CN116068096B - 僵蚕断面丝腺环相关的特异性标志物、筛选方法及僵蚕的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了僵蚕断面丝腺环相关的特异性标志物、筛选方法及僵蚕的质量检测方法，属于中药材质量检测领域。本发明是将白僵菌素、次黄嘌呤、紫云英苷作为标志物。本发明明确了僵蚕断面丝腺环与质量的相关性，提供了一种与僵蚕药材断面丝腺环相关的质量评价方法，从多指标综合评价僵蚕药材质量，操作性强，体现僵蚕药材“辨状论质”的科学性。

Description

僵蚕断面丝腺环相关的特异性标志物、筛选方法及僵蚕的质 量检测方法

技术领域

本发明涉及僵蚕断面丝腺环相关的特异性标志物、筛选方法及僵蚕的质量检测方法，属于中药材质量检测领域。

背景技术

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx moriLinnaeus 4～5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结等功效。作为典型的常用动物药之一，其疗效确切，应用广泛。

丝腺为家蚕高度特化的专一合成和分泌丝蛋白的器官，反映家蚕的生长状况和健康度，在形成僵蚕药材后丝腺环可作为重要的断面性状评价指标。自古对僵蚕的丝腺环要求就有记载，《得配本草》认为“折断腹内黑而光亮者真”，《本草纂要》强调正品僵蚕“其体重实，身直而大，内如沥青，外似蝶粉，黑白可爱”。《本草蒙筌》指出僵蚕应选择“头番僵蚕，腹内黑而光亮者。”由此，可见优质僵蚕外观性状具有“色白、条直、断面黑亮”的特点。

目前报道僵蚕质量标准的文献，多以检测其中的某种指标性成分，或是伪品的鉴别，如申请号 202011537889.9，发明名称：一种僵蚕伪品的定性定量标志物及其检测，公开了一种僵蚕伪品的定性定量标志物及其检测方法，所述的标志物为硼砂或硼酸。通过乙基己二醇-正丁醇溶液对僵蚕伪品中的硼砂进行快速的富集、微波萃取，硼砂在酸性条件下转化成硼酸，硼酸可以与被硫酸质子化的姜黄素发生显色反应，通过比色法可以定性定量的测定僵蚕伪品中硼砂的含量。

除1985年版《中国药典》未收载僵蚕外，其余历版均要求其断面“有4个亮棕色或亮黑色丝腺环”。2020年版《中国药典》僵蚕项下仅对药材检查项、浸出物以及真菌毒素进行了限量规定，尚缺乏与药材性状以及质量相关的质量控制指标。从药材形成的过程来看，断面丝腺环特征与药材质量有着密切的关系，但不同断面丝腺环特征的药材质量差异情况尚不明确。

发明内容

本发明的技术方案是提供了僵蚕断面丝腺环相关的特异性标志物，本发明另一技术方案是提供了该标志物的筛选方法，以及僵蚕的质量控制方法。

本发明提供了僵蚕断面丝腺环相关的特异性标志物，4个丝腺环样品白僵菌素含量在0.092～0.369 mg/g 、次黄嘌呤含量在21.19～328.02 μg/g、紫云英苷含量在5.44~37.35μg/g；

