CN116059248A - 一种制备干细胞凝胶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物凝胶制备技术领域，本发明公开了一种制备干细胞凝胶的方法。该制备方法是将间充质干细胞作为活性细胞加入该间充质干细胞来源的提取物，大豆皂苷、青藤碱等生物活性分子负载在以刺槐豆胶和硫酸软骨素为骨架的高分子的水凝胶材料上，不仅为干细胞在外部环境生长提供有利的稳定条件，保证干细胞在有效期的存活率，而且还能促进软骨再生和修复，发挥抑制炎症因子的作用，从而为治疗骨性关节炎提供有效的治疗手段。

Description

一种制备干细胞凝胶的方法
技术领域
本发明涉及生物凝胶制备技术领域，尤其涉及一种制备干细胞凝胶的方法。
背景技术
骨性关节炎是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为主要病症的慢性关节疾病,好发于负重较大的膝关节、髋关节、脊柱及手指等部位,严重影响患者的肢体功能和日常生活,病情严重者会出现关节疼痛,活动受限,甚至可能造成关节畸形,甚至残疾,是影响人类健康最常见的关节疾患之一。骨关节炎发病率逐年升高，患者医疗费用增加，且工作能力下降，给患者家庭和社会造成严重的负担。
关节软骨其主要功能是传导分布运动载荷，维持和承受接触应力从而顺利完成膝关节功能活动，骨性关节炎其主要病理特点是关节软骨的破坏与缺损，因此关节软骨修复是骨性关节炎的治疗关键，因关节软骨中无血管、淋巴和神经分布，其自身修复能力较弱。
相对于传统的药物治疗方案和手术治疗方案,干细胞治疗是最近逐渐兴起的一种新的骨性关节炎治疗方式,尤其是间充质类干细胞，间充质干细胞是一类具有自我更新与多向分化能力的细胞,可以分化为骨、软骨、脂肪等多种组织。间充质干细胞还具有免疫原性低,调节机体免疫反应,细胞因子分泌能力强等特点,具有治疗骨性关节炎的潜力。
水凝胶由于具有三维(3D)交联亲水性网络、多孔结构、可控柔性、易于装载货物以及良好的生物相容性等优点，被认为是软骨组织工程的候选支架材料，高分子凝胶材料负载干细胞较大多数都是以透明质酸或海藻酸钠作为骨架来进行负载的而海藻酸钠基水凝胶是一种极具吸引力的支架材料，但它仍然存在降解缓慢、难以被机体清除；而透明质酸基水凝胶支架材料，机械性能较差负载干细胞后会影响干细胞在外部生长的稳定性，从而影响干细胞的增殖以及活性。
综上所述，还需要一种合适的载体来用于负载干细胞，从而利于应用于骨性关节炎。
发明内容
有鉴于此，针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种负载干细胞的水凝胶的制备方法，为干细胞在外部环境生长提供有利的稳定条件，保证干细胞在有效期的存活率，利于作用于治疗骨性关节炎中软骨修复和再生，为治疗骨关节炎提供了有效的治疗手段。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种制备干细胞凝胶的方法，包括以下步骤：
步骤1：将干细胞的细胞培养基上清液，离心，弃上清，沉淀物重悬，得到重悬液、二次离心，再次弃上清，沉淀物重悬，过滤，即得干细胞提取物；
步骤2：将经过无菌处理的刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶用磷酸盐缓冲盐水溶解再加入干细胞专用培养基制备第一凝胶溶液，调节第一凝胶溶液pH至7；
步骤3：将步骤2制备得到的第一凝胶溶液和步骤1制备的细胞培养基上清液混匀37℃水浴孵育60min，即得干细胞凝胶。
作为优选，步骤1中所述的干细胞选自人胚胎干细胞源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞或髌下脂肪垫间充质干细胞中的任意一种。
作为优选，步骤1中制备的细胞培养基上清液中的干细胞为每毫升含1×105～1.5×106个。
作为优选，步骤2中所述的干细胞专用培养基的具体配制方法为：分别按培养干细胞的细胞基础培养基体积加入3％～5％干细胞提取物、1-2％血小板裂解液、0.1～0.5％青藤碱、0.1～0.5％大豆皂苷、0.1～2％黄腐酚即得。
