CN116083397A - 一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD及其编码基因和应用 - Google Patents

一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD及其编码基因和应用，属于农业生物技术领域；本发明所涉及的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因hazhd的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，上述水解酶HaZHD可以用于水解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮；本发明所涉及的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的重组表达载体优选为pET‑31b‑hazhd和pPICZαA‑hazhd，所述重组菌株优选为大肠杆菌和毕赤酵母；本发明还公开了一种含有上述玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的添加剂及其应用。本发明提供的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD能够同时水解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮，在饲料和食品中霉菌毒素脱毒领域具有重要应用前景。

Description

一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD及其编码基因和应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD及其编码基因和应用。
背景技术
玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）又称F-2毒素，是一种主要由禾谷镰刀菌和串珠镰刀菌等镰刀菌属真菌产生的有毒次级代谢产物。ZEN是一种***类似物，能够引起动物和人内分泌紊乱和生殖障碍，此外ZEN还具有肝脏毒性、免疫毒性和肠道毒性。饲料中污染的ZEN还会在肉、蛋、奶中残留，引发动物源性食品安全问题，全世界范围内有45%的饲料和饲料原料受到ZEN污染，给饲料工业和畜禽养殖业造成巨大经济损失。近年来研究发现，ZEN还会以硫酸酯化、糖苷化和谷胱甘肽化修饰的形式存在于谷物中，称之为“隐蔽型玉米赤霉烯酮”，常见的隐蔽型玉米赤霉烯酮包括玉米赤霉烯酮-14-硫酸盐（Zearalenone-14-Sulfate，ZEN-14-S）、玉米赤霉烯酮-16-硫酸盐（Zearalenone-16-Sulfate，ZEN-16-S）、玉米赤霉烯酮-14-葡萄糖苷（Zearalenone-14-Glucoside，ZEN-14-G）和玉米赤霉烯酮-16-葡萄糖苷（Zearalenone-16-Glucoside，ZEN-16-G）。隐蔽型玉米赤霉烯酮自身不具有毒性或毒性较弱，但在人和动物消化道微生物作用下可以转化成玉米赤霉烯酮进而产生毒性。
谷物在生长、收获和储存各个环节均可能感染产毒素霉菌，通过选用抗霉菌的作物品种，采取适当的田间管理措施，在收获和储存过程中严格控制水分含量和环境温湿度以及添加防霉剂等措施可以在一定程度上减少ZEN污染发生。对于已经受到ZEN污染的谷物和饲料，常用的脱毒方法可以分成物理法、化学法和生物法。物理法又可以分成两类，一类是在谷物和饲料中添加有机或无机吸附剂，另一类则是通过辐照加工、微波加热和等离子体处理等。化学法包括臭氧熏蒸、氨化处理、酸化处理以及电解氧化水浸泡等。生物法是指利用特定的微生物及其产生的酶催化ZEN转化成无毒或低毒代谢产物的处理方法，生物降解法相比于物理和化学法具有安全高效、绿色环保、对饲料和食品营养价值和感官品质影响小以及易于规模化推广应用等优点，被认为是最有应用前景的ZEN脱毒方法。
目前有多种酶被公开报道具有降解ZEN的功能，包括来源于地衣芽孢杆菌的漆酶CotA、来源于枯草芽孢杆菌的染料脱色过氧化物酶DyP和来源于粉红粘帚霉的内酯水解酶ZHD101等。ZEN水解酶ZHD101，以及近年来报道的其他ZEN水解酶如Zhd11B、CbZHD、ZENC、Zhd518和ZHD607等的最适反应pH在8.0-10.0之间，然而动物和人肠道pH在6.0-8.0之间，导致这些ZEN水解酶在动物和人肠道环境中水解ZEN活性低。另外，这些ZEN氧化酶和水解酶能否同时降解隐蔽型ZEN尚缺乏研究。
因此，亟需一种玉米赤霉烯酮水解酶，能够同时高效水解ZEN和隐蔽型ZEN。
发明内容
本发明的目的是：提供一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD及其编码基因和应用，该中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD能够同时高效水解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD，所述玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
MRTKGTITTHEGITWYYEQEGSGPDIVLIPDGLGECQMFDKPMSLIAAEGFRATTFDMPGMSRSSDAPPETYEDVTGQKLASYVISIIDKLGIDTATFWGCSSGGSTVLALVAGYPARVRTALAHEVPTYHIDDLSHLHKLEDEVISANLSATVPAGSCGDLEAWAGLGDDAHARLWKNYARWAHGYPRTIPQSAATNVEDLLKRPLYWTVGASTPTSRFFDNIVTATKAGVDIGHIPGMHFPYVSHPEAFTKHVVDATRTHL
所述玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的氨基酸序列还包括与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％以上的序列一致性，并具有ZEN水解酶功能的氨基酸序列。
所述玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的编码基因hazhd核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2：
