CN116064370A - 利用基因编辑UC-MSC改善胰岛β细胞功能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促进或改善胰岛β细胞分泌胰岛素的方法,尤其利用基因编辑UC‑MSC改善胰岛β细胞功能的方法,具体为将胰岛β细胞与利用基因编辑获得的UC‑MSC共培养,以提高胰岛β细胞分泌胰岛素的量,以及延长胰岛β细胞的生存时间,为糖尿病的治疗提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和细胞生物学交叉领域,具体涉及利用基因编辑UC-MSC改善β细胞功能的方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是一种起源于中胚层的多能干细胞,存在于脂肪、骨髓、脐带血和脐带等组织中。脐带血和脐带作为医疗废弃物相比于脂肪等组织,在伦理、成本和提取便捷性上作为MSC的来源途径有着巨大的优势。Shetty等研究表明,脐带中MSC含量远高于脐带血,而且相比于脐带MSC(Umbilical cord MSC,UC-MSC)提取100%的成功率,脐带血MSC的成功率仅为6%。此外,在分化潜能上,UC-MSC不仅具有其它组织来源MSC的分化能力,还保留了一些原始干细胞(胚胎干细胞)的特性,具有更高的分化潜能。
CRISPRa技术的成熟,使得研究者可以直接激活并上调细胞内源基因表达水平,这为增强MSC的营养供应和免疫调节能力提供了新的方法。2019年,Meng等利用CRISPRa技术上调骨髓MSC中IL10的表达水平,以用于治疗糖尿病小鼠的心肌梗塞,结果显示,经过基因上调表达的MSC的治疗效果明显更好。
因此,本发明提供了一种采用CRISPRa技术上调NGF基因的MSC,并将其用于营养供应与胰岛β细胞共培养,提高了胰岛素的表达量。
发明内容
本发明的第一方面,提供了一种促进胰岛β细胞分泌胰岛素的方法,所述的方法包括将胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养。
优选的,所述的方法包括采用sgRNA靶向NGF基因的转录起始位点,启动转录,以激活NGF基因表达。
优选的,所述的sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO:5、8或11中的任一种或两种以上的组合。
编码sgRNA的双链DNA序列选自下列任一组或两种以上的组合:
A)SEQ ID NO:6、7;
B)SEQ ID NO:9、10;
C)SEQ ID NO:12、13。
优选的,所述的方法包括向间充质干细胞中导入载体组合物,以激活NGF基因表达,获得NGF基因过表达的间充质干细胞。
优选的,所述的载体组合物包括:
A)表达一个或多个sgRNA和MS2结合位点的载体,或一个或多个表达sgRNA和MS2结合位点的载体;其中,所述的sgRNA可以相同或不同,其靶位点选自SEQ ID NO:5、8或11。
B)表达融合蛋白MS2-P65-HSF1的载体;以及,
C)表达dCas9蛋白的载体。
优选的,所述的载体组合物还包含包装病毒所需的其他载体。
优选的,所述的载体为细菌载体、真菌载体或病毒载体。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的载体为噬菌体载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA病毒载体、牛***瘤病毒载体、EB病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体等等现有技术中任何可以将遗传物质传送至细胞中的载体。
在本发明的一个具体实施方式中,将载体组合物导入间充质干细胞后,表达sgRNA和MS2结合位点的载体会转录为sgRNA以及可以与MS2蛋白特异性结合的具有茎环结构的RNA,与另两个载体(表达融合蛋白MS2-P65-HSF1的载体、表达dCas9蛋白的载体)形成“基因组DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2-P65-HSF1”结构的复合体。进而启动转录,并激活NGF基因表达。
优选的,所述的间充质干细胞来源于人或非人动物。
优选的,所述的间充质干细胞来源于脐带、骨髓、脐血或脂肪。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的间充质干细胞来源于人或非人动物的脐带。
优选的,所述的间充质干细胞可以为从人或非人动物的脐带、骨髓、脐血或脂肪中筛选提取获得,或者购买成品。
优选的,所述的非人动物为非人哺乳动物,包括但不限于野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的,所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。
优选的,所述的方法还包括培养导入载体组合物的间充质干细胞的步骤。
优选的,所述的培养间充质干细胞采用包含胎牛血清的培养基,进一步优选包含胎牛血清的DMEM培养基,其中,优选包含1%-20%,进一步优选2%-10%,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)的胎牛血清。
