokeratin抗体(AE1/AE3)(sc-81714)-Santa Cruz Biotechnology，稀释比例为1：300、1：600、1：900。
panCK染料配对：图14为MIF以及SNR结果。
表14
抗体 曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
CD4 480:6.65、520:20.56、650:7.07 620>650>690>480 650>480>690>620 (650)480
panCK抗体修复次数：图15为MIF以及SNR结果。
表15
抗体 570曝光时间(ms) MIF SNR 推荐
CD56 1次:54.72、3次:29.84、5次：39.52 5次>3次>1次 3次>5次>1次 都可以
B、mIF预实验
mIHC预实验计划-预实验1。
表16
mIHC-预实验1结果：扁桃体样本(21R5148SLZB)，染色结果见图16。
mIF性能验证实验-样本确认：
确认做性能验证实验的胰腺癌样本：
表17
性能验证实验样本安排方案：
重复性：2个胰腺癌样本，具体为2204204FZZA、2104370FZZA。
准确性：5个胰腺癌样本，具体为2204204FZZA、2104370FZZA、2109096FZZA、2010613FZZA、22R6152SLZA。
确认做性能验证实验的肺癌样本：
表18
/>
性能验证实验样本：
重复性：2个肺癌样本，具体为22R2897SLZA、22R3184SLZA。
准确性：5个肺癌样本，具体为22R2897SLZA、22R3184SLZA、22R4221SLZA、22R3149SLZA、22R7458SLZA。
利用BOND RX进行自动化染色，开展多次mIF条件优化，最终确定的染色程序见下表。
表19实验参数
6.mIF条件(表19)：扁桃体样本21R5148SLZD-1，染色结果如图17所示。
7.mIF条件(表19)：胰腺癌样本2104370FZZA-11，染色结果如图18所示。
8.mIF预实验结果：肺癌样本2100996FZZA，染色结果如图19所示。结果显示，780没有显色；预实验调整：更换样本。
二、试剂盒在全自动染片机中的应用及染色程序。步骤如下：
将试剂盒应用于肺癌和胰腺癌组织，以扁桃体组织为阳参，实施多重免疫组化染色，使用的机器为BOND RX全自动染片机。
(1)取肺癌、胰腺癌和扁桃体石蜡组织各一个，分别制备肺癌和胰腺癌石蜡组织切片各1张(实验切片)，扁桃体石蜡组织切片2张(阴参和阳参切片)，厚度为3微米，贴好样本标签，放在切片盒中，于4℃冰箱中待用；
(2)打开电热鼓风干燥箱，提前预热电热鼓风干燥箱至65℃。将切片放入切片架中，将切片架放入电热鼓风干燥箱中，65℃，3h。肉眼观察组织表面的蜡融化彻底即可，填写实验记录表。
(3)试剂准备：从4℃冰箱中取出、一抗、二抗、染料、封闭液，需避光的试剂需用锡箔纸包裹试管，置于冰上，备用，放于离心机中短暂离心。
a.抗体配制：取出抗体储存液，放于离心机中短暂离心，备用。在滴定管(Titration Kit)中，用抗体稀释液按照下表的稀释比例配制工作液，用锡箔纸包裹试管，在管外标记染料名称，配制时间，配制人员。
表20一抗工作液配制
b.染料配制：
①制备染料储存液，取出抗体及Opal染料，用锡箔纸包裹试管，放于离心机中短暂离心。分别往加入Opal 480、Opal 520、Opal 570、Opal 620、Opal 690、TSA-DIG染料管中加入75μL的DMSO溶液；将300μL的去离子水溶液加入Opal 780染料管中。将上述染料管上下混匀10次后，待试剂完全溶解，将染料管放于离心机中短暂离心。
②取出染料储存液，放于离心机中短暂离心，备用。在滴定管(Titration Kit)中，用稀释液按照下表的稀释比例配制工作液，用锡箔纸包裹试管，在管外标记染料名称，配制时间，配制人员。
表21染料工作液配制
c.二抗配制：使用移液器吸取二抗转至滴定管中(二抗试剂用量的计算公式：1618+150*7*n(μL)，其中n为切片数量，1618μL为30mL试剂盒死仓体积，150μL为每张切片用量)。
d.封闭液配制：使用移液器吸取封闭液转至滴定管中(封闭液用量的计算公式：1618+150*7*n(μL)，其中n为切片数量，1618μL为30mL试剂盒死仓体积，150μL为每张切片用量)。