ATGAGGACAAAAGGAACGATAACTACACACGAAGGTATCACCTGGTATTACGAGCAAGAGGGCTCTGGCCCGGATATCGTTCTGATTCCGGATGGTCTGGGTGAATGTCAGATGTTCGACAAGCCGATGTCCCTGATTGCAGCAGAGGGCTTTCGTGCTACGACCTTTGACATGCCGGGTATGTCCAGAAGCAGCGATGCCCCACCGGAAACCTACGAGGACGTTACCGGTCAGAAGTTAGCGAGCTATGTCATCTCGATCATTGACAAACTGGGCATCGACACCGCCACCTTCTGGGGTTGCAGCTCCGGCGGTTCCACCGTGCTGGCCCTGGTCGCAGGCTACCCGGCGCGTGTTCGTACGGCGCTGGCGCATGAAGTGCCAACGTACCATATCGATGACTTGTCTCACCTGCACAAATTGGAGGACGAGGTGATTTCTGCTAATCTGAGCGCGACTGTGCCGGCTGGCAGTTGCGGTGATCTTGAGGCTTGGGCGGGTCTCGGCGACGATGCGCACGCGCGTCTGTGGAAGAACTATGCACGCTGGGCACACGGCTACCCGCGTACCATTCCGCAAAGCGCGGCGACCAACGTGGAAGATTTGTTGAAACGCCCTCTGTATTGGACCGTAGGTGCTAGCACCCCGACAAGCCGCTTCTTCGACAACATTGTGACGGCCACCAAAGCGGGTGTTGACATCGGCCATATCCCGGGTATGCACTTTCCGTATGTTAGCCATCCGGAAGCCTTTACCAAGCACGTTGTTGATGCGACCCGTACCCATTTGTAA
中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD应用于水解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮，所述隐蔽型玉米赤霉烯酮包括玉米赤霉烯酮-14-硫酸盐即“Zearalenone-14-Sulfate，ZEN-14-S”、玉米赤霉烯酮-16-硫酸盐即“Zearalenone-16-Sulfate，ZEN-16-S”、玉米赤霉烯酮-14-葡萄糖苷即“Zearalenone-14-Glucoside，ZEN-14-G”和玉米赤霉烯酮-16-葡萄糖苷即“Zearalenone-16-Glucoside，ZEN-16-G”。
本发明还提供了中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体包含玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD编码基因，重组表达载体优选为pET-31b-hazhd和pPICZαA-hazhd。
本发明还提供了表达中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD编码基因的重组菌株，所述重组菌株由玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD编码基因的重组表达载体转化得到，重组菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、米曲霉、黑曲霉和里氏木霉。
优选的，所述重组菌株为大肠杆菌和毕赤酵母。
本发明还提供了一种采用大肠杆菌制备玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的方法，包括以下步骤：
1）用包含玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD编码基因hazhd的重组表达载体pET-31b-hazhd转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，得到重组菌株；
2）培养所述重组菌株，诱导玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD表达。
本发明还提供了一种采用毕赤酵母制备玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的方法，包括以下步骤：
1）用包含玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD编码基因hazhd的重组表达载体pPICZαA-hazhd转化毕赤酵母X33，得到重组菌株；
2）培养所述重组菌株，诱导玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD表达。
本发明还提供了一种降解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮的添加剂，所述添加剂包括玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD及其生理上可接受的载体，其中所述玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的含量为0.01%-10%，所述生理上可接受的载体包括石灰石、滑石粉、膨润土、高岭土、蒙脱石、壳聚糖、甲壳素、淀粉、蔗糖、稻米、米糠、稻壳粉、大豆皮、麦麸、玉米芯粉、麦芽糖糊精、环糊精和酵母细胞壁中的一种或几种。
所述添加剂应用于降解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮，所述添加剂的应用包括体内外脱除饲料和饲料原料、果汁和果渣、粮食及其加工副产物和中草药中的玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD、编码基因、添加剂及其应用，尤其涉及其在降解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉酮方面的应用；上述玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD最适反应pH为7.0；依据水解酶HaZHD水解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮活性检测表明，可有效降解ZEN和隐蔽型玉米赤霉烯酮ZEN-14-S、ZEN-16-S、ZEN-14-G和ZEN-16-G，在生产实践中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例中纯化的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的SDS-PAGE分析结果；
图2为本发明制备的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD降解ZEN的HPLC分析结果；