优选的,所述的培养基中还包含标记(例如潮霉素)及抗生素(例如嘌呤霉素)。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的NGF基因过表达的间充质干细胞的获得方法包括采用上述载体组合物感染间充质干细胞,感染12-48h(优选24-32h,例如12、15、18、20、24、28、32、35、40、45、48),更换含有标记和/或抗生素的培养基培养。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的NGF基因过表达的间充质干细胞的获得方法包括将间充质干细胞接种至DMEM培养基(添加10%胎牛血清),待细胞密度生长到50%-90%(优选60%-80%,例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%)时,将上述载体组合物转染至细胞中12-48h(优选24-32h,例如12、15、18、20、24、28、32、35、40、45、48),更换含抗生素的DMEM培养基(10%胎牛血清、400μg/mL潮霉素(Hygromycin)和5μg/mL嘌呤霉素(Puromycin))培养2-5天(优选3天)。
优选的,胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞以1:(3-7)的比例共培养,例如比例可以为1:(3、4、5、6或7)。
在本发明的一个具体实施方式中,胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞以1:5的比例共培养。
其中,所述的共培养可以在DMEM培养基中培养,可以为高糖(5.5mM以上葡萄糖,优选10-40mM,进一步优选20-30mM,例如10、15、20、25、30、35、40mM葡萄糖)、低糖(5.5mM以下葡萄糖,优选1-5.5,例如1、2、3、4、5、5.5mM葡萄糖)等。进一步优选的,所述的培养基为包含胎牛血清的DMEM培养基,其中,优选包含胎牛血清1%-20%,进一步优选2%-10%,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)的胎牛血清。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的共培养在高糖条件下,2%胎牛血清的DMEM培养基中培养。
本发明的第二方面,提供了一种构建NGF基因过表达的间充质干细胞的sgRNA,所述的sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO:5、8或11中的任一种或两种以上的组合。
编码sgRNA的双链DNA序列选自下列任一组或两种以上的组合:
A)SEQ ID NO:6、7;
B)SEQ ID NO:9、10;
C)SEQ ID NO:12、13。
本发明的第三方面,提供了一种包含上述的sgRNA的载体或载体组合。
本发明的第四方面,提供了一种载体组合物,所述的载体组合物包括:
A)表达一个或多个sgRNA和MS2结合位点的载体,或一个或多个表达sgRNA和MS2结合位点的载体;其中,所述的sgRNA可以相同或不同,其靶位点选自SEQ ID NO:5、8或11。优选为第三方面所述的载体或载体组合。
B)表达融合蛋白MS2-P65-HSF1的载体;以及,
C)表达dCas9蛋白的载体。
优选的,所述的载体组合物还包含包装病毒所需的其他载体。
优选的,所述的载体为细菌载体、真菌载体或病毒载体。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的载体为噬菌体载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA病毒载体、牛***瘤病毒载体、EB病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体等等现有技术中任何可以将遗传物质传送至细胞中的载体。
在本发明的一个具体实施方式中,将载体组合物导入间充质干细胞后,表达sgRNA和MS2结合位点的载体会转录为sgRNA以及可以与MS2蛋白特异性结合的具有茎环结构的RNA,与另两个载体(表达融合蛋白MS2-P65-HSF1的载体、表达dCas9蛋白的载体)形成“基因组DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2-P65-HSF1”结构的复合体。进而启动转录,并激活NGF基因表达。
本发明的第五方面,提供了一种包含上述sgRNA、载体或载体组合、或上述的载体组合物的细胞。
优选的,所述的细胞为微生物细胞(例如细菌、真菌、病毒),也可以为植物细胞、动物细胞或人细胞。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的细胞包括但不限于大肠杆菌、间充质干细胞、HEK293。
本发明的第六方面,提供了一种上述sgRNA、载体或载体组合、或上述的载体组合物或上述的细胞的应用,所述的应用包括:
A)在制备NGF基因过表达的间充质干细胞中的应用;
B)在促进胰岛β细胞分泌胰岛素中的应用;