(4)设置染色程序：
a.检测样本及阳参样本程序设置：点击“程序设置”，具体参数见下表。
表22 KN026 208 Opal 6-color mIF protocol
b.阴参样本程序设置：点击“程序设置”，具体参数见下表。
表23 6种染料的mIF阴参样本染色程序
/>
(5)检测***和装有抗体、染料的试剂架放入BOND RX仪器内，启动染色程序：
(6)右击玻片架直接开始染色，染色开始和结束时间会在玻片架下方显示，填写实验记录表。
(7)封片：
a.染色完成后，按下玻片架下方的“装/卸按钮”，解除玻片架的锁定状态，取出玻片架，并将一抗和二抗盒用封口膜或者盖子封好，放入4℃冰箱保存，TSA-DIG、Opal780以及DAPI染料直接倒入废液瓶，其他Opal染料在工作液有效期内可继续使用。
b.从玻片架上取出切片，去除通用玻片盖(Bond Universal Covertiles)。除组织外，使用无尘纸擦干切片上的水迹。
c.每张切片滴加抗荧光淬灭剂1-2滴进行封片，保证抗荧光淬灭剂完成覆盖组织且无气泡，同时需要避免抗荧光淬灭剂溢出。将切片放在存放板中保存，室温避光30min，待抗荧光淬灭剂凝固后，放在4℃冰箱中避光保存，留待扫描。
(8)扫描切片：使用Vectra Polaris仪器，设置程序对切片进行全片扫描。扫描结束后，确保阳性对照与阴性对照样本出现预期染色效果。阳性对照预期染色效果：样本出现阳性信号(细胞膜定位包括CD3、CD4、CD8、OX40，细胞质定位panCK，细胞核定位FOXP3，无明显的串色，染色均一)。阴性对照预期染色效果：样本未出现明显阳性信号。图20为肺癌样本的染色结果(20X)。图18为胰腺癌样本的染色结果(20X)。
(9)数据分析：将数据上传至共享文件夹，路径是指定项目文件夹。然后根据分析需求进行数据处理。
三、试剂盒在肺癌和胰腺癌组织中应用的性能验证实验方法和结果。具体实验如下：
(1)样本：
a.为了评估多色免疫荧光结果的准确性(Accuracy)，检测来自肺癌和胰腺癌的各5个FFPE样本，每个样本选择10张连续切片进行性能验证，其中6张用于IHC单色免疫组化、3张用于panel的mIF、1张用于H&E。每次实验取正常人扁桃体组织连续切片2张用于对照实验，其中1张用于阳参对照实验，1张用于IgG同型对照，所有的标本从国内组织芯片服务公司取得。
b.为了评估多色免疫荧光结果精密度(Precision)，检测来自肺癌和胰腺癌的各2个样本，每个样本至少10张连续切片，其中：每个样本9张用于重复性实验，1张切片用于H&E染色。每次实验取正常人扁桃体组织连续切片2张用于对照实验，其中1张用于阳参对照实验，1张用于IgG同型对照，所有的标本从国内组织芯片服务公司取得。
(2)HE质控：依据病理医生反馈的HE阅片结果，对切片进行HE染色结果判读，HE染色结果判读标准如下表。
表24HE质控标准
*注：五项参数需均在参考范围内才能判定为该等级样本，若有一项不符则判定为下一等级样本。风险样本通常不上机，也可以尝试上机操作，但最终结果可能差于合格样本。
(3)准确性分析：
a.检测至少3个样本来评估准确性。
b.单IHC结果作为mIF的参考。
c.结果分析中，使用Vectra Polaris扫描仪扫描IHC或mIF染色。将对10个样本进行全扫描和数字成像分析。通过成像HALO软件(或同等软件)分析mIF的扫描图像，然后将单个mIF中抗体(CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3、panCK)的每个抗体染色的细胞密度和比例与单个IHC的细胞密度和比例进行比较。
d.每张幻灯片的染色结果将显示为每个标记物的每平方毫米中阳性细胞计数和总细胞中阳性细胞的百分比。对IHC或染色片同一标记的结果进行排名。①将单个IHC的图像加载到HALO；②计算每个抗体染色的阳性细胞的密度，用公式表示为：阳性细胞计数/图像面积。③在IHC和mIF染色结果中，计算每个抗体的阳性细胞密度的斯皮尔曼相关系数Rs。
e.利用斯皮尔曼相关系数Rs检测单IHC和mIF的相关性。使用Rs描述相关性的强度：0.20-0.39，“弱”；0.40-0.59，“中等”；0.60-1.0，“强”。准确性研究只有在Rs值大于等于0.6时才能通过验证。
