CN116076344A - 一种利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法 - Google Patents

一种利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法，是以金线莲种子无菌播种萌发获得的原球茎为材料，利用丝核菌和木屑、椰糠、泥炭土、花生壳等配制共生培养基质及共生栽培基质，诱导原球茎分化并生长成完整的菌根化植株，再进行共生栽培。该方法利用金线莲种子无菌播种可快速获得数量巨大的原球茎的优势，使用天然的原材料配制共生培养基质和共生栽培基质，在短时间内可繁育获得大量金线莲菌根化种苗；获得的优质菌根化种苗可直接移栽到共生栽培基质上进行栽培，成活率和鲜重增长率高；有效解决金线莲优质种苗匮乏和人工种植难度大的实际问题，对于金线莲产业的发展具有重大意义。

Description

一种利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法
技术领域
本发明属于利用菌根真菌促进兰科植物种苗繁育和栽培技术领域，具体涉及一种利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法。
背景技术
菌根是土壤中菌根真菌菌丝与高等植物营养根系形成的一种联合体，是自然界在长期的发展和进化过程中形成的一种特殊的植物与真菌共生的存在形式，它直接参与植物根系乃至整株植物的生理代谢活动。兰科植物是典型的菌根植物，从种子萌发、幼苗生长、繁衍到种群延续的整个生活史都与真菌共生关系紧密相连。
金线莲[Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.]为兰科开唇兰属珍贵药用和观赏植物，在我国主要分布于云南、广西、福建、广东和江西等省区。作为我国传统的珍贵药材，金线莲素有“神药”、“金草”、“药王”、“乌人参”等美称，可全草入药，对急慢性肝炎、糖尿病、高血脂等多种重大疾病均有疗效。金线莲除用作中药材外，还大量用于鲜食、煲汤和制茶等保健养生方面。由于金线莲具有很好的保健和医疗功效，人们对该植物的需求量也正随着人们生活水平的提高和自我保健意识的加强而日益增大，市场供不应求，产业化开发前景广阔。
近年来，福建、浙江、广西、云南等省区逐步开展了大规模的金线莲人工繁育和栽培来进行鲜草原材料生产。然而，金线莲产业化生产遇到了瓶颈，主要表现在种苗繁育周期长和人工种植难度大甚至难以种活，主要原因之一就是因为金线莲是典型地生型兰菌共生植物，其繁殖和生长十分依赖于共生菌根真菌。但目前金线莲生产上都是通过无菌播种组培快繁进行种苗的繁殖和无菌组培苗的栽培。在种苗繁殖中，组培苗继代增殖和生根培养周期较长，每一代都需要120d左右，金线莲组培苗生根培养后，还需进行一段时间的炼苗后才能移栽。在人工栽培中，组培苗移栽后，将有40～60％的种苗因为根系难以自主吸收水分和养分而死亡，若管理稍有不善，极易诱发病害导致全部死亡，即使部分移栽种植成活，成活期限也常常不足6个月。
利用菌根真菌开展金线莲的菌根化育苗仅有零星报道，如赵有林与崔保登(2014)利用丝核菌诱导金线莲种子共生萌发繁殖获得种苗，陈雨薇等(2016)和方祥等(2009)利用丝核菌诱导金线莲离体茎段生长获得菌根化苗，但利用丝核菌诱导无菌原球茎分化与菌根化及共生栽培尚未见报道。
发明内容
针对金线莲产业中的以上技术问题，本发明公开了一种利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法；包括以金线莲种子无菌播种萌发获得的原球茎为材料，使用包含共生真菌的共生培养基质，诱导原球茎分化成根状茎，并生长成完整的菌根化植株；然后使用包含共生真菌的共生栽培基质进行共生栽培；得到完整的金线莲植株；提高成活率和鲜重增长率；
进一步地，所述共生真菌为丝核菌；
进一步地，所述包含共生真菌的共生培养基质包括丝核菌及杂木屑、蛇木屑、椰糠、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钴中一种或多种；
