CN116063535A - 一种抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段、产生该抗体或其抗原结合片段的杂交瘤细胞,以及其应用。本发明采用原核表达技术成功制备了高纯度的Tet(X4)重组蛋白,以其为抗原制备杂交瘤细胞及产生特异性抗体或其抗原结合片段,该抗体或其抗原结合片段特异性强、亲和力高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及一种抗体或其抗原结合片段及其制备方法和应用。
背景技术
现如今,随着抗生素的过度使用,细菌抗生素耐药性(AntimicrobialResistance)已成为全球健康及食品安全所面临的最大威胁之一。对于由革兰氏阴性菌如碳青霉烯类耐药大肠杆菌等引起的一系列疾病,主要依赖于粘菌素和替加环素加以治疗,但由于因质粒介导的粘菌素耐药基因(mcr)在全球范围内广泛传播,粘菌素的临床作用大大削弱,因此,替加环素成为了临床治疗抗生素感染的“最后一道防线”之一。
四环素及其衍生物(例如替加环素)是治疗革兰氏阴性细菌感染的一大临床选择,被加以广泛运用。破坏四环素类抗生素的可转移Tet(X)酶的出现,对抗菌治疗和食品/环境安全构成了巨大挑战。不同于先前广泛研究的替加环素耐药的外排泵机制,由Tet(X)基因编码的黄素依赖性单加氧酶,以替加环素作为底物,对其起着一定的修饰作用,使替加环素失去活力。其中,从肠杆菌科和不动杆菌中分离出的可转移替加环素耐药基因Tet(X4)基因极为重要。了解其特性和耐药机制,可为医疗及卫生行业提供重要依据。
发明内容
为解决现有技术中存在的缺陷,本申请提供了一种可以特异性结合可转移替加环素耐药蛋白(简称Tet(X4)),有望阻断Tet(X4)与替加环素的结合,从而解决耐药性问题。
本发明的第一方面,提供了一种抗体或其抗原结合片段,所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,和/或,轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
其中,CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或10所示的氨基酸序列,或与SEQ IDNO:1或10具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性;CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、11或26所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:2、11或26具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性;CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3或12的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:3或12具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性;CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:4、7、13、27、28或29所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:4、7、13、27、28或29具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性;CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5、8、14或30所示的氨基酸序列,或与SEQ ID NO:5、8、14或30具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性;CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6、9、15或31所示的氨基酸序列,或与SEQ IDNO:6、9、15或31具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性。
在本发明的一个具体实施方式中,CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:4、7、28或29所示的氨基酸序列;CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5、8或30所示的氨基酸序列;CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6或9所示的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列;CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:11或26所示的氨基酸序列;CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列;CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