图3为本发明制备的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD降解隐蔽型ZEN降解率结果；
图4为本发明酶学特性测试中pH对玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD酶活的影响；
图5为本发明酶学特性测试中温度对玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD酶活的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的解释说明。
实施例1：大肠杆菌中表达玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD
将合成的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的编码基因hazhd连接在pET-31b载体NdeI和XhoI酶切位点之间，重组pET-31b-hazhd质粒转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta(DE3)。
将转化有pET-31b-hazhd质粒的重组大肠杆菌Rosetta（DE3）接种于5mL LB液体培养基中活化过夜，按1：100比例转接到500mL装液量为300mL的三角瓶中，37℃、180r/min震荡培养至OD600为0.6时，添加0.4mM IPTG，28℃、180r/min震荡培养6h诱导目的蛋白表达。
收集发酵液，4℃、12000rpm离心30min，弃上清；用pH7.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，4℃、12000rpm离心30min，弃上清，重复洗涤菌体三次。将菌体细胞重悬于Bindingbuffer中，在冰水浴中超声破碎菌体，4℃、12000rpm离心10min，收集菌体破碎后上清得到HaZHD粗酶。
实施例2：毕赤酵母中表达玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD
将合成的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的编码基因hazhd连接在pPICZαA载体EcoRI和NotI酶切位点之间，经SacI酶切线性化后电转化毕赤酵母感受态细胞X33。
将转化有pPICZαA-hazhd质粒的重组毕赤酵母X33接种于20mL BMGY液体培养基中28℃、200r/min培养至OD600=2-6，4℃、5000rpm离心10min，收集菌体并接种到装有50mLBMMY液体培养基的500mL三角瓶中，每隔24h加入0.5%的甲醇诱导HaZHD表达，28℃、200r/min条件下诱导培养96h，4℃、12000rpm离心10min收集上清，即得到HaZHD粗酶。
实施例3：玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD纯酶的制备
按照实施例1所述方法获得HaZHD粗酶液，经0.45μm滤膜过滤，采用镍离子亲和层析柱（Ni2+-NTA）纯化重组蛋白，平衡、上样、洗脱等步骤参见Qiagen六联组氨酸标记蛋白纯化手册。
纯化后的蛋白用3kDa截留管超滤去除其中含有的咪唑，纯化的HaZHD进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图1所示，泳道1为纯化的HaZHD蛋白迁移条带，分子量约为30kDa，与理论分子量大小一致。
实施例4：玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD水解ZEN活性检测
将固体ZEN标准品溶解到甲醇中配成1.5mg/mL的母液，按如下500μL反应体系进行实验：485μL磷酸钠缓冲液（100mM，pH7.0），5μL实施例3制备得到的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD纯酶（0.5mg/mL），10μL ZEN母液；37℃水浴孵育0、0.5和2.0h后加入500μL甲醇终止反应，采用高效液相色谱分析检测反应体系中ZEN含量。
高效液相色谱检测ZEN的色谱条件为：色谱柱：Agilent C18色谱柱，4.6mm×250mm×5μm；流动相：乙腈-水（60：40）；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL；紫外检测器检测波长为274nm；采集时间：20分钟。
图2所示为玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD活性检测结果，由此可以看出，随着反应的进行，反应体系中ZEN（对应保留时间为7.4min）含量下降，且在保留时间为2.1min位置有产物峰生成，并随着反应的进行峰面积增加，表明玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD具有水解ZEN活性。
实施例5：玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD水解隐蔽型玉米赤霉烯酮活性检测
分别将固体隐蔽型玉米赤霉烯酮ZEN-14-S、ZEN-16-S、ZEN-14-G和ZEN-16-G标准品溶解到甲醇中配成1.5mg/mL的母液，按如下500μL反应体系进行实验：485μL磷酸钠缓冲液（100mM，pH7.0），5μL实施例3制备得到的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD纯酶（0.5mg/mL），10μL ZEN-14-S、ZEN-16-S、ZEN-14-G或ZEN-16-G母液；37℃水浴孵育0和2.0h后加入500μL甲醇终止反应，采用上述实施例4中的高效液相色谱分析方法检测反应体系中ZEN-14-S、ZEN-16-S、ZEN-14-G和ZEN-16-G含量，计算降解率。
如图3所示，结果表明ZEN-14-S、ZEN-16-S、ZEN-14-G和ZEN-16-G降解率分别达到95%、92%、93%和91%。由此表明玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD能够水解隐蔽型玉米赤霉烯酮ZEN-14-S、ZEN-16-S、ZEN-14-G和ZEN-16-G。
实施例6：玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD酶学特性测试