进一步地，所述包含共生真菌的共生栽培基质包括丝核菌及花生壳、椰糠、泥炭土中一种或多种；
进一步地，所述利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法，包括以下步骤：
步骤1、无菌播种萌发获得原球茎：将经过消毒处理的金线莲种子播种于萌发和增殖培养基上，培养30～50d萌发得到无菌原球茎；
步骤2、共生培养诱导形成根状茎：将步骤1得到的无菌原球茎接种到包含共生真菌的共生培养基质上，在共生培养条件下培养20～30d，原球茎逐步膨大并伸长，形成得到粗壮的根状茎；
步骤3、根状茎分化培养成苗：在共生分化培养条件下培养20～40d，根状茎分化成带叶片的芽苗，逐渐长高和诱导出根系，形成完整的金线莲菌根化植株；
步骤4、菌根化苗移栽：将步骤3得到的金线莲菌根化植株移栽到包含共生真菌的共生栽培基质上栽培，成活得到金线莲植株；
进一步地，所述共生真菌为丝核菌的PDA液体菌种，丝核菌在PDA液体菌种中菌落数为100～1000cfu/mL；
进一步地，所述包含共生真菌的共生培养基质，包含杂木屑50～80％、蛇木屑10～30％、椰糠10～20％，另外添加葡萄糖1.0～2.0％、硫酸铵0.5～1.0％、磷酸二氢钾0.4～1.0％、氯化钴0.03～0.05％，含水量为50～80％；
进一步地，所述包含共生真菌的共生栽培基质中，泥炭土、花生壳和椰糠之间体积比为3～5：1：1，含水量为50～70％；
在本发明的具体实施方式中，所述利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育，具体为：提供一种利用丝核菌促进金线莲原球茎分化及菌根化的方法，在短时间内获得大量金线莲菌根化种苗；
进一步地，所述利用丝核菌促进金线莲原球茎分化及菌根化方法包括以下步骤：
步骤(1)、无菌播种萌发获得原球茎：将人工授粉获得金线莲蒴果在超净工作台内进行表面消毒处理，然后切开蒴果，将内部的种子撒播在萌发和增殖培养基上，培养30～50d得到大量无菌原球茎；
步骤(1)中，人工授粉具体为：在上午8～9点，选取开放2～3d的花朵，用牙签取其蕊柱上呈浅黄色、具有黏性的花粉块置于亲本花的柱头蕊腔内，授粉方式为居群内异花或异株授粉，授粉后48～96h内停止浇水，80～100d后采收饱满无开裂的蒴果备用。
步骤(1)中，蒴果表面消毒具体为：将蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数75％的酒精浸泡60～120s后，无菌水漂洗1～2次，然后用质量分数0.1％的HgCl2溶液消毒10～15min，无菌水漂洗5～6次。
步骤(1)中，萌发和增殖培养基组成为：1/2MS培养基添加6-苄基腺嘌呤2.0～3.0mg/L、萘乙酸0.3～0.5mg/L、香蕉70～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L，pH值为5.8～6.2；
步骤(2)、共生培养诱导形成根状茎：先将丝核菌菌液接种到共生培养基质上培养3～7d，然后再将原球茎接种到共生培养基质上，在共生培养条件下培养20～30d，原球茎逐步膨大并伸长，形成粗壮的根状茎；
所述丝核菌(Rhizoctonia sp.)为絮状真菌，由本专利申请人从金线莲原生境分离筛选获得，保藏号为CGMCC No.9728，使用时先从低温保藏的斜面试管活化，然后转接到PDA液体培养基上培养，制备成液体菌种备用；
步骤(2)中，共生培养基质组成为；含杂木屑50～80％、蛇木屑10～30％、椰糠10～20％，另外添加葡萄糖1.0～2.0％、硫酸铵0.5～1.0％、磷酸二氢钾0.4～1.0％、氯化钴0.03～0.05％，含水量为50～80％，基质混合均匀经过高温灭菌后备用；
优选地，共生培养基质组成为；固体基质包括杂木屑50～70％、蛇木屑20～30％、椰糠10～20％，另外添加葡萄糖1～1.5％、硫酸铵0.6～0.8％、磷酸二氢钾0.5～0.7％、氯化钴0.03～0.05％，含水量为60～70％，基质混合均匀经过高温灭菌后备用；