:13或27所示的氨基酸序列;CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:15或31所示的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:4或7所示的氨基酸序列;CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5或8所示的氨基酸序列;CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6或9所示的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列;CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列;CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列;CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列;CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列;CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列;CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中,CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列;CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列;CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
优选的,所述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列以从N端到C端的顺序排列。
优选的,所述的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列以从N端到C端的顺序排列。
优选的,重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:16或19所示氨基酸序列,或与SEQ ID NO:16或19具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性。
优选的,轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:17、18或20所示氨基酸序列,或与SEQ ID NO:17、18或20具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性。
在本发明的一个具体实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:16,轻链可变区包含SEQ ID NO:17或18。
在本发明的一个具体实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含SEQ ID NO:19,轻链可变区包含SEQ ID NO:20。
优选的,所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合可转移替加环素耐药蛋白(简称Tet(X4))。
优选的,所述的抗体或其抗原结合片段的结构为Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、单结构域抗体或单链抗体。
本发明的第二方面,提供了一种核酸,所述的核酸编码上述的抗体或其抗原结合片段、上述的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、或上述的重链可变区或轻链可变区。
优选的,编码重链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO:21或24,或与SEQ ID NO:21或24具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性。
优选的,编码轻链可变区的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22、23或25,或与SEQ IDNO:22、23或25具有80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的同一性。
本发明的第三方面,提供了一种制备Tet(X4)重组蛋白的方法。
所述的方法包括将包含编码Tet(X4)重组蛋白的核苷酸序列的重组质粒导入宿主细胞中。
优选的,所述的宿主细胞为原核的,例如大肠杆菌。
本发明的第四方面,提供了一种重组质粒,所述的重组质粒包括编码Tet(X4)重组蛋白的核苷酸序列。
本发明的第五方面,提供了一种包含编码Tet(X4)重组蛋白的核苷酸序列或包含上述重组质粒或包含上述核酸的细胞。
本发明的第六方面,提供了一种上述方法制备的Tet(X4)重组蛋白。
本发明的第七方面,提供了一种杂交瘤细胞。
优选的,所述的杂交瘤细胞产生上述的抗体或其抗原结合片段。
本发明的第八方面,提供了一种杂交瘤细胞的制备方法。