C)在抑制胰岛β细胞凋亡中的应用;
D)延长胰岛β细胞存活时间或提高胰岛β细胞存活率中的应用;
E)在治疗糖尿病中的应用;
F)在制备治疗糖尿病的药物中的应用;或,
G)在降低血糖中的应用。
本发明的第七方面,提供了一种NGF基因过表达的间充质干细胞的制备方法。
优选的,所述的制备方法包括采用sgRNA靶向NGF基因的转录起始位点,启动转录,以激活NGF基因表达。
优选的,所述的sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO:5、8或11中的任一种或两种以上的组合。
编码sgRNA的双链DNA序列选自下列任一组或两种以上的组合:
A)SEQ ID NO:6、7;
B)SEQ ID NO:9、10;
C)SEQ ID NO:12、13。
优选的,所述的方法包括向间充质干细胞中导入载体组合物,以激活NGF基因表达,获得NGF基因过表达的间充质干细胞。
优选的,所述的载体组合物包括:
A)表达一个或多个sgRNA和MS2结合位点的载体,或一个或多个表达sgRNA和MS2结合位点的载体;其中,所述的sgRNA可以相同或不同,其靶位点选自SEQ ID NO:5、8或11。
B)表达融合蛋白MS2-P65-HSF1的载体;以及,
C)表达dCas9蛋白的载体。
优选的,所述的载体组合物还包含包装病毒所需的其他载体。
优选的,所述的载体为细菌载体、真菌载体或病毒载体。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的载体为噬菌体载体、杆状病毒载体、疱疹病毒载体、痘病毒载体、RNA病毒载体、牛***瘤病毒载体、EB病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体等等现有技术中任何可以将遗传物质传送至细胞中的载体。
在本发明的一个具体实施方式中,将载体组合物导入间充质干细胞后,表达sgRNA和MS2结合位点的载体会转录为sgRNA以及可以与MS2蛋白特异性结合的具有茎环结构的RNA,与另两个载体(表达融合蛋白MS2-P65-HSF1的载体、表达dCas9蛋白的载体)形成“基因组DNA-dCas9-sgRNA-MS2 binding site-MS2-P65-HSF1”结构的复合体。进而启动转录,并激活NGF基因表达。
优选的,所述的间充质干细胞来源于人或非人动物。
优选的,所述的间充质干细胞来源于脐带、骨髓、脐血或脂肪。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的间充质干细胞来源于人或非人动物的脐带。
优选的,所述的间充质干细胞可以为从人或非人动物的脐带、骨髓、脐血或脂肪中筛选提取获得,或者购买成品。
优选的,所述的非人动物为非人哺乳动物,包括但不限于野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的,所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。
优选的,所述的方法还包括培养导入载体组合物的间充质干细胞的步骤。
优选的,所述的培养间充质干细胞采用包含胎牛血清的培养基,进一步优选包含胎牛血清的DMEM培养基,其中,优选包含1%-20%,进一步优选2%-10%,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20)的胎牛血清。
优选的,所述的培养基中还包含标记(例如潮霉素)及抗生素(例如嘌呤霉素)。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的NGF基因过表达的间充质干细胞的获得方法包括采用上述载体组合物感染间充质干细胞,感染12-48h(优选24-32h,例如12、15、18、20、24、28、32、35、40、45、48),更换含有标记和/或抗生素的培养基培养。
在本发明的一个具体实施方式中,所述的制备方法包括将间充质干细胞接种至DMEM培养基(添加10%胎牛血清),待细胞密度生长到50%-90%(优选60%-80%,例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%)时,将上述载体组合物转染至细胞中12-48h(优选24-32h,例如12、15、18、20、24、28、32、35、40、45、48),更换含抗生素的DMEM培养基(10%胎牛血清、400μg/mL潮霉素(Hygromycin)和5μg/mL嘌呤霉素(Puromycin))培养2-5天(优选3天)。
本发明的第八方面,提供了采用上述的制备方法获得的间充质干细胞。
本发明的第九方面,提供了一种药物,所述的药物包括上述的sgRNA、上述的载体或载体组合、上述的载体组合物、上述的细胞或上述的制备方法获得的间充质干细胞或者上述胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养的混合体系,以及药学上可接受的辅料。
本发明的第十方面,提供了一种抑制胰岛β细胞凋亡的方法,所述的方法包括将胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养。