作为优选，步骤3中所述的第一凝胶溶液和细胞培养基上清液体积比为3:2。
作为优选，步骤2的刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶是分别是将酸化后的刺槐豆胶和硫酸软骨素在光引发剂的作用下产生交联生成的支架材料，具体制备方法如下：
a:刺槐豆胶以100g/L的质量浓度溶解于磷酸盐缓冲盐水中，50℃下搅拌至刺槐豆胶完全溶解，以0.5mL/min缓慢滴加甲基丙烯酸酐，滴加量为所溶解刺槐豆胶质量的0.8倍，滴加完毕后用5mol/L氢氧化钠溶液将所得溶液调至pH至7.0；50℃下持续搅拌2h，随后将溶液在50℃下的纯水中进行透析6d，干燥得到甲基丙烯酸化刺槐豆胶，并储存在-20℃环境中，备用；
b:将硫酸软骨素溶解在去离子水中制成质量浓度为2g/L的硫酸软骨素溶液，将甲基丙烯酸酸酐与二甲亚砜按1:1的比例混合，以0.08:1的体积比加入到溶解的硫酸软骨素溶液中，室温静置2h,用5mol/L氢氧化钠溶液将pH调至7.0，反应20h，室温下纯水中进行透析12h，干燥得到甲基丙烯酸化硫酸软骨素；
c:将甲基丙烯酸化刺槐豆胶和甲基丙烯酸化硫酸软骨素分别以100g/L的质量浓度分别溶解于磷酸盐缓冲盐水中混合，再向混合溶液中加入光引发剂、纳米羟基磷灰石、紫外光辐射15s，即得。
作为优选，步骤c中光引发剂选择Irgacure2959，其质量浓度为0.5g/L。
作为优选，步骤c中纳米羟基磷灰石质量浓度为3.5g/L。
作为优选，本发明干细胞凝胶制备完成后储存在-80℃冰箱中，使用时,从冰箱中取出立即置于37℃水浴中复苏即可使用。
经由上述的技术方案可知，本发明公开提供了一种制备干细胞凝胶的方法，与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
1、本发明制备方法是将间充质干细胞作为活性细胞加入该间充质干细胞来源的提取物负载在以刺槐豆胶和硫酸软骨素为骨架的高分子的水凝胶材料上，不仅为干细胞在外部环境生长提供有利的稳定条件，保证干细胞在有效期的存活率。
2、与现有的干细胞载体如：明胶、海藻酸钠、透明质酸等相比，本发明采用的是酸化的刺槐豆胶和酸化硫酸软骨素作为骨架再辅以纳米羟基磷灰石制备的水凝胶支架材料，硫酸软骨素可以提高蛋白多糖和胶原蛋白的分泌能力，其分子链上含有大量的羟基、羧基和磺酸基基团，亲水性极好，更有利于不仅干细胞的负载，而且作为类骨质的成分，具有促进软骨再生的功能并且具有良好的生物降解性；刺槐豆胶是刺角藻种子中分离得到的天然多糖类化合物，不仅具有良好的生物相容性，还具有优异的生物降解性能，同时具有的良好黏附性能够，有利于细胞及其分泌的各种细胞因子的粘附，不仅从而发挥稳定的软骨再生和修复作用，而且为干细胞在外部环境中的增殖提供了稳定的条件，提高了干细胞在外部环境的存活率。
3、本发明制备的干细胞凝胶还加入血小板裂解液、青藤碱、大豆皂苷、黄腐酚等，更进一步的促进骨性关节炎中软骨修复和再生以及抑制关节腔内的炎症因子的产生，从而为治疗骨性关节炎提供有效的治疗手段。
4、本发明制备的干细胞凝胶制备后采用低温保存方式,可以有充足的时间进行放行检验,满足药典法微生物检测、支原体检测的时间要求,保证了制品质量，而且本发明的干细胞凝胶通过冷链运输,制品达到用户处,无需繁杂操作,只需37℃水浴复苏细胞后,进行使用。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种制备干细胞凝胶的方法，包括以下步骤：
步骤1：将干细胞的细胞培养基上清液，离心，弃上清，沉淀物重悬，得到重悬液、二次离心，再次弃上清，沉淀物重悬，过滤，即得干细胞提取物；
其中，细胞培养基上清液中的干细胞为每毫升1×105～1.5×106个；
其中，干细胞提取物指的就是所述人胚胎干细胞源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞或髌下脂肪垫间充质干细胞来源的外泌体，对于上述间充质干细胞的均来自脐带、胎盘、羊膜等分离、纯化所得，对于上述间充质干细胞来源的外泌体的分离所使用的方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法，在此就不再赘述。