所述的制备方法包括使用Tet(X4)重组蛋白免疫小鼠,并分离脾细胞,与骨髓瘤细胞融合。
本发明的第九方面,提供了一种药物或诊断试剂盒,所述的药物或诊断试剂盒包含上述的抗体或其抗原结合片段、上述的核酸或上述的杂交瘤细胞。
本发明的第十方面,提供了一种上述的抗体或其抗原结合片段、上述的核酸、上述的杂交瘤细胞或上述的药物或诊断试剂盒的应用,所述的应用包括:
A)在制备治疗革兰氏阴性菌引起的疾病的产品中的应用;或
B)在制备抵抗替加环素耐药性的产品中的应用。
优选的,所述的革兰氏阴性菌包括但不限于肠道细菌的革兰氏阴性菌(大肠杆菌(E.coli)、克雷伯杆菌属(Klebsiella)、灵杆菌(Serratia)、肠道细菌属(Enterobacter)、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、摩根菌属(Morganella)、普罗威登斯菌属(Providencia)、变形菌(Proteus)等)、寄居于呼吸***中的革兰氏阴性菌(嗜血杆菌属(Haemophilus)、莫拉菌属(Moraxella)等)以及葡萄糖非发酵的革兰氏阴性菌(绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、假单胞菌属(Pseudomonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、伯克氏菌属(Burkholderia)、不动杆菌属(Acinetobacter)等)。
本发明的第十一方面,提供了一种抗体药物偶联物,所述的抗体药物偶联物包含与药物共价结合的上述抗体或其抗原结合片段。
优选的,所述的药物可以为化学合成药、抗生素或者各种生物药。优选为抗生素,例如替加环素等。
本发明的第十二方面,提供了一种Tet(X4)蛋白的检测方法,所述的检测方法包括将待检测样品与本申请所述的抗体或其抗原结合片段接触,然后检测Tet(X4)蛋白与抗体或其抗原结合片段形成的复合物。
优选的,所述的检测方法检测Tet(X4)蛋白的存在或含量。其中,所述的存在表示有无,所述的含量可以为表达量或蛋白浓度等。
优选的,所述的抗体或其抗原结合片段可以包含可选择的标记。
本发明所述的“抗原结合片段”是保留完整抗体的特定结合活性的抗体的一部分,即抗体的任何部分能够与完整抗体的靶分子上的表位特异结合。它包括例如Fab,Fab',F(ab')2和这些片段的变体。例如,完整抗体的重链和/或轻链CDR、完整抗体的重链和/或轻链可变区、完整抗体的全长重链或轻链,或来自完整抗体的重链或轻链的单个CDR。
本发明所述的“CDR”代表互补决定区(complementarity-determining region),其可以由现有技术常用的Kabat编号、Chothia编号、IMGT编号、AHo编号(Honegger编号)方案确定。
本发明所述的“包含”在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时,所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成,或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸,但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述的“同一性”是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面,本领域技术人员可以在不改变原序列结构或活性的前提下,根据实际工作需要对序列进行调整,使使用序列与本发明所述的具体序列相比,具有(包括但不限于)1%,2%,3%,4%,5%,6%,7%,8%,9%,10%,11%,12%,13%,14%,15%,16%,17%,18%,19%,20%,21%,22%,23%,24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%,42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51%,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,70%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,99.1%,99.2%,99.3%,99.4%,99.5%,99.6%,99.7%,99.8%,99.9%、100%的同一性。
利用原核表达技术获得了重组质粒,在大肠杆菌中大量表达获得了Tet(X4)重组蛋白,使用蛋白纯化仪得到了高纯度蛋白。通过不同的温度诱导,得出Tet(X4)蛋白的可溶性表达量在20℃和37℃无明显区别,纯化后的蛋白具有良好的生物活性。随后的单抗制备及验证过程中,共免疫4只小鼠,免疫完成后根据检测效价情况选择“左”小鼠冲击进行融合实验。融合后通过抗原筛选复检最终保留阳性克隆株34株用于亚克隆,收集亚克隆上清30株,并进行做亲和力排序。最终选择5D3D3用于打腹水进行抗体制备,得到的抗体分别进行重组抗原的SDS-PAGE及WB检测,均呈现出清晰条带。单克隆抗体是由淋巴细胞分泌的一种仅针对某一特定抗原表位的抗体,特异性好、亲和力强。本研究利用原核表达***制备出高纯度的Tet(X4)蛋白,并获得其单克隆抗体,可为进一步解释Tet(X4)耐药菌株的耐药机制、控制其在全球范围内的流行提供基础。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施例,其中:
图1:Tet(X4)重组质粒的PCR鉴定结果。
图2:Tet(X4)蛋白在20℃诱导条件下不同过程中的表达量。
图3:Tet(X4)蛋白在37℃诱导条件下不同过程中的表达量。
图4:抗体的SDS-PAGE图。
图5:抗体Western-Blot图。
图6:Tet(X4)蛋白变性曲线和聚集曲线叠图。
图7:抗体变性曲线和聚集曲线叠图。
图8:化学发光成像。
图9:定量分析结果,其中,Ckneg代表tet(X4)阴性菌,CKpos代表tet(X4)阳性菌不加药,T2代表替加环素浓度2μg/mL,T4代表替加环素浓度4μg/mL,T8代表替加环素浓度8μg/mL。
图10:抗体标准曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅是本发明的部分实施例,而不是全部。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例中使用的试剂及仪器来源:
大肠杆菌[Escherichia coli BL21(DE3)]购自上海维地生物技术有限公司,原核表达质粒pET-28a由北京六合华大基因科技有限公司提供。
核酸限制性内切酶rTaq,DNA T7、T7t连接酶、DL2000核酸Marker均购自于宝生物工程(大连)有限公司;
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、蛋白质分子量标准(10-150kD,非预染)均购自上海碧云天生物技术有限公司;
SDS-PAGE凝胶试剂盒(碧云天生物技术有限公司);
弗氏佐剂,Balb/C小鼠,PBS,DMEM培养基(Hyclone,SH30809.01B),胎牛血清(无噬菌体),双抗(Hyclone,SY30010),L-谷氨酸胺(Amresc,DH144-1),PEG4000(SIGMA,p7181),人淋巴细胞分离液(LTS1077),HAT(SIGNA,H0262-IVL),200目过滤网,半固体培养基,96孔细咆培养板(Corning Incroporated Costar,3699),细胞血球计数板,RPMI-1640培养基,HRP标记羊抗小鼠1gG,FC(Jacksan,115-035-071);
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、咪唑等试剂购自Sigma-aldrich公司;
超声:超声波细胞粉碎机SCIENTZ-IID购自于宁波新芝生物科技股份有限公司;
蛋白纯化***购自于伯乐生命医学产品(上海)有限公司。
实施例1:Tet(X4)重组蛋白的表达和纯化
一、实验方法
1、Tet(X4)重组质粒的转化
取50μL感受态细胞BL21(DE3),在细胞半融状态下加入10μL制备好的重组质粒pET28a-tet(X4),轻弹混匀,转移至预冷的电转杯中反应10min,置入电转仪(1800V,200Ω)进行转化,在转化完成的电转杯中加入500μL SOC培养基,37℃180rpm培养1h,用玻璃棒将细菌涂布到含卡那霉素(50μg/mL)的LB琼脂培养基上,37℃恒温培养。次日挑取长出的单菌落进行PCR阳性验证以及测序。
pET28a-tet(X4)序列:
目的基因合成厂家:生工生物工程(上海)股份有限公司。
2、Tet(X4)重组蛋白的诱导表达及纯化
挑取单菌落,接种于含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中,37℃振荡过夜;将培养物按1:100的比例接种到200mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中,扩大培养至OD600值为0.6~0.8,加入IPTG,使其终浓度为0.5mmol/L,20℃振荡培养16h,9000g 4℃离心10min收集菌体,用PBS三次清洗后,加入5mL His Bind Columns Buffer(20mmol/L Tris-HCL,500mmol/L NaCl,10mmol/L咪唑,pH 8.0)冰浴超声10min,10000g 4℃离心10min,分别保留上清及沉淀。
将得到的上清在蛋白纯化仪上使用His Bind Elution Buffer(20mmol/L Tris-HCL,500mmol/LNaCl,500mmol/L咪唑)过Ni-NTA柱进行纯化,收集洗脱液并用SDS-PAGE进行鉴定。
3、Tet(X4)重组蛋白的Western Blot分析
取诱导前、诱导后、裂解后上清、裂解后沉淀、纯化穿流液、纯化淋洗液、纯化洗脱液样品进行10%SDS-PAGE(恒压80V电泳20min,转换至恒压120V电泳60min),取一块胶进行考马斯亮蓝染色,另一块胶按照Bio-Rad公司的湿转转移方法以恒流200V电泳转膜120min,将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜用5%脱脂奶粉37℃孵育1h后用TBST洗3次,每次10min,加入鼠源His一抗(1:2000稀释)在4℃中过夜孵育,次日用TBST洗膜3次后加入辣根过氧化物酶(1:2000稀释)4℃孵育1h,用TBST洗膜5次,化学发光显影。
二、实验结果
1、重组质粒转化结果鉴定