本发明的第十一方面,提供了一种延长胰岛β细胞存活时间或提高胰岛β细胞存活率的方法,所述的方法包括将胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养。
本发明的第十二方面,提供了一种糖尿病的治疗方法,所述的治疗方法包括向个体施加上述的载体组合物、sgRNA、细胞、上述的药物或上述胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养的混合体系。
本发明的第十三方面,提供了一种降低血糖的方法,所述的方法包括向个体施加上述的载体组合物、sgRNA、细胞、上述的药物或上述胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养的混合体系。
本发明通过基因编辑技术激活并上调NGF基因的表达水平,增强UC-MSC的营养效应和微环境调节能力,通过与胰岛β细胞共培养,从而达到改善胰岛β细胞功能的目的。
本发明所述的“NGF基因”代表Nerve growth factor,指神经生长因子。
“MS2基因”代表Multiple sclerosis,susceptibility to,2,多发性硬化症敏感2基因。
“P65基因”代表RELA proto-oncogene,NF-kB subunit,RELA原癌基因,NF-kB亚基基因。
“HSF1基因”代表heat shock transcription factor 1,热休克转录因子1基因。
本发明所述的“过表达”代表与原始细胞相比,经过本申请实施方法后相应基因的表达量提高。例如在本发明的一个具体实施方式中,“NGF基因过表达的间充质干细胞”代表基因编辑前的间充质干细胞与基因编辑后的间充质干细胞相比,NGF基因表达量提高。当然,本申请所述的“过表达”主要表示表达的含量或者说程度,并不必然限定其是采用基因编辑或何种编辑原理或手段进行的操作。
本发明所述的“HEK293”代表人胚胎肾细胞293。
本发明所述的“dCas9”,是将Cas9酶切位点突变后形成的,它只具有结合基因组和sgRNA的能力,而不具备切割DNA的能力的蛋白。
本发明所述的“多个”为2个以上,包括但不限于2-50个,优选为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20等。
本发明所述的“激活”可以为将原本不表达的基因,经过激活变为可以表达,或者原本表达量低的基因变得表达量高。
本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性,但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“药学上可接受的辅料”包括但不限于载体、赋形剂、稀释剂、润湿剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、抗氧化剂、缓冲剂、助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、矫味剂和防腐剂等中的一种或多种。
本发明所述的“药物”可以采用任何合适的给药途径,例如胃肠道给药(例如口服)或非胃肠道给药(例如,静脉内、肌内、皮下、皮内、器官内、鼻内、眼内、滴注、脑内、鞘内、透皮、直肠内等)途径。
本发明所述的“药物”可以为任何合适的剂型,例如经胃肠道给药剂型或非经胃肠道给药剂型,优选包括但不限于片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂、糖浆剂、液体、乳剂、微乳剂、混悬剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、粉雾剂、洗剂、软膏剂、硬膏剂、糊剂、贴剂、滴眼剂、滴鼻剂、舌下片剂、栓剂、气雾剂、泡腾片、滴丸剂、凝胶剂等等。
本发明所述药物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。
本发明所述的“个体”可以为人或非人哺乳动物,所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的,所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。
本发明所述的“和/或”包含该术语所连接的项目的所有组合,应视为各个组合已经单独地在本文列出。例如,“A和/或B”包含了“A”、“A和B”以及“B”。又例如,“A、B和/或C”包含了“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法,当用于描述蛋白质或核酸的序列时,所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成,或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸,但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施例,其中:
图1:改造后的慢病毒载体结构图,慢病毒载体分别为Lenti-dCas9-VP64-T2A-BlastR、Lenti-MS2-P65-HSF1-T2A-HygroR、Lenti-sgRNA2.0-PuroR。