步骤2：将经过无菌处理的刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶用磷酸盐缓冲盐水溶解再加入干细胞专用培养基制备第一凝胶溶液，调节第一凝胶溶液pH至7；
其中，刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶是分别是将酸化后的刺槐豆胶和硫酸软骨素在光引发剂的作用下产生交联生成的支架材料，具体制备方法如下：
a:刺槐豆胶以100g/L的质量浓度溶解于磷酸盐缓冲盐水中，50℃下搅拌至刺槐豆胶完全溶解，以0.5mL/min缓慢滴加甲基丙烯酸酐，滴加量为所溶解刺槐豆胶质量的0.8倍，滴加完毕后用5mol/L氢氧化钠溶液将所得溶液调至pH至7.0；50℃下持续搅拌2h，随后将溶液在50℃下的纯水中进行透析6d，干燥得到甲基丙烯酸化刺槐豆胶，并储存在-20℃环境中，备用；
b:将硫酸软骨素溶解在去离子水中制成质量浓度为2g/L的硫酸软骨素溶液，将甲基丙烯酸酸酐与二甲亚砜按1:1的比例混合，以0.08:1的体积比加入到溶解的硫酸软骨素溶液中，室温静置2h,用5mol/L氢氧化钠溶液将pH调至7.0，反应20h，室温下纯水中进行透析12h，干燥得到甲基丙烯酸化硫酸软骨素；
c:将甲基丙烯酸化刺槐豆胶和甲基丙烯酸化硫酸软骨素分别以100g/L的质量浓度分别溶解于磷酸盐缓冲盐水中混合，再向混合溶液中加入其质量浓度为0.5g/L光引发剂Irgacure2959、质量浓度为3.5g/L的纳米羟基磷灰石、紫外光辐射15s，即得刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶；
其中，干细胞专用培养基的具体配制方法为：分别按培养干细胞的细胞基础培养基体积加入3％～5％干细胞提取物、1-2％血小板裂解液、0.1～0.5％青藤碱、0.1～0.5％大豆皂苷、0.1～2％黄腐酚即得，其中，血小板裂解液、青藤碱、大豆皂苷、黄腐酚均为市售产品，均可通过购买获得。
其中，细胞基础培养基是指本领域用于培养人胚胎干细胞源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞或髌下脂肪垫间充质干细胞的常规使用的培养基，比如：无血清的DMEM培养基、DMEM完全培养基或DF12培养基等。
步骤3：将步骤2制备得到的第一凝胶溶液和步骤1制备的细胞培养基上清液混匀37℃水浴孵育60min，即得干细胞凝胶，然后将本发明干细胞凝胶制备完成后储存在-80℃冰箱中，使用时,从冰箱中取出立即置于37℃水浴中复苏即可使用。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
以下实施例中刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶具体制备方法如下：
a:刺槐豆胶以100g/L的质量浓度溶解于磷酸盐缓冲盐水中，50℃下搅拌至刺槐豆胶完全溶解，以0.5mL/min缓慢滴加甲基丙烯酸酐，滴加量为所溶解刺槐豆胶质量的0.8倍，滴加完毕后用5mol/L氢氧化钠溶液将所得溶液调至pH至7.0；50℃下持续搅拌2h，随后将溶液在50℃下的纯水中进行透析6d，干燥得到甲基丙烯酸化刺槐豆胶，并储存在-20℃环境中，备用；
b:将硫酸软骨素溶解在去离子水中制成质量浓度为2g/L的硫酸软骨素溶液，将甲基丙烯酸酸酐与二甲亚砜按1:1的比例混合，以0.08:1的体积比加入到溶解的硫酸软骨素溶液中，室温静置2h,用5mol/L氢氧化钠溶液将pH调至7.0，反应20h，室温下纯水中进行透析12h，干燥得到甲基丙烯酸化硫酸软骨素；
c:将甲基丙烯酸化刺槐豆胶和甲基丙烯酸化硫酸软骨素分别以100g/L的质量浓度分别溶解于磷酸盐缓冲盐水中混合，再向混合溶液中加入其质量浓度为0.5g/L光引发剂Irgacure2959、质量浓度为3.5g/L的纳米羟基磷灰石、紫外光辐射15s，即得刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶。