将转录成功所得的单菌落进行PCR扩增后,产物经1%琼脂糖凝胶电泳,以Tet(X4)重组质粒为阳性对照,所得条带约1500bp,大小与目的片段长度相符,结果如图1所示。取阳性克隆进行测序,与NCBI中Tet(X4)的标准序列(NG_065852.1)进行比对,测序结果与数据库中结果一致并无突变。
2、Tet(X4)蛋白的表达、纯化及SDS-PAGE和Western-Blot
将测序正确的阳性菌进行原核表达和纯化,为获得更多可溶性表达蛋白,将Tet(X4)重组蛋白分别在20℃和37℃两个不同的温度下进行诱导表达。取诱导前、诱导后、裂解后上清、裂解后沉淀、纯化穿流液、纯化淋洗液、纯化洗脱液样品进行SDS-PAGE验证,Western-Blot结果及考马斯亮蓝结果如图2-3所示。可见Tet(X4)蛋白在20℃和37℃两个不同的诱导条件下,可溶性表达蛋白量均比较可观。经蛋白纯化仪洗脱后的目的蛋白条带大小约为45kd,与NCBI上查询得到的大小一致。
三、制备的Tet(X4)蛋白稳定性验证
1、使用Uncle测定制备的Tet(X4)蛋白的稳定性,其实验参数为:
升温区间:25-95℃
升温速率:0.5℃/min
升温前DLS检测粒度及多分散性
2、结果见表1、2及图6
表1
样本 | Conc.(mg/ml) | Tm1(℃) | Tm2(℃) | Tagg266(℃) |
Tet(X4) | 0.46 | 45 | 52.65 | 34.51 |
表2
实施例2:制备杂交瘤细胞及产生单克隆抗体
一、实验方法
1、Tet(X4)单克隆抗体制备及验证
1)抗血清制备及其效价检测
取0.05mg实施例1制备的Tet(X4)重组蛋白用PBS稀释后与弗氏佐剂按体积1:1混合后在4℃环境下乳化3min-5min。第一次免疫用弗氏完全佐剂,后面加强免疫则用弗氏不完全佐剂。将乳化好的Tet(X4)重组蛋白转入1mL的注射器中,排除注射器中的气泡。从笼中取出待免Balb/C小鼠放在特制的固定架中,在背部进行多点皮下注射。每次免疫相隔2周。一共免疫3-5次。三免一周后取血检测,如果效价到达了冲击免疫后摘眼球取血拉颈处死,取脾脏。一共免疫4只小鼠。
用包被液CB将Tet(X4)重组蛋白稀释至1μg/mL,100μL/孔加入酶标板,4℃过夜。取出酶标板拍干孔内液体,5%脱脂牛奶封闭,200μL/孔加入酶标板,37℃孵育2h,TBS洗板3次。用样稀将免疫血清按1:1000,1:2000,1:4000,1:8000,1:16000,1:32000,1:64000,1:128000……进行倍比稀释,每孔100μL,37℃孵育1h。TBS洗板3次。加入HRP标记羊抗小鼠IgG(1:10000酶稀稀释),100μL/孔,37℃孵育40min,TBS洗板5次。加TMB底物,90μL/孔,37℃避光5~20min。加终止液,50μL/孔,酶标仪读数(波长450nm),阳性反应的最大稀释度即为免疫小鼠的血清效价。
2、滋养细胞制备
1)小鼠腹腔巨噬细胞制备
取8-10周Balb/C小鼠,摘眼球放血拉颈处死,将小鼠浸泡于75%酒精中消毒5min。小鼠移入超净工作台并用灭过菌的针头将小鼠仰卧固定在垫有灭菌报纸的泡沫上,用剪刀镊子开腹部皮肤,钝性剥离充分暴露腹膜。用5mL注射器吸取3-5mL DMEM注入腹腔内冲洗,将培养基吸出移至50mL离心管中。
2)小鼠脾脏细胞制备
无菌剪开腹膜,暴露腹腔,剪去***分离脾脏,将其分成四段放置在200目分离网中央,对折分离网两次,用止血钳夹住分离网开口端,加入3-6mL DMEM,研磨,吹打混匀,吸出移至50mL离心管。再次加入3-6mL DMEM,吹打混匀成单个脾细胞悬液,吸出移至50mL离心管。
将巨噬细胞和脾脏细胞收集起来1500rpm离心5min弃上清,按一只老鼠1mL胎牛血清的量悬起细胞,4℃保存。
3、细胞融合
1)SP2/0的活化与制备
融合前复苏SP2/0细胞,于10%的FBS的DMEM培养基中传代培养一周,细胞生长状态较好时,取细胞无菌操作DMEM培养基洗2次,1x106个细胞/只注射于小鼠背部皮下。大约8-10天能明显看到肿瘤,待肿瘤生长至直径1-3cm,对免疫合格鼠进行冲击免疫,3天后融合。无菌剪开背部皮肤,剪下肿瘤块并剪成小块,移至200目过滤网中央放置在10cm皿中,加入5-10mL DMEM,研磨成单细胞胞悬液,全部吸出至50mL离心管内。再加入5mL DMEM,吹打混匀,全部吸出至50mL离心管中。再补加5mL DMEM,吹打混匀,全部吸出至50mL离心管中。将20mL骨髓瘤细胞悬液沿管壁轻轻摘加到预先加入有20mL淋巴细胞分离液的50mL离心管中,2000r/min离心15min,弃去上层细胞悬液后,将中层白色的骨髓瘤细胞悬液转移到另一50mL离心管中,用10mL DMEM培养基悬浮,1500r/min离心5min,洗细胞两次。弃去上清,用10mL DMEM培养基重悬骨髓瘤细胞,计数后备用。
2)免疫脾细胞的制备
取免疫合格的Balb/C小鼠一只,摘除眼球放血完全拉颈处死,收集血液并分离,血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同制备滋养细胞取脾脏的方法相同,分离并制备免疫脾细胞悬液。
3)细胞融合