具体的，杂木屑为山毛榉科灌木或小乔木的树皮、细枝和叶按3：1：1比例组成，打碎成直径大小为3～6mm的混合颗粒，蛇木屑是以桫椤树根为主要原料，晒干、打碎后备用，椰糠为椰糠丝，杂木屑和蛇木屑需先用清水浸泡和冲洗；葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾均为分析纯，水溶后进行喷施混匀；水为去离子水。
步骤(2)中，所述共生培养条件为：用黑色遮光布进行遮光培养，温度为23～27℃；湿度60～70％。
优选为，遮光率为80～100％，温度为25～27℃；湿度60～70％。
高温灭菌具体为121℃、105Pa条件下灭菌35～45min；
步骤(3)、根状茎分化培养成苗：待原球茎形成粗壮的根状茎后，在共生分化培养条件下培养20～40d，期间在共生培养基质上补充1～2次丝核菌菌液，根状茎分化成带叶片的芽苗，并逐渐长高和诱导出根系，形成完整的金线莲菌根化植株；
步骤(3)中，菌根化植株成苗率为71.5～82.7％；
步骤(3)中，共生分化培养条件为：利用日光灯进行间歇光照培养，光照度为1000～3000lx；所述间歇光照培养时所用的光源为复合波长的日光灯，光照时间为10～16h/d；温度为23～27℃；湿度60～80％；
优选为，共生分化培养条件为：利用日光灯进行间歇光照培养，光照度为1500～2000lx；所述间歇光照培养时所用的光源为复合波长的日光灯，光照时间为12～16h/d；温度为25～27℃；湿度60～70％。
在本发明的具体实施方式中，所述利用丝核菌栽培的方法为利用丝核菌进行金线莲菌根化植株的共生栽培的方法；具体操作为：
步骤(4)、菌根化植株移栽：先将丝核菌菌液接种到共生栽培基质上培养3～5d，待絮状菌丝分布到60～80％基质表面时，再将菌根化植株移栽到共生栽培基质上栽培，30d的成活率为82.5～96.5％，120d的鲜重增长率达85.9～95.5％；
步骤(4)中，所述共生栽培基质为：泥炭土、花生壳和椰糠按照体积3～5：1：1的比例混合配制而成，含水量为50～70％。
优选为，共生栽培基质为：泥炭土、花生壳和椰糠按照体积3～4：1：1的比例混合配制而成，含水量为50～70％；基质经过高温灭菌后备用；
具体的，泥炭土为德国进口的大汉泥炭土，花生壳颗粒大小为3～6mm，椰糠为椰糠丝。
共生栽培为设施大棚内栽培，使用双层遮阳网遮阴，荫蔽度为70～80％；
本发明与现有公开专利“金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法(CN201410582811.7)”和“一种金线莲共生苗的生产方法(CN200910210058.8)”相比较，本发明方法采用不同的工艺，将无菌播种与菌根化育苗结合，充分利用无菌播种可快速获得数量巨大的原球茎的优势，配制专门的共生培养基质，从原球茎到成苗只需要40～70d，且获得菌根化种苗数量得以成数倍的提高，另外，通过在基质中添加菌根真菌进行共生栽培，有利于菌根化种苗持续吸收营养和水分，成活率和鲜重增长率也有显著提高，能产生更大的经济效益。可见，本发明方法极大地提高了地生型兰菌共生植物金线莲菌根化种苗获得的效率和栽培生产量，是一项有效地菌根化育苗和栽培方法，该方法能简便快捷地应用到工厂化生产金线莲菌根化种苗和规模化栽培上，解决金线莲产业中的实际问题。
附图说明
图1为本发明活化的丝核菌菌落形态照片；
图2为本发明实施例2中金线莲原球茎形成的根状茎照片；
图3为本发明实施例2中金线莲原球茎共生培养形成完整的植株照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
本申请使用的丝核菌为从金线莲原生境分离筛选获得，分类命名为丝核菌Rhizoctonia sp，保藏号为CGMCC No.9728，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期为2014年9月28日；
配置丝核菌的PDA液体菌种：使用时先取出低温保藏的丝核菌斜面试管中进行活化(如图1所示)，然后转接到PDA液体培养基上培养，制备成液体菌种备用；丝核菌在PDA液体菌种中菌落数为100～1000cfu/mL；
实施例1