3个丝腺环样品白僵菌素含量为0.083～0.391 mg/g、次黄嘌呤含量在13.74～265.10 μg/g、紫云英苷含量在6.80～39.63 μg/g；

2个丝腺环样品白僵菌素含量为0.060～0.331 mg/g、次黄嘌呤含量在20.03～234.02 μg/g、紫云英苷含量在4.16～39.12 μg/g；

0个丝腺环样品白僵菌素含量为0.047～0.268 mg/g、次黄嘌呤含量在9.02～176.41μg/g、紫云英苷含量在3.22～33.28 μg/g；

白色丝腺环样品白僵菌素含量为0.036～0.267 mg/g、次黄嘌呤含量在5.13～142.28μg/g、紫云英苷含量在3.44～26.04 μg/g。

进一步优选地，4个丝腺环样品白僵菌素含量平均值为0.230 mg/g 、次黄嘌呤含量平均值为126.76 μg/g、紫云英苷含量平均值为24.15μg/g；

3个丝腺环样品白僵菌素含量平均值为0.212mg/g、次黄嘌呤含量平均值为121.82μg/g、紫云英苷含量平均值为21.65 μg/g；

2个丝腺环样品白僵菌素含量平均值为0.175mg/g、次黄嘌呤含量平均值为118.93μg/g、紫云英苷含量平均值为20.68 μg/g；

0个丝腺环样品白僵菌素含量平均值为0.133mg/g、次黄嘌呤含量平均值为96.66μg/g、紫云英苷含量平均值为16.05 μg/g；

白色丝腺环样品白僵菌素含量平均值为0.120mg/g、次黄嘌呤含量平均值为80.22μg/g、紫云英苷含量平均值为14.50 μg/g。

本发明还提供了僵蚕断面丝腺环相关的特异性标志物的筛选方法，它包括如下步骤：

1）僵蚕药材针对断面丝腺环进行分类，随机选取样品，于腹部第1至第2对足之间截断；观察断面有4/3/2个亮棕色或亮黑色丝腺环，分别为S4/S3/S2；断面无丝腺环或丝腺环空洞，为S0；断面有丝腺环，但丝腺环颜色为白色或伴有部分缺失，为B；

2）测定不同类型僵蚕药材的白僵菌素含量；

3）建立僵蚕药材核苷类成分的含量测定方法；

4）建立僵蚕药材黄酮类成分的含量测定方法；

5）分析僵蚕药材断面丝腺环与其成分含量的关系，寻找与断面相关的质量控制指标。

其中，所述的核苷类成分的含量测定方法是以尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、腺嘌呤作为对照品，采用高效液相色谱法检测，色谱条件为：采用色谱柱月旭AQ-C₁₈柱（4.6mm×250 mm，5μm）；检测波长为260 nm；柱温为25℃；进样量为20μL；流速为0.8 mL/min；以水为流动相A，以甲醇为流动相B；进行梯度洗脱（0～4min，99%A；4～6min，99%~98%A；6～6.1min，98%～93.5%A；6.1～14min，93.5%～86%A；14～14.1min，86%～85.5%A；14.1～18min，85.5%A，18～18.1min，85.5%～80%A，18.1～24min，80%A；24～28min，80%～99%A；28～30min，99%A）。

其中，所述的黄酮类成分的含量测定方法是以芦丁、紫云英苷、槲皮素、山奈酚作为对照品，色谱条件为：采用色谱柱Waters- C₁₈柱（4.6 mm×50 mm，1.7 μm）；检测波长为365 nm；柱温为30℃；进样量为3μL；流速为0.3 mL/min；以0.1%磷酸水为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱（0～2min，85%～80%A；2～3.5min，80%～50%A；3.5～4min，50%～45%A；4～5min，45%A；5～6min，45%～10%A；6～7min，10%A；7～7.5min；10%～85%A；7.5～10min，85%A）。

本发明还提供了一种僵蚕的质量检测方法，它是以所述的白僵菌素、次黄嘌呤、紫云英苷作为标志物，通过三种标志物的含量，确定僵蚕断面丝腺环的情况以及僵蚕的品质。

本发明质量检测方法包括如下步骤：

1）称取待检测僵蚕药材；

2）采用液相色谱法检测僵蚕药材的白僵菌素含量；

3）采用液相色谱法检测僵蚕药材中核苷类成分的含量；

4）采用液相色谱法检测僵蚕药材中黄酮类成分的含量；

5）分析检测结果。

其中，步骤3）所述的检测方法为：

所述的核苷类成分的含量测定方法是以次黄嘌呤作为对照品，采用高效液相色谱法检测，色谱条件为：采用色谱柱月旭AQ-C₁₈柱（4.6mm×250 mm，5μm）；检测波长为260 nm；柱温为25℃；进样量为20μL；流速为0.8 mL/min；以水为流动相A，以甲醇为流动相B；进行梯度洗脱（0～4min，99%A；4～6min，99%~98%A；6～6.1min，98%～93.5%A；6.1～14min，93.5%～86%A；14～14.1min，86%～85.5%A；14.1～18min，85.5%A，18～18.1min，85.5%～80%A，18.1～24min，80%A；24～28min，80%～99%A；28～30min，99%A）。