将1mL PEG和40mL DMEM培养基置于37℃,5%CO2培养箱预热。将骨髓瘤细胞和脾细胞的个数按1:3-1:10比例混合,1500rpm离心5min,弃上清,吸干残留液体,加入37℃预热的1mL PEG。向融合体系中加入40mL DMEM培养基以终止PEG的作用。加完第一个10mL后,接着沿管壁补加DMEM培养基至40mL。800rpm离心5min,弃上清。用2-4mL胎牛血清悬起融合后的混合细胞,根据融合完的细胞量加入含有滋养细胞,谷氨酸胺,双抗和HAT的25%胎牛血清的半固体培养基中。将混合好的半固体倒入3.5cm平皿内,再将所有的培养皿放置在灭过菌的湿盒内,置于37℃,5%CO2培养箱中培养。
4)选择性培养
细胞生长到第十天,根据细胞集落大小将集落挑到96孔板内培养,2-3天后,取细胞培养上清,同时用间接ELISA方法和间接竞争ELISA方法进行筛选。
4、亚克隆及亚克隆检测
取需要亚克隆的细胞轻轻吹打,制成单细胞悬浮,加入计数板计数,计算细胞密度。用包被液CB将抗原稀释至2μg/ml,100μL/孔加入酶标板,4℃过夜。取出酶标板拍干孔内液体,5%脱脂牛奶封闭,200μL/孔加入酶标板,37℃孵育2h,TBS洗板3次。按100μL/孔细胞上清加样,37℃孵育1h,TBS洗板3次。加入HRP标记羊抗小鼠IgG(1:10000酶稀稀释),100μL/孔,37℃孵育40min,TBS洗板5次。加TMB底物,90μL/孔,37℃避光20-30min。加终止液,50μL/孔,酶标仪读数(波长450nm),OD值为2.0时对应的稀释值即为细胞的效价。
5、细胞冻存与复苏扩大培养
细胞大于1x106个时冻存,1500rpm离心5min。DMSO与胎牛血清比例为1:9的冻存液来冻存细胞。细胞冻存管放入室温的梯度冻存盒内,再直接放入-80℃过夜。取出梯度冻存盒内细胞,置于液氮罐长期保存。
快速将细胞冻存管从液氮罐中取出,置37℃恒温水浴锅内快速摇晃至细胞融化。加入5mL DMEM培养基混匀,1200rpm离心5min,弃上清,加入20%的完全培养基,37℃,5%CO2培养箱内培养,传代。
6、抗体效价检测
用包被液CB将实施例1制备的Tet(X4)重组蛋白稀释至2μg/ml,100μL/孔加入酶标板,4℃过夜。取出酶标板拍干孔内液体,5%脱脂牛奶封闭,200μL/孔加入酶标板,37℃孵育2h,TBS洗板3次。用样稀将抗体按2μg/mL,1μg/mL,0.5μg/mL,0.25μg/mL,0.125μg/mL,0.0625μg/mL,0.03125μg/mL,0.015625μg/mL进行倍比稀释,每孔100μL,37℃孵育1h。TBS洗板3次。加入HRP标记羊抗小鼠IgG(1:10000酶稀稀释),100μL/孔,37℃孵育40min,TBS洗板5次。加TMB底物,90μL/孔,37℃避光5~20min。加终止液,50μL/孔,酶标仪读数(波长450nm),阳性反应的最大稀释度即为抗体的效价。
二、实验结果
1、抗血清制备及其效价检测
根据血清效价情况,编号为“左”号小鼠效价最高,理论上这两只小鼠的特异性也会更强,所以选这只小鼠来进行融合实验。具体抗血清效价数据见表3及表4。
表3:三免效价检测
表4:四免效价检测
2、细胞融合及亚克隆检测
融合筛选后挑选出1只小鼠进行融合,融合后用免疫抗原复检一次,选出34株进行亚克隆。而后亚克隆筛选获得30株阳性,收取细胞上清并对阳性克隆株做亲和力排序。最后根据上清梯度选定5D3D3来打腹水制备抗体。
3、单克隆抗体纯化及抗体效价检测
细胞经过冻存、复苏后对其进行亚型鉴定,细胞株5D3D3经鉴定均为igG1(见表5),故选用Protein G柱对其纯化,获得的抗体分别命名为A抗体和B抗体,其CDR序列见表6。
表5:细胞株亚型鉴定表
表6:抗体的CDR序列
其中,A抗体的重链可变区如SEQ ID NO:16所示,编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示,轻链可变区如SEQ ID NO:17或18所示,编码的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22或23所示,具体如下:
B抗体的重链可变区如SEQ ID NO:19所示,编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示,轻链可变区如SEQ ID NO:20所示,编码的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示。具体如下:
而后检测抗体效价进行重组抗原(Tet(X4)重组蛋白)的SDS-PAGE及WB检测,均得到目的条带,具体可见图4、图5。表明,实施例制备的杂交瘤细胞产生了特异性结合Tet(X4)重组蛋白的特异性抗体。
4、单克隆抗体稳定性及效价
检测抗体a(重链可变区如SEQ ID NO:16所示,轻链可变区如SEQ ID NO:17所示)、b(重链可变区如SEQ ID NO:16所示,轻链可变区如SEQ ID NO:18所示)、c(重链可变区如SEQ ID NO:19所示,轻链可变区如SEQ ID NO:20所示)的稳定性。
1)使用Uncle测定制备的抗体的稳定性,其实验参数为:
升温区间:25-95℃
升温速率:0.5℃/min
升温前DLS检测粒度及多分散性
2)稳定性结果
结果显示,a、b、c抗体的稳定性均较好,示例性的a抗体结果见表7、8及图7。
表7
样本 | Conc.(mg/ml) | Tm1(℃) | Tm2(℃) | Tagg266(℃) |
a抗体 | 1 | 72.79 | - | 65.7 |
表8
实施例3 Western-Blot验证
1、材料与方法
1)材料