一种利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法，包括以下步骤：
(1)无菌播种萌发获得原球茎
采用常规的组培快繁消毒技术对金线莲的蒴果进行表面消毒，然后用无菌刀片切开蒴果，将内部的种子撒播于萌发和增殖培养基1/2MS+6-BA2.0～3.0mg/L+NAA0.3～0.5mg/L+香蕉70～100g/L+AC1.0～2.0g/L+蔗糖20～30g/L+琼脂3.5～5.5g/L上，pH值为5.8～6.2，培养30～50d，得到大量无菌原球茎如图2所示，可作为下一步培养菌根化植株的材料。
(2)原球茎与丝核菌共生培养形成根状茎
先将丝核菌菌液接种到共生培养基质上培养3d，然后再将原球茎接种到共生培养基质上，利用遮光布设置不同的遮光率，在温度为23～27℃、湿度60～70％条件下培养，共生诱导培养基质组成为；杂木屑50％、蛇木屑30％、椰糠20％、葡萄糖1.0％、硫酸铵0.6％、磷酸二氢钾0.4％、氯化钴0.03％，含水量为60～70％，基质经过高温灭菌后备用。培养20～30d时的株高和茎粗及生长情况结果如表1所示，随着遮光率的增加，原球茎的生长越快，高度显著增加，表明金线莲原球茎诱导成根状茎以遮光率80～100％的微弱光照或暗培养条件最佳。
表1不同遮光率对原球茎生长的影响
Figure BDA0003895391500000071
(3)根状茎与丝核菌共生培养分化成苗
先在共生培养基质上补充菌液1次，然后在光照度为1000～1500lx、光照时间为10h/d、温度为23～25℃、湿度60～70％条件下培养10～20d，根状茎分化成带叶片芽苗，继续培养10～20d，芽苗逐渐长高并诱导出根系，形成完整的植株，成苗率为71.5％。
步骤(1)、(2)、(3)为培养室内环境进行培养；
(4)根部显微结构观察
取植株根系制作石蜡切片，然后利用光学显微镜进行观察，可从根部细胞中观察到已形成大量菌丝结，且大多靠近髓部，表明获得的为金线莲菌根化种苗。
(5)菌根化植株栽培
将泥炭土、花生壳和椰糠按照其体积3：1：1的比例混合配制成共生栽培基质，保持含水量为50～60％，然后将丝核菌菌液接种到基质上，待絮状菌丝分布到60％基质表面时进行种苗移栽，30d的成活率为82.5％，120d鲜重增长率达85.9％；
菌根化植株可全年进行移栽，移栽前不需要经过专门的炼苗处理，可直接出瓶移栽种植；
步骤(5)为设施大棚内环境，使用双层遮阳网遮阴，荫蔽度为70～80％。
实施例2
(1)金线莲无菌播种萌发获得原球茎
该步骤同实施例1
(2)原球茎与丝核菌共生培养形成根状茎
先将丝核菌菌液接种到共生培养基质上培养5d，然后再将原球茎接种到共生培养基质上，在遮光率80～100％的微弱光照或暗培养条件下培养，共生诱导培养基质组成为；杂木屑50％、蛇木屑30％、椰糠20％、葡萄糖1.5％、硫酸铵0.8％、磷酸二氢钾0.7％、氯化钴0.05％，含水量为60～70％。培养20～30d时原球茎逐步膨大并伸长，形成粗壮的根状茎(如图2所示)。
(3)根状茎与丝核菌共生培养分化成苗
先在共生培养基质上补充菌液1次，然后在光照度为1500～2000lx、光照时间为12h/d、温度为25～27℃、湿度60～70％条件下培养10～20d，根状茎分化成带叶片芽苗，再补充菌液1次继续培养10～20d，芽苗逐渐长高并诱导出根系，形成得到完整的菌根化植株；(如图3所示)，成苗率为82.7％。步骤(1)、(2)、(3)为培养室内环境进行培养；
(4)根部显微结构观察
该步骤同实例1。
(5)菌根化植株移栽
将泥炭土、花生壳和椰糠按照其体积4：1：1的比例混合配制成共生栽培基质，保持含水量为60～70％，然后将丝核菌菌液接种到基质上，待絮状菌丝分布到60％基质表面时进行种苗移栽，30d的成活率为96.5％，120d鲜重增长率达95.5％；
菌根化植株可全年进行移栽，移栽前不需要经过专门的炼苗处理，可直接出瓶移栽种植；
步骤(5)为设施大棚内环境，使用双层遮阳网遮阴，荫蔽度为70～80％。
实施例3
(1)金线莲无菌播种萌发获得原球茎
该步骤同实施例1
(2)原球茎与丝核菌共生培养形成根状茎