(4)精密度分析：
a.为了精确评估，3个肿瘤的FFPE样本将至少分三个批次进行重复性实验，每次实验每个患者取3张切片用于抗体panel检测。且每次实验均需1张切片用于阳参对照检测和1张切片用于同型对照检测。
b.评估测定精度的三个批次应由至少两名不同的人员在至少两天进行，以涵盖尽可能多的变量。
c.通过Vectra Polaris或同等方法对染色后的切片进行扫描。每个样本中的9张切片都将进行全片扫描和数字成像分析。HALO或同等软件分析图像，然后将一批次的染色结果与其他批次的染色结果进行比较。①将每批的一个样本的mIF的图像加载到HALO。②每个抗体染色的阳性细胞的密度和百分比，用公式表示：阳性细胞计数/图像面积和总细胞中的阳性细胞百分比。③计算每个抗体染色的C.V.值。
d.计算每个抗体的阳性细胞密度和比例(阳性细胞计数/图像面积百分比)，得到C.V.值。只有当C.V.≤0.2时，精密度评估才会被视为通过；如果C.V.>0.2，我们将维持机器稳定，控制实验室环境条件，确保更稳定的实验条件，再次重复实验，然后使用重复实验的数据计算C.V.值；因任何原因导致切片无法产出有效结果，该切片扫描结果需排除在计算之外。除此之外，还需重复包括此样本在内批次的评估，并在重复实验结果中重新计算C.V.值。
(5)验证结果：
a.样本符合质控要求：病理学家对样本H&E染色结果判读，如下表。
表25样本H&E质控结果
b.染色结果：在满足质控要求的肺癌和胰腺癌样本中，利用Bond RX进行自动化染色，使用Vectra Pol aris全景扫描。染色结果判读亚细胞定位正确(细胞膜定位包括CD3、CD4、CD8、OX40，细胞质定位panCK，细胞核定位FOXP3)。染色准确性分析：3个肿瘤FFPE样本，每个样本取3张切片用于mIF检测，6张切片用于IHC检测。使用HALO，我们对图像进行分析处理，以及统计学分析(图21、22)。依据的数据源：肺癌和胰腺癌样本IHC和mIF检测的阳性细胞密度以及阳性细胞比例。
c.相关性分析：利用斯皮尔曼相关系数R计算IHC和mIF的相关性。使用R描述相关性的强度：0.20-0.39，“弱”；0.40-0.59，“中等”；0.60-1.0，“强”。如图21与图22所示，图21为肺癌和胰腺癌样本中，IHC和mIF检测的阳性细胞密度相关性分析结果，图22为肺癌和胰腺癌样本中，IHC和mIF检测的阳性细胞比例相关性分析结果。可见，使用IHC和mIHC检测CD3、CD4、CD8、OX40、FOXP3及panCK的6种蛋白的表达情况，斯皮尔曼相关系数R值均大于等于0.6，因此通过准确度验证。
d.精密度分析：将肺癌和胰腺癌各2个肿瘤的FFPE样本分3个批次进行重复性实验，每次实验每个患者取3张切片用于检测。且每次实验均需1张切片用于阳参对照检测和1张切片用于同型对照检测。使用HALO，我们对图像进行分析处理，以及统计学分析，结果如图23以及下表所示。图23为肺癌和胰腺癌样本中重复实验的染色结果(200X)。行1至行9分别为replicate slide 1至9；列1-列8分别为全景图、DAPI、FOXP3、OX40、CD8、CD3、panCK以及CD4。
e.计算每个抗体的阳性细胞密度(阳性细胞计数/图像面积百分比)的C.V.值并计算平均值(表26)。当阳性细胞密度(Overall Density)大于100/mm2时，C.V.≤0.2通过精密度评估；当阳性细胞密度小于100/mm2时，C.V.≤0.4通过精密度评估。因C.V.均满足对应的条件，所以通过精密度验证。
表26肺癌和胰腺癌样本中mIF检测的精密度验证结果
/>
/>
/>
验证结论：样本通过病理学家对样本H&E染色结果判读，样本符合质控要求；染色结果判读亚细胞定位正确(细胞膜定位包括CD3、CD4、CD8、OX40，细胞质定位panCK，细胞核定位FOXP3)；准确度验证结果显示阳性细胞密度以及比例相关性系数均大于0.6，满足验收标准。精密度验证结果显示，当阳性细胞密度(Overall Density)大于100/mm2时，C.V.平均值分布约为0.139至0.194；当阳性细胞密度小于100/mm2时，C.V.平均值分布约为0.297至0.299，满足验收标准。性能验证通过验收，可用于检测肺癌和胰腺癌样本。