实施例1
一种制备干细胞凝胶的方法，包括以下步骤：
步骤1：将人滑膜间充质干细胞的细胞培养基上清液，离心，弃上清，沉淀物重悬，得到重悬液、二次离心，再次弃上清，沉淀物重悬，过滤，即得干细胞提取物；具体人滑膜间充质干细胞培养、分离以及外泌体提取操作参照文献“人滑膜间充质干细胞外泌体对小鼠腰椎小关节骨性关节炎的疗效研究”
步骤2：分别按人滑膜间充质干细胞的细胞基础培养基体积加入3％干细胞提取物、1％血小板裂解液、0.1％青藤碱、0.1％大豆皂苷、0.1％黄腐酚制成干细胞专用培养基；将经过无菌处理的刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶用磷酸盐缓冲盐水溶解再加入间充质干细胞专用培养基制备第一凝胶溶液，调节第一凝胶溶液pH至7；
步骤3：将步骤2制备得到的第一凝胶溶液和步骤1制备的人滑膜间充质干细胞的细胞培养基上清液混匀37℃水浴孵育60min，即得干细胞凝胶；所得细胞培养基上清液中每毫升含有2.5×105个/ml干细胞。
通过利用流式细胞仪对细胞表面标记物进行检测，根据美国“The InternationalSociety for Cellular Therapy(ISCT)”在2006年发布的有关检定间充质干细胞的准则，该细胞在标记物检测中应符合以下要求：结果显示：细胞表面分子特异性标志物CD90、CD105阳性，CD31、CD34阴性，符合国际细胞治疗协会鉴定间充质干细胞标准。
实施例2
一种制备干细胞凝胶的方法，包括以下步骤：
步骤1：将骨髓间充质干细胞的细胞培养基上清液，离心，弃上清，沉淀物重悬，得到重悬液、二次离心，再次弃上清，沉淀物重悬，过滤，即得干细胞提取物；具体骨髓间充质干细胞培养、分离以及外泌体提取操作参照文献“HE L,HE T,XING J,et al.Bone marrowmesenchymal stemcell-derivedexosomes protect cartilage damage and relieveknee osteoarthritis painin a rat model of osteoarthritis.Stem Cell ResTher.2020；11(1):276.”
步骤2：分别按骨髓间充质干细胞的细胞基础培养基体积加入5％干细胞提取物、2％血小板裂解液、0.5％青藤碱、0.5％大豆皂苷、2％黄腐酚制成干细胞专用培养基；将经过无菌处理的刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶用磷酸盐缓冲盐水溶解再加入干细胞专用培养基制备第一凝胶溶液，调节第一凝胶溶液pH至7；
步骤3：将步骤2制备得到的第一凝胶溶液和步骤1制备的骨髓间充质干细胞的细胞的细胞培养基上清液混匀37℃水浴孵育60min，即得干细胞凝胶；所得细胞培养基上清液中每毫升含有1.1×105个/ml干细胞。
通过利用流式细胞仪对细胞表面标记物进行检测，根据美国“The InternationalSociety for Cellular Therapy(ISCT)”在2006年发布的有关检定间充质干细胞的准则，该细胞在标记物检测中应符合以下要求：结果显示：细胞表面分子特异性标志物CD29、CD90阳性，CD11b/c、CD45阴性，符合国际细胞治疗协会鉴定间充质干细胞标准。
实施例3
一种制备干细胞凝胶的方法，包括以下步骤：
步骤1：将人脐带间充质干细胞的细胞培养基上清液，离心，弃上清，沉淀物重悬，得到重悬液、二次离心，再次弃上清，沉淀物重悬，过滤，即得干细胞提取物；具体人脐带间充质干细胞培养、分离以及外泌体提取操作参照文献“人脐带间充质干细胞来源外泌体对大鼠骨关节炎的治疗作用及机制研究”；
步骤2：分别按人脐带间充质干细胞的细胞基础培养基体积加入4％干细胞提取物、1.5％血小板裂解液、0.3％青藤碱、0.35％大豆皂苷、1.2％黄腐酚制成干细胞专用培养基；将经过无菌处理的刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶用磷酸盐缓冲盐水溶解再加入干细胞专用培养基制备第一凝胶溶液，调节第一凝胶溶液pH至7；