其中，步骤4）所述的检测方法为：

所述的黄酮类成分的含量测定方法是以紫云英苷作为对照品，色谱条件为：采用色谱柱Waters- C18柱（4.6 mm×50 mm，1.7 μm）；检测波长为365 nm；柱温为30℃；进样量为3μL；流速为0.3 mL/min；以0.1%磷酸水为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱（0～2min，85%～80%A；2～3.5min，80%～50%A；3.5～4min，50%～45%A；4～5min，45%A；5～6min，45%～10%A；6～7min，10%A；7～7.5min；10%～85%A；7.5～10min，85%A）。

其中，所述的分析结果的方法是通过检测白僵菌素、次黄嘌呤、紫云英苷三种标志物的含量，确定僵蚕的品质。

本发明提供了一种僵蚕药材核苷类和黄酮类成分的含量测定方法，明确了僵蚕断面丝腺环与质量的相关性，提供了一种与僵蚕药材断面丝腺环相关的质量评价方法，从多指标综合评价僵蚕药材质量，操作性强，体现僵蚕药材“辨状论质”的科学性。

附图说明

图1僵蚕核苷类成分HPLC色谱图(A:对照品；B:样品；C:空白溶液）（1尿嘧啶；2次黄嘌呤；3尿苷；4鸟苷；5腺嘌呤）。

图2僵蚕黄酮类成分HPLC色谱图（A:对照品；B: 样品；C:空白溶液）（1芦丁；2紫云英苷；3槲皮素；4山奈酚）。

具体实施方式

实施例1 本发明僵蚕断面丝腺环相关的特异性标志物的筛选方法

1.材料与仪器

1.1 实验材料

35批僵蚕药材于2020年5月～2022年1月购自不同产地和市场，样品信息见表1，经成都中医药大学中药鉴定教研室李敏教授鉴定为僵蚕Bombyx Batryticatus。

表1样品信息表

1.2 仪器及试剂

Ulti Mate 3000 型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；BP-121s精密电子天平（万分之一，浙江精密仪器有限公司）；BS-200S-WEI精密电子天平（千分之一，北京赛多利斯仪器***有限公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DZKW-4型电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）；智能型电热鼓风干燥箱（上海琅玕实验设备有限公司）；马弗炉（Lindberg/Blue M）；

对照品：白僵菌素（批号：419469，北京百灵威科技有限公司，纯度：99%）；尿嘧啶、次黄嘌呤、鸟苷、尿苷、腺嘌呤（批号分别为：wkq21101205、wkq21042902、wkq21042810、wkq21081905、wkq21060210，四川维克奇生物科技有限公司，纯度均≥98%）；芦丁（批号：MUST-19010202，纯度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司）；槲皮素、山奈酚，紫云英苷（批号分别为wkq20061112，wkq21041507，MUST-20070414，纯度均≥98%，四川维克奇生物科技有限公司）；

氯化钠（GR），乙腈、磷酸、甲醇均为色谱纯；水为超纯水。

2实验方法

2.1 性状分类

随机选取样品200g～500g，根据断面丝腺环情况分为S4、S3、S2、S0、B不同丝腺环类型的僵蚕药材。

注：于腹部第1至第2对足之间截断，观察断面有4/3/2个亮棕色或亮黑色丝腺环，分别为S4/S3/S2；断面无丝腺环或丝腺环空洞，为S0；断面有丝腺环，但丝腺环颜色为白色或伴有部分缺失，为B。