制备所得的Tet(X4)小鼠单克隆抗体;tet(X4)阳性野生菌及tet(X4)阴性野生菌;Western及IP细胞裂解液、PMSF、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)均购自上海碧云天生物技术有限公司,化学发光液购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。
2)方法
细菌培养:将tet(X4)阳性野生菌及tet(X4)阴性野生菌划线于LB琼脂培养基上,37℃过夜培养,而后挑取单菌落至1mL LB肉汤培养基中,37℃180rpm培养6h,按照1:100的比例将菌液分别移至5mL LB培养基中,添加不同浓度替加环素,使替加环素终浓度为0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL,37℃180rpm过夜培养。
蛋白提取:10000rpm离心5min,去除上清,用预冷的PBS清洗菌体三次,而后用1mLPBS重悬菌体,加入溶菌酶使其终浓度为0.25mg/mL,颠倒混匀后冰上静置30min,后37℃孵育5min,重新置于冰上静置30min。在裂解液中加入终浓度1mM的PMSF,向溶菌酶处理后的菌体中加入200μL裂解液,轻弹后静置10min,使用超声波细胞破碎仪裂解菌体5min,50w,工作3s,停2s,最后离心取上清液。
蛋白浓度均一化:使用Bradford法测量蛋白浓度,加入蛋白样品缓冲液,而后用裂解液调节每个蛋白样品的浓度使其均一为0.8μg/μL。
Western-Blot验证:将蛋白样品煮沸后10000rpm离心5min,使用浓度为10%的胶进行SDS-PAGE电泳,每个样品上样16μg,条件为80V 30min,120V 90min。将PVDF膜置于甲醇溶液中活化1min,用转膜缓冲液浸泡膜、胶、海绵、滤纸等,按照白面-白海绵-两层滤纸-膜-胶-两层滤纸-黑海绵-黑面的顺序夹好,进行湿转法转膜,300mA 2h。转膜结束后使用5%脱脂奶对膜进行封闭,37℃180rpm摇床封闭1h,用TBST洗膜3次,按照1:1000的比例加入Tet(X4)小鼠单克隆抗体和一抗稀释液,4℃孵育过夜,次日用TBST洗膜3次,而后按照1:1000的比例加入辣根过氧化物酶和5%脱脂奶,4℃孵育1h,用TBST洗膜3次,加入化学发光液进行成像,并用ImageJ软件对灰度进行分析。
2、结果与分析
化学发光成像图由图8可见,上样次序为:通道1、2为tet(X4)阴性菌,通道3、4为不加药培养条件的tet(X4)阳性菌,通道5、6为加入替加环素浓度为2μg/mL培养条件下的tet(X4)阳性菌,通道7、8为加入替加环素浓度为4μg/mL培养条件下的tet(X4)阳性菌,通道9、10为加入替加环素浓度为8μg/mL培养条件下的tet(X4)阳性菌。替tet(X4)阴性菌上样通道无蛋白条带,而tet(X4)阳性菌通道均显现出了不同程度的条带,可见Tet(X4)小鼠单克隆抗体与Tet(X4)蛋白具有良好的结合能力。定量分析图由图9所示,分别为tet(X4)阴性菌,tet(X4)阳性菌不加药、替加环素浓度2μg/mL、替加环素浓度4μg/mL、替加环素浓度8μg/mL。tet(X4)阳性菌与阴性菌在Tet(X4)的表达上呈现出了显著的差异,另外,在加药情况下,Tet(X4)蛋白的表达显著提高,且表达量稳定。
在Western-Blot验证中,不表达Tet(X4)蛋白的tet(X4)阴性菌蛋白样品中没有呈现出条带,而在表达Tet(X4)蛋白的tet(X4)阳性菌蛋白样品中呈现出清晰的条带,并且条带灰度值随着蛋白表达量的增加而增加,这体现了Tet(X4)小鼠单克隆抗体与Tet(X4)蛋白有着良好的结合能力。
实施例4
检测抗体a(重链可变区如SEQ ID NO:16所示,轻链可变区如SEQ ID NO:17所示)、b(重链可变区如SEQ ID NO:16所示,轻链可变区如SEQ ID NO:18所示)、c(重链可变区如SEQ ID NO:19所示,轻链可变区如SEQ ID NO:20所示)的稳定性。
1、实验方法
(1)用包被液将tetx4蛋白稀释1000倍,加至酶标板,100μL/孔,4℃过夜包被;
(2)倾倒去孔内液体,用洗涤液洗涤1次,每孔加入150μL封闭液,37℃恒温封闭1h,然后倒去封闭液,甩干;
(3)将浓度梯度稀释的tetx4抗体加入酶标板中反应,抗体浓度分别为1ug/mL,0.67ug/mL,0.50ug/mL,0.40ug/mL,0.33ug/mL,0.11ug/mL,0.037ug/mL,0.012ug/mL,各浓度有3个重复,50μL/孔,37℃反应30min,洗涤液洗涤3次后甩干孔内液体;
(4)每孔加入100μL HRP-羊抗鼠IgG,37℃反应30min,洗涤同上;
(5)加入新鲜配制的TMB溶液,100μL/孔,避光37℃显色15min;
(6)加入2mol/L H2SO4,50μL/孔;
(7)用酶标仪读取各孔OD450nm;
(8)以tetx4抗体浓度为横坐标,以tetx4抗体各浓度对应的OD值为纵坐标,用GraphPad prism9软件,按四参数拟合绘制标准曲线,见图10。
2、实验结果