为测试在不同pH条件下玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD酶活性，采用如下反应体系：485μL不同pH缓冲液，5μL实施例3制备得到的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD纯酶（0.5mg/mL），10μL ZEN母液；37℃水浴孵育10min后加入500μL甲醇终止反应，采用上述实施例4中的高效液相色谱分析方法检测反应体系中ZEN含量，计算相对酶活。结果如图4所示，玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD最适反应pH为7.0，在pH6.0-10.0范围内其相对酶活维持在50%以上。
为测试在不同温度条件下玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD酶活性，采用如下反应体系：485μL磷酸钠缓冲液（100mM，pH7.0），5μL实施例3制备得到的玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD纯酶（0.5mg/mL），10μL ZEN母液；在不同温度（22、27、32、37、42、47、52和57℃）条件下水浴孵育10min后加入500μL甲醇终止反应，采用上述实施例4中的高效液相色谱分析方法检测反应体系中ZEN含量，计算相对酶活。结果如图5所示，玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD最适反应温度为47℃，在27-52℃范围内其相对酶活维持在50%以上。
实施例7：一种降解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮的添加剂及制备方法
称取添加剂总质量的99.9%的载体，载体中麦芽糖糊精与淀粉按质量比1:2比例混合，然后再按添加剂总质量的0.1%的比例混入玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD，得到添加剂。
实施例8：一种脱除玉米浆中的ZEN和ZEN-14-G的方法
采用上述实施例7制备的添加剂脱除玉米浆中的ZEN和ZEN-14-G，在500mL三角瓶中加入100mL含有5.3μg/mL ZEN和3.4μg/mL ZEN-14-G的玉米浆，用浓度为1M的NaOH调节pH至7.0，加入0.5g实施例7所述的添加剂，37℃反应5h，取10mL反应液经固相萃取柱净化后采用实施例4所述的高效液相色谱分析方法检测反应体系中ZEN和ZEN-14-G含量，结果表明反应结束后玉米浆中ZEN和ZEN-14-G含量分别下降至0.04μg/mL和0.02μg/mL。
本发明提供了一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD、编码基因、添加剂及其应用，其最适反应pH为7.0；依据水解酶HaZHD水解玉米赤霉烯酮ZEN和隐蔽型玉米赤霉烯酮活性检测表明，可有效降解ZEN和隐蔽型玉米赤霉烯酮ZEN-14-S、ZEN-16-S、ZEN-14-G和ZEN-16-G，在生产实践中具有广泛的应用前景。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD，其特征在于：所述玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD，其特征在于：所述玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的编码基因hazhd核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1或2所述的中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD应用于水解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮，其特征在于：所述隐蔽型玉米赤霉烯酮包括玉米赤霉烯酮-14-硫酸盐即“Zearalenone-14-Sulfate，ZEN-14-S”、玉米赤霉烯酮-16-硫酸盐即“Zearalenone-16-Sulfate，ZEN-16-S”、玉米赤霉烯酮-14-葡萄糖苷即“Zearalenone-14-Glucoside，ZEN-14-G”和玉米赤霉烯酮-16-葡萄糖苷即“Zearalenone-16-Glucoside，ZEN-16-G”。
4.一种包含中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD编码基因的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体包含玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD编码基因，重组表达载体优选为pET-31b-hazhd和pPICZαA-hazhd。
5.一种表达中性玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的重组菌株，其特征在于：所述重组菌株由玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD编码基因的重组表达载体转化得到，重组菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、乳酸乳球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、米曲霉、黑曲霉和里氏木霉。
6.根据权利要求5所述的重组菌株，其特征在于：优选重组菌株为大肠杆菌和毕赤酵母。
7.一种降解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮的添加剂，其特征在于：所述添加剂包括玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD及其生理上可接受的载体，其中所述玉米赤霉烯酮水解酶HaZHD的含量为0.01%-10%，所述生理上可接受的载体包括石灰石、滑石粉、膨润土、高岭土、蒙脱石、壳聚糖、甲壳素、淀粉、蔗糖、稻米、米糠、稻壳粉、大豆皮、麦麸、玉米芯粉、麦芽糖糊精、环糊精和酵母细胞壁中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的添加剂在降解玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮上的应用，其特征在于：所述添加剂的应用包括体内外脱除饲料和饲料原料、果汁和果渣、粮食及其加工副产物和中草药中的玉米赤霉烯酮和隐蔽型玉米赤霉烯酮。
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