在一实施例中，本发明提供的用于肺癌和胰腺癌样本的全自动多色免疫荧光检测试剂盒及方法实现了自动化检测，对单张切片进行多重免疫荧光实验，可同时呈现六个抗原靶标的表达情况，大大提高单张组织样本的利用率，尤其是珍贵样本。
在一实施例中，节约病人取材的样本，便于样本有足够的量做其他检测项目。
在一实施例中，自动化染色可以进行高通量测试，实现标准化操作，单次最多可同时检测30片病理切片，避免了手工操作时间长和误差大的弊端，为临床病理人员提供了简便高效的检测方法。
在一实施例中，该试剂盒实现标准化操作的自动化检测，已经通过性能验证，具有高准确性和高精密度。
在一实施例中，该试剂盒及检测方法降低了传统检测方法对组织样本的要求，穿刺样本也可以满足要求，同时避免了微小组织样本染色重复性差的问题。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (12)

1.一种肺癌和/或胰腺癌样本的染色方法，包括
染色步骤，包括按照如下抗原组中的抗原顺序，使用对应的一抗依次对待测的肺癌和/或胰腺癌样本进行孵育，使用染色剂对孵育后的样本进行染色，得到染色后的样本：
OX40、CD3、FOXP3、CD4、CD8、panCK；
所述染色步骤中，抗原对应的一抗与染色剂按如下方式依次配对染色：
抗OX40单克隆抗体配对Opal 690，抗CD3单克隆抗体配对Opal 620，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗panCK单克隆抗体配对Opal 780。
2.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，染色步骤中，包括按照抗原顺序，重复进行抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、染色、去除抗体。
3.如权利要求2所述的染色方法，其特征在于，染色步骤中，二抗孵育时使用的二抗标记有辣根过氧化物酶。
4.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，染色步骤中，对前5种抗原完成染色后，使用封闭液对样本进行封闭，然后对第6种抗原依次进行一抗孵育、二抗孵育、信号放大染色、去除抗体、使用对应的染色剂进行染色、使用核染色剂进行染色，获得染色后的样本。
5. 如权利要求4所述的染色方法，其特征在于，信号放大染色时，使用的染色剂包含Opal TSA-DIG染料。
6.如权利要求5所述的染色方法，其特征在于，所述核染色剂包括DAPI。
7.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，染色步骤中，所述样本包括癌组织切片。
8.如权利要求1所述的染色方法，其特征在于，还包括成像步骤，包括对染色后的样本进行连续光谱成像，获得对应的染色图像。
9.如权利要求8所述的染色方法，其特征在于，还包括非诊断治疗目的的检测步骤，对染色图像进行检测，获得检测结果。
10.一种用于检测肺癌和/或胰腺癌样本的试剂盒，其特征在于，包括如下抗体：
抗OX40单克隆抗体、抗CD3单克隆抗体、抗FOXP3单克隆抗体、抗CD4单克隆抗体、抗CD8单克隆抗体、抗panCK单克隆抗体；
还包括染色剂，染色剂的种类数量与抗体的种类数量一致；
所述染色剂包括荧光染色剂；
所述染色剂包括：
Opal 690、Opal 620、Opal 570、Opal 520、Opal 480、Opal 780；
所述抗体与染色剂的配对关系如下：
抗OX40单克隆抗体配对Opal 690，抗CD3单克隆抗体配对Opal 620，抗FOXP3单克隆抗体配对Opal 570，抗CD4单克隆抗体配对Opal 520，抗CD8单克隆抗体配对Opal 480，抗panCK单克隆抗体配对Opal 780。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于还包括荧光染料Opal TSA-DIG。
12.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含抗原修复液、辣根过氧化物酶标记的二抗、封闭液、抗荧光淬灭剂中的至少一种。
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