先将丝核菌菌液接种到共生培养基质上培养7d，然后再将原球茎接种到共生培养基质上，在遮光率80～100％的微弱光照或暗培养条件下培养，共生诱导培养基质组成为；杂木屑70％、蛇木屑10％、椰糠20％、葡萄糖2.0％、硫酸铵1.0％、磷酸二氢钾1.0％、氯化钴0.05％，含水量为70～80％。培养20～30d时原球茎逐步膨大并伸长，形成粗壮的根状茎。
(3)根状茎与丝核菌共生培养分化成苗
先在共生培养基质上补充菌液1次，然后在光照度为2000～3000lx、光照时间为16h/d、温度为25～27℃、湿度60～70％条件下培养10～20d，根状茎分化成带叶片芽苗，再补充菌液1次继续培养10～20d，芽苗逐渐长高并诱导出根系，形成完整的植株，成苗率为75.0％。
步骤(1)、(2)、(3)为培养室内环境进行培养；
(4)根部显微结构观察
该步骤同实例1。
(5)菌根化植株移栽
将泥炭土、花生壳和椰糠按照其体积5：1：1的比例混合配制成共生栽培基质，保持含水量为60～70％，然后将丝核菌菌液接种到基质上，待絮状菌丝分布到80％基质表面时进行种苗移栽，30d的成活率为91.0％，120d鲜重增长率为88.5％；
菌根化植株可全年进行移栽，移栽前不需要经过专门的炼苗处理，可直接出瓶移栽种植；
步骤(5)为设施大棚内环境，使用双层遮阳网遮阴，荫蔽度为70～80％。
对比例4
采用申请号为CN201410582811.7，发明名称为金线莲种子与真菌共生萌发快速成苗的方法中实施例的操作进行金线莲的培育成苗操作：将成熟的金线莲种子撒播在固体培养基[固体培养基的制备方法同CN201410582811.7中实施例的(3)]上，金线莲种子与固体培养基上的共生真菌-丝核菌共生萌发成原球茎，在室温25～27℃的条件下，经过45～60d的暗培养，发育成长度达1.5～3cm金线莲原球茎(有菌)；
然后将金线莲原球茎(有菌)进行转移到山毛榉科树叶：山毛榉科木屑体积比为1：1的混合基质，在室温25～27℃的条件下，光照强度在2000lx,每天光照12h,光培养约20～30d，金线莲原球茎(有菌)分化成苗；
经对金线莲种子的萌发率进行统计，金线莲种子与共生真菌--丝核菌共生萌发成原球茎，最终分化成苗的萌发成苗率为18％；
与采用申请号CN201410582811.7的技术方案的相比，本发明具体实施方式的实施例1～3的步骤(1)～(3)成苗率71.5～82.7％，远远高于采用申请号CN201410582811.7的技术方案的18％的成苗率。
表明，采用本发明的技术方案，将金线莲种子首先无菌播种萌发，得到的无菌原球茎，然后在包含共生真菌--丝核菌的共生培养基质上培养得到有菌根状茎，进一步形成金线莲菌根化的成苗植株；与对比例4的直接将金线莲种子与固体培养基上的共生真菌-丝核菌共生萌发成有菌原球茎，然后分化成苗的技术方案相比，显著提高了金线莲的萌发成苗率。并且，本发明具体实施方式的实施例1～3的金线莲的菌根化植株的移栽成活率高于80％，有利于提高地生型兰菌共生植物金线莲栽培生产量。
本发明其他技术方案具有与上述相似的有意效果。

Claims (6)

1.一种利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法，其特征在于，包括以金线莲种子无菌播种萌发获得的原球茎为材料，使用包含共生真菌的共生培养基质，诱导原球茎分化成根状茎，并生长成完整的菌根化植株；然后使用包含共生真菌的共生栽培基质进行共生栽培，得到完整的金线莲植株；
其中，所述共生真菌为丝核菌；
所述包含共生真菌的共生培养基质包括丝核菌及杂木屑、蛇木屑、椰糠、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钴中一种或多种；
所述包含共生真菌的共生栽培基质包括丝核菌及花生壳、椰糠、泥炭土中一种或多种。
2.根据权利要求1所述利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、无菌播种萌发获得原球茎：将经过消毒处理的金线莲种子播种于萌发和增殖培养基上，培养30～50d萌发得到无菌原球茎；