图2:BsmBI酶切位点和Lenti-sgRNA2.0-PuroR经BsmBI单酶切后形成的粘性末端。
图3:NGF基因的3条sgRNA单独和共同转染HEK293细胞后,NGF基因的相对表达量。A.RT-PCR分析不同sgRNA激活效率。B.qPCR分析不同sgRNA对NGF基因的激活效率。
图4:未感染慢病毒Lenti-dCas9-SAM/sgRNA和感染后UC-MSC中NGF基因相对表达量。
图5A:UC-MSC和感染UC-MSC与胰岛β细胞共培养24h对insulin基因表达量的影响。
图5B:UC-MSC和感染UC-MSC与胰岛β细胞共培养24h对胰岛素分泌量的影响。
图6:UC-MSC和感染UC-MSC与胰岛β细胞共培养24h对胰岛β细胞中凋亡相关基因表达的影响。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的方法和应用进行说明,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
实施例中使用的慢病毒载体Lenti-dCas9-VP64_Blast(#61425)、Lenti-MS2-P65-HSF1_Hygro(#61426)和Lenti-sgRNA2.0(#61427)均来自ADDGENE。
实施例中使用的PGK-PuroR购自SBI(System Biosciences)公司,产品目录号:CD810A-1。
实施例1:Lenti-dCas9-SAM/sgRNA2.0载体构建
1、Lenti-dCas9-VP64_Blast和Lenti-MS2-P65-HSF1_Hygro载体将EF1a启动子换成CMV强启动子。
设计带有NheI和BsiWI内切酶位点的CMV启动子引物,引物序列为:
NheI-CMV-F:5’GCTAGCCCCGTTACATAACTTACGG3’(SEQ ID NO:1);
CMV-BsiWI-R:5’CGTACGGATCTGACGGTTCACTAAA3’(SEQ ID NO:2);
从公司现有携带CMV启动子的质粒中扩增得到NheI-CMV-BsiWI DNA片段,将该DNA片段克隆到pEasy载体上,构建成pEasy-CMV载体,测序筛选阳性单克隆,提取质粒备用。Lenti-dCas9-VP64_Blast、Lenti-MS2-P65-HSF1_Hygro和pEasy-CMV载体进行NheI-BsiWI双酶切,酶切体系体系见表1。
表1:酶切体系
37℃温浴过夜,1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物,回收纯化大小分别为12820bp(Lenti-dCas9-VP64_Blast)、10471bp(Lenti-MS2-P65-HSF1_Hygro)和521bp(CMV)DNA片段。将12820bp和10471bp片段分别与521bp片段用T4连接酶进行连接反应。反应产物转化stbl3大肠杆菌感受态,涂布于含Amp的LB固体平板中,37℃培养过夜,筛选阳性克隆,则为改造后的慢病毒载体Lenti-dCas9-VP64-T2A-BlastR和Lenti-MS2-P65-HSF1-T2A-HygroR,如附图1。
2、Lenti-sgRNA2.0载体改造,将其中EF1a-BleoR改造为PGK-PuroR。
设计带有BamHI和EcoRI内切酶位点的PGK-PuroR引物,序列为:
BamHI-PGK-F:5’-GGATCCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTC-3’(SEQ ID NO:3),和PuroR-EcoRI-R:5’-GAATTCTCAGGCACCGGGCTTGCGGG-3’(SEQ ID NO:4),以带有PGK-PuroR的质粒为模板,DNA高保真聚合酶扩增得到BamHI-PGK-PuroR-EcoRI片段,连接到平末端载体上,构成pEasy-PGK-PuroR载体,筛选正确克隆,提取质粒备用。BamHI-EcoRI双酶切Lenti-sgRNA2.0和pEasy-PGK-PuroR,酶切体系见表2。
表2:酶切体系
质粒 | 1μg |
BamHI | 1μl |
EcoRI | 1μl |
10×CutSmart Buffer | 5μl |
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 补足到50μl |
37℃温浴过夜,1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物,纯化回收大小为8351bp(Lenti-sgRNA2.0)和1146bp(PGK-PuroR)的DNA片段,T4连接酶连接,连接产物转化stbl3大肠杆菌感受态,筛选阳性克隆,则为改造后慢病毒质粒Lenti-sgRNA2.0-PuroR,图例见附图1。
3、sgRNA设计及载体构建
NGF基因的sgRNA设计使用CHOPCHOP(version3)在线sgRNA设计工具,sgRNA序列见表3。
表3:sgRNA序列及位置
根据内切酶BsmBI单酶切Lenti-sgRNA2.0-PuroR后所得粘性末端(附图2),设计sgRNA***载体的粘性末端(附图2),送商业公司合成。