2.2 白僵菌素含量测定

白僵菌素含量参照文献方法（陈辉, 何金晓, 刘佳灵, 等. 一种安全快速测定僵蚕中白僵菌素含量的高效液相方法研究[J]. 时珍国医国药,2018,29(4): 823-825.）进行测定。

2.3 核苷类成分含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱：月旭AQ-C18柱（4.6mm×250 mm，5μm）；以水（A）-甲醇（B）进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表2；检测波长为260 nm；柱温为25℃；流速为0.8mL/min。

表2 梯度洗脱程序

2.3.2 混合对照品溶液制备

精密称定尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、腺嘌呤各对照品置于20mL 容量瓶，用0.9%氯化钠溶液溶解并定容，即为各核苷类成分的对照品母液。再取各核苷类母液适量，置于10 mL容量瓶中，以0.9%氯化钠溶液稀释并定容，即混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液制备

取本品粉末1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.9%氯化钠溶液20mL，密塞，称重，超声提取30 min，放冷，补足重量，摇匀，8000r/min离心5min，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 ***适用性试验

取混合对照品溶液、供试品溶液，分别按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，各待测成分与各自相邻峰间的分离度均大于1.5，理论板数按尿嘧啶峰计不低于4000，色谱峰对称因子在0.95～1.05之间。色谱图见图1。

2.3.4.2 线性关系考察

分别精密吸取“2.3.2”项下混合对照品溶液1000、600、300、200、50 μL至1mL量瓶中，加0.9%氯化钠溶液至刻度线，摇匀。按“2.3.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（y）、各对照品质量浓度为横坐标（x，μg/mL）绘制标准曲线并进行线性回归分析，结果见表3。

表3五种成分线性关系

2.3.4.3 精密度考察

取“2.3.2”项下混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录各色谱峰的峰面积。结果，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、腺嘌呤峰面积的RSD值分别为0.13%、1.77%、0.51%、0.72%、0.29%（n=6），各成分峰面积RSD 值均符合标准，表明仪器精密度良好。

2.3.4.4 重复性考察

取同一份僵蚕样品，按“2.3.3”项下制备6份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件进行检测，记录各色谱峰的峰面积。结果，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、腺嘌呤峰面积RSD值分别为2.50%、2.50%、2.67%、2.34%、2.49%（n=6），各成分峰面积RSD 值均符合标准，表明该方法重现性好。

2.3.4.5 稳定性考察

取僵蚕样品粉末，按“2.3.3”项下制备供试品溶液，室温放置并分别于0、2、4、6、8、12 h进样，按“2.3.1”项下色谱条件进行检测，记录各色谱峰的峰面积。结果，尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、腺嘌呤峰面积RSD值分别为1.17%、1.93%、2.36%、1.89%、2.94%，各成分峰面积RSD 值均符合标准，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.4.6 加样回收试验

取僵蚕样品粉末0.5 g，共6份，分别精密加入一定量的各对照品溶液，按“2.3.3”项下制备供试品溶液，照“2.3.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表4。结果表明，各个成分的加样回收率均在95%～110%以内，RSD值均符合标准，说明该方法准确度良好。

表4加样回收实验结果

2.4 黄酮类成分含量测定

2.4.1 色谱条件

色谱柱：Waters- C₁₈柱（4.6 mm×50 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表5；检测波长为365 nm；柱温为30 ℃；流速为0.3 mL/min。进样量3μL。

表5 梯度洗脱程序

2.4.2 混合对照品溶液的制备

精密称取芦丁、紫云英苷、槲皮素、山奈酚各对照品适量于20 mL 容量瓶，用80%甲醇溶液溶解并定容，即为各黄酮类成分的对照品母液。再取各黄酮类母液适量，置于10 mL容量瓶中，以水稀释并定容至刻度线，即混合对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备

取僵蚕粉末2.0g，精密称定，加80%甲醇20mL超声提取30min，过滤，精密吸取10mL，减压浓缩至干，加2mL80%甲醇复溶，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 ***适用性试验