步骤3：将步骤2制备得到的第一凝胶溶液和步骤1制备的人脐带间充质干细胞的细胞培养基上清液混匀37℃水浴孵育60min，即得干细胞凝胶；所得细胞培养基上清液中每毫升含有1.3×106个/ml干细胞。
通过利用流式细胞仪对细胞表面标记物进行检测，根据美国“The InternationalSociety for Cellular Therapy(ISCT)”在2006年发布的有关检定间充质干细胞的准则，该细胞在标记物检测中应符合以下要求：标记物CD73、CD90、CD105表达阳性；标记物CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR表达阴性。
上述实施例1-3制备的干细胞凝胶，它们在-80℃冰箱中冻存10天之后，常温融化后细胞活率在88-92％范围内，经测定，10小时细胞活率在80-83％范围内，显示细胞具有优异的存活率。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (7)

1.一种制备干细胞凝胶的方法，包括步骤1：将干细胞的细胞培养基上清液，离心，弃上清，沉淀物重悬，得到重悬液、二次离心，再次弃上清，沉淀物重悬，过滤，即得干细胞提取物；其特征在于，还包括以下步骤2和步骤3，具体为：
步骤2：将经过无菌处理的刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶用磷酸盐缓冲盐水溶解再加入干细胞专用培养基制备第一凝胶溶液，调节第一凝胶溶液pH至7；
步骤3：将步骤2制备得到的第一凝胶溶液和步骤1制备的细胞培养基上清液混匀37℃水浴孵育60min，即得干细胞凝胶；
所述的干细胞专用培养基的具体配制方法为：分别按培养干细胞的细胞基础培养基体积加入3％～5％干细胞提取物、1-2%血小板裂解液、0.1～0.5%青藤碱、0.1～0.5%大豆皂苷、0.1～2%黄腐酚即得。
2.根据权利要求1所述的一种制备干细胞凝胶的方法，其特征在于：所述的干细胞选自人胚胎干细胞源间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、滑膜间充质干细胞或髌下脂肪垫间充质干细胞中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种制备干细胞凝胶的方法，其特征在于：步骤1中制备的细胞培养基上清液中的干细胞为每毫升含1× 105〜1.5×106个。
4.根据权利要求1所述的一种制备干细胞凝胶的方法，其特征在于：步骤3中所述的第一凝胶溶液和细胞培养基上清液体积比为3:2。
5.根据权利要求1所述的一种制备干细胞凝胶的方法，其特征在于：刺槐豆胶-硫酸软骨素水凝胶具体制备方法如下：
a:刺槐豆胶以100 g/L 的质量浓度溶解于磷酸盐缓冲盐水中，50℃下搅拌至刺槐豆胶完全溶解，以0.5 mL/min缓慢滴加甲基丙烯酸酐，滴加量为所溶解刺槐豆胶质量的0.8倍，滴加完毕后用5 mol/L氢氧化钠溶液将所得溶液调至pH至7.0；50℃下持续搅拌2h，随后将溶液在50℃下的纯水中进行透析6d，干燥得到甲基丙烯酸化刺槐豆胶，并储存在-20℃环境中，备用；
b:将硫酸软骨素溶解在去离子水中制成质量浓度为2g/L的硫酸软骨素溶液，将甲基丙烯酸酸酐与二甲亚砜按1:1的比例混合，以0.08:1的体积比加入到溶解的硫酸软骨素溶液中，室温静置2h,用5 mol/L氢氧化钠溶液将pH调至7.0，反应20h，室温下纯水中进行透析12h，干燥得到甲基丙烯酸化硫酸软骨素；
c:将甲基丙烯酸化刺槐豆胶和甲基丙烯酸化硫酸软骨素分别以100g/L 的质量浓度分别溶解于磷酸盐缓冲盐水中混合，再向混合溶液中加入光引发剂、纳米羟基磷灰石、紫外光辐射15s，即得。
6.根据权利要求5所述的一种制备干细胞凝胶的方法，其特征在于：纳米羟基磷灰石质量浓度为3.5 g/L。
7.根据权利要求5所述的一种制备干细胞凝胶的方法，其特征在于：光引发剂选择Irgacure2959，其质量浓度为0.5g/L。
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