将商业公司合成的单链寡聚脱氧核糖核酸合成双链。具体为:将合成的冻干粉溶解为10μM,取互补链各5μl加入到0.2ml PCR管后放入PCR仪,反应程序为37℃,10min;95℃,5min;每分钟下降1.5℃,直至室温。
双链sgRNA磷酸化。T4多聚核苷酸激酶对合成的双链sgRNA进行磷酸化处理,反应体系见表4。
表4:反应体系
双链sgRNA | 1μl |
10× T4 PNK buffer | 1μl |
T4 PNK | 0.25μl |
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 终体积10μl |
37℃,1h,-20℃保存。
sgRNA载体构建。内切酶BsmBI单酶切Lenti-sgRNA2.0-PuroR,酶切体系见表5。
表5:酶切体系
Lenti-sgRNA2.0-PuroR | 1μg |
10×CutSmart Buffer | 5μl |
BsmBI | 0.5μl |
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> | 补足到50μl |
终体积 | 50μl |
37℃,20min。1%琼脂糖凝胶分离酶切产物,纯化回收大片段。T4连接酶连接双链sgRNA和Lenti-sgRNA2.0-PuroR,连接产物转化stbl3大肠杆菌感受态,测序筛选阳性克隆。
实施例2:dCas9-SAM/sgRNA激活NGF基因表达效率鉴定
将HEK293接种到6孔细胞培养板中,培养基为添加10%胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的DMEM,37℃,5%CO2培养箱培养至细胞密度为70%。转染试剂Lipofectamine 3000共转染实施例1制备的Lenti-dCas9-VP64-T2A-BlastR、Lenti-MS2-P65-HSF1-T2A-HygroR和Lenti-sgRNA2.0-PuroR,转染体系见表6。
表6:转染体系
室温放置15min,37℃,5%CO2培养箱培养24h,更换新鲜培养基,培养48h,收集细胞。Invitrogen TRIzol RNA提取试剂盒提取总RNA,提取过程见产品说明。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的RNA样品质量。
TakaRa PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA(详见产品说明)。
cDNA样品使用ABI-7500进行qPCR和RT-PCR分析。未转染HEK293细胞作为阴性对照,标记为CN,β-actin作为内参,引物序列见表7。
表7:引物序列
基因相对表达量采用2-ΔΔC法分析,具体如下:
β-actin基因作为内参,CN和NGF_sgRNA1的细胞样品中,其Ct值分别表示为Ct(β-actin_CN)和Ct(β-actin_NGF_sgRNA1),两个待测样本的Ct值分别为Ct(CN)和Ct(NGF_sgRNA1)。
ΔCt(CN)=Ct(CN)-Ct(β-actin_CN);
ΔCt(NGF_sgRNA1)=Ct(NGF_sgRNA1)-Ct(β-actin_NGF_sgRNA1);
ΔΔCt=ΔCt(NGF_sgRNA1)-ΔCt(CN);
NGF_sgRNA1转染细胞中NGF的相对表达量就是CN样品的2-ΔΔCt。
结果显示,3条sgRNA协同作用激活NGF基因的效率明显高于3条sgRNA单独的激活效率(附图3)。
实施例3:慢病毒包装及表达量分析
慢病毒包装采用四质粒***,PEI作为转染试剂,共同转染HEK293细胞,12h后换液,72h后收集上清,纯化柱纯化浓缩病毒。病毒滴度测定采用qPCR法。其中,sgRNA为3个sgRNA协同作用。
1、dCas9-SAM/sgRNA激活UC-MSC中NGF基因
P3代UC-MSC接种到含10%胎牛血清的DMEM培养基中,待细胞密度为80%时,实施例1制备的慢病毒Lenti-dCas9-VP64-T2A-BlastR、Lenti-MS2-P65-HSF1-T2A-HygroR和Lenti-sgRNA2.0-PuroR共感染细胞。感染24h后,更换含有抗生素的DMEM培养基(10%胎牛血清、400μg/ml潮霉素(Hygromcin)和5μg/ml嘌呤霉素(Puromycin))培养三天。未感染慢病毒的UC-MSC作为平行对照。
2、UC-MSC中NGF基因表达量分析
收集感染第4d的UC-MSC,Invitrogen TRIzol RNA提取试剂盒提取总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的RNA样品质量。
TakaRa PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA(详见产品说明)。
cDNA样品使用ABI-7500进行qPCR分析。未感染UC-MSC作为平行对照,β-actin作为内参,引物序列见表7。
基因相对表达量采用2-ΔΔC法分析。
结果显示,感染慢病毒Lenti-dCas9-SAM/sgRAN的UC-MSC中NGF基因表达量是未感染UC-MSC的15.55倍(见图4)。