取混合对照品溶液、供试品溶液分别按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，各待测成分与各自相邻峰间的分离度均大于1.5，理论板数按槲皮素峰计不低于6000，色谱峰对称因子在0.95～1.05之间，色谱图见图2。

2.4.4.2 线性关系考察

分别精密吸取“2.4.2”项下混合对照品溶液1000、500、200、100、50 μL至1mL量瓶中，加80%甲醇溶液至刻度线，摇匀。按“2.4.1”项下色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（y）、各对照品质量浓度为横坐标（x，μg/mL）绘制标准曲线并进行线性回归分析，结果见表6。

表6四种黄酮类成分线性关系

2.4.4.3 精密度考察

取“2.4.2”项下对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，芦丁、紫云英苷、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD值分别为0.40%、0.62%、0.71%、2.09%，各成分峰面积RSD 值均符合标准，表明仪器精密度良好。

2.4.4.4 重复性考察

取同一份僵蚕样品，按“2.4.3”项下制备6份供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行检测，计算各成分含量。结果，芦丁、紫云英苷、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD值分别为2.82%、2.16%、1.24%、2.50%，各成分峰面积RSD 值均符合标准，表明该方法重现性好。

2.4.4.5 稳定性考察

取僵蚕样品粉末，按“2.4.3”项下制备供试品溶液，室温放置并分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，按“2.4.1”项下色谱条件进行检测，记录各色谱峰的峰面积。结果，芦丁、紫云英苷、槲皮素、山奈酚峰面积的RSD值分别为0.92%、1.64%、0.84%、2.58%，各成分峰面积RSD值均符合标准，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4.6 加样回收率考察

取僵蚕样品粉末1.0 g，共 6 份，分别精密加入一定量的各对照品溶液，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，照“2.4.1”项下色谱条件测定，计算回收率。结果表明，各个成分的加样回收率均在95%～110%以内，RSD值均符合标准，说明该方法准确度良好。结果见表7。

表7加样回收实验结果

3结果与分析

3.1丝腺环性状与药材白僵菌素含量的关系

不同丝腺环样品表僵菌素含量结果见表8。4个丝腺环样品白僵菌素含量在0.092～0.369 mg/g之间，平均值为0.230 mg/g；3个丝腺环样品白僵菌素含量为0.083～0.391mg/g，平均值为0.212mg/g；2个丝腺环样品白僵菌素含量为0.060～0.331 mg/g，平均值为0.175 mg/g；0个丝腺环样品白僵菌素含量为0.047～0.268 mg/g，平均值为0.133mg/g；白色丝腺环样品白僵菌素含量为0.036～0.267 mg/g，平均值为0.120 mg/g。各批次样品白僵菌素含量结果多为S4、S3、S2>S0>B。显著性分析结果表明，每一批样品白色丝腺环样品白僵菌素含量均显著低于S4。

表8 35批样品丝腺环白僵菌素含量测定结果（

±s，n=3， mg·g-1）/>

注：“-”表示该批次样品对应丝腺环占比低，无检测数据；

同一行不同小写字母表示有显著性差异,下同。

3.2丝腺环性状与药材核苷类成分的关系

3.2.1 丝腺环性状与药材次黄嘌呤的关系

不同丝腺环样品次黄嘌呤测定结果见表9。4个丝腺环样品次黄嘌呤含量在21.19～328.02 μg/g之间，平均值为126.76 μg/g；3个丝腺环样品次黄嘌呤含量在13.74～265.10 μg/g之间，平均值为121.82 μg/g；2个丝腺环样品次黄嘌呤含量在20.03～234.02μg/g之间，平均值为118.93 μg/g；0个丝腺环样品次黄嘌呤含量在9.02～176.41μg/g之间，平均值为96.66 μg/g；白色丝腺环样品次黄嘌呤含量在5.13～142.28μg/g之间，平均值为80.22 μg/g。各批次样品次黄嘌呤含量结果多为S4、S3、S2>S0>B。显著性分析结果表明，每一批样品0个丝腺环和白色丝腺环次黄嘌呤含量均显著低于S4、S3、S2。