步骤2、共生培养诱导形成根状茎：将步骤1得到的无菌原球茎接种到包含共生真菌的共生培养基质上，在共生培养条件下培养20～30d，原球茎逐步膨大并伸长，形成得到粗壮的根状茎；
步骤3、根状茎分化培养成苗：在共生分化培养条件下培养20～40d，根状茎分化成带叶片的芽苗，逐渐长高和诱导出根系，形成完整的金线莲菌根化植株；
步骤4、菌根化苗移栽：将步骤3得到的金线莲菌根化植株移栽到包含共生真菌的共生栽培基质上栽培，成活得到金线莲植株；
其中，所述共生真菌为丝核菌的PDA液体菌液，丝核菌在PDA液体菌种中菌落数为100～1000cfu/mL。
3.根据权利要求2所述利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法，其特征在于，具体操作包括：
步骤(1)无菌播种萌发获得原球茎：将经过消毒处理的金线莲种子播种于萌发和增殖培养基上，培养30～50d萌发得到无菌原球茎；
步骤(2)原球茎与丝核菌共生培养：先将丝核菌菌液接种到共生培养基质上培养3～7d，然后再将原球茎接种到共生培养基质上，在共生培养条件下培养20～30d，原球茎逐步膨大并伸长，形成粗壮的根状茎；
所述共生诱导培养基质为；含杂木屑50～70％、蛇木屑20～30％、椰糠10～20％，另外添加葡萄糖1～1.5％、硫酸铵0.6～0.8％、磷酸二氢钾0.5～0.7％、氯化钴0.03～0.05％，含水量为60～70％，基质混合均匀经过高温灭菌后备用；
所述共生培养条件为：用黑色遮光布进行遮光培养，遮光率为80～100％，温度为25～27℃；湿度60～70％；
步骤(3)根状茎分化培养成苗：在共生分化培养条件下培养20～40d，期间在共生培养基质上补充1～2次丝核菌菌液，根状茎分化成带叶片的芽苗，并逐渐长高和诱导出根系，形成完整的金线莲菌根化植株；
所述共生分化培养条件为：利用日光灯进行间歇光照培养，光照度为1500～2000lx；所述间歇光照培养时所用的光源为复合波长的日光灯，光照时间为12～16h/d；温度为25～27℃；湿度60～70％；
步骤(4)菌根化苗移栽：先将丝核菌菌液接种到共生栽培基质上培养3～5d，待絮状菌丝分布到60～80％基质表面时，再将菌根化植株移栽到共生栽培基质上栽培，30d的成活率为82.5～96.5％，120d的鲜重增长率达85.9～95.5％；
所述共生栽培基质为：泥炭土、花生壳和椰糠按照体积3～4：1：1的比例混合配制而成，含水量为50～70％；基质经过高温灭菌后备用。
4.根据权利要求3所述利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法，其特征在于，所述步骤(1)的金线莲原球茎为无菌原球茎，由人工授粉获得的蒴果经过消毒处理后，种子播种到无菌培养基上萌发而来；
金线莲人工辅助授粉具体为；在金线莲开花期选择开放2～3d的花朵，在上午8～9点进行人工异花授粉，授粉时用牙签将父本花粉囊涂抹在母本柱头面上，授粉后2～4d内不要浇水；
消毒处理具体为：将授粉后生长80～100d的未开裂蒴果在自来水下用软毛刷刷洗掉外表的灰尘和杂物，再用体积分数75％的酒精浸泡60～120s后，无菌水漂洗1～2次，然后用质量分数0.1％的升汞溶液消毒10～15min，无菌水漂洗5～6次。
5.根据权利要求3所述利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法，其特征在于，所述步骤(1)，所述金线莲种子萌发培养基为含6-苄基腺嘌呤2.0～3.0mg/L、萘乙酸0.3～0.5mg/L、香蕉70～100g/L、活性炭1.0～2.0g/L、蔗糖20～30g/L和琼脂3.5～5.5g/L的1/2MS培养基，pH值为5.8～6.2。
6.根据权利要求3所述利用丝核菌促进金线莲原球茎分化与菌根化繁育及栽培的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(3)为培养室内环境进行培养；步骤(4)为设施大棚内环境，使用双层遮阳网遮阴，荫蔽度为70～80％。
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