结果显示,三个抗体均有较高的与tetx4蛋白结合的能力,其EC50值均在0.4566至0.5775之间。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于上述实施方式中的具体细节,在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是,在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征,在不矛盾的情况下,可以通过任何合适的方式进行组合,为了避免不必要的重复,本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述的抗体或其抗原结合片段包含重链可变区的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3,和/或,轻链可变区的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3;其中,
CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或10所示的氨基酸序列;
CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2、11或26所示的氨基酸序列;
CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3或12的氨基酸序列;
CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:4、7、13、27、28或29所示的氨基酸序列;
CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5、8、14或30所示的氨基酸序列;
CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6、9、15或31所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,其中,
CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;
CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列;
CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:4、7、28或29所示的氨基酸序列;
CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:5、8或30所示的氨基酸序列;
CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:6或9所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,其中,
CDR-H1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列;
CDR-H2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:11或26所示的氨基酸序列;
CDR-H3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列;
CDR-L1的氨基酸序列包含SEQ ID NO:13或27所示的氨基酸序列;
CDR-L2的氨基酸序列包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列;
CDR-L3的氨基酸序列包含SEQ ID NO:15或31所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,重链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:16或19所示氨基酸序列;
轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:17、18或20所示氨基酸序列。
5.根据权利要求所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合可转移替加环素耐药蛋白。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段,其特征在于,所述的抗体或其抗原结合片段的结构为Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、单结构域抗体或单链抗体。
7.一种核酸,其特征在于,所述的核酸编码权利要求1-6任一所述的抗体或其抗原结合片段。
8.一种杂交瘤细胞,其特征在于,所述的杂交瘤细胞产生权利要求1-6任一所述的抗体或其抗原结合片段。
9.一种药物或诊断试剂盒,其特征在于,所述的药物或诊断试剂盒包含权利要求1-6任一所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的杂交瘤细胞。
10.一种权利要求1-6任一所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7所述的核酸、权利要求8所述的杂交瘤细胞或权利要求9所述的药物或诊断试剂盒的应用,其特征在于,所述的应用包括:
A)在制备治疗革兰氏阴性菌引起的疾病的产品中的应用;或
B)在制备抵抗替加环素耐药性的产品中的应用。
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