表9 35批样品丝腺环次黄嘌呤含量测定结果（

±s，n=3，μg·g-1）

3.2.2 丝腺环性状与药材鸟苷含量的关系

不同丝腺环样品鸟苷测定结果见表10。4个丝腺环样品鸟苷含量在85.34～824.36μg/g之间，平均值为488.20μg/g；3个丝腺环样品鸟苷含量在84.8～820.27 μg/g之间，平均值为479.04 μg/g；2个丝腺环样品鸟苷含量在80.57～1006.48 μg/g之间，平均值为490.22μg/g；0个丝腺环样品鸟苷含量在95.47～1177.2 μg/g之间，平均值为498.62μg/g；白色丝腺环样品鸟苷含量在86.95～891.22 μg/g之间，平均值为508.48 μg/g。不同丝腺环类别样品鸟苷含量大小无显著规律。

表10 不同丝腺环性状的药材鸟苷含量测定结果（

±s，n=3，μg·g-1）

/>

3.2.3 丝腺环性状与药材尿嘧啶含量的关系

不同丝腺环样品尿嘧啶测定结果见表11。4个丝腺环样品尿嘧啶含量在110.40～674.36μg/g之间，平均值为301.61μg/g；3个丝腺环样品尿嘧啶含量在85.45～666.64μg/g之间，平均值为340.40μg/g；2个丝腺环样品尿嘧啶含量在90.58～610.39μg/g之间，平均值为349.79 μg/g，0个丝腺环样品尿嘧啶含量在121.78～639.52 μg/g之间，平均值为408.08μg/g；白色丝腺环样品尿嘧啶含量在161.65～607.19 μg/g之间，平均值为419.62μg/g。白色丝腺环样品尿嘧啶普遍较高，不同丝腺环类别样品尿嘧啶含量大小无显著规律。

表11不同丝腺环性状的药材尿嘧啶含量测定结果（

±s，n=3， μg·g-1）

3.2.4丝腺环性状与药材腺嘌呤含量的关系

不同丝腺环样品腺嘌呤测定结果见表12。4个丝腺环样品腺嘌呤含量在130.06～570.13 μg/g之间，平均值为325.98μg/g；3个丝腺环样品腺嘌呤含量在93.07～618 μg/g之间，平均值为345.86 μg/g；2个丝腺环样品腺嘌呤含量在112.2～666.22 μg/g之间，平均值为361.51μg/g；0个丝腺环样品腺嘌呤含量在148.27～625.87 μg/g之间，平均值为315.44μg/g；白色丝腺环样品腺嘌呤含量在116.79～674.25 μg/g之间，平均值为318.97 μg/g。不同丝腺环类别样品腺嘌呤含量大小无明显规律。

表12不同丝腺环性状的药材腺嘌呤含量测定结果（

±s，n=3， μg·g-1）

3.2.5丝腺环性状与药材尿苷含量的关系

不同丝腺环样品尿苷测定结果见表13。4个丝腺环样品尿苷含量在77.64～769.64μg/g之间，平均值为275.84μg/g；3个丝腺环样品尿苷含量在45.15～924.39 μg/g之间，平均值为295.96μg/g；2个丝腺环样品尿苷含量在92.77～746.77 μg/g之间，平均值为285.09μg/g；0个丝腺环样品尿苷含量在26.20～577.56 μg/g之间，平均值为196.00μg/g；白色丝腺环样品尿苷含量在39.30～944.31 μg/g之间，平均值为220.71 μg/g。不同丝腺环类别样品尿苷含量大小无明显规律。