实施例4:基因编辑UC-MSC对胰岛β细胞功能的改善
慢病毒感染4d后,利用transwell细胞共培养***将感染UC-MSC和胰岛β细胞在DMEM高糖培养基(25mM葡萄糖、2%胎牛血清)共培养,上室为感染UC-MSC,下室为胰岛β细胞。未感染UC-MSC与胰岛β细胞共培养作为平行对照。结果如下:
1、对胰岛素基因表达量和分泌量的影响
共培养24h后,收集胰岛β细胞和培养上清。胰岛β细胞用Invitrogen TRIzol RNA提取试剂盒提取总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的RNA样品质量。TakaRa PrimeScriptRT reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA,cDNA用qPCR进行分析,β-actin作为内参。基因相对表达量采用2-ΔΔC法分析。
收集上清,用Abcam胰岛素ELISA试剂盒测定胰岛素分泌量。
结果显示,与感染UC-MSC共培养的胰岛β细胞的insulin基因相对表达量为9.36±1.17,胰岛素分泌量为12.208±0.914μg/l,均显著高于与未感染UC-MSC共培养的胰岛β细胞(附图5)。
2、对β细胞凋亡的影响
为了分析UC-MSC细胞中基因NGF上调对胰岛细胞凋亡的影响,本发明检测了在与感染UC-MSC共培养24h后,胰岛β细胞中凋亡相关基因bcl2、bax、bad、Caspase-9和survivin的表达水平变化。共培养24h后,收集胰岛β细胞。胰岛β细胞用Invitrogen TRIzol RNA提取试剂盒提取总RNA,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的RNA样品质量。TakaRa PrimeScript RTreagent Kit反转录试剂盒合成cDNA,cDNA用qPCR进行分析,β-actin作为内参。基因相对表达量采用2-ΔΔC法分析。
结果显示,与感染UC-MSC共培养的胰岛β细胞中促细胞凋亡基因(bax、bad和Caspase-9)和抑制细胞凋亡基因(bcl2和survivin)的表达水平均上升,但抑制细胞凋亡基因的表达上升的量显著高于促细胞凋亡基因(附图6)。表明高糖环境下,UC-MSC中NGF基因上调表达能够抑制人β细胞的凋亡。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种促进胰岛β细胞分泌胰岛素的方法,其特征在于,所述的方法包括将胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的方法包括采用sgRNA靶向NGF基因的转录起始位点,启动转录,以激活NGF基因表达。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的sgRNA的靶位点序列包含SEQ IDNO:5、8或11中的任一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法,其特征在于,所述的方法包括向间充质干细胞中导入载体组合物,以激活NGF基因表达,获得NGF基因过表达的间充质干细胞;
优选的,所述的载体组合物包括:
A)表达一个或多个sgRNA和MS2结合位点的载体,或一个或多个表达sgRNA和MS2结合位点的载体;
B)表达融合蛋白MS2-P65-HSF1的载体;以及,
C)表达dCas9蛋白的载体;
优选的,所述的载体为病毒载体。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法,其特征在于,所述的间充质干细胞来源于人或非人动物的脐带、骨髓、脐血或脂肪。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法,其特征在于,其中,胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞以1:(3-7)的比例共培养。
7.一种构建NGF基因过表达的间充质干细胞的sgRNA,其特征在于,所述的sgRNA的靶位点序列包含SEQ ID NO:5、8或11中的任一种或两种以上的组合。
8.一种包含权利要求7所述的sgRNA的载体或载体组合物;
优选的,所述的载体组合物包括:
A)表达一个或多个sgRNA和MS2结合位点的载体,或一个或多个表达sgRNA和MS2结合位点的载体;
B)表达融合蛋白MS2-P65-HSF1的载体;以及,
C)表达dCas9蛋白的载体;
优选的,所述的载体为病毒载体。
9.一种NGF基因过表达的间充质干细胞的制备方法,其特征在于,包括采用权利要求7所述的sgRNA靶向NGF基因的转录起始位点,启动转录,以激活NGF基因表达;
优选的,包括向间充质干细胞中导入权利要求8所述的载体组合物,以激活NGF基因表达,获得NGF基因过表达的间充质干细胞。
10.一种抑制胰岛β细胞凋亡、延长胰岛β细胞存活时间或提高胰岛β细胞存活率的方法,其特征在于,所述的方法包括将胰岛β细胞与NGF基因过表达的间充质干细胞共培养。
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