表13不同丝腺环性状的药材尿苷含量测定结果（

±s，n=3， μg·g-1）/>

3.3丝腺环性状与药材黄酮类成分含量的关系

3.3.1 丝腺环性状与药材紫云英苷含量的关系

不同丝腺环样品紫云英苷测定结果见表14。4个丝腺环样品紫云英苷含量在5.44~37.35μg/g之间，平均值为24.15μg/g；3个丝腺环样品紫云英苷含量在6.80～39.63 μg/g之间，平均值为21.65 μg/g；2个丝腺环样品紫云英苷含量在4.16～39.12 μg/g之间，平均值为20.68 μg/g；0个丝腺环样品紫云英苷含量在3.22～33.28 μg/g之间，平均值为16.05 μg/g；白色丝腺环样品紫云英苷含量在3.44～26.04 μg/g之间，平均值为14.50 μg/g。各批次样品紫云英苷含量结果多为S4、S3>S2>S0>B。显著性分析结果表明，每一批样品0个丝腺环、白色丝腺环样品紫云英苷含量均显著低于S4。

表14 35批样品丝腺环紫云英苷含量测定结果（

±s，n=3， μg·g-1）

3.3.2 丝腺环性状与药材槲皮素含量的关系

不同丝腺环样品槲皮素测定结果见表15。4个丝腺环样品槲皮素含量在5.25～49.06 μg/g之间，平均值为21.78 μg/g；3个丝腺环样品槲皮素含量在5.81～63.61 μg/g之间，平均值为23.20 μg/g；2个丝腺环样品槲皮素含量在2.90～48.57 μg/g之间，平均值为24.36 μg/g；0个丝腺环样品槲皮素含量在7.15~71.22μg/g之间，平均值为28.59μg/g；白色丝腺环样品槲皮素含量在4.03～60.45μg/g之间，平均值为23.74μg/g。各批次样品槲皮素含量无明显规律。

表15 35批样品丝腺环槲皮素含量测定结果（

±s，n=3， μg·g-1）

3.3.3 丝腺环性状与药材山奈酚含量的关系

不同丝腺环样品山奈酚测定结果见表16。4个丝腺环样品山奈酚含量在1.76～35.00 μg/g之间，平均值为7.84 μg/g；3个丝腺环样品山奈酚含量在2.22～37.62 μg/g之间，平均值为7.89 μg/g；2个丝腺环样品山奈酚含量在2.12～27.82 μg/g之间，平均值为8.49 μg/g；0个丝腺环样品山奈酚含量在1.35～43.97 μg/g之间，平均值为11.97 μg/g；白色丝腺环样品山奈酚含量在1.84～29.51 μg/g之间，平均值为9.31 μg/g。各批次样品山奈酚含量无明显规律。

表16 35批样品丝腺环山奈酚含量测定结果（

±s，n=3，μg·g-1）

3.3.4 丝腺环性状与药材芦丁含量的关系

不同丝腺环样品芦丁测定结果见表17。4个丝腺环样品芦丁含量在4.52～84.09 μg/g之间，平均值为30.09 μg/g；3个丝腺环样品芦丁含量在7.30～77.32 μg/g之间，平均值为32.40 μg/g；2个丝腺环样品芦丁含量在3.42～79.80 μg/g之间，平均值为32.46 μg/g；0个丝腺环样品芦丁含量在4.66～76.01 μg/g之间，平均值为31.50 μg/g；白色丝腺环样品芦丁含量在3.87～61.79 μg/g之间，平均值为25.91 μg/g。各批次样品芦丁含量无明显规律。

表17 35批样品丝腺环芦丁含量测定结果（

±s，n=3，μg·g-1）

3.4 丝腺环性状与药材质量指标的相关性分析

相关性分析结果见表18，丝腺环个数与药材白僵菌素、紫云英苷、次黄嘌呤含量呈显著正相关，与尿嘧啶、山奈酚含量呈显著负相关。考虑到僵蚕为“菌-虫-叶”的复合体，各大类成分中选择正相关性较强的3个成分作为僵蚕药材的质控指标，分别为白僵菌素、次黄嘌呤、紫云英苷。

表18 丝腺环个数与药材各质量指标相关性分析结果

注：**表示相关性在0.01 水平上显著（双尾）。*表示相关性在0.05水平上显著（双尾）。

4 验证实验

4.1 材料与仪器

4.1.1 实验材料

5批不同蚕种的僵蚕样品信息见表19

表19 样品信息表

4.1.2 仪器与试剂

同1.2。

4.2 不同类型丝腺环相关成分含量测定

由表20可知，不同类型丝腺环相关成分含量趋势整体和前文一致，其中YZ1、YZ4的白僵菌素、次黄嘌呤、紫云英苷含量相对较高，可推测两个样品的丝腺环较好。由表21可知，YZ1、YZ4的4个丝腺环比例较高，0个丝腺环和白色丝腺环的比例低，与相关成分含量具有一致性。

表20 不同丝腺环类型僵蚕相关成分含量测定（

±s，n=3）/>

注：同一列小写字母表示P<0.05差异显著。

表 21 样品丝腺环比例统计结果

4小结

僵蚕具有息风止痉、化痰散结、祛风止痛的功效。其有效成分白僵菌素具有镇静、抗惊厥的药理作用，可作为僵蚕药效评价和质控指标之一；僵蚕同地龙具有化痰止咳的作用，且二者常组合应用，研究表明次黄嘌呤多作为地龙止咳平喘的药效成分之一，因此可推断次黄嘌呤也可作为僵蚕药效评价和质控指标之一；紫云英苷源于僵蚕食用桑叶后的代谢成分之一，具有抗炎、镇痛等药理作用，也可作为僵蚕药效评价和质控指标之一。

综上，本研究明确了僵蚕断面丝腺环与药材质量具有较强的相关性，较为充分地考虑到僵蚕本身为“菌-虫-叶”的复合体，选取白僵菌素、次黄嘌呤、紫云英苷作为僵蚕药材的质量控制指标，为多指标综合评价僵蚕药材质量提供了思路，为完善僵蚕药材质量控制体系提供了科学依据。

Claims (1)

1.一种僵蚕的质量检测方法，其特征在于：它包括如下步骤：

1）称取待检测僵蚕药材；

2）采用液相色谱法检测僵蚕药材的白僵菌素含量；

3）采用液相色谱法检测僵蚕药材中核苷类成分的含量；

4）采用液相色谱法检测僵蚕药材中黄酮类成分的含量；

5）分析检测结果；

步骤3）所述的检测方法为：

所述的核苷类成分的含量测定方法是以尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷、腺嘌呤作为对照品，采用高效液相色谱法检测，色谱条件为：采用色谱柱月旭AQ-C₁₈柱 4.6mm×250 mm，5μm ；检测波长为260 nm；柱温为25℃；进样量为20μL；流速为0.8 mL/min；以水为流动相A，以甲醇为流动相B；进行梯度洗脱 0～4min，99%A；4～6min，99%~98%A；6～6.1min，98%～93.5%A；6.1～14min，93.5%～86%A；14～14.1min，86%～85.5%A；14.1～18min，85.5%A，18～18.1min，85.5%～80%A，18.1～24min，80%A；24～28min，80%～99%A；28～30min，99%A ；供试品溶液的制备方法为：取本品粉末1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入0.9%氯化钠溶液20mL，密塞，称重，超声提取30 min，放冷，补足重量，摇匀，8000r/min离心5min，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

步骤4）所述的检测方法为：

所述的黄酮类成分的含量测定方法是以芦丁、紫云英苷、槲皮素、山奈酚作为对照品，色谱条件为：采用色谱柱Waters- C₁₈柱 4.6 mm×50 mm，1.7 μm ；检测波长为365 nm；柱温为30℃；进样量为3μL；流速为0.3 mL/min；以0.1%磷酸水为流动相A，以乙腈为流动相B；进行梯度洗脱 0～2min，85%～80%A；2～3.5min，80%～50%A；3.5～4min，50%～45%A；4～5min，45%A；5～6min，45%～10%A；6～7min，10%A；7～7.5min；10%～85%A；7.5～10min，85%A ；供试品溶液的制备方法为：

取僵蚕粉末2.0g，精密称定，加80%甲醇20mL超声提取30min，过滤，精密吸取10mL，减压浓缩至干，加2mL80%甲醇复溶，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

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